Recherche appliquée

100 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale de cellules cancéreuses pour développer une carcinose du péritoine, un suivi tumoral par bioluminescence sous anesthésie, puis trois tests comportementaux que le porteur ne détaille pas, censés mesurer une "dépression". Elles sont tuées à J14 ou J28 pour analyses, un point limite de mise à mort étant fixé à 20 % de perte de poids. Le porteur affirme que le modèle murin ne peut être remplacé et espère qu'un antidépresseur pourrait freiner le développement des carcinoses chez les patients.

Objectifs

Un patient porteur d’un cancer va exprimer des troubles psychologiques. Le fait de se savoir malade d’une pathologie mortelle à court terme, d’y associer une possible prédisposition familiale, ou une exposition à des toxiques, va aussi affecter la thymie (siège des passions et de l’humeur) des patients. Une des manifestations est la dépression. Pour les cancers qui sont métastatiques au péritoine, nommés carcinose, la dépression est fréquente, 30% des carcinoses coliques et 70% des carcinoses ovariennes selon certaines publications. L’objectif de notre étude est d’évaluer cette dépression chez la souris développant une carcinose péritonéale et d’évaluer l’effet des traitements antidépresseurs ou/et chimiothérapie sur le développement de la carcinose et de la dépression.

Bénéfices attendus

Si l'utilisation d'un antidépresseur diminue la dépression des animaux et le développement de la carcinose péritonéale, nous pourrions mettre en évidence un nouveau type de traitement non invasif qui diminuerait le développement des carcinoses chez les patients. Aujourd’hui les patients qui reçoivent un traitement antidépresseur lors de leur soins, le reçoive souvent à l’initiative de leur médecin généraliste et non de l’oncologue et cela comme un traitement visant à améliorer leur qualité de vie et non la durée de leur survie.

Procédures

Les souris vigiles seront soumis à une injection de cellules cancéreuses en intrapéritonéale (1 fois 30 secondes) qui sera associée associé à une chimiothérapie (3 à 4 fois 30 secondes) ou à un anti-dépresseur (dilué dans l’eau de boisson pendant la durée de l’expérience). Puis sous anesthésie, ils auront un suivi non invasif par bioluminescence pour suivre l'évolution tumorale (3 fois 20 minutes pour les bal/c; 4 fois 20 minutes pour les C57BL/6) après une injection de luciférine (3 x pour les Balb/c (4X pour les C57BL/6) 0,1ml pour 10g, poids des souris). A J14 pour les Balb/c et à J28 pour les C57BL/6, les souris suivront 3 tests comportementaux (3 x 15 min par souris répétées deux fois donc 6 x 15 min). Ces tests comportementaux ont pour objectif la mesure de la dépression des animaux.

Impact sur les animaux

Les souris vont développer une carcinose péritonéale et nous observerons si le traitement par un antidépresseur va diminuer le développement tumoral au même titre que la chimiothérapie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à J14 ou à J28 post-injection des cellules cancéreuses pour des analyses post mortem.

Remplacement

Nous ne pouvons remplacer le modèle murin car un comportement dépressif corrélé à un développement de la carcinose péritonéale ainsi qu’une réponse du comportement à un anti-dépresseur et/ou une chimiothérapie ne peut être évalué in vitro.

Réduction

En dessous de 7 animaux par groupe, du fait des variations de nos modèles, en nombre de nodules ou vitesse de propagation de la maladie il y a trop peu de données pour avoir un résultat solide. Compte tenu de notre expérience sur le modèle et de la variabilité observée, un nombre minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire. En cas de groupe contrôle régulier nous nous autorisons à diminuer le nombre à 5 en acceptant pour faire les analyses scientifiques de pooler deux groupes contrôles. Ce sont des règles de bonne pratique pour toutes expériences en oncologie sur l’animal, utilisant des xenogreffes. Aussi, le suivi par bioluminescence d'un même animal tout au long de l'expérience permet de diminuer le nombre d'animaux. Nous réaliserons des tests Student et Anova en comparant le groupe CTRL avec les groupes traités par la chimiothérapie ou l'antidépresseur.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement. Lors du suivi de la croissance tumorale par bioluminescence, les animaux seront sous anesthésie générale gazeuse et avant l'intervention finale (ponction cardiaque) les animaux recevront une injection d'analgésie et seront ensuite sous anesthésie générale Différents points limites seront particulièrement surveillés tels que la perte de poids (>20%), la déshydratation, le comportement (yeux fermés, dos voûté, isolement), l’apparence physique (automutilation, plaies) et la gêne pour se déplacer qui seront notifiés dans un cahier de suivi des animaux 2 fois par semaine. De plus, le suivi par bioluminescence nous permet d’arrêter l’expérience avant que la progression tumorale soit trop importante (signal de bioluminescence étendu à tout l’abdomen) mais surtout de confirmer le développement de la carcinose et ne pas inclure des animaux non malades dans l’expérience.. Les cellules utilisées exprimant la luciférase, la bioluminescence correspond à l’émission de lumière à partir du substrat injecté en intrapéritonéale des souris, la luciférine, lue par un luminomètre. Les souris seront hébergées en portoir ventilé avec alimentation standard classique) et eau stérile ad libitum. Cycle nycthéméral 12h jour/12h nuit Température : 22°C Aussi, les souris disposeront d’enrichissement tels que maison rouge, nids en papier kraft ou buchette de bois à ronger pour leur permettre d’exprimer tout le comportement social normal d’une souris et ainsi améliorer leurs conditions d’hébergements. En cas d’atteinte des points limites, ils seront alors exclus de l'expérience dans les 24heures.

Choix des espèces

Il s’agit de souris femelles immunocompétentes (BALB/c ou C57BL6). Ces types de souris sont utilisés largement dans la recherche en cancérologie pour sa capacité d’incrémenter l’incidence tumorale après injection des cellules cancéreuses. Les CT26 correspondent à une lignée de cellules cancéreuses du côlon murin qui est issue des Balb/C alors que les ID8 correspondent à un lignée de cellules cancéreuses ovarienne murines qui est issue des C57BL/6. Les souris seront utilisées à l’âge de 8 semaines pour ne pas interagir avec les processus de vieillissement.

48 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant 56 jours ils reçoivent des additifs alimentaires à base de plantes, subissent des pesées et deux prélèvements sanguins à la jugulaire par immobilisation au lasso, avant d'être tués pour prélever leur contenu intestinal, leurs muscles et leur graisse. L'objet du projet est de valider des additifs commerciaux réduisant les émissions d'ammoniac de l'élevage porcin intensif, en vue de leur mise sur le marché. Le porteur affirme que l'inconfort se limite au stress de la contention et présente l'expérimentation in vivo comme la suite de tests in vitro déjà probants.

Objectifs

Le projet présenté ici a pour objectif d’évaluer une solution pour atténuer les émissions gazeuses, spécialement d’ammoniac, enregistrées en élevage intensif des porcs. Les émissions atmosphériques de composés polluants sont au centre des préoccupations environnementales et concernent notamment le secteur de l’agronomie avec l’élevage porcin qui constitue un gros émetteur de gaz. Les émissions proviennent des déjections des animaux qui dépendent de la composition des régimes alimentaires et des performances des animaux. Les aliments à teneur élevée en protéines non valorisée par les animaux conduit à une excrétion d’azote importante sous formes d’azote fécal et d’azote urinaire composé d’urée, pour éliminer l’ammoniaque issu du catabolisme des protéines, rapidement converti en azote ammoniacal. Cet azote ammoniacal conduit à des émissions d’ammoniac (NH3) et de protoxyde d’azote (N2O), en bâtiment, au stockage et à l’épandage. Les mesures de réduction des apports azotés et donc de l’excrétion d’azote pourraient être utilisées à la fois pour réduire les émissions de gaz à effets de serre (GES) mais aussi et en priorité pour réduire les émissions d’ammoniac, compte tenu de ses effets sur la santé humaine, la santé animale, l’acidification et l’eutrophisation. Depuis plusieurs années, des stratégies ont été développées pour réduire les émissions d’azote, dont l’ammoniac. Une des stratégies vise notamment à optimiser l’alimentation animale (volailles et porcins), avec l’ajustement des apports protéiques dans les rations. En effet, une alimentation à basse teneur en protéines permet de réduire les quantités de protéines ingérées par les porcs, et donc les excrétions azotées des animaux ainsi que les pertes gazeuses associées, sous forme d’ammoniac. Une autre stratégie consiste aussi ces derniers temps à utiliser des extraits de plantes (extrait du thé vert, d'olive, de réglisse) comme additifs naturelles pouvant être ajoutées à la ration alimentaire pour empêcher efficacement la libération d’ammoniac dans l’air à différents niveaux.

Bénéfices attendus

Les émissions d'ammoniac provenant des élevage d'animaux font fréquemment l'objet de plaintes pour odeurs et de préoccupation en raison de la possibilité de leurs effets négatifs sur la santé des humains et des animaux. Les animaux peuvent développer une variété de troubles lorsqu'elles sont exposées à des niveaux élevés d'ammoniac pendant des périodes prolongées. Il est donc très important de développer des stratégies efficaces pour réduire les émissions de NH3 provenant des lisiers. Les résultats de ce projet permettront donc de valider l’utilisation d’inhibiteur d’uréase comme stratégie de réduction des émissions gazeuses en élevage porcins et comprendre leur mode d’action, et d’identifier de nouvelles substances qui contribueront à la rétention de l’azote.

Procédures

Les animaux seront soumis à la procédure pour une durée de 56 jours. Les animaux seront soumis au cours de la procédure à deux prélèvements sanguins au niveau de la veine jugulaire. Les deux prélèvements sanguins seront réalisés avec une période de récupération de 4 semaines entre les deux. Pour chaque prise de sang le temps de prélèvement ne dépassera pas 1 minute.

Impact sur les animaux

Perte de poids, ralentissement de la croissance en cas de réduction de l'ingestion alimentaire (palatabilité), refus d'alimentation. Stress dû à la conduite des animaux en vue de leur pesée individuelle. Inconfort et stress dus à l’immobilisation des animaux à l'aide d'un lasso pour la prise de sang.

Devenir

Tous les animaux entrant dans la procédure expérimentale seront mis à mort à l'issu de la procédure afin de réaliser des prélèvements d'échantillons biologiques (contenus intestinal, muscle, mesure d'épaisseur de graisse)

Remplacement

Le projet envisagé fait suite aux tests in vitro réalisés au préalable afin d'évaluer l'efficacité des substances testées. Les résultats ayant montré des résultats probants, la finalité de la démarche consiste ensuite à démontrer l’effet bénéfique de l’ajout des substances d’origine végétale sur la réduction de l’émission gazeuse tout en maintenant l’efficacité de croissance des animaux.

Réduction

Sur la base des résultats rapportés dans la littérature, l'addition de substance d'origine végétale a des effets positifs sur différents paramètres liés à l'accrétion protéique, la rétention d'azote par l'animal, paramètres cibles de décision dans ce projet pour montrer les effets bénéfiques de la supplémentation des additifs testés. Une approche statistique a permis d'évaluer la taille de l'échantillon nécessaire afin de montrer un effet attendu de 5 % .L'analyse statistique a montré que 12 animaux par lot étaient necessaires pour montrer une difference significative.

Raffinement

Le stress dû à la conduite des animaux en vue de leur pesée individuelle est réduit en réalisant les opérations de conduite jusqu’à la balance en évitant de claquer les portes des cages métalliques, en déplaçant les porcs en groupe (cage par cage) dans le calme en prenant en compte le point de balance de l’animal qui avance si l’opérateur est placé en arrière du point de balance et qui recule si l’opérateur est placé en avant du point de balance. L’opérateur doit porter une tenue de couleur sombre, et stimuler les animaux par la voix et la main afin de guider leur déplacement. Des panneaux de conduites, des tapettes en plastiques sont autorisés pour la conduite des animaux. La mesure du gras dorsal est réalisée au moment de la pesée au niveau de la balance afin d'éviter une manipulation supplémentaire des animaux ou directemnt dans la cage pour éviter de manipuler l'animal. Lors des prises de sang, chaque animal est présenté à l'aide d'un lasso en acier souple en bon état, maintenu à la main et tiré vers l’avant afin que la tête soit alors présentée légèrement relevée pour des porcs de plus de 30 kg. L’inconfort et le stress dus à l’immobilisation des animaux sont réduits par une manipulation compétente et rapide des animaux par les applicateurs de la procédure, par un prélèvement de faibles volumes de sang en fonction de la volémie et par l’application d’un point de pression sur le site de prélèvement comme décrit dans le procédure interne « Geste technique sur animaux vivants : prises de sang » qui définit le volume limite de prélèvement sanguin et les périodes de récupération nécessaires. A la fin de la prise de sang, l’animal peut être caresser au niveau du groin ou sous le cou. Les conditions d’hébergement des animaux sont définies de telle sorte que l’enrichissement des cages (ballons, croix, chaine), la densité des animaux par cage, ou encore les paramètres environnementaux (température et hygrométrie…) procurent le maximum de confort aux animaux, et restent supérieurs ou égaux à la législation en vigueur (Arrêté du 01/02/2013). Aucun animal ne reste isolé, en cage individuelle sans contact olfactif, auditif et visuel avec ses congénères, ceci afin de réduire au minimum l’angoisse et le stress des animaux..

Choix des espèces

Les additifs alimentaires développés sont destinés à être incorporés dans les aliments destinés aux porcins (porcs en croissance) qui représentent de ce fait la cible privilégiée des produits que nous voulons mettre sur le marché. Porcs : études avec des animaux sevrés à 28 jours d’âge au niveau de l’élevage et réceptionnés avec un poids vif de 28-32 kg en moyenne Les animaux sont utilisés au stade de l'engraissement qui constitue le stade de développement qui génère le plus d'émissions gazeuses, permettant ainsi d'évaluer les solutions proposées par ce projet.

260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Infectées de façon répétée par une génotoxine bactérienne, elles subissent des injections, des imageries et des prélèvements de sang étalés sur six à dix-huit mois, pour tenter de démontrer que cette toxine cause un cancer du foie. Le porteur mentionne une perte de poids liée à l'inflammation hépatique et une fatigue liée aux prélèvements répétés. Il justifie l'euthanasie par le prélèvement des organes et affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative pour reproduire ce processus.

Objectifs

Nous sommes fréquemment infectés par des bactéries qui produisent des toxines qui endommagent l’ADN de nos cellules et seraient à l’origine de cancers digestifs. Parmi ces toxines, la génotoxine CDT est répandue chez de nombreuses bactéries. L’objectif est de démontrer que cette génotoxine induit le cancer.

Bénéfices attendus

Cette étude devrait permettre de démontrer le rôle direct et causal de la génotoxine dans la transformation maligne, démontrant que l'infection chronique et/ou répétée par des bactéries productrices de cette génotoxine cause le cancer.

Procédures

L'ensemble des gestes sera réalisé sur animaux anesthésiés. Injection dans la circulation sanguine (inférieur à 3 minutes) : une seule fois pour 100 animaux, tous les 2 mois environ pendant 6 mois (40 animaux), 12 mois (60 animaux) ou 18 mois (60 animaux). Imagerie nécessitant une injection dans le péritoine (inférieur à 10 minutes) : 2 fois par semaine pendant 2 semaines (40 animaux), 1 fois par semaine pendant 1 mois (20 animaux), 2 mois (20 animaux) ou 4 mois (20 animaux), 2 fois par mois pendant 6 mois (40 animaux), 12 mois (60 animaux) ou 18 mois (60 animaux). Prélèvement sanguin (inférieur à 3 minutes) : 2 fois par semaine pendant 2 semaines (40 animaux), 1 fois par semaine pendant 1 mois (20 animaux), 2 mois (20 animaux) ou 4 mois (20 animaux), 2 fois par mois pendant 6 mois (40 animaux), 12 mois (60 animaux) ou 18 mois (60 animaux).

Impact sur les animaux

Possible perte de poids liée au développement d’une inflammation au niveau du foie et voir d’une carcinogénèse. Fatigue liée aux prélèvements sanguins répétés, dans ce cas les prélèvements seront davantage espacés.

Devenir

Nous souhaitons faire des analyses sur les prélèvements issus des animaux. Pour cela les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour que leurs organes soient prélevés.

Remplacement

Nous souhaitons voir les effets d’une infection longue et répétée de bactéries productrices de la génotoxine CDT. Notre hypothèse est que la CDT induit le développement de cancer hépatique. L’étude chez la souris est indispensable pour permettre de voir le développement éventuel d’un cancer au niveau hépatique après des mois d’infection constante à la CDT. Il n'existe pas de méthodes alternatives pour mimer ce processus.

Réduction

L'imagerie de bioluminescence nous permet de faire un suivi longitudinal sur un même animal. Nous sommes également capables de réaliser des bilans hépatiques à partir de petits volumes de sang au cours du temps, sur un même animal. Ces 2 procédés nous permettent de réduire le nombre d'animaux. Des analyses seront aussi effectuées sur les tissus récoltés.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (nids de woodwoll). Une mise en place de points limites évalués par une grille de scoring spécifique a été mise en place pour le suivi des souris. Les souris seront pesées 2 fois par semaine, en cas de perte de poids nous mettrons de la nourriture humidifiée dans la litière et les souris seront pesées quotidiennement durant les prochaines 48H. Si la perte de poids persiste les souris seront euthanasiées. Afin de pallier à une éventuelle déshydratation liée aux prélèvements sanguins, du sérum physiologique sera administré à l’animal après chaque prélèvement.

Choix des espèces

De par notre expérience l’inflammation hépatique provoquée par une infection bactérienne se fait très bien chez la souris. Le modèle souris est également un modèle de choix vis-à-vis de la technique de suivi en imagerie que nous avons mis en place. Nous travaillerons avec des jeunes adultes car nous souhaitons garder les animaux jusqu’à 18 mois suivant les lots. Le cancer touchant les 2 sexes, nous travaillerons avec des mâles ou des femelles.

24 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée d'organoïdes cérébraux humains, puis une ouverture de la cage thoracique et une exsanguination sous anesthésie, avant le prélèvement des greffons. Le porteur avance que valider ces organoïdes vascularisés pourrait à terme "réduire fortement l'utilisation d'animaux" pour l'étude des tumeurs cérébrales, un bénéfice conditionné à la réussite du modèle. Il affirme qu'aucune méthode alternative n'existe pour vérifier la vascularisation, faute de circulation sanguine hors d'un animal vivant.

Objectifs

Les organoïdes cérébraux sont composés de différents types de cellules (neurones et cellules gliales) d’origine humaine constituant le cerveau. Nous développons une nouvelle génération d’organoïdes cérébraux qui sont pourvus également de vaisseaux sanguins, car la vascularisation joue un rôle essentiel dans la physiopathologie du cerveau. En particulier, dans le contexte de tumeurs cérébrales, la vascularisation favorise la survie et la croissance tumorale. Ce projet a pour but de valider que la vascularisation de ces nouveaux organoïdes est fonctionnelle. Cette validation sera obtenue par transplantation des organoïdes à des animaux. Ce nouveau modèle permettra d’étudier les mécanismes de la croissance des tumeurs cérébrales et de développer de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de vérifier que notre modèle d’organoïde comporte une vascularisation fonctionnelle. La présence de vascularisation est importante dans le cadre des études des tumeurs cérébrales car elle joue un rôle important dans le développement tumoral. Si la vascularisation des organoïdes est fonctionnelle, de nombreuses expériences sur les cancers cérébraux et, en particulier, les tests des médicaments anticancéreux ne nécessiteront plus l’utilisation d’animaux. Ce modèle réduira donc fortement l’utilisation d’animaux ; en particulier dans le cadre des études sur les tumeurs cérébrales comme le glioblastome.

Procédures

L’opération de greffe sous-cutanée des organoïdes cérébraux comporte 4 étapes (injection d’un antalgique, une anesthésie gazeuse, une incision cutanée et un point de suture) pour une durée totale de moins de 15 min/souris. Un mois après la greffe, un produit fluorescent sera administré sous anesthésie afin de colorer les vaisseaux sanguins. Cette opération comporte 5 étapes (injection d’un antalgique, injection d’anesthésique, ouverture de la cage thoracique, perfusion de la solution fluorescente et exsanguination) cette opération est suivie de la mort de l’animal. L’opération dure 15-20 min (sans compter la période de 30 min après l’injection d’antalgique);

Impact sur les animaux

Les opérations de greffe sous-cutanées ne sont pas très invasives et devraient n’entraîner que des perturbations physiologiques et cliniques mineures. Néanmoins, un stress opératoire et une douleur post-opératoire sont attendus mais cette dernière sera limitée par une pharmacologie adaptée. L’anesthésie pourrait entraîner une détresse respiratoire voire un arrêt cardio-respiratoire et ceux-ci seront surveillés.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélever les organoïdes afin de réaliser des analyses histologiques.

Remplacement

Aucune méthode alternative n’existe pour vérifier que la vascularisation des organoïdes est effective. Les expériences de transplantation permettront à la vascularisation de l’organoïde de se « connecter » à la vascularisation de l’hôte grâce à une néo-vascularisation. En revanche, cette dernière ne peut être obtenue que si l’animal est vivant et permettre une circulation sanguine dans l’organoïde.

Réduction

La procédure sera réalisée sur un total de 6 lots d’animaux afin d’analyser des organoïdes d’âges différents obtenus avec deux lignées de cellules souches pluripotentes. Les analyses histologiques révèlent que la grande majorité des organoïdes que nous avons obtenus à ce jour présentent des structures ressemblant à des vaisseaux dès un mois. Ainsi, nous testerons deux groupes d’âge : organoïdes jeunes (1 mois) et organoïdes âgés (4-6 mois) pour les 2 lignées dont nous disposons. Par ailleurs, nous avons estimé qu’un nombre de quatre animaux par lot d’organoïdes serait suffisant pour appréhender la variabilité expérimentale. Ainsi, un maximum de vingt-quatre souris devra être utilisé pour ce projet (6 lots x 2 ages x 2 lignées). Les expériences seront réalisées de façon séquentielle afin d’arrêter le protocole si cela est suggéré par les premiers résultats.

Raffinement

Un protocole d’anesthésie/analgésie sera mis en place pour les greffes d’organoïdes. Par la suite, une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier l’état clinique des animaux et les critères d’arrêt de souffrance sont prédéfinis.

Choix des espèces

De nombreuses études ont montré la néovascularisation de greffons ou d’organoïdes humains lorsqu’ils sont greffés chez la souris adulte. Les xénogreffes seront réalisées chez des souris adultes âgées de 2 mois. La formation de nouveaux vaisseaux sanguins, ou néovascularisation, est toujours observée chez la souris adulte.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation d'un canal sodique cardiaque, elles subissent l'implantation chirurgicale de capteurs de télémétrie et trois échocardiographies sous sédation avant que leur cœur ne soit prélevé. Le porteur qualifie ses investigations d'"indolores et non-invasives" tout en décrivant une étape chirurgicale de 25 minutes et un isolement de dix jours en cage individuelle. Il affirme que la progression de la maladie ne peut s'étudier que dans un "organisme entier" et conclut qu'aucune méthode de substitution n'existe.

Objectifs

Le projet consiste à étudier une pathologie : la cardiomyopathie dilatée, liée à une mutation d’un canal ionique (sodique) cardiaque. Le mécanisme induit par la mutation est nouveau. Les investigations in-vivo sont essentielles pour comprendre le développement de la pathologie et permettre de nouvelles approches thérapeutiques. Il s’agira de caractériser, de manière non-invasive, les effets de la mutation sur différents paramètres cardiaques clés d’un modèle murin (souris) porteur de la mutation.

Bénéfices attendus

Des données cliniques humaines associent la mutation étudiée ici à une cardiomyopathie dilatée. La mutation d'un canal ionique est le plus souvent accompagné par le développement d'un phénotype remarquable in-vivo, pouvant se traduire par des effets sur l'électrocardiogramme (ECG), avec la survenue d'arythmies très souvent létales, et des modifications de la structure, de la morphologie et de la fonction du cœur. L'étude in-vivo est incontournable pour valider le concept du lien entre la mutation et la cardiomyopathie dilatée, étudier la relation gène-phénotype complexe (parfois contre-intuitive), et évaluer le potentiel thérapeutique de molécules visant, soit directement la cible d'intérêt, soit indirectement le remodelage cardiaque pathologique. A notre connaissance, il n'y a aucune étude équivalente à l'heure actuelle.

Procédures

Les investigations in-vivo sont indolores et non-invasives. On notera une étape chirurgicale légère, unique, d'une durée de 25 minutes qui consiste à implanter les capteurs de signaux en amont des enregistrements d’ECG en télémétrie. Les capteurs sont retirés après le sacrifice des animaux. Les enregistrements ECG sont complètement neutres pour l’animal (pas de présence humaine, pas de stress, réalisés en ambulatoire comme chez l’homme). Trois échocardiographies seront réalisées avec des anesthésies légères et un stress limité à une manipulation pendant 10 minutes.

Impact sur les animaux

La lignée murine utilisée, génétiquement modifiée, est établie depuis plusieurs générations avec une transmission de la modification génétique stable. Ni dans le laboratoire qui l’a établie, ni dans notre étude pilote, il n’a été noté de phénotype dommageable. Le phénotype est purement cardiaque (comme attendu) avec une insuffisance cardiaque, modérée et stable, et des troubles du rythme ne conduisant pas à la mort subite. L’échocardiographie est une méthode de choix pour l’exploration indolore de la morphologie et de la fonction cardiaque in-vivo. Sa nature non invasive permet des études longitudinales avec un suivi des animaux au cours du temps. Elle permettra de caractériser la fonction cardiaque in-vivo (3 investigations). Le stress subi se limite à la manipulation pendant une période courte (10 min/animal). Une sédation légère permet l’obtention d’images échocardiographiques de qualité (rythme cardiaque proche de la physiologie). Concernant l'enregistrement des ECG par télémétrie en ambulatoire, le bénéfice expérimental inclut l’absence d’interférence liée à une anesthésie, sans limitation de la durée d’observation, avec un accès aux périodes diurnes et nocturnes, une qualité supérieure du signal. La nuisance liée à l'implantation chirurgicale des capteurs (25 minutes) est limitée. Après l’implantation, les aninaux sont maintenus en cage unique pendant 10 jours pour : (i) éviter des blessures au niveau des cicatrices chirurgicales par les congénères (risque d’inflammation ; modification des conditions expérimentales) et, (ii) respecter la nécessité technique d’avoir un seul animal par plaque (qui est le receveur des signaux) d'enregistrement de l'ECG.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour prélever le coeur à des fins d'études in vitro (électrophysiologie, biochimie, histologie).

Remplacement

Le projet, dans sa globalité fait appel à des approches in-vitro et in-vivo. Les approches in-vitro concernent la caractérisation des effets moléculaires et cellulaires de la mutation. Elles permettent de comprendre les mécanismes de base, sans utilisation d’animaux. Pourtant, la validation des effets dans un modèle expérimental in-vivo est indispensable pour évaluer l’impact de la mutation sur la fonction cardiaque intégrée. Il n'existe actuellement aucune méthode (in-vitro ou in-silico) de substitution. Le cœur est un organe complexe, en interaction forte avec de nombreux autres systèmes. La progression de la maladie et les nombreux effets qui découlent de la mutation ne peuvent être étudiés que dans un organisme « entier ». La validation du modèle et les connaissances acquises permettront cependant d’évoluer vers l’utilisation de cellules cardiaques dérivées de cellules souches de patients en se basant en partie sur les connaissances acquises in-vivo.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux utilisés tout en obtenant des informations fiables et robustes, nous utiliserons deux techniques de choix dérivées d’approches couramment utilisées chez l’homme en clinique ; à savoir : (i) l’électrocardiograhie (ECG par télémétrie) et (ii) l’échocardiographie. Elles permettent toutes les deux un suivi de l’animal au cours du temps ; ce qui permet d’augmenter la puissance statistique et de limiter le nombre d’animaux utilisés dans le cas d’une pathologie évolutive comme la cardiomyopathie. Les animaux peuvent ainsi faire l’objet d’investigations répétées (chaque animal étant son propre témoin), au lieu d’être sacrifiés à chaque stade de la pathologie. Le protocole expérimental a été conçu à partir d'études similaires. Notre expérience permet, pour chacun des paramètres étudiés, de définir de manière pratique, le nombre minimum, mais scientifiquement nécessaire, d'animaux dans chaque groupe. Il est à noter que le phénotype cardiaque murin normal est parfaitement connu; ce qui simplifie et fiabilise les interprétations scientifique, et réduit ainsi le nombre d'animaux nécessaire.Nous avons évalué le nombre d’animaux nécessaires par une étude statistique, établi à un minimum de 10 par groupe (échocardiographie, ECG). Dans un souci de Réduction, chaque animal sera également utilisé pour mesurer plusieurs autres caractéristiques (physiologiques, histologiques, biochimiques et moléculaires).

Raffinement

Nous réaliserons des approches in-vivo non invasives (électrocardiographie, échocardiographie) pour comparer le phénotype murin pathologique avec la pathologie humaine afin de transférer les résultats et les connaissances acquises vers la clinique. Nous veillerons à maintenir les meilleures conditions de vie possibles pour les animaux tout au long du protocole, ce qui garantira aussi la qualité et la pertinence des résultats scientifiques. Cela inclut la réduction des contraintes pour les animaux, en matière de stress (ex : période de « repos » après le transport), de douleurs éventuelles (soins adéquats avant, pendant et après l’implantation des capteurs de télémétrie ; anesthésie/analgésie), d’enrichissement du milieu (jouets, tunnel, etc…), de détresse, de points limites et d’arrêt anticipé des procédures expérimentales. Une grille d’évaluation avec différents scores a été établie pour mesurer, réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse, et pour définir précisément des points limites et l’arrêt anticipé de la procédure.

Choix des espèces

Les animaux transgéniques sont principalement des modèles murins (souris). Les rongeurs sont effectivement le modèle le plus couramment utilisé en laboratoire. Ceci est particulièrement vrai pour l’étude du phénotype pathologique résultant de mutations humaines (comme décrit ici). Le phénotype cardiaque murin normal est parfaitement connu, à la fois au laboratoire et via une bibliographie abondante ; ce qui simplifie et fiabilise les analyses et les interprétations scientifique. Cela réduit aussi le nombre d'animaux nécessaire pour maitriser le modèle. Les animaux seront réceptionnés au stade jeune adulte, entre 4 et 8 mois. Ils seront utilisés après une période d'adaptation dans l'animalerie. Le stade choisi rend plus faciles et précises les investigations échocardiographiques et l'implantation des capteurs de télémétrie pour l'ECG (taille de l'animal). Il s’agit également d’un stade approprié pour l’étude de la progression de la cardiomyopathie.