Recherche appliquée
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Evaluation de la tumorigenèse dans un modèle de souris atteint de la mucoviscidose
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Atteintes de mucoviscidose, elles reçoivent des injections de cellules tumorales ou des injections répétées d'uréthane pour induire des cancers, afin d'étudier le sur-risque tumoral lié à la maladie. Le porteur affirme que ses modèles de culture in vitro suffisent pour la majorité des expériences mais qu'une approche sur "organisme entier" reste "nécessaire" pour la tumorigenèse. Il renvoie les développements thérapeutiques à de possibles pistes futures.
Objectifs
Ces dernières décennies, les nouvelles thérapies de transplantation pulmonaire et celles visant à corriger l’expression du gène responsable de la mucoviscidose, ont permis à ces patients de dépasser les 40 ans. L’augmentation de l’espérance de vie des patients a également accentué l’apparition de nouvelles comorbidités associées à cette maladie, dont un risque accru de développer plusieurs types de cancers (cancers digestifs, pulmonaires, cutanés, etc.). Dans ces comorbidités, la composante vasculaire y est affectée mais encore peu étudiée. Néanmoins, nos travaux ont démontré que le gène responsable de la mucoviscidose avait un rôle insoupçonné dans les cellules endothéliales, en promouvant une dysfonction/inflammation endothéliale qui est également impliquée dans les pathologies menant à l’apparition de cancers (ex : obésité, diabète, inflammation chronique de l’intestin). De plus l’expression du gène responsable de la mucoviscidose est souvent réprimée dans de nombreux cancers et un haut taux de ce gène est corrélé à une mauvaise survie des patients. Notre projet vise donc à démontrer l’augmentation de l’incidence de cancer dans un modèle de souris déficiente pour le gène responsable de la mucoviscidose, puis d’expliquer comment une dysfonction des cellules endothéliales serait associée à ce développement tumoral. Nos différents travaux publiés et en cours démontrent l’implication des cellules endothéliales dans ce phénomène, mais dans une optique de transfert vers la clinique requiert le passage dans des modèles animaux vivants qui reproduisent de façon pertinente la physiologie des tumeurs et les réponses immunitaires systémiques associées.
Bénéfices attendus
Les dernières avancées thérapeutiques ont permis aux patients atteints de mucoviscidose de voir leur qualité et espérance de vie augmentées de façon significative. En revanche de nombreuses comorbidités préjudiciables à leur santé sont également apparues. Parmi celles-ci un risque élevé de cancers gastro-intestinaux, qui est maintenant pris en charge par un dépistage précoce chez ces patients. En revanche la cause principale du risque élevé de développer certains cancers n’est pas bien comprise. Grâce à ce projet, l’utilisation de différents modèles tumoraux, et à différents stades de la tumorigénèse, permettra d’ouvrir de nouvelles pistes pour expliquer l’élévation de l’incidence des cancers chez les patients atteints de mucoviscidose, et mettre en lumière de potentiels développements thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections sous-cutanées de cellules tumorales (1 seule injection), ou à des injections intra-péritonéales répétées de traitements (1 injection hebdomadaire pendant 4 semaines). Chaque injection durera une trentaine de secondes, à raison d'un maximum de 4 injections par animal.
Impact sur les animaux
Les données de la littérature sur le modèle d’induction tumorale par injection intra-péritonéale d’uréthane (4 fois par semaine) ne font état d’aucun effet indésirable notoire pour les animaux lorsque ceux-ci sont euthanasiés au cours du 4ème mois suivant la première injection d’uréthane. Néanmoins, l'établissement et la croissance des tumeurs pourra générer des douleurs qui seront détectées précocement grâce aux points limites préalablement établis pour chaque procédure.
Devenir
Des prélèvements de tissus seront nécessaires pour les études histologiques de nos procédures. De fait, tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure. De même, les animaux ne pourront être réutilisés car les procédures précédentes pourraient potentiellement introduire une variabilité indésirable sur les prochaines expérimentations.
Remplacement
Notre laboratoire a développé au cours des dernières années des systèmes de culture in vitro complexes (sphéroïdes, puces microfluidiques) et de cellules primaires dérivées de patients qui nous permettent de nous affranchir de l'utilisation d'animaux pour une majorité de nos expériences. Grâce à ces modèles nous avons d’ailleurs validé de nombreux aspects qui soutiennent notre hypothèse. L'approche sur organisme entier nous est en revanche nécessaire pour analyser des processus plus complexe et sur le long terme comme la tumorigénèse.
Réduction
Les différents paramètres mesurés seront comparés par des tests statistiques adaptés aux très petits échantillons. Notre projet nécessitera 168 animaux au total.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des cages ventilées (5 souris maximum par cage) en milieu enrichi (copeaux de litière, lambeaux de papier) dans des salles à température et hygrométrie contrôlées. Les litières sont changées chaque semaine par le personnel qualifié de l’animalerie. Toutes les procédures prévues dans ce projet sont de classe modérée. L’utilisation d’antalgiques morphiniques n’est pas envisagée car les animaux seront immédiatement euthanasiés en fin de procédure ou d’atteinte d’un point limite. Des points limites adaptés à l’espèce utilisée ont été prévus pour chaque procédure. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel zootechnique et les expérimentateurs. En cas d’atteinte d’un des points limites suivants un signalement sera fait au responsable de la SBEA ainsi qu’au responsable de l’étude ou à son suppléant. Les animaux seront alors euthanasiés directement afin de prévenir toute douleur au stade le plus précoce possible et d’éviter la collecte de données altérées en raison d’un stress chez les animaux. •Critères cliniques : - Mauvais état du pelage (diminution du toilettage, perte excessive de poils, plaies) - Faciès contracté et position anormale des vibrisses - Yeux clos et larmoyant - Gonflement abdominal pouvant être causé par l’accumulation de liquide d’ascites en raison des tumeurs - Fèces liquides ou absence de fèces. - Respiration anormalement rapide et synonyme d’une masse tumorale intrathoracique trop importante (dans le cas des tumeurs thoraciques). •Critères comportementaux : - Position recourbée (dos voûté, prostration) - Diminution de la mobilité interférant avec l’activité de base de l’animal (alimentation, toilettage) - Réduction de l’activité, isolement - Signes de stress (hyper-sensibilité aux bruits, agressivité, stéréotypie) •Critères zootechniques : - Perte de poids de plus de 20 % par rapport au poids initial de l’animal ou comparativement au poids moyen des individus soumis au même protocole expérimental.
Choix des espèces
L’objectif principal de notre projet est de déterminer l’impact d’un défaut du gène responsable de la mucoviscidose sur le développement tumoral. Nos précédents travaux publiés ont utilisé le modèle de souris envisagé dans ce projet, et mis en lumière des défaut vasculaires qui pourraient expliquer l’apparition de cancers. De fait, l’utilisation de ce modèle de souris particulier au travers de différents modèles tumoraux nous apparaît pertinente et essentielle pour apporter une preuve solide étayant notre hypothèse. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 à 10 semaines (jeunes adultes). Le stade de développement est justifié par la nécessité d'avoir des animaux adultes ayant un système immunitaire mature
Evaluation chez le rongeur, de la biodistribution de composés chimiques ou biologiques par des méthodes froides ou radioactives
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Rats : 12500
Hamsters dorés : 300
Gerbilles de Mongolie : 200
Une perte de poids de plus de 15 %, ou de plus de 10 % pendant plus de trois jours, constitue un point limite pour les 25 500 rongeurs de ce projet : 12 500 souris, 12 500 rats, 300 hamsters dorés et 200 gerbilles de Mongolie, utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les composés testés, froids ou radiomarqués, leur sont administrés par la bouche, le nez, la trachée, le muscle, la peau, l'abdomen, la veine porte, le cerveau ou la vessie, cette dernière voie après jusqu'à quatre heures de privation d'eau, ou par minipompe implantée par chirurgie. La phase in vivo peut durer jusqu'à 12 mois, avec des jeûnes jusqu'à 16 heures et un hébergement individuel sans enrichissement pour recueillir urines et fèces, afin de mesurer la distribution et l'élimination de composés que le résumé ne nomme pas. Le porteur déclare 10 220 rongeurs réutilisés, et réserve ce maintien en vie à ceux qui n'ont reçu qu'une administration unique de composé non radioactif et sont restés moins d'une semaine en procédure, les autres étant mis à mort pour prélever leurs organes et de grands volumes de sang.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo l’absorption, la distribution, la métabolisation et l’excrétion de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur. Les paramètres de distribution et d’excrétion des composés seront si possible déterminés préalablement in vitro, ce qui conditionnera le choix de l’espèce rongeur (souris, rat, hamster, gerbille) et de la souche à utiliser pour évaluer la biodistribution in vivo dans le sang, les urines, et les différents organes. Dans certains cas, il sera possible d’avoir recours à une forme radiomarquée des composés afin de faciliter leur dosage et l’identification de leur distribution. Ce projet permettra d’une part de révéler la pharmacocinétique des composés testés in vivo, par administration unique ou répétée (dans le respect des recommandations vétérinaires concernant les voies, volumes et fréquences) de la molécule froide. Une seconde partie du projet aura recours à la forme radiomarquée de la molécule. Dans certains cas, les administrations nécessiteront une pose chirurgicale d’implant (de diffusion prolongée sous cutanée, intraveineuse ou intrapéritonéale). Ces chirurgies seront réalisées stérilement, sous anesthésie avec analgésie couvrant toute la durée de la chirurgie et dans le respect des recommandations du comité d’éthique. Des prélèvements divers (sang, urines, fèces, liquide cérébro spinal etc., dans le respect des recommandations vétérinaires) pourront être effectués in vivo afin de doser le composé dans ces fluides, ou des paramètres métaboliques (insulinémie, glycémie) et des prélèvements d’organes pourront avoir lieu, exclusivement post mortem. Dans le cas de l’insulinémie et de la glycémie ou d’autres paramètres métaboliques, une injection de glucose en IP ou SC ou une administration PO pourront être réalisées au préalable des prélèvements sanguins.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer la pharmacocinétique in vivo de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, sur une période allant de 1 jour à 12 mois. Cette évaluation est critique afin de pouvoir ensuite réaliser des études d’efficacité.
Procédures
Des composés chimiques ou biologiques froids ou radiomarqués seront administrés aux animaux par voie: intranasale, intratrachéale, sous anesthésie générale d’environ une heure; intramusculaire, intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie; orale sur animaux vigiles (acte d’1min environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ 1h); injection intraportale ou minipompe (intraveineuse, sous cutanée ou intrapéritonéale) posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ 1h). Les implants pourront être retirés au plus tôt une semaine plus tard (chirurgie d’environ 15min, anesthésie d’environ 1h). Des administrations intravésicales (par cystocentèse ou cathéter) pourront être réalisées (anesthésie générale de moins d’1h) après privation d’eau sur maximum 4h et vidange de la vessie par pression légère sur le ventre. Il sera aussi possible de réaliser des administrations intracérébrales. Ce geste sera réalisé lors d’une anesthésie de moins d’une heure avec analgésie. Pour les administrations orales où l’alimentation pourrait biaiser la pharmacocinétique, les animaux pourront être mis à jeun au maximum 16h,Ils seront pesés et éventuellement réhydratés après le jeûne. Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. La phase in vivo pourra durer jusqu’à 12 mois dans le cas de composés froids et 2 mois pour les composés radiomarqués. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés afin de suivre la biodistribution et l’élimination des produits administrés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera au maximum une heure. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement En fin de projet, la plupart des animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie. Dans le cas particulier d’animaux ayant subi une administration unique de produit non radioactif et ayant été gardés en procédure au maximum une semaine, ils pourront être gardés en vis sur avis du vétérinaire.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, nous attendons n’attendons pas d’effets indésirables particuliers chez les animaux. Dans le cas de phénotypes dommageables, celui-ci n’affectera pas le bien-être animal, bien que les animaux pourraient boire plus d’eau et/ou être obèses. Il ne peut toutefois pas être exclu que les composés administrés causent de la toxicité (diarrhée, perte de poids, douleur, signes neurologiques), ce qui sera surveillée. Une douleur transitoire modérée pourrait être générée par les chirurgies. Un stress de courte durée et une douleur légère sera générée par les administrations de produit. Les mises à jeun pourraient générer un stress léger et une déshydratation légère.
Devenir
Les animaux seront la plupart du temps mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés. Les animaux ayant reçu une administration unique de composé non radioactif et étant restés en procédure moins d’une semaine pourront être gardés en vie pour réutilisation.
Remplacement
Les molécules chimiques ou biologiques dont la pharmacocinétique sera évaluée dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro (tests sur hépatocytes, microsomes etc) afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire la biodistribution in vivo des molécules. La pharmacocinétique réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal.
Réduction
Le nombre d’animaux par lot a été déterminé sur la base des expériences passées dans notre centre, pour choisir le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus, ex collecte de peau à plusieurs points de temps), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps. Dans le cas de screening de nouvelles molécules, au maximum 5 animaux par groupes seront inclus. Le nombre sera adapté en fonction de la variabilité attendue de la pharmacocinétique du composé. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux. Des analyses statistiques seront réalisées sur les paramètres mesurés.
Raffinement
Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine : • A partir de 10% de perte du poids, les animaux seront pesés quotidiennement et une de l’alimentation et de l’eau gélifiées seront mises à disposition dans les cages. • Entre 10 et 15% du poids : les animaux seront réhydratés avec du Ringer Lactate, 0.5mL, une fois par jour. Une perte de poids de plus de 15% ou se maintenant plus de 3 jours au-delà de 10% constituera un point limite. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, un arbre décisionnel validé par la SBEA et le comité d’éthique (document de référence) sera utilisé pour décider de l’arrêt du traitement, de traitements de support et/ou de l’euthanasie de l’animal. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal sont listés en détail dans les procédures. Les administrations intracérébrales, intrathécales, intravésicales, intraportales, les prélèvements de liquide cérébrospinal et les poses et retraits de mini-pompes osmotiques ou d’un implants seront réalisées sous anesthésie générale avec analgésie pré-, per- et post-opératoire (buprénorphine au moins 30 minutes avant). Pour les pompes et implants, les animaux seront hébergés individuellement et suivis quotidiennement le temps de la cicatrisation de la plaie suturée (en général 3-4 jours) et des soins locaux seront apportés si nécessaire. Les administrations IM et ID seront réalisées après administration d’un analgésique (buprénorphine).
Choix des espèces
Si le profil pharmacocinétique in vitro est adéquat dans cette espèce, la souris sera privilégiée pour évaluer la pharmacocinétique des nouveaux composés in vivo, car c’est l’espèce mammifère la plus décrite dans les modèles d’évaluation de molécules chimiques ou biologiques. La souris sera aussi préférée dans le cas d’une administration d’un composé ou d’un traceur radioactif, si le mécanisme d’action de la molécule le permet, pour des raisons pratiques de gestion de la radioactivité et de ses déchets. Pour certaines études pré-réglementaires comme l’étude de l’élimination d’un composé radiomarqué in vivo, le rat sera l’espèce préférée. Des hamsters et des gerbilles pourront être occasionnellement utilisés si besoin, en cas d’études préalables à la mise en place d’un modèle particulier bien décrit dans ces espèces (exemple : hamster pour une étude préalable à une étude d’infection au SARS-CoV2). Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.
Thérapie cellulaire dans la gestion du diabète et de ses complications
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Rats : 232
Jusqu'à trois prises de sang par semaine sur une étude de six mois au plus, et des tests de tolérance au glucose comptant chacun jusqu'à dix prélèvements en trois à six heures : 348 rongeurs, 116 souris et 232 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue pour des prélèvements terminaux. Rendus diabétiques par une injection de streptozotocine, ils reçoivent des îlots pancréatiques nus ou encapsulés, injectés ou implantés par chirurgie sous anesthésie, puis restent isolés environ une semaine pour récupérer. Jusqu'à une fois par semaine, l'équipe stimule leurs pattes au toucher ou à la chaleur pour mesurer la neuropathie, et examine le fond de leur œil. Les capsules doivent protéger les îlots greffés du système immunitaire, pour épargner un jour aux patients diabétiques de type 1 les traitements immunosuppresseurs. Ces procédures sont classées au niveau sévère, et le porteur écrit que "des effets indésirables légers peuvent apparaitre dans certaines procédures".
Objectifs
Le diabète est une maladie métabolique caractérisée par une hyperglycémie chronique résultant d’un défaut de sécrétion d'insuline (diabète type 1) ou d'action de l'insuline (diabète de type 2). L’hyperglycémie chronique expose les personnes atteintes à un risque accru de pathologies plus graves telles que la néphropathie, la neuropathie, les complications cardiovasculaires, oculaires (rétinopathie). Aujourd’hui, l’incidence du diabète a atteint une proportion pandémique et les estimations pour les prochaines années sont alarmantes, on estime que d’ici à 2045, le nombre de diabétiques s’élèvera à 700,2 millions dans le monde. Le diabète de type 1 (DT1), résulte d’une réaction auto-immune par une autodestruction progressive des cellules bêta des îlots de Langerhans du pancréas, productrices d’insuline. Ainsi, les patients souffrants de DT1 n’ont d’autre choix qu’un apport exogène d’insuline pour pouvoir réguler leur homéostasie glucidique. Aujourd’hui, malgré une amélioration non négligeable de la gestion du DT1 par le développement des analogues à l’insuline et l’utilisation de moniteurs de glycémie, la régulation glucidique reste compliquée pour certains patients. En effet, ces derniers sont souvent exposés à des épisodes d’hypoglycémie iatrogène.Une alternative offrant une meilleure capacité de régulation glucidique serait une greffe d’ilots pancréatiques. Toutefois, le recours systématique aux traitements immunosuppresseurs pour protéger les cellules greffes de la destruction à médiation immunitaire, reste le principal obstacle. Afin d’éviter l’utilisation de traitement immunosuppresseur, qui expose le patient à un risque accru de complications infectieuses, la greffe d’ilots pancréatiques encapsulés représente une stratégie thérapeutique prometteuse. En effet, les cellules d’ilots de Langerhans sont contenues dans une capsule semi-perméable, les protégeant ainsi du rejet par le système immunitaire, tout en permettant le passage à la fois des nutriments, de l’oxygène et de l’insuline. Ainsi, l’objectif du présent projet est d’évaluer l’efficacité des ilots encapsulés implantés chez les animaux diabétiques sur la régulation métabolique et à prévenir les complications liées au diabète (rétinopathie et neuropathie).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité des implants d’ilots pancréatiques sur la régulation métabolique et leur tolérance locale chez les rats diabétiques. Par ailleurs l'effet préventif des implants sur les complications du diabète (neuropathie, rétinopathie) est également évalué.
Procédures
Les troubles métaboliques sont induits par une administration unique d'un réactif (durée d'environ 1 minute). Après sélection des animaux diabétiques, les ilots pancréatiques nus ou encapsulés sont injectés ou implantés/explantés par chirurgie sous anesthésie qui dure généralement 1 heure. Par la suite, les animaux sont maintenus isolés avec enrichissement pour une meilleure récupération post-chirurgicale (généralement pour une semaine). Juste avant la chirurgie et durant la période post chirurgicale, anti-inflammatoire et antibiotique sont administrés par bolus rapide (quelques secondes) par voie sous-cutanée ou intramusculaire (de manière générale) selon les bonnes pratiques vétérinaires. Les tests de tolérance au glucose et à l’insuline (1/ mois) nécessitent une administration unique par voie orale, intrapéritonéale ou sous cutanée (durée d’environ 1 minute) suivie de prélèvements d'une goutte de sang (durée de quelques secondes, 10 prélèvements maximum, sur 3 à 6 h de test). Par ailleurs, des prélèvements de sang peuvent être réalisés de manière répétée par exemple : 3 fois par semaine au maximum pendant la toute durée de l’étude (6 mois au maximum), chaque prélèvement durant quelques secondes à 3 minutes. De plus, un hébergement individuel (durée maximum de 24 h) peut être nécessaire au cours de l'étude pour prélèvement d'urine ou de fèces. L’évaluation de la neuropathie se fait par stimulation tactile et/ou thermique au niveau des pattes de l’animal, la procédure dure quelques minutes et peut être répétée 1 fois par semaine au maximum. Enfin, un examen du fond de l’œil (durée de quelques minutes, répété 1 fois par semaine au maximum) est réalisé par méthode non invasive (ophtalmoscope).
Impact sur les animaux
Dans ce projet, des effets indésirables légers peuvent apparaitre dans certaines procédures, ceux-ci sont essentiellement marqués par : (1) une perte de poids suite à l'induction des troubles métaboliques, (2) des phases d’hypoglycémie ou d'hyperglycémie, (3) une courte privation de nourriture (pour une durée n’excédant pas 16h ± 1 h) ou des prélèvements sanguins et/ou urinaires. Toutefois, si une souffrance devait apparaître, l’atteinte de points limites clairement établis permettraient l'euthanasie de l'animal. Par ailleurs, de courtes périodes d'isolement n’excédant pas 24h ± 1h sont nécessaires au projet (en veillant à conserver le contact olfactif, visuel et sonore entre les congénères). En outre, lors de la phase de récupération post-chirurgicale, une attention particulière est apportée (surveillance des cicatrices, état général, poids, appétit, excrétion de fécès…).
Devenir
Tous les animaux sont soumis à des prélèvements terminaux ce qui implique leurs euthanasies.
Remplacement
De nombreux tests ex vivo (in vitro et in silico) sont réalisés avant les tests sur l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant de générer des données préliminaires de concept, d’effectuer un tri du matériel d’encapsulation et de ne retenir que les matériaux présentant une certaine efficacité et inocuité.. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substances à tester (et donc du nombre d’animaux), ils ne donnent aucune indication sur la tolérance et l’efficacité du complexe (capsule-ilots) chez l’Homme. Ainsi, les modèles d'animaux restent indispensables pour valider et optimiser de nouvelles thérapies pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.
Réduction
Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif (Implant sans ilots ou Placébo) et éventuellement à un contrôle positif et négatif (implantation d’ilots par voie intra-portale : ilot allogénique et ilot syngénique) si cela s'avère pertinent. Quand le protocole d'étude le permet, un groupe traité est utilisé comme son propre contrôle permettant ainsi d’utiliser un nombre d’animaux réduit. Les données de la littérature indiquent qu’un effectif de 8 animaux (rats et souris) en standard par groupe (nombre de groupes variables, selon l’objectif de l’étude) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. L’analyse statistique prévue repose sur des tests paramétriques. Par ailleurs, des prélèvements terminaux peuvent être ajoutés en fin de procédure pour éviter une répétition inutile de l'étude.
Raffinement
Les mesures de raffinement s'intégrant à la régle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites clairement définis et spécifiques à la procédure, permettant de stopper l'étude et/ou d'euthanasier, de façon précoce, tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins pré/post-opératoires complets.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur le métabolisme de rongeurs (rats, souris), est prédictif de leur efficacité et/ou sécurité en clinique. En effet, le rongeur s'est avéré être un modèle fiable pour découvrir et valider de nouveaux traitements du Diabète, il présente une physiologie proche de celle de l'Homme. Les études sont principalement menées sur des jeunes rongeurs sains dont l'âge est compris entre minimum 4 semaines (correspond à la fin du sevrage des animaux) et maximum 20 semaines (correspond à l'apparition du processus de sénescence). Par ailleurs les rongeurs soumis à la procédure d'induction du diabète par injection de streptozotocine seront agés au maximum de 12 semaines en début de traitement et ce afin d'éviter le risque de mortalité.
Administration intracérébrale de candidats médicaments, collectes de sang répétées et analyse comportementale chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Rats : 450
4 050 rongeurs, souris et rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 450 d'entre eux et sévère pour 3 600. Ils subissent une chirurgie stéréotaxique avec perçage du crâne pour une administration intracérébrale, puis jusqu'à huit prélèvements de sang en 24 à 48 heures, pour caractériser la pharmacocinétique de candidats médicaments pour le compte de clients. Le porteur reconnaît des douleurs post-opératoires de 24 à 48 heures et un risque lié au geste sur des molécules innovantes peu connues. Il affirme que l'évaluation in vivo reste "incontournable" et que la tolérabilité comportementale ne peut pas s'étudier in vitro.
Objectifs
Au cours du développement préclinique, de nombreuses études sont effectuées afin d’évaluer l’efficacité et l’innocuité des candidats médicaments (i.e., nouveaux composés ayant un potentiel thérapeutique). Les études pharmacocinétiques, qui sont menées en parallèle, permettent d’étudier le devenir du composé dans un organisme vivant. Classiquement, il s’agit de caractériser son absorption, sa distribution dans l’organisme, son métabolisme (c’est-à-dire comment l’organisme procède à sa transformation) et enfin son élimination. Les données collectées dans le cadre de ces études permettent notamment d’affiner les doses et par conséquent de contribuer à la détermination de fenêtres/marges thérapeutiques, qui matérialisent la zone de concentrations permettant d’observer une efficacité tout en limitant la survenue d’effets secondaires/toxiques. De plus, l’efficacité d’un composé est également dépendant de sa voie d’administration. Dans le cadre de pathologies touchant le système nerveux central (SNC), une des voies d’administration pouvant être la plus efficace est l’injection intracérébrale (ICB). Cette voie d’administration permet de contourner la barrière hémato-encéphalique (BHE) qui limite voire empêche le passage de certaines molécules provenant de la circulation sanguine. De plus, cette voie d’administration permet d’agir directement sur le tissu cérébral donc de focaliser de manière plus précise la biodistribution du composé dans la zone à traiter. In fine, cela permettrait de réduire la dose à injecter et donc de possiblement limiter les effets secondaires/toxiques potentiels. Cependant, il n’est pas impossible que certaines molécules injectées en ICB traversent la BHE et se retrouvent dans la circulation sanguine. Ainsi, en tant que prestataire de services pour l’industrie pharmaceutique, nous proposons à nos clients de réaliser la phase expérimentale de leurs études pharmacocinétiques. Ce projet a donc pour objectif de fournir à nos clients des échantillons de sang et/ou de tissus prélevés chez le rongeur (rat ou souris) dont l’analyse permettra de connaître les variations de concentration plasmatique (au cours du temps et/ ou en terminal) et/ou tissulaires (en terminal) des candidats médicaments après une administration unique. La tolérabilité de ces composés, injectés par voie ICB, pourra également être objectivée au cours du temps à partir d’une analyse comportementale basée sur une grille d’observation fonctionnelle (FOB test) de l’animal.
Bénéfices attendus
Les échantillons de sang et d’organes collectés seront traités et analysés par nos clients afin d’établir le profil pharmacocinétique de leur candidat médicament. En parallèle, l’analyse comportementale permettra de compléter les analyses tissulaires en évaluant les répercussions fonctionnelles du candidat médicament (FOB test) sur les animaux et ainsi d’en juger la tolérabilité afin d’affiner la dose optimale avec des effets secondaires maitrisés.
Procédures
Les animaux seront soumis à une administration de composé unique par voie intracérébrale sous anesthésie gazeuse dont la durée est variable allant de 30min à 1h30. Des prélèvements répétés de sang seront réalisés soit sur animal vigile, à la veine de la queue ou submandibulaire (souris uniquement) (durée : 5min), soit sur animal anesthésié par ponction directe de la veine jugulaire (durée : 10min). Ces prélèvements seront réalisés le plus souvent pendant les 24 à 48h suivant l’administration avec un maximum de 8 prélèvements sur cette période, mais ils pourront également être étalés sur plusieurs semaines (1 à 2 prélèvements par semaine maximum). Certains prélèvements pourront être réalisés en terminal par ponction intracardiaque pour les prélèvements sanguins sur animal anesthésié. Les souris de plus de 2 mois seront isolées pour tous le protocole dont la durée dépendra des objectif du client (de 7 jours à plusieurs semaines).
Impact sur les animaux
-Un des effets indésirables potentiel est lié à l'administration du candidat médicament. Le personnel est formé et entrainé à l’administration intracérébrale pour réduire tout risque. Cependant, un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut-être observé surtout pour les nouvelles molécules innovantes avec peu de recul. -Les animaux seront soumis à une administration intracérébrale sur un ou plusieurs sites nécessitant une chirurgie réalisée sur un cadre stéréotaxique et sous anesthésie gazeuse pour disséquer les tissus cutanés et pour percer l'os crânien. Cette étape peut engendrer des douleurs durant les 24-48h suivant la chirurgie. La peau du crâne sera ensuite suturée ce qui peut provoquer des démangeaisons lors de la cicatrisation et un risque de retrait du point par l'animal. Des prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigile soumis à une contention, impliquant parfois des ponctions directes dans les vaisseaux à l’aide d’une aiguille ou d’une lancette pouvant être à l’origine 1) d’une douleur, 2) de stress et 3) d’un écoulement sanguin persistant. Ces prélèvements pourront nécessiter également d’anesthésier les animaux et ce de façon répétée. Dans le cadre de prélèvements multiples, au maximum, 8 prélèvements pourront être réalisés sur 48h, ou encore 2 prélèvements maximum par semaine pendant plusieurs semaines. Lorsque des volumes importants seront nécessaires, le prélèvement pourra être effectué en intracardiaque de façon terminale, sous anesthésie. En cas de prélèvement du cerveau, les animaux subiront une thoracotomie précédent une perfusion intracardiaque sous anesthésie chimique et analgésie morphinique. Afin de limiter tout risque de bagarre (rapport dominant/dominé) et donc de blessures, les souris dont l’âge est au-dessus de 2 mois seront isolées ce qui est également une source importante d'anxiété.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de collecter du sang et/ou des organes.
Remplacement
Si des méthodes d’extrapolation in vitro-in vivo sont de plus en plus utilisées, comme la modélisation pharmacocinétique à fondement physiologique, ces approches présentent malgré tout encore certaines limites, notamment la difficulté à paramétrer certains processus mis en jeu en particulier pour les phases d’absorption et d’excrétion. Ces approches ne constituent qu’une aide à la caractérisation des interactions pharmacocinétiques, et l’évaluation in vivo du devenir d’un composé dans un organisme vivant reste incontournable. De même, il n’est pas possible d’évaluer la tolérabilité des composés sur la réponse comportementale fonctionnelle sur des modèles in vitro.
Réduction
Toutes les mesures seront prises pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet tout en prenant en compte les besoins de nos clients (volumes de sang, nombre de points de prélèvements et de doses à tester nécessaires). Chaque animal pourra être son propre contrôle, et le recours à des prélèvements répétés au cours du temps sur le même animal permet également de limiter le N total par étude.
Raffinement
L’ensemble des expérimentations seront effectuées par un personnel compétent et entraîné. L’état clinique des animaux sera suivi quotidiennement grâce à une grille de score. Des points limites précis et spécifiques à chaque procédure sont également établis afin de s’assurer que toute douleur/souffrance éventuelle des animaux pourra être détectée et prise en charge rapidement. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie. Les animaux seront également habitués à la manipulation et à la contention pour diminuer le stress lié à ces procédures. Les prélèvements sanguins ainsi que les doses et volumes d’injection des anesthésiques chimiques (i.p), analgésiques (s.c) et de sérum physiologique (NaCl 0,9%) seront réalisés selon les recommandations éthiques pour chaque espèce. Après chaque prélèvement, une injection de NaCl 0,9% sera réalisée (volume équivalent injecté directement dans la voie veineuse ou 3 fois le volume prélevé injecté en sous cutané) afin de compenser la perte de volémie. Les chirurgies ICB seront sous anesthésie et analgésie et les animaux bénéficieront d’une surveillance accrue (minimum 2 fois par jour sur 48h) en phase post-opératoire. De la nourriture et/ou des gels enrichis seront déposés dans la cage afin de limiter la perte de poids des animaux après la chirurgie. Par ailleurs, l'eau et la nourriture seront fournis ad libitum et les animaux bénificiront d'un environnement enrichi. Les animaux hébergés (souris) individuellement disposeront d’un environnement avec plusieurs type d'enrichissements (petite maison et plusieurs matériaux pour la réalisation de leur nid). Ces dernières seront également disposées dans des cages transparentes et placées les unes à côté des autres pour qu'elles puissent se sentir et s'observer. La manipulation des animaux au cours du FOB test peut être une source d'anxiété. De plus, afin de limiter tout risque de bagarre (rapport dominant/dominé) et donc de blessures, les souris dont l’âge est au-dessus de 2 mois seront isolées ce qui est également une source importante d'anxiété.
Choix des espèces
Ces études de pharmacocinétique vont permettre de déterminer les doses qui seront ensuite utilisées pour les études d’efficacité et de pharmacologie de sécurité chez le rongeur, ce qui justifie le choix des espèces retenues pour ce projet. Le choix entre souris et rat sera ensuite conditionné notamment par l’historique des études déjà réalisées par nos clients, le choix du modèle de pathologie envisagé par la suite, et les volumes de sang requis pour les bioanalyses. Les animaux utilisés dans le cadre de ces études sont : - Des rats de tous âges soit environ 150 à 600g - Des souris de tous âges soit environ 20 à 40g Les études seront effectuées sur des animaux en post-sevrage dont l’âge des animaux dépendra du protocole à réaliser, des objectifs de l’étude et des candidats médicaments à tester.
Développement d’un NanoBooster en combinaison aux immunothérapies en oncologie
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
224 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du poumon puis des injections de liposomes par voie rétro-orbitaire, avant un prélèvement de la totalité du sang par ponction intracardiaque et le prélèvement de leurs organes, pour mettre au point une nanoparticule censée renforcer l'immunothérapie. Le porteur reconnaît que les tumeurs peuvent métastaser et provoquer des douleurs, et que la contention et l'anesthésie stressent les animaux. Il annonce surtout des retombées de brevet et de modèle mathématique, et affirme ne maîtriser l'étude de l'immunomodulation que in vivo.
Objectifs
L’objectif principal de ce projet est de synthétiser une nanoparticule générique (appelée NanoBooster) pouvant être administrée en amont (ou simultanément) à l’immunothérapie, dans le but de remodeler le terrain immunitaire du patient et ainsi augmenter ses chances de bénéficier au mieux de ces traitements.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra non seulement de consolider l’intérêt de développer des outils in silico pour la synthèse des nanoparticules mais aussi de définir des premières caractéristiques essentielles à un NanoBooster (taille, cytotoxique encapsulé ou non, dose de cytotoxique ) avec l’exemple de son association à un anticorps anti-PD-1 dans le cancer du poumon non à petites cellules. Ces résultats seront valorisés lors de congrès internationaux et dans le cadre d’une publication scientifique. Le modèle mathématique pourra également être valorisé par un brevet. Les perspectives de ce projet sont nombreuses. Elles consistent en : - La Validation du modèle mathématique sur un éventail plus large de molécules d’immunothérapies (nivolumab, Opdivo®, anti-PD-1 et l’atézolizumab, Tecentriq®, anti-PD-L1) et de type de cancers tels que le cancer du sein et du pancréas. - Le développement d’un modèle mathématique afin d’optimiser les modalités de ce schéma combinatoire.
Procédures
Pour l'étude d'immunomodulation: -Greffe de cellules tumorales (injection sous-cutanée sur le flanc de l'animal) : sur animal anesthésié -Administration du lot de liposome (vide ou avec cytotoxique encapsulé) par la voie rétro-orbitale: sur animal anesthésié -Suivi du poids de l'animal et du volume tumoral (3 fois par semaine) : sur animal vigile -Prélèvement de la totalité du sang par ponction intra-cardiaque, prélèvement de la tumeur et de la rate également: sur animal anesthésié Chaque souris subit 1 seule fois chacune des interventions évoquées ci-dessus (excepté le suivi du poids de l'animal et le suivi de la croissance tumoral). Pour l'étude de la pharmacocinétique: -Greffe de cellules tumorales (injection sous-cutanée sur le flanc de l'animal) : sur animal anesthésié -Administration du lot de liposome (vide ou avec cytotoxique encapsulé) par la voie rétro-orbitale: sur animal anesthésié -Suivi du poids de l'animal et du volume tumoral (3 fois par semaine) : sur animal vigile -Prélèvement de la totalité du sang par ponction intra-cardiaque, le cerveau, rein, foie, rate, tumeur, poumon, coeur, et pancréas seront également prélevés sur les animaux ayant reçu le lot de liposome avec cytotoxique : sur animal anesthésié. -Imagerie sur animaux réservés aux temps tardifs et ayant reçu le lot de liposome avec cytotoxique (6 temps seront définis en fonction du cytotoxique encapsulé): sur animal anesthésié -Imagerie pour les animaux ayant reçu le lot de liposome vide (les acquisitions des images auront lieu selon les mêmes temps définis pour le groupe ayant reçu le lot de liposome avec cytotoxique): sur animal anesthésié.
Impact sur les animaux
Les animaux seront greffés avec des cellules de cancer du poumon (LL/2) pouvant métastaser dans de rares cas, et donc engendrer de la douleur. Les injections des traitements se font par voie intraveineuse rétro orbitale, ainsi une douleur courte au site d'injection peut apparaitre. Les animaux seront anesthésiés à l'aide d'une cage à induction ce qui peut les stresser quelques minutes avant l'endormissement. La mesure du volume tumoral sur animal vigile peut également être stressant pour l'animal.
Devenir
Chaque procédure nécessite le prélèvement de sang, et d'organes et donc la mise à mort des animaux. Les 6 souris utilisées pour les études de biodistribution par imagerie en fluorescence des liposomes vides seront mises à mort une fois le point limite atteint.
Remplacement
A ce jour, Il existe des modèles in vitro pour étudier l'immunité tumorale mais ces tests ne sont pas mit en place au sein de notre laboratoire. L'équipe du laboratoire est compétente pour l'étude de l'immunomodulation in vivo seulement. C'est pourquoi nous collaborons avec une autre équipe pour l'évaluation de l'immunomodulation in vitro. Ces études d'immunomodulation sur splénocytes,d'apoptose en co-culture splénocyte/cellules cancéreuses et d'étude d'interaction des liposomes avec les cellules immunitaires (lymphocyte et macrophages) nous permettront de remplacer les expériences initialement prévues in vivo pour sélectionner les deux nanoboosters les plus immunomodulateur.
Réduction
Le logiciel Kinetic pro sera utilisé pour définir des temps informatifs pour les études de pharmacocinétique, afin de réduire au maximum le nombre de temps de prélèvements nécessaires et la durée de l'étude. La pharmacocinétique des liposomes vides sera évaluée en imagerie par fluorescence permettant de faire un suivi non invasif, non destructif et longitudinale de la pharmacocinétique. Que ce soit dans le cadre de l'étude d''immunomodulation ou dans le cadre de l'étude de la pharmacocinétique, le volume tumorale est monitoré 3 fois par semaine et dès lors qu'un animal est mis à mort, la totalité de ses organes et de son sang sont prélevés. Malgré le fait que seuls le sang, la tumeur et la rate soient utilisés pour étudier l'immunomodulation, nous prélevons la totalité des organes afin de pouvoir générer des datas supplémentaires sur la pharmacocinétique de nos formulations. Ces datas (volume tumoral, données sur la pharmacocinétique supplémentaires) nous serviront à valider le futur modèle PBPK (physiologically based pharmacokinetics) développé en parallèle des études expérimentales et donc d'éviter d'utiliser des animaux supplémentaires pour la validation de ce modèle. L’analyse statistique des données sera effectuée avec un test non paramétrique de Mann et Whitney.
Raffinement
Le bien être animal est respecté: - temps d'acclimatation de 10 jours avant toute procédure - enrichissement des cages (dômes - copeaux de cellulose) , prévention de la douleur, réduction du stress (les manipulations telles que les administrations, prélèvements seront conduites sous anesthésie générale et aucun stress ou souffrance particulière n’est attendue au cours de ces diverses interventions sur l'animal) - définition des points limites et évaluation quotidienne du bien être animal.
Choix des espèces
Les données de la littérature montrent que la souris est un bon modèle expérimental pour des études de pharmacocinétiques et d'immunomonitoring , de plus notre laboratoire possède déjà l'expertise de ces procédures sur ces modèles . La souche de souris utilisée est la C57Bl/6, les souris C57Bl/6 sont immunocompétentes. En effet, une partie de l'étude consiste en l'évaluation in vivo de la régulation de plusieurs effecteurs de l'immunité tels que les cellules LT CD8, LT CD4, NK et Treg. Par ailleurs, la facilité de manipuler la souris dans un milieu confiné fait de cette espèce animale l’espèce la plus appropriée pour répondre aux questions posées. Les données bibliographiques se réfèrent principalement à des études effectuées sur des souris de 6 semaines. L'utilisation d’animaux de cet âge permettra une comparaison plus aisée avec les données déjà publiées dans la littérature et permettra ainsi de mieux évaluer la performance de nos nanoboosters. De plus le cancer touche généralement une population adulte.
Etude de l’effet bénéfique potentiel d’une souche de lactobacille contre le développement de cellules cancéreuses chez la souris.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
656 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 564 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 92 léger. On leur induit un cancer sous-cutané ou colorectal par un agent cancérigène, ce dernier provoquant une inflammation intestinale avec perte de poids et diarrhée sanglante, pour tester une souche de lactobacille administrée par voie nasale ou orale. Le porteur indique viser un complément probiotique anticancéreux d'abord pour les chiens et les chats, puis un possible dépôt de brevet et une mise sur le marché. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative fiable à ce stade, les cultures cellulaires ne reproduisant pas les communications entre organes.
Objectifs
Le projet a comme objectif d’étudier des alternatives thérapeutiques contre le cancer pour les animaux de compagnie et basées sur une souche bactérienne particulière en les testant d’abord chez la souris. Aujourd’hui, le cancer chez les animaux de compagnie (principalement chiens et chats) est diagnostiqué plus précocement. Le cancer représente 27% de cause de mortalité chez eux, quel que soit l’âge, et la première cause de décès (avec près de 45%) chez les chiens de plus de 10 ans. Les propriétaires demandent souvent une qualité de soins proche de celle utilisée en santé humaine pour leurs animaux. Il existe donc une demande de plus en plus importante pour une prise en charge anticancéreuse et elle va probablement augmenter à l’avenir. Malheureusement, les traitements actuellement disponibles pour lutter contre le cancer chez le chien (curatif ou palliatif) demeurent insuffisants. Les thérapies par chimiothérapie présentent des limites telles que leurs coûts, les effets secondaires et la nécessité d’une hospitalisation de l’animal en clinique spécialisée. Le développement de nouvelles thérapies anticancéreuses plus accessibles et non invasives semble ainsi nécessaire. Actuellement, il y a un manque en produits alternatifs en cancérologie vétérinaire malgré la forte demande (insatisfaite) vis-à-vis de produits naturels. Des approches dites « non conventionnelles » telles que la phytothérapie, la mycothérapie, l’homéopathie, etc. représentent des stratégies alternatives et/ou complémentaires. Les probiotiques représentent une option intéressante pour traiter et prévenir le cancer chez le chien. En effet, des études récentes ont montré que la consommation de probiotiques peut avoir un rôle préventif et/ou protecteur dans le développement de différents types de cancer chez l'homme. En outre, une étude récente a signalé les potentiels effets bénéfiques de probiotiques sur certains symptômes gastro-intestinaux chez des chiens atteints de lymphome et soumis à une chimiothérapie. Cependant, à ce jour, aucune autorisation de mise sur le marché n'a encore été accordée à un probiotique pour la prévention ou le traitement du cancer chez le chien. Les perspectives à moyen terme seraient de développer un complément alimentaire et probiotique pour prévenir et traiter certaines formes de cancer chez le chien, et à plus long terme et si les résultats sont positifs, de proposer un tel complément chez l'homme.
Bénéfices attendus
Nous attendons de ce projet qu’il fasse progresser nos connaissances scientifiques sur les biothérapies à base de probiotiques contre le développement du cancer chez les animaux de compagnie et chez l’humain. En se basant sur nos résultats validés in vitro et en complément des essais in ovo (en cours chez l’embryon de poulet), ces expérimentations animales sur les différents modèles souris nous permettront de valider l’effet bénéfique d’une souche bactérienne particulière in vivo. S’ils sont positifs, nous envisageons par la suite un dépôt de brevet portant sur la caractérisation de l’effet anti-cancer de cette souche chez le chien. Actuellement, des discussions avec des partenaires privés sont aussi en cours et les expérimentations animales faisant l’objet de cette demande d’autorisation nous serviront à décider si une demande d’Autorisation de Mise sur le Marché est envisageable à l’avenir.
Procédures
Dans ce projet nous utiliserons des souris et deux modèles de maladies cancéreuses : un modèle de cancer sous cutané pour évaluer un effet bénéfique à distance de la souche bactérienne qui sera donnée par voie intra-nasale et un modèle de cancer colo-rectal où la bactérie sera donnée par voie orale. Pour le modèle d’induction de tumeur sous-cutanée / test d’un effet bénéfique à distance (systémique) : Chaque animal recevra sous anesthésie (anesthésie faite par injection dans l’abdomen sur animal vigile, environ 15 secondes de manipulation de l’animal) 3 administrations intra-nasale des produits à évaluer (10µl de liquide) espacées de 2 semaines et une administration sous-cutanée de cellules tumorales, qui génèreront une tumeur par la suite au site d’injection. Chaque animal sera placé quelques minutes toutes les deux semaines en pot transparent afin de récolter des déjections. Chaque animal sera pesé régulièrement (au moins une fois par semaine, environ 15 secondes de manipulation de l’animal). La taille des tumeurs sera mesurée pour chaque animal chaque semaine avec un pied à coulisse électronique (environ 30 secondes de manipulation de l’animal). En fin d’essai, un prélèvement sanguin sur animal vigile (environ 30 secondes de manipulation de l’animal) est effectué avant la mise à mort et la collecte d’organes. Pour le modèle d’induction de tumeurs colo-rectales / test d’un effet bénéfique local : Chaque animal recevra une administration orale par gavage quotidienne des produits à évaluer pendant toute la durée de l’expérimentation, soit un total de 58 administrations (animal vigile). Chacune de ces administrations est réalisée rapidement (environ 15 secondes de manipulation par animal). Chaque animal recevra une injection dans l’abdomen d’un agent cancerigène (animal vigile) une fois (environ 15 secondes de manipulation par animal). Chaque animal sera placé quelques minutes par jour en pot transparent afin de récolter des déjections. Chaque animal sera pesé quotidiennement (environ 15 secondes de manipulation par animal) et évalué sur un ensemble de paramètres d’état général par des observations. En fin d’essai, un prélèvement sanguin sur animal vigile (environ 30 secondes de manipulation de l’animal) est effectué avant la mise à mort et la collecte d’organes.
Impact sur les animaux
En ce qui concerne le modèle d’induction de tumeur sous-cutanée : Suite à l’injection des cellules tumorales, les souris développeront une tumeur localisée au site d’injection, non douloureuse. Dans certains cas, il peut y avoir formation d’une plaie susceptible de s’infecter. Le modèle d’induction de cancer colorectal déclenche dans un premier temps une inflammation intestinale qui entraine une perte de poids modérée pour une souris (10-15%) et une modification de la consistance des déjections pouvant aller jusqu’à une diarrhée accompagnée de saignements. Cette inflammation reviendra de manière cyclique et sera suivie de périodes de récupération qui permettent la disparition presque complète de ces symptômes. En fin de protocole, il y a apparition d’une ou plusieurs tumeur(s) de taille proche de 2mm3 au niveau du côlon.
Devenir
Le prélèvement des différents organes est incompatible avec la survie de l’animal
Remplacement
Nous avons effectué de nombreux essais in vitro et in ovo (dans des œufs de poule) avant d’envisager une confirmation dans deux modèles souris pour valider ces résultats et passer aux étapes suivantes de caractérisation du produit d’intérêt (une souche de bactérie probiotiques). A notre connaissance, il n’existe pas d’alternatives fiables à l’utilisation des animaux à ce stade. De telles expériences ne peuvent être réalisées sur des cultures cellulaires qui ne permettent pas de reconstituer les communications entre les différents organes. De plus, les paramètres inflammatoires et cancéreux tels que la modification de la consistance des fèces, la perte de poids, le développement des tumeurs coliques ou cutanées ne peuvent pour le moment être quantifiés que sur l’animal.
Réduction
Comme mentionné précédemment, les microorganismes à tester sont issus d’un programme de sélection in vitro au préalable. Ce programme est par ailleurs complété par des essais in vivo sur des embryons de poulet. A partir d’une collection contenant près d’une quinzaine de souches de microorganismes, ces essais ont permis d’identifier une souche de bactérie particulièrement intéressante. Nous avons donc retenu une approche permettant de limiter les tests in vivo à la meilleure candidate que nous avons pu identifier jusque là. Par ailleurs, nous utilisons toujours une approche statistique pour déterminer la taille de nos groupes en fonction de l’intensité des effets que nous souhaitons mettre en évidence et des données déjà disponibles. Nous effectuerons des tests statistiques adaptés pour évaluer les performances de la souche bactérienne en comparaison des groupes témoins.
Raffinement
Tout au long des procédures expérimentales, les animaux sont observés et pesés régulièrement : suivi hebdomadaire pour le modèle d’induction de tumeur sous-cutanée et suivi quotidien pour le modèle de cancer colo-rectal. De plus, pour le modèle de cancer colo-rectal, un score clinique quotidien est réalisé. Toutes ces mesures représentent une surveillance accrue nécessaire lors de ces phases expérimentales. Par ailleurs, les animaux sont hébergés à plusieurs (4 ou 5) afin de ne pas exposer ces animaux sociaux à un stress lié à l’isolement. Les quelques fois où les animaux sont séparés ne représentent qu’un temps très faible (5-10 minutes, environ une fois par semaine, pour les collectes de fécès des animaux de la procédure 1 et quotidiennement pour les animaux de la procédure 2). Des anesthésies sont prévues lors des phases qui pourraient être stressantes/douloureuses pour l’animal vigile (administrations intra-nasales ou injection sous-cutanées des cellules tumorales pour l’induction de la tumeur sous-cutanée). Nous veillons toujours à ce que les durées d’anesthésie soient limitées au minimum nécessaire (30-45 minutes environ). Nous incluons des enrichissements dans les cages : cellulose à dechiqueter et permettant la création de nids, bâtons à ronger et maisonnettes en carton (sans encre). Le matériel que nous utilisons (sonde de gavage) est adapté à nos animaux. Les sondes de gavages sont en plastique souple et fin (diamètre externe voisin du millimètre), à bords arrondis et de taille adaptée (4cm) pour empêcher les blessures et réduire l’inconfort. Enfin, des points limites sont définis afin de réduire au maximum la douleur ressentie par les animaux.
Choix des espèces
La souris est une espèce de référence en nutrition, toxicologie, cancérologie et immunologie; disciplines au carrefour desquelles la thématique du laboratoire nous positionne. La souris est un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies cancéreuses et inflammatoires humaines. Elle est également pertinente pour envisager une approche vétérinaire pour les animaux de compagnie. Les animaux sont utilisés à un âge de 8 semaines (adultes). Cet âge est régulièrement utilisé par d’autres laboratoires. Cet âge constitue donc un point d’ancrage pour les comparaisons avec les données disponibles dans la littérature.
Effet des enrichissements du milieu sur le bien-être et robustesse chez la truite arc en ciel
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
720 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pour valider des indicateurs de bien-être en pisciculture, une partie subit une réduction de moitié du volume d'eau une fois par semaine et 360 sont soumises à une infection provoquée pendant dix jours, avec des pesées sous anesthésie. Le porteur signale un stress aigu, des furoncles et une surmortalité liés à l'infection. Il indique tuer tous les poissons en fin de protocole faute de pouvoir relâcher des individus potentiellement infectés, et affirme que l'évaluation des enrichissements ne peut se faire que sur animaux vivants.
Objectifs
Le projet cherche à valider des indicateurs opérationnels du bien-être des truites en pisciculture. Nous étudierons dans quelles mesures un milieu enrichi physiquement (abris, plantes, ombrière) permet-il d’améliorer le bien-être et la robustesse des truites et de contrecarrer les effets de stress rencontrés en pisciculture. Les résultats seront transférés aux professionnels de la filière et aux structures d’enseignement agricole.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont d'apporter des éléments objectivés et mesurés (diminution du stress, meilleure prise de poids, comportements adaptés, résistance aux maladies) de l'effet de différents types d'enrichissements physiques dans le milieu d'élevage de la truite arc en ciel. Cela permettra de valider l'effet des enrichissements sur le bien-être et d'apporter des éléments de discussion pour déployer l'usage des enrichissements chez les poissons (en élevage, en expérimentation animal, en aquarium).
Procédures
Pesée sous anesthésie : 3 pesées (T0, T1 et T2) pour tous les animaux (T0 =720, T1 = 600 et T2 = 480 animaux). L'anesthésie et la pesée dure environ 7-8 minutes pour 1 animal. Réduction de moitié du volume d'eau dans le bac d’élevage : 45 animaux, 1 fois par semaine, soit 9 fois pendant 1 heure. Challenge infectieux : 360 animaux pendant 10 jours.
Impact sur les animaux
Pesée sous anesthésie, nuissances: stress de l'anesthésie. Réduction de moitié du volume d'élevage, nuissances : stress aigue. Challenge infectieux, nuissances: stress, furoncle surmortalité
Devenir
L'euthanasie des poissons est prévu en fin de protocole, pour des raisons notamment sanitaire (impossibilité de relacher ou de réutiliser des poissons potentiellement infectés par A. salmonicida)
Remplacement
L'objectif du projet CASDAR AQUA BEA étant d'évaluer l'efficacité d'enrichissements sur le bien être et la robustesse des animaux, cela ne peut se faire que sur animaux vivants.
Réduction
Pour vérifier la répétabilité de notre protocole et éviter l'effet bac, chaque condition sera réalisée en triplicat (3 bacs). Pour le calcul du nombre de poissons nécessaires à notre étude, nous avons utilisé le site internet https://biostatgv.sentiweb.fr/et les données obtenues sur la mesure du cortisol dans les écailles et le plasma dans des projets précédents et dans la littérature. Le test de comparaison de deux moyennes observées avec un risque alpha de 0.05, une puissance à 0,8 et un test unilatéral, un nombre de 13 poissons par lot est préconisé. Pour prendre en compte notre étude en triplicat, le nombre d'animaux prélévés par lot est amené à 15 (3 x 5). Pour l'évaluation de la robustesse des animaux suite au challenge infectieux, en utilisant le site internet https://biostatgv.sentiweb.fr/, le test de comparaison de 2 proportions observés (pourcentage de mortalité dans le lot non enrichi et stressé estimé a 50%, pourcentage de mortalité dans le lot enrichi P2 estimé a 30% - 40 %), avec un risque alpha de 0.05, une puissance à 0,8 et un test unilatéral, un nombre de 36-37 poissons par lot est préconisé. Le nombre d'animaux restant si aucune mortalité avant challenge est de 45 poissons par lot et répond donc au nombre d'animaux préconisé.
Raffinement
Les animaux seront observés 2 fois par jour durant toute le durée du protocole (12 semaines). Les points limites sont d'une part les paramètres d'ambiance de l'élevage (température, oxygène). Si les paramètres critiques sont atteints (température > 20°C, oxygène 1 cm² lors du challenge seront retirés de l'expérimentation et euthanasiés par surdosage d'anesthésique.
Choix des espèces
La truite arc en Ciel est l'espèce de poisson la plus élevée en france, il est donc important de travailler sur cette espèce pour améliorer le bien être animal Les truites utilisées pèseront environ 150g au début pour aller jusqu'a 250g environ. Cela représente une partie de l'élevage de truite pour aller jusqu'au stade dit portion commercialisable (250g). Ce poids permet d'observer facilement les animaux pour remplir les grilles de bien être et de comportements. Des enrichissements adaptés à ces stages seront également adaptés pour des poissons plus gros.
Evaluation des conséquences de la surexpression de CYP04X dans le métabolisme striatal et sanguin dans deux modèles murins de la maladie d’Huntington.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
308 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Modèles de la maladie de Huntington, elles développent des troubles moteurs et subissent une chirurgie d'injection dans le cerveau de soixante-dix minutes, avant leur mise à mort pour analyser sang et tissus. Le porteur décrit des mouvements involontaires, des tremblements, des crises d'épilepsie et des vocalisations inhabituelles liés au phénotype. Il affirme que seuls les modèles murins reproduisent assez fidèlement la maladie et que ces étapes sont exigées par l'agence du médicament avant tout essai clinique.
Objectifs
Le but principal de cette étude est d’investiguer les conséquences générales, de la surexpression du gène thérapeutique dans la région cible du cerveau (striatum), sur le métabolisme cellulaire des souris de deux modèles pour la maladie d'Huntington (MH). Pour répondre à cette question, différentes molécules du métabolisme présentes dans les tissus et dans le sang seront analysées par chromatographie. L’objectif final est de poursuivre toutes les étapes précliniques permettant de proposer cette approche thérapeutique chez les patients à un stade précoce de la maladie d'Huntington. En effet, l’objectif est d’évaluer si la diminution de Huntingtine mutée (agent causal de la maladie d'Huntington), présente dans le striatum des modèles de souris de la MH (maladie d'Huntington), est corrélée à une diminution de la concentration de Huntingtine mutée soluble dans le sang (plasma) ainsi que d’autres biomarqueurs liés à la progression de la maladie/efficacité du traitement. Les prélèvements de sang et de tissus seront effectués suite à la constatation de la mort de l’animal.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de comparer dans deux modèles de souris de la maladie d’Huntington la concentration de biomarqueurs (métabolites) dont le profil est modifié à la suite de l’injection d’un virus adeno-associés exprimant le gène thérapeutique. Le métabolite ou les métabolites qui seront identifiés par spectrometrie pourront être utilisés comme marqueur d’efficacité de ce traitement dans le cadre d’un futur essai clinique.
Procédures
Les animaux développent un phénotype dommageable avec troubles moteurs. Une chirurgie avec injection d'une substance dans le cerveau sous anesthésie générale et sous analgésie (Durée 70 minutes). Une euthanasie sera réalisée par une méthode réglementaire d'une durée de 3 minutes. Il s’agit d’une procédure sous analgésie.
Impact sur les animaux
Pour minorer toutes douleurs post-chirurgie suite à la mise en barre d’oreille, une crème antalgique est appliqué au niveau des oreilles en préventif. Une perte de poids due à la chirurgie pourrait être observée (5 à 10% du poids de référence de l’animal). Un risque d’arrêt/détresse respiratoire, hypothermie ou bien un risque infectieux lié à la chirurgie pourrait être observé. Des effets neurologiques liés au phénotype dommageable sont attendus chez ses animaux tels que : les mouvements choréiformes, les mouvements stéréotypés involontaires, les tremblements et les crises d'épilepsie, ainsi que les composantes des troubles non liés aux mouvements, y compris les vocalisations inhabituelles.
Devenir
Les animaux intégrés dans la procédure d’injection de virus adéno-associés seront euthanasiés pour l’étude des différents métabolites dans le plasma et les tissus. Les prélèvements de sang et de tissus seront effectués suite à la constatation de la mort de l’animal.
Remplacement
A ce jour, seuls les modèles murins de la maladie d’Huntington permettent de mimer suffisamment fidèlement la pathologie et donc d'être utilisés dans des études d'efficacité de nouveaux traitements. Toutes les études in vitro possibles ont été effectuées en amont de ce projet. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de l’approche thérapeutique chez l’Homme, nécessite une preuve de concept chez les rongeurs (souris modèle). Ces étapes sont requises par l'agence nationale de Sécurité du medicaments et des produits de santé (l’ANSM) pour toute demande d’autorisation d’étude clinique.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques. Leur nombre (308) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives. En effet, des travaux précédents ont permis d’établir les doses de vecteur à injecter et les temps d'analyses. Afin de limiter le nombre total d’animaux essentiels au projet, et les analyses histologiques, biochimiques et moléculaires post-mortem seront dans la mesure du possible réalisés sur les mêmes animaux. Le design expérimental a pour but d’obtenir un maximum d’informations en utilisant un minimum d’animaux. Les différents paramètres (biochimiques, histologiques, etc) seront analysés grâce à des essais appropriés en fonction des contraintes expérimentales. De plus, un plan statistique complet a été rédigé et validé. Des résultats préliminaires nous ont également permis d’estimer, la puissance statistique de nos analyses et l’échantillonnage nécessaire pour caractériser les effets biologiques souhaités.
Raffinement
Afin de réduire la douleur lors de la mise en barre d’oreille nous enduisons préalablement les oreilles de l’animal de crème analgésique. Le geste réalisé pour la craniotomie est maitrisé au sein de l’équipe et les risques de saignement n’apparaissent que rarement. Pour limiter le risque de traumatisme mécanique local, relativement faible lié à l’injection, nous utilisons des aiguilles fines acquises avec l’expérience de nos études précédentes). Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance. 6h après l’acte chirurgical, une première injection d’analgésique est réalisée pour éviter tout inconfort de l’animal. 24h après une fiche de scoring est remplie pour tout animal et une deuxième est réalisée. Entre 4h et 5h après cette injection les animaux seront observés par l’expérimentateur pour examiner les animaux et vérifier qu’aucun signe de douleur est détecté. Si besoin, une injection d’analgésique est réalisée pour éviter tout inconfort de l’animal. La prophylaxie de la douleur sera donc adaptée à l’examen clinique de l’animal. Le protocole d’analgésie post opératoire a été décidé avec l’accord du vétérinaire. L’expérimentateur surveille la respiration de la souris et adapte si besoin l’analgésie et le dosage de l’anesthésique. Les animaux reçoivent un traitement analgésique approprié selon le geste chirurgical. L’application de critères d’arrêts en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe certifient le bien-être des animaux. Le suivi est renforcé au cours des 48h suivant la chirurgie puis celle-ci est ensuite allégé à 1 fois par semaine sauf à l’approche de points limites. De plus, le suivi du poids et les tests comportementaux étant réalisé de façon hebdomadaire (période de repos d’un jour entre chaque test, favorise un suivi renforcé). Les animaux seront hébergés en groupe et un igloo sera ajouté dans chaque cage stabulée en portoir ventilé.
Choix des espèces
Afin de tester différentes approches thérapeutiques pour traiter les différentes maladies neurodégénératives, il est nécessaire de disposer d'animaux modèles. A ce jour, seules les souris transgéniques pour la MH permettent de mimer assez fidèlement la pathologie et donc d'être utilisées dans des études d'efficacité de nouvelles cibles thérapeutiques. De plus, ces deux modèles présentent des différences pertinentes par rapport aux souris saines et l’une par rapport à l’autre (rapidité d’évolution de la pathologie). Cette étude nous permettra de comparer dans deux modèles de souris de la maladie d’Huntington les modification du profil métabolique suite de l’injection d’un virus adénoassociés exprimant le gène thérapeutique. Nous réaliserons les injections stéréotaxiques à un âge adulte, 4 semaines ou 2 mois en fonction du modèle c'est à dire avant l'apparition des symptômes afin de maximiser les effets bénéfiques du traitement.
Evaluation de la sécurité et de l’efficacité de différents matériaux d’embolisation sur un modèle porcin d’inflammation tendineuse.
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
60 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation du tendon du genou leur est provoquée par injection de collagénase, un produit irritant, puis ils subissent des angiographies et une embolisation, et juste avant leur mise à mort des embolisations supplémentaires sont pratiquées sur d'autres organes comme les reins, la prostate ou l'utérus. Le porteur indique que le modèle est "maîtrisé" et qu'aucune nuisance supplémentaire n'est attendue, et signale que le projet sert aussi à former des internes en radiologie interventionnelle. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative reproduisant des conditions proches des cas cliniques.
Objectifs
Les inflammations chroniques des tendons et des articulations sont fréquentes et difficiles à soigner. C'est un problème de santé publique avec un coût médico-économique important et des arrêts de travail prolongés (douleur épaule, coude, poigner, genou) et arrêt de sport. Dans cette pathologie, des nouvelles artères (néovaisseaux) se forment et entretiennent cette inflammation. Une équipe de chercheurs rapporte que le fait de boucher ces néovaisseaux, c'est à dire de réaliser une embolisation, permet d'améliorer les patients souffrant de ces maladies chroniques. L’agent utilisé pour boucher les vaisseaux est un antibiotique, et n’a pas l’autorisation en France pour être utilisé dans les artères. Cette approche doit être validée sur un modèle animal avant de pouvoir faire des tests chez l'Homme notamment pour prouver qu'il n'existe pas de risque à priver de sang les tendons ou les articulations inflammatoires et d’étudier les différents agents d’embolisation possibles. Dans une étude précédente, notre équipe a mis au point un modèle porcin reproductible d’inflammation du tendon du genou qui associe une inflammation du tendon et le développement de vaisseaux pathologiques. Il a été utilisé pour tester l'embolisation avec des microbilles définitives, montrant l’absence de complication sévère chez l’animal. Cependant l’embolisation avec ces petites billes semble avoir des résultats nettement moins bons sur la douleur que les publications utilisant l’antibiotique comme agent d’embolisation. Dès lors, il est nécessaire d’étudier l'efficacité de cet antibiotique sur notre modèle animal, ainsi que celle de nouveau agents d’embolisation pour orienter la prise en charge future de ces patients. L’objectif de ce projet est donc de proposer notre modèle validé, reproductible et maîtrisé par les radiologues interventionnels, à différentes équipes pour tester la sécurité et l'efficacité de leurs matériaux d'embolisation.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes d’action de l’embolisation dans la pathologie tendineuse. Ceci permettra de mieux comprendre les douleurs des patients et ainsi de leur apporter un nouveau traitement antalgique qui permettra de limiter le recours aux médicaments, soins de kinésithérapie, d’accélérer la reprise du travail et la reprise du sport. De plus, ce projet contribuera également à la formation d'internes en radiologie interventionnelle à la réalisation de gestes techniques.
Procédures
Les animaux seront impliqués dans une seule procédure opératoire qui se déroulera en plusieurs étapes : le 1er jour, induction d'une inflammation au niveau du tendon du genou du porc par injection intra-tendineuse d'une produit irritant (collagénase) sous échographie (30 min maximum). Après une semaine, réalisation d'une angiographie (examen d'imagerie d'environ 1 heure) afin de valider la présence de néovaisseaux et embolisation le cas échéant. Après deux semaines, réalisation d'une angiographie pour vérifier la réussite de l’embolisation. Juste avant la mise à mort, d'autres procédures d'embolisations pourront être réalisées sur d'autres organes (reins, prostate, utérus...) avec différents agents embolisants. L'objectif sera d'évaluer la faisabilité en vue de futurs protocoles de recherche sans avoir à utiliser de nouveaux animaux. Ce sont des méthodes mini-invasives non chirurgicales, possibles par l'accès à la carotide qui sera déjà utilisé au cours de la procédure expérimentale, et qui permet d'amener le cathéter jusqu'aux artères alimentant les différents organes (artère rénale, prostatique...). Ainsi aucune autre technique ne sera utilisée pour réaliser ces gestes supplémentaires. L'ensemble de cette dernière phase n'excèdera pas 2 heures.
Impact sur les animaux
L’étude précédente ayant permis la validation de la dose de collagénase n’a montré aucun signe d’apparition d’inconfort ou de douleur, ni de changement de comportement chez les animaux. Ainsi, le modèle étant désormais maîtrisé, aucune nuisance supplémentaire n'est attendue. Concernant les effets indésirables, devant le risque ischémique lié à l’utilisation des agents embolisants testés, il conviendra de s'assurer de l'absence de complication locale visible au niveau des cuisses de l’animal.
Devenir
Tous les animaux seront seront mis à mort en fin de procédure afin d'effectuer le prélèvement des tendons.
Remplacement
Il s’agit d’une étude ayant pour objectif de vérifier l'efficacité et la précision d'une technique interventionnelle. Il n’existe pas de méthode alternative permettant d’atteindre cet objectif dans des conditions le plus proches possibles des cas cliniques.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit en veillant toutefois de travailler sur un nombre suffisant pour obtenir une différence significative entre les groupes en cas de comparaison, ou un groupe suffisamment important pour valider un groupe pilote sur un nouvel agent. Dans un souci de Réduction du nombre d’animaux utilisés, nous souhaitons profiter de l’anesthésie générale finale, après l’artériographie et donc juste avant l’euthanasie de l’animal, pour réaliser ces gestes, similaires à ceux réalisés sur les genoux, sur d’autres organes. Cela permettra de valider leur faisabilité technique soit en prévision de projets futurs, soit pour répondre à des questions ponctuelles, sans engendrer de souffrance supplémentaire pour les animaux déjà anesthésiés profondément et mis à mort juste après, et sans nécessité d’écrire un nouveau protocole impliquant un nombre supplémentaire d’individus. Enfin, cette démarche contribuera également à la formation d'internes en radiologie interventionnelle à la réalisation de ces gestes techniques. Aucun étude statistique ne sera prévu sur ces expérimentation (étude de faisabilité).
Raffinement
Nous attacherons une importance majeure au raffinement des conditions d’hébergement et d'enrichissement pendant la période d'acclimatation d'une semaine et tout au long de la procédure. Afin de limiter leur stress, les animaux seront hébergés en groupe. L'enrichissement est réalisé en créant une zone de repos couverte de litière, leur permettant de s'allonger tous ensemble et de répondre à leur comportement de fouissement. Ils disposent également de jouets suspendus à mordiller. Ce modèle ayant été mis au point dans les mêmes conditions, toutes les techniques expérimentales ont été optimisées. Pour la phase d'injection dans le tendon, une anesthésie légère. Les gestes interventionnels (angiographie) seront toujours réalisés sous anesthésie générale afin de prévenir la souffrance et l’angoisse de l’animal, de même que la mise à mort. Lors des quelques gestes possiblement douloureux, un morphinique. La mise en place des cathéters sera réalisée sous échographie, évitant l'ouverture cutanée à l'exception de la ponction à l'aiguille.
Choix des espèces
De manière générale, le porc est un bon modèle d'étude proche de la physiologie humaine, notamment au niveau de la vascularisation, ce qui permet de se former sur l'animal avant l'usage chez l'Homme. Nous profiterons également de la mise en place de ce projet pour réaliser des formations aux radiologues interventionnels sur cette nouvelle technique d’embolisation. Les animaux sont choisis au terme du post-sevrage à l'âge de 2-3 mois, pour des raisons techniques d'une part (poids entre 25 et 35 kg, permettant des groupes homogènes) et pour des raisons de coût d'autre part.
Étude de l’implication de la protéine Pax6 dans l’inflammation du système nerveux à l’aide d’un modèle de souris de sclérose en plaques
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections pour supprimer la protéine Pax6, puis on leur induit une encéphalomyélite proche de la sclérose en plaques, jusqu'à une paralysie des pattes arrière qui déclenche leur mise à mort. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de démontrer le rôle de Pax6 dans un modèle animal et que les données ne peuvent être obtenues autrement. Il attend que la suppression de Pax6 aggrave la maladie et en avance l'apparition.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier l’implication de la protéine Pax6 dans l’inflammation du système nerveux à l’aide d’un modèle de souris de sclérose en plaques. La protéine Pax6 est essentielle à la formation du cerveau embryonnaire. Nos données récentes non publiées indiquent que cette protéine est importante pour contrôler l’inflammation du système nerveux, ce qui laisse penser que sa régulation puisse aider à traiter certaines maladies neurodégénératrices. La sclérose en plaques (SEP) est une maladie chronique inflammatoire du système nerveux central ou la gaine protectrice des neurones est détruite par des cellules immunitaires. Cela conduit à la dégradation des neurones et la perte de communication entre le cerveau et les organes périphériques. Les cellules immunitaires du cerveau qui participent à la réparation de la gaine protectrice, sont défectives chez les patients atteints de SEP. Toutes les données originales que nous venons d'accumuler des expériences réalisées sur des cellules suggèrent que la protéine Pax6 est présente dans ces cellules immunitaires du cerveau et a un rôle essentiel dans la régulation de l’inflammation dans ces cellules. Afin de confirmer ce lien, il est indispensable de le démontrer dans un modèle animal. Pour la première fois, nous testerons des souris qui présentent une inflammation sévère de type sclérose en plaques en présence ou non de la protéine Pax6.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de comprendre le rôle de la protéine Pax6 dans la régulation de l’inflammation du système nerveux. Elle ouvrira de plus des perspectives concernant toutes les pathologies neuroinflammatoires, de type Alzheimer, Parkinson, la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) et autres. Les données que nous obtiendrons permettront d'identifier de nouveaux outils pronostics et peut-être thérapeutiques pour ces maladies du système nerveux.
Procédures
- Les souris recevront une injection dans le ventre pendant 4 jours consécutifs d’un produit qui permet de supprimer la protéine Pax6 dans les souris qui ont une modification génétique spécifique pour ceci. Cette injection dure moins de 2 minutes. - Les souris recevront au moins 8 jours plus tard, deux injections en dessous de la peau et dans le ventre d’une combinaison des substances qui produisent le modèle de sclérose en plaques chez l'animal (EAE). Ce traitement consiste à injecter deux produits qui induisent une inflammation du système nerveux. Cette intervention dure moins de 15 minutes sur des souris anesthésiées pour ne pas induire du stress chez la souris. Toutes les souris seront quotidiennement observées pour le niveau de gravité de la pathologie et ceux qui présentent une dégradation importante de leur état (perte de poids importante ou réaction violente ou très faible) ou souffrent de paralysie complète des pattes arrière et partielle des pates avant seront immédiatement sacrifiées et analysées. Les autres seront sacrifiées au bout de 30 jours pour analyse.
Impact sur les animaux
Les souris permettant d’obtenir les souris étudiées après injection du produit, vivent normalement. Il a été démontré que ces souris continuent à vivre normalement après l’injection avec le produit et ne présentent aucune souffrance. Cependant, l’injection du produit pendant 4 jours consécutifs peut être une source de stress pour les animaux. Par la suite, l'induction de la maladie peut entraîner des souffrances aux animaux si la paralysie complète des pattes arrières et partielle des pattes avant est atteinte. Dans ce cas, les souris seront immédiatement euthanasiées et analysées. Enfin, nous nous attendons que la suppression de Pax6 après injection du produit dans les souris, va probablement induire la maladie plus tôt avec des symptômes plus forts.
Devenir
Les 120 souris étudiées (souris d’intérêts et souris contrôle) seront euthanasiées à la fin de l’étude, sauf celles qui présentent une dégradation importante de leur état (perte de poids importante ou réaction violente ou très faible) ou souffrent de paralysie complète des pattes arrière et partielle des pattes avant qui seront immédiatement euthanasiées et analysées. Toutes les souris seront euthanasiées. Des études post-mortem seront réalisées sur les cellules immunitaires prélevées à partir de cerveaux de ces souris.
Remplacement
Toutes nos données réalisées dans des cellules montrent clairement, et pour la première fois, que la protéine Pax6 est exprimé par les cellules immunitaires du cerveau. Pax6 est connue comme essentielle au développement normal du cerveau et nos travaux récents démontrent qu'il régule aussi la réponse inflammatoire du cerveau. Nous utilisons une lignée de souris qui permet de supprimer la protéine Pax6 chez l'adulte car sa suppression au cours du développement de l'embryon est létale. Par ailleurs, le modèle de sclérose en plaques que nous utilisons chez la souris est simple expérimentalement. Il permet de mimer au mieux la sclérose en plaques chez l’homme, une des maladies sévères du système nerveux qui est liée à une inflammation des cellules immunitaires du cerveau. Les connaissances issues de cette étude sur l’animal ne peuvent pas être actuellement obtenues par d’autres méthodes compte-tenu de la complexité physiologique du développement de l’inflammation du système nerveux. La suppression de la protéine Pax6 ne peut être fait que chez l'animal et la complexité du cerveau et des interactions entre les nombreux types cellulaires impliqués (neurones, cellules immunitaires) ne peut être reproduit par des cultures en trois dimensions à partir des cellules souches.
Réduction
Nous utilisons l'effectif minimal qui permet d'avoir une puissance statistique pour tester nos hypothèses. D'après la littérature du domaine, le nombre d’animaux pour le modèle de sclérose en plaques que nous proposons est normalement fixé à 10 par groupe de témoins et d’animaux d’intérêt avec au moins 2 expériences reproductibles. Cependant, compte tenu de la variabilité de l’efficacité de la suppression de la protéine Pax6 par le produit injecté, nous avons besoin d'augmenter sensiblement le nombre de souris traitées pour obtenir suffisamment de souris à comparer en présence et absence de Pax6. Donc, nous allons utiliser 10 souris par groupe pour 4 expériences indépendantes. Si dans la première expérience, l’efficacité du produit injecté et le développement de la maladie présentent peu de variabilité, nous pourrons réduire le nombre d’expériences. De plus, pour réduire le nombre total de croisement et donc de souris, nous utiliserons aussi bien des femelles que des mâles, le modèle de sclérose en plaques ne montrant pas de différence dans le développement de la maladie due au genre.
Raffinement
Les méthodes et les mesures choisies visent à diminuer au maximum les contraintes imposées aux animaux. Les souris sont placées dans des portoirs ventilés, 5 individus par cage. La température, l'hygrométrie, la nourriture et l'eau sont contrôlées tous les jours. En plus de la litière, les cages sont enrichies avec 1 bâtonnet en bois, des cotons et du kraft. Avant les injections sous la peau, les souris seront anesthésiées, pour éviter l’induction de stress. Des points limites suffisamment précoces et prédictives ont été définis pour éviter toute douleur, souffrance et angoisse infligée aux animaux. Ces points limites concernent l’apparence, le poids, le comportement et les signes cliniques de chaque animal. D’ailleurs nous avons choisi une dose des substances injectées pour induire la maladie, qui permet un bon développement des symptômes sans induction de douleur et sans perte significatif de poids. A partir du moment où les souris présentent une queue molle et faiblesse des pattes postérieures après l’induction de la maladie, nous veillerons à disposer de la nourriture dans la cage sous forme d’hydrogel (gel rempli d'eau). Cela permettra aux souris de continuer de s’hydrater et s’alimenter sans difficulté. Dans des cas rares des petits ulcères formés sur les sites d’injection, ceux-là seront traités avec une pommade cicatrisante après désinfection. Le suivi quotidien de l'état des souris permettra de réagir immédiatement en cas de souffrance par leur mise à mort dès la détection d’une dégradation importante de leur état (perte de poids importante ou réaction violente ou très faible) ou de paralysie complète des pattes arrière et partielle des pates avant. Ces points limites seront surveillés 1 fois par jour (état général et pesée). Enfin, nous nous attendons à ce que la suppression de Pax6, qui est un facteur anti-inflammatoire, va probablement induire la maladie plus tôt avec des symptômes plus forts. Si notre hypothèse est correcte, nous allons raccourcir la durée de l’expérience.
Choix des espèces
Nous travaillons sur la souris car c’est le meilleur modèle pour réaliser des animaux avec des mutations génétiques et comparer les phénotypes de ces animaux avec les pathologies humaines. Les souris avec des mutations génétiques sont largement utilisées dans l'étude des mécanismes physiopathologiques des différentes maladies. L’objectif du projet est d’étudier le développement de l’inflammation du système nerveux en présence ou absence de la protéine Pax6 grâce à un modèle de sclérose en plaques chez la souris. Toutes nos données obtenues dans des expériences réalisées sur des cellules démontrent que la protéine Pax6 est présente dans les cellules immunitaires du cerveau. Cette protéine a un rôle essentiel dans la régulation de l’inflammation dans ces cellules. Afin de confirmer ce lien, il est indispensable de le démontrer dans un modèle animal. Nous utilisons une lignée de souris qui permet de supprimer la protéine Pax6 chez l'adulte, alors que sa suppression à la naissance est létale (développement précoce anormal du cerveau). Par ailleurs, le modèle de sclérose en plaques chez la souris est simple expérimentalement. Il permet de mimer au mieux la sclérose en plaques chez l’homme, une des maladies sévères du système nerveux qui est liée à une inflammation des cellules immunitaires du cerveau. Toutes les souris seront adultes, âgées de 6-8 semaines pour le traitement avec le produit. L’efficacité de la suppression de la protéine Pax6 induite par le produit aura atteint son maximum 8 jours après la dernière injection, donc les souris auront de 7 à 12 semaines au moment d'induire la maladie.
Manipulation des enzymes de synthèse de la dopamine en conditions inflammatoires et dimensions motivationnelles
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont maintenues à 90 % de leur poids pendant environ huit semaines, subissent une chirurgie stéréotaxique de quatre-vingt-dix minutes, un régime hypercalorique de treize semaines puis une injection de lipopolysaccharide, pour étudier le lien entre inflammation, dopamine et "fatigue". Le porteur indique que le lipopolysaccharide provoque un comportement de maladie avec fièvre et perte d'appétit pendant une douzaine d'heures. Il affirme que ces dimensions comportementales ne sont pas modélisables in vitro ou in silico.
Objectifs
De nombreuses études cliniques montrent que l'inflammation peut conduire au développement de symptômes dépressifs, en particulier la "fatigue". Ce projet vise à déterminer si et comment la manipulation d'enzymes de la voie de synthèse de la dopamine sélectivement au sein de la voie mésocorticolimbique est suffisant pour restaurer les troubles motivationnels induits par un état inflammatoire.
Bénéfices attendus
Ces études permettront de comprendre comment l'inflammation perturbe la transmission dopaminergique, et si manipuler la voie de synthèse de la dopamine mésocorticolimbique pourrait permettre de réverser les troubles motivationnels induits par l'inflammation.
Procédures
Les procédures de conditionnement opérant nécessitent une déprivation alimentaire légère (maintien à 90% du poids ad libitum) durant environ 8 semaines - 1 chirurgie stéréotaxique d'environ 90 minutes- Exposition chronique à des régimes hypercaloriques pendant environ 13 semaines- Administration aigue de lipopolysaccharide (quelques secondes).
Impact sur les animaux
Une déprivation alimentaire légère (maintien à 90% du poids ad libitum) a des effets très limités pour l'animal. Les chirurgies stéréotaxiques présentent un degré de sévérité modéré durant la période entourant l'opération. L'exposition chronique à des régimes hypercaloriques conduit au développement d'une obésité. L'administration aigue de lipopolysaccharide induit un comportement dit "de maladie" (fièvre, perte d'apétit, etc..) pendant une douzaine d'heure.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour procéder à des analyses histologiques.
Remplacement
Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions comportementales, non modélisables sur des modèles in vitro ou in silico.
Réduction
Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. En particulier, nous utiliserons une stratégie de croisements génétiques qui permettra l'utilisation de tous les animaux de la descendance et comparerons les mâles et les femelles. Du fait de cette stratégie, tous les animaux (génotypes et sexes) issus de nos croisements seront utilisés. Le nombre d'animaux nécessaires est basé sur des expériences précédemment effectuées au laboratoire permettant de révéler des différences statistiques entre groupes.
Raffinement
Tous les efforts seront faits pour réduire la souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés en cages collectives et environnement enrichi (igloo, bâtons à ronger et lanières de papier). Du fait de la déprivation alimentaire durant les expériences de conditionnement opérant, les animaux seront observés et pesés tous les jours de la semaine. Concernant la chirurgie stéréotaxique, des analgésiques et anesthésiques seront administrés. Les animaux seront observés jusqu'au réveil puis 2 fois par jour pendant 3 jours. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille basée sur des scores de 0 à 3 et seront consignés sur une fiche de scorage: - Perte de poids anormale (15% score 1, 15-20% score 2) - Comportements anormaux (poil hérissé, prostration,...) score 3 - Signes neurologiques score 2 Si un score entre 9 et 12 persiste pendant plus de 48h les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale suivie de décapitation. Dans tous les cas, si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées et les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l'animal ne montre pas d'amélioration significative il sera mis à mort dans les 48h.
Choix des espèces
Ce projet nécessite l'utilisation de modèles transgéniques disponibles uniquement dans des modèles souris. Les animaux expérimentaux seront utilisés à l'âge adulte (>8 semaines) puisque le projet vise à évaluer les conséquences fonctionnelles des manipulations de la synthèse de dopamine sur le cerveau mature.
Étude de la qualité de la semence congelée de coqs selon 2 cryoprotecteurs
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
60 volailles vont être utilisées, maintenues en cages individuelles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis remises en élevage si le responsable du bien-être animal le valide. Les mâles subissent des prélèvements de semence par massage dorso-lombaire trois fois par semaine et les femelles sont inséminées artificiellement, pour comparer deux cryoprotecteurs de la semence. Le porteur décrit ces gestes comme des "pratiques d'élevage courantes" et justifie l'isolement en cage par les comportements agressifs des mâles. Il affirme qu'aucun test in vitro ne peut remplacer l'évaluation in vivo de la fertilité.
Objectifs
L’objectif de cette expérimentation est de définir quel serait le meilleur cryoprotecteur non toxique pour les spermatozoïdes de coqs entre le diméthylacétamide (DMA) et le diméthylformamide(DMF).Nous allons cryoconserver de la semence aviaire avec les deux cryoprotecteurs et réaliser des analyses in vitro de qualité de la semence avant et après congélation afin de déterminer quel cryoprotecteur est le moins délétère pour la semence.
Bénéfices attendus
Suite à ce projet nous serons capables d’affirmer quel cryoprotecteur parmi le DMF et le DMA est le meilleur cryoprotecteur à utiliser pour cryopréserver de la semence de Gallus gallus. Suite à ce projet, nous pourrons optimiser le protocole de manière à obtenir un taux de fertilité maximal après cryopréservation de la semence avec l’un de ces cryoprotecteur. L’avantage de cette technique est qu’il ne sera pas nécessaire de rétirer le cryoprotecteur à la décongélation avant de réaliser les inséminations à l’inverse du protocole actuel qui utilise le glycérol comme cryoprotecteur. Le glycérol étant un spermicide il est nécessaire de le rétirer à la décongélation ce qui complique l’utilisation de la semence cryopréservée aviaire.
Procédures
Mise en cages individuelles Les prélèvements de semence auront lieu 3 fois par semaines espacés de 48h par du personnel qualifié. La méthode de collecte se fera par la technique de massage dorso lombaire décrite par Burrow et Quin, ce prélèvement dure entre 20 et 40 secondes. 3 inséminations artificielles seront réalisées espacées de 48h, ce geste d'élevage duren environ 5 secondes.
Impact sur les animaux
Des pratiques d’élevage courantes seront mises en œuvre, collecte de semence, inséminations artificielles. Les animaux devront être placés en cage individuelle pour éviter les comportements agressifs des mâles et pour suivre la ponte et la fertilité des femelles.
Devenir
Les animaux seront remis en élevage, si le responsable du bien-être animal valide cette possibilitée.
Remplacement
Etant donné que nous souhaitons étudier l’effet de la cryopreservation sur le potentiel de fertilité de la semence aviaire aucun test in vitro ne pourra remplacer les étapes in vivo (test de fertilité).
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au minimum informatif et est basé sur les publications récentes sur le sujet. Etant donné le taux de ponte des femelles utilisées pour cette expérimentation, le nombre de 30 femelles est le minimum pour pouvoir tirer des conclusions sur l’effet des cryoprotecteurs sur le potentiel de la semence congelée-décongelée. Le nombre de mâles est défini à 30 pour avoir suffisament de matériel biologique (semence, 1 ml par éjaculat pour tester les différentes conditions de cryiopréservation et réaliser les tests de fertilité dans le temps imparti (8 semaines). Nous allons calculer des pourcentages de fertilités et comparer les 2 conditions. Nous allons comparer les pourcentages de fertilités entre les différentes conditions. Les variables suivies seront la fertilité des poules. Les données de fertilité seront analysées afin d'évaluer l'influence des conditions suivantes : DMF vs DMA. Nous comparerons les résultats obtenus avec ceux de la littérature pour savoir si les moyennes de fertilités de notre expérimentation sont proches des résultats préalablement obtenus.
Raffinement
Les poules et les coqs hébergés en cages individuelles de 0.75 m² pendant 8 semaines au maximum bénéficient d'un milieu enrichi par un jouet à picorer ainsi qu'un perchoir, et de la proximité avec leurs congénères permettant des échanges visuels, olfactifs et auditifs.
Choix des espèces
Travaillant avec les sélectionneurs avicoles, mon modèle d’étude est la poule. Cette étude est mise en place suite aux sollicitations des sélectionneurs pour mettre au point une méthode d’utilisation de la semence cryopréservée simplifiée. Le stade de développement correspond à l’âge des animaux utilisés pour renouveler les cheptels des lignées parentales des sélectionneurs avicoles.