Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Evaluation des caractères observables de nouvelles lignées de souris génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
425 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 210 d'entre elles et modéré pour 215. Le porteur indique qu'elles ne subissent aucune intervention et sont seulement observées de la naissance à l'âge adulte, la souffrance venant du phénotype dommageable que certaines lignées génétiquement modifiées portent dès la naissance. Les 210 souris sans comportement anormal seront réutilisées dans d'autres projets, les autres seront tuées. Le porteur affirme que ces modèles sont "indispensables" et que la création de lignées est la "seule" voie pour étudier un "organisme entier".
Objectifs
Le phénotype est l'ensemble des caractères observables des souris. En modifiant génétiquement les souris nous cherchons à étudier une maladie ou un phénomène biologique important ou responsable d'une maladie. Mais cela peut provoquer d'autres dommages à l'animal, donc créer un phénotype dommageable que l'animal subira dès sa naissance, mimant ainsi la pathologie humaine. Le but de ce projet est de s'assurer qu'il n'y a pas phénotype dommageable, ou de l'évaluer s'il y en a un, afin de comprendre la maladie. L'objectif est de produire des nouvelles lignées de souris génétiquement modifiées par croisement avec des lignées déjà existantes ou sur un fond génétique particulier pour répondre à de nouvelles questions scientifiques en lien avec les thématiques de recherche de l’Institut sur des maladies humaines.
Bénéfices attendus
Les projets développés dans l'Institut visent à la compréhension des mécanismes responsables de maladies humaines et au développement de traitement pour ces maladies humaines. Une étape indispensable est le développement de modèles de souris génétiquement modifiées pour reproduire la pathologie humaine et tester des approches thérapeuthiques. Le bénéfice de ce projet est donc de développer de tels modèles dans des conditions les plus adaptées au bien être animal.
Procédures
Les animaux ne seront soumis à aucune intervention dans le cadre de ce projet, ils seront simplement examinés et surveillés tout au long de leur développement, de la naissance à l'age adulte
Impact sur les animaux
Il n'y aura pas d'intervention sur les animaux, seulement une observation attentive des caractères visibles et du comportement. Les effets indésirables potentiels seraient liés au phénotype dommageable
Devenir
Les animaux ne présentant pas de comportement anormal pourront être réutilisés dans d'autres projets pour répondre aux questions scientifiques ayant conduit au développement de cette lignée.
Remplacement
Ce projet ayant pour but le développement de modèles souris mimant des pathologies humaines en particulier pour la mise au point de thérapies, il n'y a pas de remplacement possible par d'autres modèles.
Réduction
Le nombre d'animaux sera réduit au maximum en fonction des besoins. Les animaux ne présentant pas de phénotype associé à une douleur non controlée pourront être ré-utilisés dans d'autres projets afin de réduire le nombre d'animaux produits pour ces projets et répondre aux questions scientifiques ayant conduit au développement de cette lignée.
Raffinement
Les animaux présentant le génotype d’intérêt feront l’objet d’une surveillance particulière selon les recommandations de l'Union Européenne afin d’établir si ces créations de nouvelles lignées provoquent l’apparition d’un phénotype dommageable vis-à-vis du bien-être animal, et si c’est le cas, des points limites seront mis en oeuvre et éventuellement réadaptés en fonction du phénotype observé pour limiter toute souffrance chez les animaux. Les animaux sont hébergés en groupe dans un environnement enrichi. Ils sont observés quotidiennement et des points limites ont été définis afin de prendre en compte d’éventuels effets inattendus pour lesquels il sera décidé de mettre en place un traitement approprié ou une euthanasie.
Choix des espèces
Le but de ce projet est la création de modèles génétiquement modifiés pour reproduire les pathologies humaines. Le développement de souris génétiquement modifiées est l'approche la plus simple à mettre en oeuvre et la seule permettant d'étudier un organisme entier. Ces modèles vont permettre de répondre à de nouvelles questions scientifiques en lien avec les thématiques de recherche de l’Institut telles que la compréhension des mécanismes physiopathologiques et le développement d'approches thérapeuthiques pour lesquelles les modèles souris sont indispensables. Ces pathologies pouvant toucher l'homme à tous les stades du développement, tous les stades seront donc analysés dans les lignées créées.
Validation d’un test d’apprentissage spatial préservant le bien-être animal à destination de la souris
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
96 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis gardées vivantes et transférées vers un autre projet. Elles apprennent à trouver une issue sur un plateau éclairé, le labyrinthe de Barnes, sous l'effet de lumières et de ventilateurs dirigés vers elles pour les forcer à mémoriser le trajet, et une partie reçoit un traitement qui efface la mémoire. Le porteur présente ce test comme un remplacement moins stressant du labyrinthe aquatique de Morris et met en avant le "bien-être animal". Il décrit ces désagréments, lumière et courant d'air, comme volontairement créés pour contraindre l'apprentissage.
Objectifs
L’étude des maladies qui affectent le cerveau et en particulier celles qui réduisent la mémoire nécessite d’évaluer - chez les animaux - le souvenir des trajets que ceux-ci effectuent dans une piscine. Néanmoins, il a été montré que cette façon de procéder comporte quelques désavantages qui peuvent être réduits ou même supprimés si l’utilisation d’une piscine, et donc le placement de l’animal dans l’eau, peut être évité. La solution alternative a été trouvée par l’utilisation d’un grand plateau éclairé où le rongeur se déplace à la recherche d’une issue dont il devra apprendre l’emplacement. Nous souhaitons dans le futur utiliser cette nouvelle façon de faire chez la souris, mais auparavant nous devons valider cette procédure en nos locaux, ce qui représente le but de ce projet. Pour ce faire, nous allons devoir trouver les meilleures conditions pour que les souris se souviennent de leurs trajets et qui seront des conditions d’éclairage ou de ventilation plus ou moins fortes du plateau. Une fois que ces conditions auront été trouvées, il nous faudra ensuite montrer que des souris présentant une mémoire réduite pourront être distinguées - par cette procédure - des souris non malades. Comme il existe de multiples types de souris, nous prendrons des souris avec ou sans une bonne vision et de niveaux de témérité différents. Si la nouvelle procédure confirme bien que, et quelque soit le type de souris évaluées, les animaux sont capables de se souvenir de leurs trajets sur un vaste plateau éclairé, nous remplacerons alors la procédure de la piscine par celle du plateau.
Bénéfices attendus
Il a été montré que la procédure faisant appel à un plateau pour étudier les trajets des souris est beaucoup moins stressante pour les animaux que celle de la piscine, et donc fournit des résultats plus précis. Ainsi, si nous remplaçons la procédure de piscine par celle du plateau, cela représentera un grand bénéfice pour les animaux car cela leur évitera un stress important lorsque nous voudrons évaluer leur mémoire ; et le bénéfice sera également non négligeable pour nous, car les résultats seront plus précis et donc, en conséquence, cette alternative nous permettra d’avoir à utiliser moins d’animaux pour étudier les maladies qui affectent le cerveau.
Procédures
Lorsque nous voudrons montrer que la procédure du plateau est capable de distinguer des souris présentant une mémoire réduite par rapport à des souris non malades (seconde phase du projet), nous devrons injecter une fois par jour, sur un total de 3 jours consécutifs, un traitement qui efface les souvenirs chez les souris considérées comme malades. Les traitements seront réalisés par la personne de notre structure qui a été validée par notre vétérinaire pour les injections. La préhension de l'animal et l'injection prendront environ 10 secondes. En ce qui concerne la détermination des bonnes conditions nécessaires pour le test du plateau, les animaux subiront le même jour 3 fois la procédure sur une durée maximum établie à 180 secondes. Pour la seconde phase du projet, ce schéma sera conservé, et répliqué pendant 3 jours consécutifs.
Impact sur les animaux
Les souris sont des animaux qui n’aiment pas apprendre. Si elles doivent néanmoins apprendre un chemin dans un piscine, elles n’ont pas le choix mais cette façon de faire est stressante et mérite d’être remplacée. L’alternative à cette procédure de la piscine par l’utilisation d’un plateau est beaucoup moins stressante, mais peut n’aboutir à aucun résultat si les souris ne sont pas obligées d’apprendre. Pour faire face à ce problème, il peut être nécessaire d’utiliser des lumières ainsi que des ventilateurs dirigés vers le plateau. Ainsi ces légers désagréments que nous créons volontairement pour les souris seront susceptibles de les forcer à apprendre le chemin vers l’issue sombre et sans courants d’air qui constituera alors leur récompense au terme de ce test de mémoire de trajets.
Devenir
Les souris seront gardées en nos locaux avant leur sortie une fois affiliées à un autre projet.
Remplacement
A l’heure actuelle, il n’existe pas de technique in vitro ou in silico permettant d’évaluer les effets d’un traitement sur les fonctions cognitives supérieures telles que l’apprentissage ou la mémoire.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux repose sur une démarche d'essais successifs : pour la phase 1 du projet, les 24 souris de chaque souche étudiée seront réparties en 8 sous-groupes de 3 individus. Le trio d’animaux de chaque sous-groupe sera testé aux mêmes conditions expérimentales, conditions qui seront ensuite modulées en fonction des résultats obtenus pour l’évaluation du sous-groupe suivant. Cette démarche devrait aboutir in fine à la détermination des modalités optimales à mettre en œuvre pour aboutir à un apprentissage spatial, en utilisant un nombre le plus faible possible d’animaux. L’expérience acquise par le personnel opérant à la réalisation du test comportemental est suffisante pour interpréter les données issues d’un groupe de 3 individus uniquement. Si les conditions étaient trouvées adéquates avant que la totalité des 8 sous-groupes n’aient été testé, le restant des sous-groupes (animaux non testés) sera alors évalué selon les conditions optimales précédemment déterminées afin d’augmenter la puissance statistique des résultats obtenus via un accroissement des effectifs. Si malgré tout, aucun apprentissage n’était détecté à l’issue de cette première phase, les animaux seront alors gardés en hébergement pendant un mois durant, au terme duquel ils seront alors retestés pour une nouvelle phase de paramétrage. Cette période sera suffisante pour opérer chez les souris une perte de souvenir des 3 tests préalablement réalisés. Concernant les effectifs requis minimum (n=12/groupe) pour la phase 2 du projet ils ont été définis par un programme informatique spécifique.
Raffinement
Les cages seront munies d’éléments d’enrichissement (buchettes, tunnels en carton, sizzlenet), permettant d’offrir aux animaux la possibilité d’évoluer en espaces clos, type de milieu préférentiel chez des rongeurs. L’état des animaux sera évalué quotidiennement par observation de tout comportement pouvant suggérer la présence de mal être chez les animaux de cette étude. Par ailleurs, le succès de ce projet aura pour conséquence le remplacement - quand cela sera possible - en notre structure de la procédure lu labyrinthe aquatique de Morris par celle du plateau troué de Barnes lorsque l’apprentissage ou la mémoire de rétention devront être testés sur modèle souris, ce qui constituera un raffinement certain de nos pratiques d’études.
Choix des espèces
La validation de la procédure du plateau troué de Barnes sera effectuée chez la souris car ce modèle animal est celui qui est majoritairement utilisé par les utilisateurs de notre structure de recherche. Les animaux seront âgés de 6 semaines à la réception (jeunes adultes)
Validation d’un protocole de thérapie génique et essai pré-clinique dans un modèle murin pour une neuropathie fatale chez l’Homme (EU 2/3)
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
314 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un vecteur viral sous anesthésie, cinq prélèvements de sang et cinq séries de tests comportementaux sur douze mois, pour évaluer une thérapie génique contre une maladie neuromusculaire mortelle chez l'humain. Ce dossier constitue le deuxième volet d'une série de trois autorisations pour le même programme. Le porteur mentionne des tests moteurs et sensoriels sans les nommer et juge la souris "essentielle" pour prouver l'efficacité de l'approche.
Objectifs
Ce projet concerne le développement d’une thérapie génique pouvant constituer un traitement curatif pour une maladie neuromusculaire fatale chez l’Homme et pour laquelle, il n’existe aujourd’hui aucun traitement curatif. Cette maladie est provoquée par des mutations d’un gène, et cela entraine des troubles moteurs et sensoriels chez les patients dès l’enfance. La thérapie génique consiste donc à compenser le gène défectueux en important une copie du gène fonctionnelle dans l’organisme grâce à un vecteur viral. Précédemment, nous avons développé un modèle animal (souris) qui reproduit pour la première fois les troubles moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients. Nous avons élaboré une méthodologie avec ce modèle pour développer notre thérapie. Notre premier objectif est d’optimiser les conditions de notre protocole (choix du meilleur promoteur, doses à utiliser) en analysant les effets sur le comportement et l’organisme de nos souris (prélèvements sanguins, analyses moléculaires). Ensuite, notre deuxième objectif est d’évaluer les bénéfices de ce protocole thérapie génique grâce à un essai pré-clinique dans notre modèle sur une durée de 12 mois. Nous évaluerons ces bénéfices en évaluant le comportement et l’effet sur l’organisme de ces souris.
Bénéfices attendus
La validation de notre protocole et l’évaluation des bénéfices de notre thérapie génique chez la souris constituerait un premier pas vers une thérapie adaptable à l’Homme dans le cadre d’une maladie génétique. De plus, lors des analyses sanguines, nous aimerions pouvoir mettre en évidences des marqueurs sanguins de cette maladie. Ces marqueurs pourraient être utilisés également dans le cadre du diagnostic d’autres maladies neurodégénératives.
Procédures
Les souris recevront le vecteur viral (durée : 5mn) sous anesthésie générale. Les souris auront 5 prélèvements sanguins (durée : 5mn). Les souris réaliseront 5 fois la série de tests comportementaux (5 tests comportementaux, durée : entre 30s et 15mn) entre 1 mois et 12 mois. Ces tests permettront d’évaluer les capacités motrices et sensorielles des animaux permettant de rendre compte de l’efficacité de l’approche thérapeutique.
Impact sur les animaux
L’administration du vecteur viral, les prises de sang pourront induire un stress faible chez les animaux. Les tests comportementaux pourront induire un stress variable chez les animaux allant de faible à modérer. Aucun autre effet indésirable n’est attendu à l’issu de ces éléments.
Devenir
Ce projet compte 2 procédures. La première permettra de valider le protocole de thérapie génique sur les souris par des analyses comportementales et tissulaires, nécessitant leur mise à mort afin d’étudier le phénotype tissulaire (prélèvement d’organes post-mortem pour analyses). La deuxième permettra d’évaluer les bénéfices de la thérapie au niveau comportemental et tissulaire nécessitant la mise à mort des souris (prélèvement d’organes post-mortem pour analyses.
Remplacement
Le projet a pour but de valider un premier essai pré-clinique de thérapie génique pour une maladie neuromusculaire fatale et incurable chez l’Homme. Les modèles in vitro (cellules immortelles et neurones en culture) ont permis de mettre en évidence des effets au niveau moléculaire/cellulaire de cette approche. Elle nécessite à présenter être validée dans un organisme modèle de mammifère. Le tissu nerveux ne pouvant être accessible chez l’Homme et les essais thérapeutiques ne pouvant être testés directement chez l’Homme, il est essentiel de prouver l’efficacité de notre approche dans une étude pré-clinique chez la souris.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire au maximum le nombre d’animaux par condition expérimentale tout en conservant un nombre suffisant de souris par lot pour pouvoir analyses nos résultats de façon statistique et ne pas avoir besoin de reconduire ce type de projet.
Raffinement
Le phénotype de notre modèle murin ne diffère pas du modèle sauvage durant le temps de l’expérimentation (12 mois maximum) permettant un hébergement en cage collective pour respecter leurs besoins sociaux. L’administration du vecteur viral est réalisée sous anesthésie générale avec un réveil post-anesthésie dans une cage chauffée, du gel ophtalmique est appliqué post-injection et mise en place d’une analgésie si besoin. Les prises de sang sont effectuées sous anesthésie générale avec réveil post-anesthésie dans une cage chauffée et mise en place d’une analgésie si besoin. L’organisation des tests comportementaux seront précédés d’une phase d’entrainement et une période de récupération d’au moins une demi-journée voir 2 jours entiers est prévue afin de limiter au maximum le stress des animaux. Chaque animal sera surveillé de façon individuelle et de façon quotidienne. A chaque étape du projet, des points limites ont été établis pour soustraire l’animal à la souffrance.
Choix des espèces
Avec 98% d’identité protéique avec l’Homme, la souris constitue un modèle idéal pour reproduire les pathologies humaines afin de les étudier dans un contexte physiologique mais également de pouvoir tester et valider des approches thérapeutiques. L’étude réalisée sur notre modèle a montré qu’il reproduit pour la première fois les symptômes moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients, justifiant son utilisation valider notre approche de thérapie génique. Notre projet utilisera le stade juvénile (1 mois) et le stade adulte (2 à 12 mois). Notre modèle murin présente des défauts moteurs et sensoriels à partir de 3 mois ; il est donc nécessaire de débuter la stratégie à un stade précoce. La validation du protocole et l’évaluation des bénéfices au niveau comportemental et histologique doivent être évaluées au stade adulte pour évaluer les effets de la thérapie à moyen- et long-terme.
Effet d’une constriction thoracique externe sur la distribution régionale de l’aération et du strain alvéolaire dans un modèle ovin de SDRA
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
26 moutons vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, dans des procédures classées sans réveil. Chaque agneau est intubé, équipé de plusieurs cathéters, reçoit une lésion pulmonaire provoquée par un lavage ou une endotoxine bactérienne, puis un dispositif de compression du thorax pendant une imagerie, avant d'être tué par injection de pentobarbital pour prélever ses poumons. L'étude cherche à reproduire les bénéfices du décubitus ventral chez les patients en réanimation, dans le prolongement de la pandémie de Covid-19. Le porteur affirme qu'un "modèle grand mammifère" est "indispensable" pour se rapprocher de l'anatomie humaine.
Objectifs
La pandémie de COVID-19 a mis en lumière les contraintes physiopathologiques, techniques et logistiques associées à la prise en charge de patients présentant une détresse respiratoire aiguë. Qu’il soit d’origine infectieuse ou non, le syndrome de détresse respiratoire aigue (SDRA) nécessite, dans la majorité des cas, la mise en œuvre d’une suppléance de la fonction respiratoire impliquant une sédation pharmacologique, une intubation orotrachéale et une ventilation mécanique. Alors que cette approche permet de maintenir des échanges gazeux physiologiques, une iatrogénie propre y est associée : des lésions pulmonaires induites par la ventilation mécanique. Ces lésions sont caractérisées par l’exposition de certaines alvéoles pulmonaires à des niveaux traumatiques de distension dont l’impact sur le pronostic des patients est bien établi. La prévention de cette distribution hétérogène de l’aération alvéolaire au sein du volume pulmonaire constitue un élément clé de la prise en charge des patients de réanimation. Par exemple, en modifiant radicalement la conformation de la paroi thoracique et l’effet de la gravité sur le tissu pulmonaire, le positionnement régulier de ces patients en décubitus ventral (environ 16 heures / jour) homogénéise l’aération pulmonaire régionale, prévient les lésions induites par la ventilation mécanique, et in fine, diminue significativement la mortalité hospitalière. Néanmoins, la mobilisation de patients sédatés pour retournements bi-quotidiens implique des complications propres (mobilisation accidentelle des cathéters, hypotension artérielle, escarres de la face, complications ophtalmologiques, vomissement) et augmente nécessairement les besoins en ressources humaines. Reproduire les bénéfices associés avec le décubitus ventral en maintenant les patients en position dorsale représente une cible thérapeutique solidement justifiée par les concepts physiopathologiques et dont l’impact pourrait être majeur sur les plans clinique et médico-économique. Les objectifs de ce travail de recherche sont double : 1) Déterminer l’effet d’une constriction thoracique externe sur la distribution régionale de l’aération pulmonaire et du strain alvéolaire lorsque des niveaux de pression des voies aériennes, couramment utilisés en clinique, sont appliqués. 2) Décrire la déformation induite par la constriction thoracique externe sur la morphologie et les caractéristiques biomécaniques de la paroi thoracique.
Bénéfices attendus
Cette étude expérimentale comparative permettra d'obtenir une décription exhaustive de l’impact régional (à l’échelle du voxel et sur l’ensemble du volume pulmonaire) de la constriction thoracique externe sur l’aération pulmonaire régionale. Des résultats en faveur d’une homogénéisation de l’aération pulmonaire régionale permettraient d’envisager le développement d’un dispositif médical de constriction thoracique externe chez l’Homme en vue d’une évaluation clinique avec pour objectif de reproduire les effets du décubitus ventral mais en maintenant les patients sur le dos ; et ainsi d’améliorer le pronostic des patients placés sous ventilation mécanique en réanimation.
Procédures
Mise en place d’une voie veineuse périphérique sous contention manuelle douce. Induction intraveineuse de l’anesthésie générale qui sera maintenue jusqu’à la fin de l’expérimentation et la mise à mort. Mise en place d’une sonde d’intubation pour ventilation mécanique + cathéter veineux centraux (jugulaire interne droite), artériel (fémoral) et oesophagien. Induction d’une lésion pulmonaire par lavage bronchioloalvéolaire au sérum physiologique ou injection intraveineuse d’endotoxine bactérienne. Protocole d’imagerie (tomodensitométrie pulmonaire) avant et après mise en place d’un dispositif de compression thoracique externe (niveau de pression compatible avec le maintien d’une ventilation pulmonaire efficace et d’une stabilité hémodynamique). Mise à mort sous anesthésie générale profonde par injection intraveineuse de pentobarbital (140mg/kg).
Impact sur les animaux
La veille de l'intervention, les animaux seront isolés du groupe social en petit groupe de 2 afin d'être mis à jeun, ce qui peut etre source de stress. Mise en place d’une voie veineuse périphérique (18 G) au niveau de la veine jugulaire externe sous contention physique douce des animaux. Mise en place d’une sonde d’intubation pour ventilation mécanique + cathéter veineux centraux (jugulaire interne droite), artériel (fémoral) et oesophagien. Induction d’une lésion pulmonaire par lavage bronchioloalvéolaire au sérum physiologique ou injection intraveineuse d’endotoxine bactérienne. Mise en place d’un dispositif de compression thoracique externe limitant le volume respiratoire de l'animal.
Devenir
L'ensemble des animaux des 2 procédures (n=26) seront mis à mort. Les procédures seront assez longues, induisant un temps d'anesthésie générale important. De plus, l'explantation des poumons est nécessaire afin d'effectuer des analyses histologiques et immunohistochimiques des zones de lésions pulmonaires.
Remplacement
Il s’agit d’une étude biomécanique de la fonction respiratoire par des outils d’imagerie utilisés en clinique humaine. L’utilisation d’un modèle grand mammifère est donc indispensable afin de se rapprocher au maximum de la physiopathologie humaine en termes de taille des poumons, de réglage de la ventilation mécanique et d’interaction animal-ventilateur. Les modèles de SDRA chez le mouton sont parfaitement validés. Une alternative est représentée par les modèles porcins mais ceux-ci sont associé à un plus faible niveau d’hétérogénéité pulmonaire.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire a été reproduit à partir d’études antérieures ayant utilisé l’imagerie pulmonaire pour l’étude des lésions induites par la ventilation mécanique considérant la relative variabilité de la réponse à l’injection d’endotoxine ou au lavage bronchioloalvéolaire (entre 6 et 10 animaux pour chaque modèle dans la majorité des publications). La réalisation d’une étude pilote permettra de valider au préalable un niveau de compression thoracique assurant des effets physiologiques significatifs et reproductibles tout en prenant en compte les variabilités interindividuelles. L'étude pilote permettra de définir un niveau de constriction thoracique externe "idéal" et permettra également de mieux définir et propablement de réduire le nombre d’animaux nécessaires lors de la phase expérimentale comparative.
Raffinement
Toutes les procédures expérimentales ainsi que l’environnement d’hébergement ont été optimisées. Les gestes interventionnels seront toujours réalisés sous anesthésie générale, par du personnel formé, permettant un temps interventionnel réduit au maximun, afin de prévenir la souffrance et l’angoisse des animaux. Le bien-être des animaux sera contrôlé en veillant aux conditions d'hébergement et au comportement des animaux. L'acclimatation des animaux sera d'une semaine avant d'entrer dans le protocole. Des observations quotidiennes seront réalisées par une personne compétente basées sur l'apparence physique externe, le comportement (sociabilité, appétit) et les réponses comportementales aux stimuli externes (peu enclins aux manipulations, tentative de fuite). Ces contrôles sont enregistrés et permettent de repérer tout animal malade ou blessé pour prendre des mesures appropriées. Tout constat d'un mal-être est remonté au responsable du bien-être des animaux pour examen approfondis, traitements adaptés et/ou consultation du vétérinaire référent. L’imagerie est une approche non invasive, qui n’est pas source de douleur. L’utilisation de la contention physique douce, possible chez la brebis, pour la mise en place de la voie veineuse jugulaire externe est préférable à l’administration d’une prémédication intramusculaire source de douleur et de stress. La mise en place d’un tissu sur les yeux lors de la contention douce de l'animal réduit les stimuli externes et donc le stress de l'animal. Une fois la voie veineuse périphérique mise en place, l’anesthésie générale est induite en quelques secondes et sera maintenue jusqu’à la mise à mort. L’ensemble des procédures seront réalisées sous anesthésie générale en présence d’un médecin anesthésiste-réanimateur qui assurera une profondeur d’anesthésie suffisante et le maintien d’une stabilité physiologique.
Choix des espèces
Il s’agit d’une étude biomécanique de la fonction respiratoire par des outils d’imagerie utilisés en clinique humaine. L’utilisation d’un modèle grand mammifère est donc indispensable afin de se rapprocher au maximum de la physiopathologie humaine en termes de taille des poumons, de réglage de la ventilation mécanique et d’intéraction animal-ventilateur. Les modèles ovins de SDRA sont parfaitement validés. Une alternative est représentée par les modèles porcins mais ceux-ci sont associé à un plus faible niveau d’hétérogénéité pulmonaire. Agneau de 3 à 4 mois pesant entre 15 et 20 kg. A ce stade la taille des poumons et les réglages du ventilateur sont proches de ceux des humains. L’utilisation de brebis prépubères facilite leur manipulation notamment pour la contention physique douce et la pose de voie veineuse périphérique.
Validation d’un protocole de thérapie génique et essai pré-clinique dans un modèle murin pour une neuropathie fatale chez l’Homme (EU 3/3)
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
314 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un vecteur viral sous anesthésie, cinq prélèvements de sang et cinq séries de tests comportementaux entre un et douze mois, pour évaluer une thérapie génique contre une maladie neuromusculaire mortelle chez l'humain. Le porteur mentionne des tests moteurs et sensoriels sans en préciser la nature. Il affirme qu'il est "essentiel" de prouver l'efficacité de l'approche chez la souris, présentée comme ayant "98 % d'identité protéique" avec l'humain.
Objectifs
Ce projet concerne le développement d’une thérapie génique pouvant constituer un traitement curatif pour une maladie neuromusculaire fatale chez l’Homme et pour laquelle, il n’existe aujourd’hui aucun traitement curatif. Cette maladie est provoquée par des mutations d’un gène, et cela entraine des troubles moteurs et sensoriels chez les patients dès l’enfance. La thérapie génique consiste donc à compenser le gène défectueux en important une copie du gène fonctionnelle dans l’organisme grâce à un vecteur viral. Précédemment, nous avons développé un modèle animal (souris) qui reproduit pour la première fois les troubles moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients. Nous avons élaboré une méthodologie avec ce modèle pour développer notre thérapie. Notre premier objectif est d’optimiser les conditions de notre protocole (choix du meilleur promoteur, doses à utiliser) en analysant les effets sur le comportement et l’organisme de nos souris (prélèvements sanguins, analyses moléculaires). Ensuite, notre deuxième objectif est d’évaluer les bénéfices de ce protocole thérapie génique grâce à un essai pré-clinique dans notre modèle sur une durée de 12 mois. Nous évaluerons ces bénéfices en évaluant le comportement et l’effet sur l’organisme de ces souris.
Bénéfices attendus
La validation de notre protocole et l’évaluation des bénéfices de notre thérapie génique chez la souris constituerait un premier pas vers une thérapie adaptable à l’Homme dans le cadre d’une maladie génétique. De plus, lors des analyses sanguines, nous aimerions pouvoir mettre en évidences des marqueurs sanguins de cette maladie. Ces marqueurs pourraient être utilisés également dans le cadre du diagnostic d’autres maladies neurodégénératives.
Procédures
Les souris recevront le vecteur viral (durée : 5mn) sous anesthésie générale. Les souris auront 5 prélèvements sanguins (durée : 5mn). Les souris réaliseront 5 fois la série de tests comportementaux (5 tests comportementaux, durée : entre 30s et 15mn) entre 1 mois et 12 mois. Ces tests permettront d’évaluer les capacités motrices et sensorielles des animaux permettant de rendre compte de l’efficacité de l’approche thérapeutique.
Impact sur les animaux
L’administration du vecteur viral, les prises de sang pourront induire un stress faible chez les animaux. Les tests comportementaux pourront induire un stress variable chez les animaux allant de faible à modérer. Aucun autre effet indésirable n’est attendu à l’issu de ces éléments.
Devenir
Ce projet compte 2 procédures. La première permettra de valider le protocole de thérapie génique sur les souris par des analyses comportementales et tissulaires, nécessitant leur mise à mort afin d’étudier le phénotype tissulaire (prélèvement d’organes post-mortem pour analyses). La deuxième permettra d’évaluer les bénéfices de la thérapie au niveau comportemental et tissulaire nécessitant la mise à mort des souris (prélèvement d’organes post-mortem pour analyses.
Remplacement
Le projet a pour but de valider un premier essai pré-clinique de thérapie génique pour une maladie neuromusculaire fatale et incurable chez l’Homme. Les modèles in vitro (cellules immortelles et neurones en culture) ont permis de mettre en évidence des effets au niveau moléculaire/cellulaire de cette approche. Elle nécessite à présenter être validée dans un organisme modèle de mammifère. Le tissu nerveux ne pouvant être accessible chez l’Homme et les essais thérapeutiques ne pouvant être testés directement chez l’Homme, il est essentiel de prouver l’efficacité de notre approche dans une étude pré-clinique chez la souris.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire au maximum le nombre d’animaux par condition expérimentale tout en conservant un nombre suffisant de souris par lot pour pouvoir analyses nos résultats de façon statistique et ne pas avoir besoin de reconduire ce type de projet.
Raffinement
Le phénotype de notre modèle murin ne diffère pas du modèle sauvage durant le temps de l’expérimentation (12 mois maximum) permettant un hébergement en cage collective pour respecter leurs besoins sociaux. L’administration du vecteur viral est réalisée sous anesthésie générale avec un réveil post-anesthésie dans une cage chauffée, du gel ophtalmique est appliqué post-injection et mise en place d’une analgésie si besoin. Les prises de sang sont effectuées sous anesthésie générale avec réveil post-anesthésie dans une cage chauffée et mise en place d’une analgésie si besoin. L’organisation des tests comportementaux seront précédés d’une phase d’entrainement et une période de récupération d’au moins une demi-journée voir 2 jours entiers est prévue afin de limiter au maximum le stress des animaux. Chaque animal sera surveillé de façon individuelle et de façon quotidienne. A chaque étape du projet, des points limites ont été établis pour soustraire l’animal à la souffrance.
Choix des espèces
Avec 98% d’identité protéique avec l’Homme, la souris constitue un modèle idéal pour reproduire les pathologies humaines afin de les étudier dans un contexte physiologique mais également de pouvoir tester et valider des approches thérapeutiques. L’étude réalisée sur notre modèle a montré qu’il reproduit pour la première fois les symptômes moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients, justifiant son utilisation valider notre approche de thérapie génique. Notre projet utilisera le stade juvénile (1 mois) et le stade adulte (2 à 12 mois). Notre modèle murin présente des défauts moteurs et sensoriels à partir de 3 mois ; il est donc nécessaire de débuter la stratégie à un stade précoce. La validation du protocole et l’évaluation des bénéfices au niveau comportemental et histologique doivent être évaluées au stade adulte pour évaluer les effets de la thérapie à moyen- et long-terme.
Modulation de la flore intestinale (microbiote) pour améliorer les réponses anti-cancéreuses de l’hôte
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 480 d'entre elles et modéré pour 1 440. Elles reçoivent des prébiotiques ou des probiotiques par gavage, une greffe de tumeur sous la peau ou une injection de cellules cancéreuses dans le sang, puis une immunothérapie et des prélèvements sanguins, pour tester si la modification du microbiote intestinal renforce les réponses anti-tumorales. Le porteur annonce des essais chez l'humain et des recommandations nutritionnelles dans un second temps. Il affirme que le rôle du microbiote "ne peut être étudié qu'in vivo" et qu'il n'existe "pas d'alternative à ce jour".
Objectifs
Le microbiote intestinal (flore intestinale) comprend l'ensemble des bactéries, champignons et virus contenus dans notre intestin. Il est montré que ces bactéries communiquent avec notre immunité. Les espèces bactériennes qui composent notre microbiote détermine la qualité de notre immunité, donc de nos défenses contre les infections, ou même les cancers. Ainsi certaines bactéries ont été identifiées comme bénéfiques pour la santé, et notamment pour notre immunité. On peut augmenter la présence de ces bactéries dans l'intestin pour améliorer notre immunité notamment via l'alimentation, en consommant des fibres alimentaires qui les nourrissent, c'est ce que l'on appel des prébiotiques. On peut aussi consommer des probiotiques, c'est à dire directement ces bonnes bactéries. Le but de ce projet est d'améliorer la composition du microbiote intestinal de souris soit par prébiotiques, soit par probiotiques dans le but d'augmenter les réponses anti-tumorales et ainsi prévenir l'apparition de cancers ou le développement de métastases ou enfin, d'améliorer la réponse à l'immunothérapie. Nous avons pour objectif de tester 10 prébiotiques et 10 probiotiques différents dans les 5 ans à venir.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mettre en évidence des propriétés immunostimulantes de composés alimentaires (fibres) et/ou de compléments alimentaires (probiotiques) qui pourraient être utiles dans un contexte de cancer. Les découvertes quien découlerons, permettrons d'évaluer dans un second temps ces composés chez l'Homme, à travers des essais cliniques. In fine, ce travail permettra de rationaliser des interventions nutritionnelles qui favoriserons la prévention des cancers dans la population générale, et permettront de favoriser la réponse aux immunothérapies et/ou prévenir le phénomène de métastases chez les patients atteints de cancer.
Procédures
Une partie des animaux sera nourrie avec un régime prébiotique administré dans l'eau de boisson ou de probiotiques administrés par gavage oral 5 fois par semaine durant 1 mois (1 minute / gavage). Une partie des animaux recevra une implantation tumorale par injection sous-cutanée (1 minute / souris sur souris vigile), ou une injection de cellules cancéreuses par voie intra-veineuse (5 minutes / souris sur souris vigile). Les prélèvements sanguins (2 minutes / souris) seront réalisés principalement en fin d'expérience (ou lors d'atteinte de point limite), sous anesthésie volatile, et sans réveil. Sinon, un prélèvement après 15 jours de régime enrichi pourra être effectué sous anesthésie volatile avec suivi de réveil. Ainsi les animaux auront au maximum 2 prélèvements sanguins, dont un sans réveil. Le trateiement par immunothérapie consistera à 6 injections maximum en intra péritonéale ou intraveineuse, sur souris vigiles.
Impact sur les animaux
Les animaux, hébergés en groupe sociaux dans un environnement enrichi adapté, seront abreuvés et nourris sans restriction. Le régime alimentaire n'induit aucune nuisance et représente un enrichissement en termes de bien-être nutritionnel. L’administration par gavage oral nécessite une habituation de l’animal soumis à un léger stress. Les animaux recevront jusqu'à 6 injections sans anesthésie induisant une contrainte de niveau léger. Les prélèvements sanguins seront tous réalisés sous anesthésie générale induisant une contrainte de niveau léger ou sans réveil. Enfin, la tumeur implantée pourra évoluer en taille (maladie au stade léger), et dans de rare cas nécroser (lésion de niveau modéré) représentant un point limite pour l’arrêt de la procédure expérimentale.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront euthanasiés, à la fin des expériences ou dès atteinte des points limites. Des prélèvements seront effectués pour des analyses immunologiques complémentaires.
Remplacement
Le rôle du microbiote (flore) intestinal ne peut être étudié qu'in vivo. En effet, les interactions hôte/microbes et notamment système immunitaire de l'hôte/microbes et les réponses anti-tumorales induites nécessitent une étude dans un organisme vivant. Il n'existe donc pas d'alternative à ce jour.
Réduction
Afin de tenir compte de la variabilité inter individuelle dans la réponse aux différents traitements, des groupes de 12 animaux seront constitués. Ainsi, malgré la variabilité, ce nombre d'animaux par groupe apportera une fiabilité au niveau statistique. Pour renforcer nos observations, et réduire au maximum le nombre d'animaux, nous prévoyons de réaliser une première expérience avec 6 animaux par groupe et de confirmer tout effet anti-tumoral observé (ou tendance encourageante) en dupliquant l'expérience afin d'obtenir au final 12 animaux par groupes en 2 expériences indépendantes, plutôt qu'en une seule avec des groupes de 12 animaux d'emblée. De plus, dans les procédure 2 et 3, nous testerons 2 conditions expérimentales en parallèle, lorsque nous disposerons de 2 composés en simultané, afin de mutualiser les groupes contrôles, et donc de réduire le nombre d'animaux contrôles utilisés.
Raffinement
Afin d'assurer le bien-être des animaux, les souris seront hébergées par cage de 6, avec environnement enrichi. Le régime alimentaire (fibres) sera administré dans l'eau de boisson ou par gavage, et les probiotiques (bactéries) seront administrées par gavage. L'injection sous-cutanée des cellules tumorales ou l'injection IP des immunothérapies n'induisent qu'une brève légère souffrance des animaux. . Toutefois, les animaux seront quotidiennement surveillés à la suite des implantations tumorales. Les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale à la fin de l'expérience ou dès lors qu'un point limite est atteint. L'euthanasie par dislocation cervicale se fera sous anesthésie à l'isoflurane (3 %) quand il y aura prélèvement sanguin terminal.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus pertinent pour mener ce genre d'étude. La manipulation de leur flore est acquise. De plus, les modèles tumoraux ainsi que les outils pour étudier les réponses immunes induites sont parfaitement développées pour ce modèle animal. Tous nos résultats précédents obtenus dans le cadre de cette thématique l'ont été avec ce même modèle murin. Les souris seront utilisées à partir de 6 semaines d'âge (livrées à 5 semaines + 1 semaine d'acclimatation). A ce stade, les souris sont sevrées et le système immunitaire est pleinement mature et permet donc son étude.
Effet d’huiles essentielles seules et en combinaison de molécules bioactives sur la colonisation de Salmonella chez le poulet de chair.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
405 poulets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les poussins sont inoculés par voie orale avec la bactérie Salmonella dès leur premier jour, élevés jusqu'à trente-cinq jours puis tués, par dislocation cervicale pour les plus jeunes et par saignée à la jugulaire après étourdissement pour les autres, afin de prélever leur intestin. L'étude teste l'effet d'huiles essentielles sur la colonisation par Salmonella dans la filière avicole, dans une perspective de santé publique. Le porteur indique aussi vouloir valider un modèle sur le nématode Caenorhabditis elegans qui pourrait "réduire l'utilisation d'animaux", tout en jugeant "nécessaire" l'essai sur le poulet.
Objectifs
Le projet vise au déploiement d’une stratégie de gestion de bactéries zoonotiques chez les animaux d’élevages, grâce à des alternatives naturelles telles que les huiles essentielles. La recherche d’activités biologiques sera liée à la prévention de la colonisation digestive chez la volaille par Salmonella, une des principales bactéries responsables de zoonoses et largement répandues dans les élevages. L’objectif premier de ce projet s’inscrit dans une problématique de santé publique avec le développement d’une gamme de solutions adaptées pour réduire la colonisation chez la volaille de ces deux principaux pathogènes impliqués dans les zoonoses. Le second objectif permettra de tester un nouveau modèle prédictif in vitro reposant sur le modèle de colonisation digestive du modèle nématode Caenorhabditis elegans. Le développement de cette méthode alternative à l’expérimentation animale, pourrait permettre de réduire l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques et ainsi de satisfaire à la règle des 3R : Réduire, Remplacer, Raffiner. Au cours de ce projet, cette procédure visera à étudier l’effet d’huiles essentielles seules et en combinaison avec d’autres moyens de lutte (traitement de l’aliment et de la litière) sur la colonisation de Salmonella Typhimurium en poulet de chair.
Bénéfices attendus
Ce travail permettra de valider les effets bénéfiques des huiles essentielles sur la colonisation du poulet de chair par Salmonella. En parallèle la combinaison de statégie de lutte sera étudiée pour proposer un moyen de lutte plus efficace contre la contamination à Salmonella dans les élevages. Par ailleurs, les résultats obtenus sur l’effet anti-colonisateur des huiles essentielles sur le modèle poulet et le modèle nématodes seront comparés pour confirmer l’effet prédictif du modèle nématode et ainsi valider son utilisation comme modèle alternatif à l’expérimentation animale.
Procédures
Les animaux seront soumis à une inoculation par voie orale de Salmonella Typhimurium ou de Tryptone Sel. Le prélèvement de caeca aura lieu après mise à mort des animaux. Dès la mise en place (J1), les poussins tout venant de 1 jour de l’espèce Gallus gallus de souche commerciale de chair ROSS 308, seront pesés. A J1, tous les animaux seront inoculés avec 100 µL de Salmonella Typhimurium (Lot 1, Lot 3, Lot 5 et Lot 7) ou 100 µL de de Tryptone Sel (Lot 2, Lot 4, Lot 6 et Lot 8), et l’inverse sera réalisé à J7.
Impact sur les animaux
Les infections à Salmonella chez les volailles passent généralement inaperçues et les molécules testées sont normalement inoffensives : les huiles essentielles, les probiotiques et acides organiques ainsi que l’asséchant pour litière utilisés dans cette étude sont des produits commercialisés et utilisés en élevage de volailles.
Devenir
Les prélèvements de caeca nécessitent la mise à mort des animaux. C’est pourquoi tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale, par dislocation cervicale les jeunes poussins (poids < 250 g) et pour les poussins plus âgés et les poulets adultes après une anesthésie par électronarcose suivie d’une saignée à la veine jugulaire.
Remplacement
La volaille et notamment le poulet de chair représente une source importante de salmonellose pour l’Homme. Ainsi, il est nécessaire de contribuer au développement d’un moyen de lutte contre Salmonella dans la filière avicole afin de réduire in fine le risque d’infection humaine par Salmonella. Des résultats préliminaires utilisant un modèle d'infection du nématode Caenorhabditis elegans permettant un suivi de la colonisation digestive par Salmonella Typhimurium, ont mis en évidence les activités anticolonisatrices des huiles essentielles qui seront utilisées pour ce projet. Il est necessaire de valider ces résultats lors d’un essai sur le poulet de chair. Cette validation nous permettra de vérifier que les résultats obtenus in vitro sont transposables in vivo afin de réduire par la suite le recours à l’expérimentation animale.
Réduction
Les animaux seront utilisés au seuil de la pertinence scientifique et statistique. Cette étude s’interesse à l’effet d’huiles essentielles seules et en combinaison avec d’autres moyen de lutte sur la colonisation de Salmonella chez le poulet de chair. La réalisation de 8 lots distincts permettra de différencier l’effet des huiles essentielles seules ou en combinaison afin de maximiser l’efficacité d’un traitement en elevage. En raison de la variabilité interindividuelle importante des niveaux de colonisation par les bactéries étudiées, il a été déterminé qu’un minimum de 10 animaux par groupe était nécessaire pour chaque temps donné afin d’assurer la robustesse des tests statistiques. Ainsi, 8 lots x 5 temps x 10 animaux = 400 animaux. En supplément 5 animaux seront utilisés au début de l’étude pour vérifier l’absence de contamination par Salmonella. Soit un total de 405 animaux.
Raffinement
Dans des expériences précédentes d’inoculation avec la souche de S. Typhimurium choisie pour cette étude, aucun symptôme ou effet indésirable n’a été détecté chez les animaux étudiés. L’inoculation des bactéries à la pipette par voie orale et les pesées seront réalisées par le personnel expérimenté qui apportera la même attention à chaque inoculation de sorte à éviter/limiter les inconforts au moment de l’administration. Le protocole a été établi pour limiter les gestes invasifs et le stress chez les animaux. Les animaux seront observés quotidiennement. Si toutefois, une altération de l’état de santé était observée quelle que soit la raison, les animaux concernés seront mis à mort en cas d’atteinte des points limites suivants : blessure grave, prostration, absence de réaction après sollicitation (absence de réponse à des stimuli tactiles et visuels), anorexie ou impossibilité de s’abreuver ou de s’alimenter. Le raffinement des conditions d’hébergement visera à assurer des conditions d’hébergement limitant l’inconfort potentiel des animaux. Quatre animaleries de type A2 seront utilisées en dépression (moyenne). Chaque lot de poulets sera installé dans des parcs au sol de 3,4 m² entourés par des panneaux en bois. La litière sera composée de copeaux de bois (qui sert d’enrichissement du milieu puisque les animaux grattent et picorent cette litière). Les paramètres d’ambiance utilisés sont préconisés pour les élevages de poulets de chair. Les installations sont équipées de lumières électriques programmables, d'un chauffage électrique automatisé et d'une ventilation. Les animaux recevront à volonté, de l’eau et de l’aliment réservé aux poulets de chair spécifiques à leur âge.
Choix des espèces
Les salmonelloses humaines sont principalement attribuées à la filière avicole. Ce projet à pour objectif de développer une stratégie de lutte efficace pour limiter la colonisation des animaux par Salmonella dès l’élevage afin de réduire la charge qui arrive sur la chaine alimentaire. Par conséquent, le poulet de chair est l’espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de notre procédure. Des poussins de 1 jour seront utilisés et élevés jusqu’à 35 jours (âge d’abattage des poulets de chair pour la consommation). Le but est de suivre l’effet de l’ajout des huiles essentielles et en combinaison d’autres moyen de lutte sur la colonisation de Salmonella.
Etude pharmacocinétique en modéle murin de 10 anticorps monoclonaux
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection dans le sinus veineux situé derrière l'œil sous anesthésie, puis subit jusqu'à neuf prélèvements de sang par la joue sur deux à trois semaines, pour comparer des anticorps produits à partir de microalgues à des anticorps classiques. Le porteur présente l'enjeu comme économique, réduire le coût de production des anticorps, et annonce le bénéfice pour les patients à terme. Il affirme qu'après vérification in vitro il était "nécessaire" d'étudier ces anticorps dans un organisme au système immunitaire mature.
Objectifs
L’industrie pharmaceutique mise de plus en plus sur les anticorps thérapeutiques pour satisfaire les besoins de santé, encore nombreux. Cependant, l’industrie française a pris du retard dans ce domaine. Malgré une consommation importante de médicaments par la population française, seuls trois anticorps thérapeutiques sont produits en France (omalizumab, canakinumab, sécukinumab). Avec la prévalence croissante des maladies chroniques comme les cancers, les maladies autoimmunes et infectieuses telles que la COVID-19, le besoin en médicaments de type anticorps s’accroit considérablement. Ces médicaments sont actuellement produits en utilisant des cellules de mammifères comme usines cellulaires. Le coût de production de ces anticorps est très élevé. En conséquence, il devient indispensable de développer des systèmes alternatifs de production d’anticorps qui permettent de décroître leurs coûts de production et ainsi de les rendre plus accessibles. Récemment, les microalgues ont été utilisées avec succès pour produire des anticorps fonctionnels dirigés contre des virus comme le virus de l’Hépatite B ou le virus de Marburg. Nous produisons actuellement des bio-similaires d’anticorps anti-cancéreux. L'objectif du projet est donc de comparer la pharmacocinétique de ces anticorps produits à partir de microalgues par rapport aux anticorps génériques.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude, si ils valident le système alternatif de production d'Ac à partir de microalgues va permettre de diminuer considérablement leur coût de production et ainsi les rendre plus accessibles.
Procédures
Chaque souris recevra à J0 une injection intraveineuse unique via le sinus rétro-orbitale de 5 mg/kg d’anticorps dans un volume total de 200µl de PBS. Cette injection sera pratiquée sous anesthésie générale. Chaque souris aura des prélèvements sanguins, un total de 9 sur 2 à 3 semaines. Prélèvements de sang via les veines submandibulaires. L’ensemble des prélèvements sera effectué sous anesthésie générale à l’isoflurane 2.5% après une induction à l’isoflurane 5% dans l’air. Le volume de chaque prélèvement sera de 50µl récupéré dans des capillaires calibrés. Après chaque ponction une pommade antiseptique cicatrisante sera appliquée (Biseptine Cica gel).
Impact sur les animaux
Les gestes expérimentaux sur les animaux se limitent à une injection intraveineuse et des prélèvements sanguins qui ne devraient pas induire de nuisances ou effets indésirables particuliers compte tenu des mesures préventives prises et des précautions apportées à leur mise en oeuvre.
Devenir
Tous les animaux de l'étude seront mis à mort.
Remplacement
Les anticorps sont actuellement produits en utilisant des cellules de mammifères comme usines cellulaires. Récemment, les microalgues ont été utilisées avec succès pour produire des anticorps fonctionnels, malgré une structure protéique identique certaines modifications post-traductionnelles peuvent intervenir et par conséquent modifier l'affinité des parties constantes pour les différents récepteurs aux FcGamma ou son immunogénicité. Après vérification in-vitro de ces différentes interactions anticorps récepteurs il était nécessaire d’étudier leur comportement dans un organisme vivant avec un système immunitaire mature et fonctionnel.
Réduction
Au-delà de l’utilisation du nombre minimum d’animaux pour obtenir une modélisation correcte de la pharmacocinétique de chaque anticorps, cette étude à terme permettra de remplacer les milieux de culture riches en sérum de veaux foetal par de l’eau de mer pour la production de ces anticorps. Le problème éthique majeur du sérum de veau foetal vient du fait qu’il provient du sang de foetus de vache, prélevé au moment de l'abattage de vaches gestantes. Le foetus est retiré du ventre de sa mère, et la totalité de son sang est prélevé par ponction cardiaque, le plus souvent sans anesthésie afin de garantir la qualité de l’échantillon. Ce nouveau mode de production permettra donc à court et à long terme moins d’utilisation de sérum de veaux foetal et donc d’animaux donneurs.
Raffinement
L’injection intraveineuse ainsi que les différents prélèvements seront pratiqués sous anesthésie générale à l’isoflurane. Afin de limiter le nombre de prélèvement sur chaque souris tout en garantissant un suivi sérologique optimal pour l’étude pharmacocinétique, les 16 souris seront divisées en 4 groupe de 4. De cette façon le nombre de prélèvements par individu sera divisé par 4, de plus les prélèvements seront alternés coté droit et gauche de la mandibule. L’innocuité de ces anticorps devant être totale, des points limites extrêmement précoces basés sur le mouse grimace scale et le poids seront appliqués :
Choix des espèces
La souris est un très bon modèle qui permet d'évaluer après modélisation le profil pharmacocinétique d'un anticorps monoclonal. La demi vie d'un anticorps et sa bio distribution au sein des différents tissus d'un organisme vivant sont dûs à un récepteur aux Fc des immunoglobulines G, le FcRn. Chez la souris il est totalement fonctionnel pour les IgG humaines ce qui permet d'évaluer la demi vie et la courbe de distribution par dosage cinétique des concentrations résiduelles dans le sang (volume périphérique) d'un anticorps choisi. Ces anticorps sont actuellement produits en utilisant des cellules de mammifères comme usines cellulaires. Récemment, les microalgues ont été utilisées avec succès pour produire des anticorps fonctionnels, malgré une structure protéique identique certaines modifications post-traductionnelles peuvent intervenir et par conséquent modifier l'affinité des parties constantes pour les différents récepteurs aux FcGamma. Cette étude chez la souris permettra donc d'évaluer ces modifications potentielles. Les souris seront utilisées à l’âge de 7 semaines pour que leur système immunitaire soit mature. Elles arriveront dans notre animalerie à l’âge de 6 semaines et seront acclimatées pendant 7 jours période nécessaire au développement d'un microbiote dépendant de notre animalerie.
Evaluation d’inhibiteurs de eIF4A en combinaison avec des thérapies ciblées anti-cancéreuses
- Recherche appliquée
- Cancers
6 098 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses sous la peau, des injections dans le ventre, des médicaments par gavage et des prélèvements de sang, pour tester huit inhibiteurs de la protéine eIF4A censés lever la résistance des mélanomes et cancers du poumon aux thérapies ciblées. Le porteur situe l'essai clinique et le bénéfice pour les patients dans un temps ultérieur, l'objectif immédiat restant de mesurer l'effet des composés sur la tumeur. Il affirme qu'aucun modèle in vitro n'est assez robuste et que le recours à un modèle animal "comparable au corps humain" est "indispensable".
Objectifs
Le mélanome est la première cause de décès par cancer des jeunes adultes. Les thérapies ciblées actuelles augmentent la durée de vie des patients porteurs d’une mutation sur le gène BRAF mais n’empêchent pas l’apparition d’un phénomène de résistance au traitement dans la grande majorité des cas. Nos récentes études ont montré que l’inhibition de la protéine eIF4A impliquée dans la traduction de l’ARN en protéine entraine une levée de cette résistance in-vitro. Ces découvertes encourageantes ont initié l’étude de l’utilisation d’inhibiteurs de la protéine eIF4A en combinaison avec les thérapies ciblées usuelles. Actuellement plusieurs dizaines de candidats sont en cours de caractérisation in-vitro afin de sélectionner les 8 inhibiteurs les plus prometteurs qu’il est indispensable de tester in vivo. L’objectif de ce projet est de démontrer l'efficacité in vivo de 8 inhibiteurs eIF4A, dans différents modèles de mélanome et de cancer du poumon qui est également très répandu. Ces modèles ont été choisis parce qu’ils modélisent plusieurs types de thérapies ciblées usuellement utilisées en cancérologie et qu’ils présentent différents degrés de sensibilité à celles-ci nous permettant ainsi de mimer différentes situations cliniques. Les souris recevront une greffe sous-cutanée de cellules cancéreuses, permettant d’obtenir un modèle rapide et reproductible, avec une mesure de la croissance tumorale directe et des métastases rares.
Bénéfices attendus
A l’heure actuelle aucun inhibiteur eIF4A n’a reçu d’Autorisation de Mise sur le Marché (AMM) pour le traitement des mélanomes et du cancer du poumon. Cela serait une avancée considérable dans la prise en charge des patients avec le recul du risque de rechute qui est malheureusement prévisible dans la plus grande majorité des cas. Les expériences in-vitro réalisées sur ces inhibiteurs présentent des conclusions très prometteuses lors de la combinaison avec une thérapie ciblée sur le phénomène de résistance. L’objectif par la suite sera de mettre en place un essai clinique dès qu’un inhibiteur eIF4A aura fait ses preuves dans le modèle animal afin de permettre aux patients d’en bénéficier dès que possible.
Procédures
Greffes de tumeurs en sous-cutanée sous anesthésie générale (durée 15 minutes). Injections en intrapéritonéale (durée 10 minutes). Administration de médicaments par gavage (durée 1 minute). Prélèvements de sang sous anesthésie générale, durée 2 minutes.
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à la présence de tumeurs unique sur le flanc en sous-cutanée.
Devenir
Mise à mort pour prélèvements post-mortems d'organes et de tissus aux fins d'analyses.
Remplacement
Il n'existe, à ce jour, pas de modèle in vitro modélisant suffisamment robuste pour tester ces synergies ni les interactions entre tumeur et système immunitaire. La variété et la complexité des cancers, ainsi que leur incidence élevée, rendent l’utilisation de modèles animaux cruciale pour comprendre comment le cancer se développe et pour améliorer les stratégies préventives, de diagnostiques et thérapeutiques. L'utilisation de modèles animaux comparables par de nombreux aspects au corps humain est donc indispensable pour l'évaluation des nouvelles approches thérapeutiques.
Réduction
Des études préliminaires sur cultures cellulaires ont permis d’affiner les tests d’optimisation et de cibler les analyses à effectuer et ainsi réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention de résultats statistiques significatifs. Ainsi, le nombre d’animaux a été défini pour utiliser l’effectif minimal d’animaux possible. Des études antérieures conduites dans les mêmes modèles d'étude et avec des cibles thérapeutiques différentes ont montré que 10 animaux par groupe sont nécessaires et suffisants pour obtenir des effets significatifs sur la croissance tumorale par rapport à des souris contrôle non traitées (procédures 3 et 4). De plus, les résultats de la procédure 3 nous permettront de réduire le nombre d'inhibiteurs à tester aux 5 les plus efficaces dans les modèles immunodéficients. La procédure 1 étant une étape préliminaire pour vérifier l’absence de toxicité in vivo, 3 animaux par groupe seront suffisants. La procédure 2 étant une étape d’optimisation, elle nécessitera également un nombre réduit de souris à savoir 3 animaux par groupe pour déterminer la dose et l’intervalle optimaux. Le nombre d'animaux indiqué est un nombre maximal qui pourra être réduit si le nombre de composés à tester diminue pour des raisons de toxicité ou autre raison.
Raffinement
Les animaux seront surveillés tous les jours lors des procédures qui sont raffinées par l’établissement de points limites précoces, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. De plus, des médications appropriées (anesthésiques et analgésiques) seront utilisées lors des greffes pour réduire la douleur et le stress de l’animal. La présence de souffrance sera recherchée en utilisant les critères habituels (état général, sous-alimentation, état du pelage, prostration). Les souris seront également surveillées quotidiennement afin de déceler le plus rapidement possible l’apparition de points limites précoces. Trois fois par semaine, les animaux seront pesés et les tumeurs mesurées.
Choix des espèces
Le génome de la souris a été séquencé et de nombreux outils ont été développés pour étudier ce modèle. De plus, on observe une croissance tumorale rapide chez ce modèle et son poids permet d’utiliser des doses de produits moins importantes. La souris est donc le modèle de choix pour l'étude des cancers. Le projet nécessite des souris adultes (5-8 semaines) sans plus de contraintes sur l’âge. Ceci se justifie par l’âge de la population humaine touchée par le mélanome et le cancer du poumon et ciblée par les éventuels traitements.
Validation d’un modèle porcin dédié à l’évaluation de biomatériaux de substitution osseuse destinés aux greffes alvéolaires secondaires des patients en cours de croissance porteurs de fentes faciales
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
8 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Âgés de trois mois pour rester en croissance, ils subissent une chirurgie d'environ deux heures sous anesthésie pour l'implantation de biomatériaux osseux, avec des risques de douleur, de saignement et d'infection reconnus par le porteur, puis des examens buccaux sous sédation aux jours trois et sept. L'objectif est de valider un modèle porcin pour évaluer des substituts osseux destinés aux enfants porteurs de fentes faciales. Le porteur affirme que les modèles de culture peinent à reproduire la perfusion et les contraintes mécaniques de la mastication, ce qui rendrait "pertinent" de disposer d'un modèle animal.
Objectifs
En France, l’incidence des fentes labiales et / ou palatines, toutes formes cliniques confondues, est de 1 pour 700 à 1000 naissances. Leur prise en charge nécessite plusieurs temps de réparation chirurgicale. La greffe osseuse alvéolaire secondaire (GOAS) intéresse les enfants en cours de croissance cranio-faciale, entre 5 et 7 ans. Bien que les biomatériaux soient utilisés en reconstruction osseuse adulte, leur emploi dans le domaine des fentes reste peu courant. Ils permettraient pourtant de s’affranchir de prélèvements iliaques aux complications multiples. En outre, l’amélioration des biomatériaux doit se confronter à un nombre limité de modèles animaux à même de retranscrire les particularités d’une greffe en site en cours de croissance cranio-faciale. Le choix du modèle porcin s’est fait en raison de son utilisation dans la littérature comme modèle dans l’étude des defects osseux maxillo-faciaux. En effet, il est considéré comparable à l’homme aux vues de sa ressemblance en terme d’anatomie, de morphologie, de sa capacité de guérison, de remodelage osseux et de sa densité minérale. De ce fait, sa pertinence est largement supérieure à celle du modèle rongeur pour les objectifs visés ici. L’objectif de ce projet est de valider un modèle gros animal (porcin) dédié à l’évaluation de biomatériaux de substitution osseuse destinés aux GOAS réalisée en cours de croissance cranio-faciale, par l’intermédiaire de l’implantation in-vivo de matériaux conventionnels et de nouveaux biomatériaux mis forme par impression 3D.
Bénéfices attendus
Les nouvelles approches thérapeutiques, comme l'ingénierie tissulaire, utilisent des échafaudages de biomatériaux (scaffolds) pour stimuler et guider la régénération tissulaire. Ils constituent un réseau tridimensionnel qui imite le micro-environnement extracellulaire favorisant la viabilité, la fixation, la croissance et la migration des cellules tout en maintenant la structure du tissu régénéré in-vivo. La littérature montre que les scaffolds sur mesure améliorent la précision et réduit le temps d'opération, tout en étant associés à de meilleurs résultats cliniques. Les principales applications de ce projet sont la mise à disposition d’un modèle gros animal à même de permettre l’évaluation de tel scaffolds implantés en site de croissance, ainsi que les premières évaluations de nouveaux biomatériaux de reconstruction utilisables pour les GOAS des fentes.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale afin d'implanter les biomatériaux de substitution osseuse sous anesthésie générale. La manipulation de chaque animal devrait durer environ 2h en comptant les phases pré et post-opératoires. Ils recevront en post-opératoire une antibiothérapie (Amoxicilline 1 g 3 fois par jour pendant 3 jours) ainsi que des antalgiques (anti-inflammatoires) systèmatiques pendant 48h. Il s'agit là d'injections réalisées en quelques secondes. A J3 et J7 post-opératoire, un examen clinique sous sédation ou anesthésie générale (la choix sera fait en fonction des résultats du pré-essai)sera réalisé sur l'ensemble des animaux pour effectuer un examen endo-buccal pour surveiller la cicatrisation. L’animal sera aussi pesé. Ces examens devraient durer environ 30min.
Impact sur les animaux
Durant l’intervention la douleur sera prise en charge puisque la réalisation du geste s'effectuera sous anesthésie générale et analgésie. Risque inhérent à l’anesthésie générale. Risque de saignement per opératoire. En post opératoire, les animaux seront particulièrement surveillés sur les points suivant: signes de douleurs, problèmes de cicatrisation, infection du site opératoire. Les douleurs et le risque infectieux sont principalement existant durant les 48 premières heures post opératoire. Difficultés d’alimentation en post opératoire pouvant résulter en une perte de poids. Une nouvelle évaluation clinique sera réalisée à 3 et 7 jours, source potentielle de stress et douleur liée à l’injection d’anesthésique en intramusculaire.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issu des procédures pour réaliser une évaluation radiologique et anatomopathologique.
Remplacement
L’évaluation physico-chimique et biologique in vitro est un préalable à l’utilisation de nouveaux biomatériaux en chirurgie oro-faciale. Pour autant, mêmes les modèles de culture tridimensionnels peinent à reproduire la physiologie humaine, notamment la perfusion constante des zones greffées et l’application de contraintes mécaniques à la mastication. A ce titre, il devient pertinent de disposer de modèles animaux d’évaluation des biomatériaux.
Réduction
Notre étude est une étude interventionnelle. Pour répondre à l’objectif principal qui est la validation du modèle, les défauts laissés vacants devront constituer des défauts critiques. Pour répondre aux objectifs secondaires, à savoir l'efficacité des matériaux implantés, l’évaluation se fera en comparaison à l’absence d’implantation de matériel correspondant au témoin sur le même animal. Une pré-étude afin de valider les protocoles chirurgicaux sera réalisé en amont sur 1 à 2 animaux. Pour évaluer les résultats nous réaliserons une analyse radiologique et anatomopathologique à 3 périodes, 30 jours, 60 et 120 jours. Ainsi nous réaliserons les expérimentations sur 3 lots de deux animaux. Ceci permettra une fiabilisation des résultats et de ne pas mettre en péril l’étude en cas de problème sur un animal. S’agissant de la validation d’un modèle, l’objectif principal reposera sur la bonne cicatrisation des zones greffées et le maintien de la physiologie des animaux, tout en validant la taille du défaut critique. Pour répondre à cette approche, l’utilisation de deux animaux par lot permettra d’obtenir des résultats tout en s’affranchissant de la variabilité individuelle. En parallèle, les paramètres de densité et volume osseux seront étudié de manière descriptive sans emploi de méthode statistique.
Raffinement
Afin de diminuer le stress péri-opératoire, il sera prévu une période d’acclimatation des animaux avant la prise en charge chirurgicale ainsi que l’administration d’une prémédication. L’intervention chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale et pour éviter toute douleur pendant l’intervention des antalgiques seront administrés en per opératoire, une couverture chauffante sera mise en place afin de prévenir l’hypothermie, un protocole d’asepsie sera strictement appliqué pour éviter le risque d’infection du site opératoire et une antibioprophylaxie préviendra également ce risque. Une injection de lidocaïne sera faite au niveau du site opératoire afin de diminuer les douleurs post opératoires et le risque de saignement per opératoire. Des antalgiques seront administrés de façon systématique afin de prévenir les douleurs en post opératoire.
Choix des espèces
Le porc est un animal de choix pour tester les biomatériaux de substitution osseuse car son taux de régénération osseuse (1,2-1,5 μm/j) est comparable à celui des humains (1,0-1,5 μm/j). De plus, il est considéré comme un des modèles représentatifs proches des processus de régénération osseuse chez l'homme en ce qui concerne l'anatomie, la morphologie, la capacité de guérison, le remodelage, la densité minérale. Le modèle porcin adulte a récemment été validé pour tester l’efficacité de greffe osseuse au niveau maxillo-facial. Pour autant, aucun travail n’a porté sur l’individu en cours de croissance. Les animaux seront âgés de 3 mois pour qu’ils soient toujours en cours de croissance.
Evaluation par imagerie multimodale d’une stratégie thérapeutique à base d’apeline-13 dans un modèle d’ischémie cérébrale murin
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
264 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par chirurgie sous anesthésie, suivi de jusqu'à onze séances d'imagerie, de prélèvements sanguins et d'injections dans le sinus rétro-orbitaire, pour tester un traitement répété à l'apéline. Le porteur reconnaît que l'infarctus peut entraîner des troubles de la déglutition, une asphyxie et la mort, ainsi qu'une hémiplégie potentiellement durable qui motive la mise à mort. Il affirme qu'aucun modèle in silico ou in vitro ne permet de reproduire un AVC et prélève le cerveau de tous les animaux.
Objectifs
L’Accident Vasculaire Cérébral (AVC) constitue la première cause d'handicap acquis chez l’homme, la 2ème cause de démence et la 3ème cause de mortalité en France. Sa forme ischémique est causée par l’occlusion d’une artère cérébrale par un caillot de sang. L’occlusion de l’artère entraine une crise énergétique, par défaut d’apport en glucose et oxygène et provoque la destruction rapide et définitive d’une zone du cerveau. Malgré l’avancée des traitements de recanalisations (thrombolyse chimique et thrombectomie mécanique), 50% des patients traités gardent des séquelles. La plasticité vasculaire et neuronale constitue le pivot de la récupération post-AVC. En situation post-AVC, différents mécanismes compensatoires de création de nouveau vaisceaux sont activés. Ces mécanismes physiologiques compensatoires peuvent s’avérer insuffisants pour assurer une reperfusion efficace lors d’épisodes ischémiques aigus, mais également chroniques. Plusieurs pistes expérimentales sont étudiées pour améliorer la récupération post-AVC (thérapies régénératives, agents neuroprotecteurs, entrainement physique + cognitif). Une molécule "l'Apeline" et son récepteur sont largement distribués dans différents tissus et organes. La littérature suggère un effet protecteur de l’Apeline sur la neurotoxicité, le stress oxydatif, l’apoptose neuronale et joue un rôle neuroprotecteur après une lésion aigue d’ischémie-reperfusion cérébrale. Cependant dans ces études une seule administration d’Apeline est faite le jour de l’ischémie, les bénéfices sont évalués à très court terme. L’objectif de ce projet est d’une part de caractériser le modèle AVC chez la souris à l’aide de l’imagerie clinique nucléaire et d’évaluer par la suite l’effet thérapeutique d'un traitement répété d’Apeline sur la récupération post-AVC dans ce modèle d'AVC murin.
Bénéfices attendus
Notre projet a pour objectif d’évaluer le potentiel neuroprotecteur d'injections répétées d’Apeline dans un contexte d’accident vasculaire cérébral (AVC) chez la souris. Ceci n’a jamais été rapporté dans la littérature à ce jour. Les troubles cognitifs pouvant être associés à l’AVC ont des répercussions négatives sur la qualité de vie du patient, sur le taux de mortalité dans les 4 années suivant l’AVC, et représentent un impact médico-social considérable pour la société. Il est donc essentiel de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le but de réduire ces troubles cognitifs. L’Apeline est un peptide dont l’effet neuroprotecteur est décrit lors d'une injection pendant l'ischémie. Dans ce modèles, les conséquences neurovasculaires de l’administration d’apeline sont encore très peu décrites. Dans ce projet l’objectif est de mettre en évidence l’intérêt d’un traitement répété sur une durée de traitement plus longue et d’évaluer l’impact de ce traitement sur la réduction des différents troubles moléculaires, moteurs et cognitifs après la survenue d’un AVC.
Procédures
(1) Chirurgie pour le modèle d'AVC, elle se fait sous anesthésié général gazeuse (durée moyenne 1h30 ) 1 fois par animaux. (2) imagerie isotopique: se fait sur souris anesthésié (5min pour l'injection du traceur, puis 30 minutes pour l'acquisitions des images) les animaux pourront avoir jusqu'à 11 imageries répartie sur 1 mois. (3) 3 Prélèvements sanguins (5 µL) par micro-incision sur la veine caudale, se fait sur animal anesthésié et 4 prélèvements de 150µl répartis sur 30 jours (durée 5 minutes le temps de l'induction de l'anesthésie gazeuse et du réveil). (4) injection des traitements, se fera en par injection dans le sinus retro-orbitaire sur animal anesthésie maximum 3 injections sur 3 jours (durée 5 minutes le temps de l'induction de l'anesthésie gazeuse et du réveil). (5) Frottis vaginaux 3 fois par semaines maximum sur animal anesthésiés (durée 5 minutes le temps de l'induction de l'anesthésie gazeuse et du réveil).
Impact sur les animaux
Ce projet nécessite des prélèvements sanguins itératifs, qui seront effectués par incision caudale pouvant entrainant une douleur au moment de l’incision et un risque d’infection. La chirurgie a pour conséquence de générer un infarctus cérébral conduisant à une perte de mobilité plus ou moins transitoire et d’intensité variable. Durant les premières heures, l'animal ne sera peut-être pas capable de boire ou manger, car il peut présenter des troubles de la déglutition, entrainant fausse route, asphyxie et décès. Une perte de poids peut être observée dans les jours suivants la chirurgie, ainsi que l'apparition d'infection au niveau des plaies. L’anesthésie prolongée lors de la chirurgie et des imageries peut induire un risque l’hypothermie. Les injections intraveineuses répétées dans les veines caudales ou dans les sinus rétro-orbitaires peuvent engendrer l’apparition de bleus et des risques de complications de cicatrisation.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures, qui entrainerait une hémiplégie potentiellement durable. A la fin des protocoles les cerveaux des animaux seront récupérer afin de faire des études complémentaires de type immunohistochimie ou analyse par westerne blot ou Elisa.
Remplacement
L’étude des Accidents Vasculaire Cérébraux (AVC) et de ces traitements, nécessite un modèle animal complexe (système nerveux, système vasculaire, connexion en les organes). En effet, les AVC ont des impacts au niveau de différentes structures du cerveau ainsi que de conséquences moteur et physiologiques sur l’ensemble de l’organisme. Il n’existe à l’heure actuel aucun modèle in silico ou in vitro permettant de mimer les impacts d’un AVC ou d’étudier les effets d’un traitement. Suite à l’induction du modèle chez les souris, et à la fin de nos études in vivo nous récupérons les organes pour compléter et enrichir nos données avec des études ex vivo.
Réduction
Cette étude nous permettra d’évaluer l’effet de l’Apeline dans la réduction de la neurotoxicité cérébrale suite à un AVC. La première phase du projet nous permettra d’évaluer la faisabilité du projet. Si nous n'arrivons pas à obtenir un modèle de'AVC chez la souris suffisamment reproductible (nombre d'échecs < ou = à 20% sur 15 chirurgies consécutives) le projet sera arrêté. Une souris avec un AVC réussi répondra à 3 critères : (1) perte de la perfusion cérébrale d’au moins 80%pendant l’ischémie ; (2) un score d'évaluation clinique à J1 supérieur à 4 ; (3) survie de plus de 5 jours. Le nombre maximal de chirurgies réalisées pour un opérateur pour valider le modèle sera de 50. Pour évaluer le modèle ischémie cérébrale transitoire chez la souris au cours du temps nous utiliserons l’imagerie isotopique, technique permettant des études non invasives, longitudinales, multiparamétriques et quantitatives, ce qui permet de minimiser le nombre d’animaux nécessaire. Nous nous basons sur l’expertise de la plateforme et nous aurons donc besoin de 8 souris par traceurs. Ce nombre est suffisant pour prendre en compte la variabilité interindividuelle et permettre de déterminer la meilleure fenêtre d’imagerie pour chaque traceur dans notre modèle. Le modèle d'AVC chez le rongeur a des impacts physiologiques et fonctionnels interindividuels très variés. Les études déjà publiés chez la souris utilisent des effectifs par groupe très variable. Pour la dernière phase de notre étude où nous évaluerons les effets d’un traitement précoce d’Apeline sur 3 jours, études qui n’ont jamais été réalisées chez la souris, nous nous baserons sur notre expérience du modèle chez le rat pour déterminer le nombre d’animaux nécessaire. Nous avons donc choisi d'avoir des groupes de 12 animaux pour nous permettre une évaluation statistique fiable à la fin de l'étude (anova two way pour les analyses longitudinales entre les différents groupes et test non paramétrique de wilcoxon pour les comparaisons entre 2 groupes).
Raffinement
Les chirurgies, prélèvements sanguins, les injections iv et les séances d’imagerie se feront sous anesthésie générale gazeuse, ce qui permettra de minimiser le stress de l’animal et un réveil rapide de l’animal. Les souris anesthésiées seront toujours placées sur un tapis ou lit chauffant avec contrôle de la température pour éviter tout risque d’hypothermie. Les expérimentations douloureuses seront toujours accompagnées en plus de l’anesthésie générale d’une analgésie locale et/ou générale par injection en s.c de morphinique . Pendant une heure après la chirurgie une surveillance accrue des animaux sera mise en place, pour éviter tout complications post-opératoires. L’accès à la nourriture et à l’eau ne permise qu’une fois que l’animal sera parfaitement réveillé pour éviter les problèmes de fausse route. Puis le bienêtre des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel qualifié, ce qui nous permettra d’intervenir rapidement dès le moindre signe éventuel de souffrance pour la prendre en charge. Tout signe et/ou comportement anormal : difficultés à respirer, souris prostrée, en retrait, ou une perte de poids, par exemple, sera signalé et pris en charge par des compléments alimentaires ou une médication adaptée. Si les signes clinique ne s’améliore pas ou que la perte de poids est supérieur à 20% du poids initial l’animal sera sorti du protocole et mis à mort sans délai pour éviter toutes souffrances inutiles. Les conditions d’hébergement classique, animaux hébergés en groupe (maximum 5 par cage), avec accès à la nourriture et l’eau sans restriction et avec un cycle jour/nuit de 12/12h, seront enrichi en alternance par l’ajout de dôme, de tube, de matériel (fibre de coton) pour la nidification, afin d’enrichir l’environnement et d’éviter les comportements de stéréotypies.
Choix des espèces
Le modèle d’AVC transitoire chez la souris est bien décrit dans la littérature. Cette technique d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (tMCAO) par un filament de nylon introduit dans l'artère carotide commune via l’artère carotide interne pour occlure l’artère cérébrale moyenne, reproduit l’accident vasculaire cérébral ischémique le plus fréquent chez l’humain (par occlusion de l’artère cérébrale moyenne). Les animaux seront utilisés au stade adulte entre 3 et 4 mois conformément au modèle décrit dans la littérature. Après réception, les animaux seront hébergés pendant 7 jours minimum avant le début du protocole expérimental.
Détermination de la composante neurodéveloppementale d’une neuropathie fatale chez l’Homme dans un modèle de poisson zèbre et modulations pharmacologiques à visée thérapeutique (EU1/2)
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
1 060 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent un prélèvement d'un à deux millimètres de nageoire caudale sous anesthésie pour le génotypage, l'administration de molécules candidates par l'eau ou par injection, et un test comportemental de tunnel de nage prolongé jusqu'à la fatigue de l'animal. Ce projet est le volet jumeau d'une même étude sur une maladie neuromusculaire humaine sans traitement curatif, et le porteur affirme qu'un essai dans un "organisme entier" est nécessaire, l'in vitro ne permettant pas d'étudier le comportement. Tous les poissons sont tués pour des analyses post-mortem.
Objectifs
Ce projet s’intéresse à une maladie neuromusculaire fatale chez l’Homme et pour laquelle il n’existe aujourd’hui aucun traitement curatif. Cette maladie est provoquée par des mutations d’un gène entrainant des troubles moteurs chez les patients dès l’enfance. Deux modèles poisson zèbre de la pathologie ont été créés et présentent les défauts de motilité au stade larvaire. Des molécules ont été identifiées comme capables de restaurer la motilité à ce stade de développement. Le premier objectif du projet est de définir s’il existe une composante neurodéveloppementale dans la maladie. Le deuxième est de déterminer si les molécules ont un potentiel thérapeutique lorsqu’elles sont administrées à un stade présymptomatique ou symptomatique.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans une démarche de recherche fondamentale en permettant de déterminer s’il existe une composante neurodéveloppementale dans la pathologie. Il s’inscrit également dans une démarche de recherche translationnelle puisqu’il permettra de déterminer quelle fenêtre de temps est adéquate pour le traitement.
Procédures
- Génotypage par prélèvement d’une petite partie de la nageoire caudale (1 – 2 mm) sous anesthésie générale (durée totale de l’endormissement au réveil : 15mn) : réalisé 1 fois – concerne 240 poissons - Administration de molécules candidates au stade développemental (durée d’administration de 8 à 48 heures post-fertilisation) directement dans l’eau : réalisée 1 seule fois – concerne 400 poissons - Administration de molécules thérapeutiques au stade adulte par injection sous anesthésie générale (durée totale de l’endormissement au réveil : 20mn) : réalisée 1 seule fois – concerne 400 poissons - Test du tunnel de nage sur animal vigile (Durée totale : 9 x 15mn) : réalisé 1 seule fois – concerne tous les poissons
Impact sur les animaux
Le génotypage des poissons par fin clip (prélèvement de 1 à 2 mm de la nageoire caudale) se fera à 4 mois sous anesthésie générale. La nageoire se reconstituant au cours du temps, il s’agit d’un acte pour lequel aucun effet indésirable n’est attendu (durée totale comprenant balnéation, prélèvement et réveil : 20mn – stress faible). Avant de réaliser le test du tunnel de nage, chaque individu est placé dans le tunnel de nage (phase d’habituation – durée : 15h) avec mise à jeun pour éviter toute contamination de l’eau avec les déjections et une altération des performances de nage. Le tunnel de nage (durée : 9 x 15mn – stress moyen) se déroule sur animal vigile dans un environnement proche de son habitacle naturel (faible court d’eau, oxygénation) et s’arrête dès lors que l’animal est fatigué, visualisé par le recul de l’animal dans le tunnel. L’administration des molécules thérapeutiques au stade développemental se fera par balnéation (durée : 40h – stress faible). L’administration des molécules thérapeutiques au stade adulte se fera par injection intrapéritonéale sous anesthésie générale (durée totale comprenant balnéation, injection et réveil : 20mn – stress faible). Les molécules thérapeutiques ne devraient apriori n’avoir aucun effet indésirable.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l’issu de chaque procédure pour permettre des analyses post-mortem.
Remplacement
Le projet vise à déterminer s’il existe une composante neurodéveloppementale dans la pathologie par analyse comportementale, et de déterminer le potentiel thérapeutique de molécules candidates sur les défauts moteurs de deux modèles poisson zèbre de la maladie. Les modèles in vitro ne permettant pas d’étuder le comportement, seul le modèle animal est donc possible. Le poisson zèbre est particulièrement adapté à ce projet puisque son système neuromusculaire est similaire à celui de l’Homme et fonctionnel au stade larvaire. De plus, l’utilisation de molécules candidates nécessite en première intention un essai dans un organisme entier. La formulation et l’administration de ces molécules sont simplifiées chez le poisson zèbre par rapport aux mammifères.
Réduction
Le projet est mené sur un nombre d’animaux réduit tout en permettant une analyse statistique suffisante. L’unique procédure de ce projet repose sur un test comportemental (tunnel de nage) qui permet d’évaluer les performances de nage dans un couloir qui reproduit le flux d’eau des habitats naturels. Un seul test par animal suffit à déterminer différents paramètres (temps de nage, distance de nage, vitesse de nage…) qui sont quantifiés par analyses statistiques. L’expérience indique qu’il est nécessaire d’avoir 20 animaux par condition. Le criblage pharmacologique effectué dans une étude antérieure in vivo nous permet également de réduire le nombre de molécules candidates à tester et donc le nombre d’animaux utilisés dans ce projet.
Raffinement
Les modèles poissons utilisés dans le projet permettent un élevage en conditions d’hébergement standards avec une surveillance quotidienne. Le temps entre le prélèvement de la nageoire caudale pour génotypage (4 mois) et le test du tunnel (6 mois) de nage permet de laisser le temps à la nageoire de se régénérer et de permettre une performance de nage optimale pour nos poissons. Les conditions du test comportemental sont proches de celles de son habitat naturel et des points limites adaptés ont été déterminés en amont pour éviter toute souffrance à l’animal. Dans le cas de l’injection intrapéritonéale, les animaux seront mis à jeun 24h avant pour permettre la rapidité du geste.
Choix des espèces
Avec la grande conservation fonctionnelle de ses gènes avec l’Homme, le poisson zèbre constitue un modèle idéal pour étudier des maladies génétiques dans un contexte physiologique et d’organisme entier. Il permet également de tester des approches pharmacologiques grâce à une formulation et administration simplifiées. L’étude de nos modèles a permis de démontrer des défauts moteurs durant les stades de développement. Il est maintenant nécessaire d’évaluer le phénotype au stade adulte pour considérer la robustesse de nos modèles, et de valider l’effet bénéfique de nos molécules candidates au regard de la pathologie humaine. Notre projet vise à déterminer si l’absence d’expression du gène causant la maladie durant le développement conduit à un phénotype moteur lors d’une stimulation (épreuve motrice) chez l’adulte. Pour cela, les poissons passeront le test du tunnel de nage à 6 mois, considéré comme stade adulte. Notre projet a également pour but de déterminer l’effet bénéfique de molécules candidates à deux temps différents, au stade développemental et au stade adulte. Les poissons seront donc traités avec les molécules candidates soit durant le développement (2 jours), soit à 4 mois.