Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Etude d’excrétion chez le rat après application cutanée d’un produit chimique
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
1 760 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est isolé jusqu'à sept jours dans une cage à métabolisme, le dos rasé et recouvert d'un dispositif collé, pendant qu'une molécule chimique appliquée sur la peau est suivie dans son organisme. Le porteur reconnaît que l'isolement, la contention sur grille et le dispositif provoquent stress et inconfort, et que le produit testé peut entraîner démangeaisons ou irritation. Il présente ces essais d'excrétion cutanée comme des études de sécurité réglementaires requises par les autorités, et justifie le choix du rat par la guidance OCDE 427.
Objectifs
Ce projet a pour but de décrire les études d’excrétion réalisées chez le rat après l’application cutanée d'un produit chimique dans le contexte de l’approche suivante : la comparaison des résultats obtenus in-vitro sur peau humaine et peau de rat avec les résultats obtenus in-vivo chez le rat pour prédire les résultats lors de l’application chez l’humain. L’objectif de chaque étude réalisée dans le cadre de ce projet est d’évaluer l’absorption, la distribution cutanée au point d'application et l’excrétion d’une molécule chimique chez le rat après l’application cutanée unique de cette molécule. Cette étude permet de connaître la fraction de la molécule chimique d’intérêt qui est susceptible de traverser la peau et d’atteindre la circulation sanguine. Les quantités retenues dans la peau sont également déterminées. Le projet est justifié d’un point de vue de la législation : les études réalisées dans le contexte de cette approche permettent d’évaluer la sécurité de produits chimiques suivant les guidances spéficiques à ces études et sont ainsi requises et inspectables par les autorités. Le projet est également justifié d’un point de vue scientifique : les résultats de l’étude in vivo chez le rat permettent dans le contexte de cette approche de prédire ce qu’il se passe chez l’humain, dans le même contexte d’évaluation de la sécurité des produits chimiques, évaluée par les mêmes autorités.
Bénéfices attendus
Ce type d'étude permet de comprendre comment des molécules sont excrétées de l'organisme et fait partie des études de sécurité obligatoires dans le cadre du développement d'un nouveau produit chimique selon les guidances spécifiques à ce type d’études.
Procédures
Les animaux sont placés individuellement dans les cages à métabolisme pendant maximum 168h après 3 à 4 jours d’acclimatation sur litière. Un dispositif utilisé pour délimiter et protéger le site d'application cutané est collé sur le dos de l'animal dans une zone rasée pendant toute la durée de l'expérimentation (conformément à la guidance spécifique à ce type d’étude).
Impact sur les animaux
« Le placement individuel en cage à métabolisme pendant un maximum de 168h après 3 à 4 jours d’acclimatation sur litière est une situation d’isolement pouvant entrainer un stress de l’animal, tandis que la mise sur grille dans la cage peut entrainer un inconfort (classe de sévérité modérée). La présence d’un dispositif collé sur le dos de l’animal pendant toute la durée de l’expérimentation pour délimiter et protéger le site d’application cutané dans une zone rasée (conformément à la guidance spécifique à ce type d’étude) peut entrainer un inconfort pour l’animal (classe de sévérité légère). Selon le type de produit appliqué sur la peau, les nuisances peuvent être de l’inconfort telles que des démangeaisons ou une irritation (classe modérée). »
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de l'étude, afin d’analyser la quantité de molécule chimique retrouvée dans le corps de l’animal et non excrétée.
Remplacement
L’étude est réalisée à la suite d’études menées in vitro : la variabilité observée sur les résultats obtenus in vitro permet d’évaluer le nombre d’animaux nécessaires in vivo. Ainsi, selon les guidances, le nombre minimum d'animaux est défini à 12 (3 temps de collecte et 4 animaux par temps de prélèvement). En fonction de la variabilité attendue au niveau des résultats et suivant la guidance EFSA, le nombre d’animaux au dernier temps de prélèvement terminal peut être porté à 8 afin d'augmenter la puissance statistique de l'analyse des résultats en réduisant la variabilité.
Réduction
L’étude est réalisée à la suite d’études menées in vitro : la variabilité observée sur les résultats obtenus in vitro permet d’évaluer le nombre d’animaux nécessaires in vivo. Ainsi, selon les guidances, le nombre minimum d'animaux est défini à 12 (3 temps de collecte et 4 animaux par temps de prélèvement). En fonction de la variabilité attendue au niveau des résultats et suivant la guidance spécifique à ce type d’étude, le nombre d’animaux au dernier temps de prélèvement terminal peut être porté à 8 afin d'augmenter la puissance statistique de l'analyse des résultats en réduisant la variabilité.
Raffinement
Dans le cadre de l'utilisation des cages à métabolisme ou le placement seul dans une cage, toutes les cages sont maintenues dans la même pièce et sur le même portoir afin de favoriser l'instinct grégaire (visuel, odeur, communication). Afin de réduire l’inconfort de l’animal des panneaux opaques sont placés sur un des quatre côtés de la cage pour éviter l’exposition directe à la lumière. Les animaux sont observés tous les jours et les points limites basés sur l’apparence et le comportement de l’animal sont définis dans une grille afin de décider si l’animal doit être soulagé de son inconfort. De plus une plaque métallique recouvrant un tiers de la cage sera systématiquement placée sur la grille de la cage à métabolisme pour permettre à l’animal d’avoir un espace de repos sans gêner la collecte des urines et fèces.
Choix des espèces
Selon la guidance OCDE427 concernant la sélection de l’espèce animale, le rat est l’espèce la plus communément utilisée : Les espèce utilisées sont des espèces présentant un taux d’absorption cutanée proche de celle de l’homme. .Les animaux utilisés ont 6 à 7 semaines conformément aux recommandations de la guidance spécifique à ce type d’étude : (animaux entre 200 et 250g).
Maintien d’une lignée de chiens modèle de la mucopolysaccharidose de type IIIB (MPS3B)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
100 chiens vont être utilisés pour entretenir une lignée reproduisant la maladie de Sanfilippo (mucopolysaccharidose de type IIIB), 25 d'entre eux étant tués, 60 réutilisés dans d'autres protocoles et 15 adoptés à la retraite. L'élevage repose sur des prises de sang, des frottis vaginaux, des inséminations artificielles et des prélèvements de semence, et le porteur indique que les chiots homozygotes développent une atteinte neurologique avec troubles locomoteurs dès douze à quinze mois. Le but déclaré n'est pas thérapeutique en soi mais de faire naître des chiens atteints pour un futur projet de thérapie génique, objet d'une autre demande. Sur le remplacement, le porteur qualifie le recours à un modèle gros animal d'"indispensable" et affirme qu'aucune méthode alternative ne permet aujourd'hui de tester une thérapie génique in vivo.
Objectifs
L'objecif principal de ce projet est de maintenir une lignée de chiens atteints de mucopolysaccharidose de type IIIB afin de générer des animaux nécessaires à l'évaluation d'un projet thérapeutique par thérapie génique qui fera l'objet d'une autre demande de projet.
Bénéfices attendus
Le syndrome de Sanfilippo, ou MPS IIIB, est la conséquence d’une accumulation de molécules de sulfate d’héparane, partiellement dégradées, dans les tissus de l’organisme. Ceci est le fait d’une mutation génétique qui affecte l’activité d’une enzyme nécessaire pour la dégradation du sulfate d’héparane. Ces molécules mal dégradées, qui ne peuvent pas être éliminées, entravent le développement normal du cerveau puis détruisent les cellules du cerveau. Les premiers symptômes de la maladie associent un retard du développement cognitif associé à une hyperactivité, un comportement autistique et des troubles du sommeil. Chez l’Homme, ils apparaissent habituellement avant l’âge de 3 ans. Par la suite, l’atteinte neurologique entraîne une déficience intellectuelle et une réduction des capacités motrices qui aboutissent à la perte d’autonomie vers l’âge de 10 ans et un décès survenant le plus souvent entre 10 et 20 ans. Actuellement, cette pathologie est incurable, le traitement n'est que symptomatique. L'évaluation d'approches thérapeutiques reste donc essentielle pour évoluer vers la mise en place d'un réel traitement curatif pour ces patients. La thérapie génique est une des approches prometteuses qui permettrait de traiter la cause moléculaire de la maladie. Pour évaluer de telles approches thérapeutiques, avoir un modèle animal pertinent est nécessaire pour pouvoir réaliser des études précliniques nécessaires (preuves de concept de l’efficacité des produits thérapeutiques, études de dose…). Le présent projet vise à obtenir des animaux atteint de la maladie puis d’évaluer l’efficacité d’un traitement de thérapie génique. C’est une étape essentielle dans le développement préclinique qui permettra à terme de proposer un traitement curatif aux patients atteints. Elle permettra ainsi de générer toutes les données précliniques telles que les données de biodistribution du vecteur dans le cerveau et les organes périphériques des animaux injectés, l'étude histologique globale (expression du transgène, neurotoxicité avec marquages NeuN, astrogliose et microgliose, infiltration lymphoplasmocytaire), mais aussi la tolérance globale de l'approche avec le suivi IRM, les données hématologiques et le neurofilament Light Chain comme biomarqueur. Le but global de l'étude est de soutenir la demande d'un essai clinique de phase I/II chez des patients souffrant de la maladie de San Filippo.
Procédures
Pour la mise en place de la colonie, les animaux seront soumis aux interventions suivantes: - Prise de sang pour dosage hormones sexuelles afin de déterminer avec précision l’insémination : au maximum 8 par cycle la prise de sang prend 5 min maximum Frottis vaginaux pour détermination du cycle sexuel : au maximum 8 frottis par cycle. Le prélèvement prend 5 min IA : 2 IA intra vaginal par cycle : l’intervention prend 10 min Prélèvements pour conservation de semences en congelé : prélèvement d’éventuels futurs mâles et l’intervention prend environ 30 min Injections possibles pour aider à la mise bas : 1 à 2 injections qui prennent quelques secondes Prélèvements buccaux et /ou poils sur les chiots pour déterminer statut génétiques : 1 fois à la naissance et prend 1 min
Impact sur les animaux
Les actes nécessaires au développement et maintien de lignée sont peu ou non invasifs. Les effets indésirables possibles sont ceux liés à la reproduction: - un risque de complication lors des gestations, mises bas et lactations - hématome lors de prise de sang nécessaire pour un suivi vétérinaire - risque de morsures entre reproducteurs - cannibalisme des chiots par la mère Pour les animaux malades MPS III B (-/-) : - une atteinte neurologique pouvant générer des anomalies locomotrices avec un début vers 12-15 mois Les animaux hétérozygotes MPS IIIB (-/+) ne présentent pas de phénotype dommageable
Devenir
Tous les reproducteurs seront adoptés lors de leur retraite. Les animaux réutilisés : - les hétérozygotes MPS III b générés deviendront reproducteurs pour la continuité de la lignée. - Les animaux homozygotes MPS IIIB malades obtenus seront intégrés dans des études d’évaluation de produits thérapeutiques. Les animaux HO MPS I obtenus en début de lignée seront euthanasiés. Les animaux sains WT seront soit inclus en tant que témoin sain dans les projets de recherche pré-clinique ou euthanasiés lors du génotypage suivant les besoins.
Remplacement
Toutes les études in vitro possibles ont été́ effectuées en amont de ce projet, en particulier la démonstration de la fonctionnalité́ des AAV. Nous arrivons ici aux dernières étapes précliniques nécessaire pour une demande d’essai clinique de phase I/II pour lesquelles l’utilisation d’un modèle gros animal, permettant la mise en place d’approche chirurgicale similaire à celle effectuée sur les patients dans l’essai clinique est indispensable et nécessite donc l’utilisation de cette lignée de chiens MPS3B. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pour tester l’effet d’un traitement de thérapie génique in vivo. Nous savons que l’efficacité du transfert de gène dans une lignée cellulaire in vitro n’est pas comparable à ce qui peut se passer in vivo dans un organisme entier. L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier l’impact d’un transfert de gène dans différents types cellulaires (différents organes) et sur son phénotype, en lien avec le mode d’administration utilisé et la dose administrée. L'utilisation d’un modèle animal est donc essentiel pour l'évaluation préclinique de produits thérapeutiques pour le traitement de la Mucopolysaccharidose de type IIIB
Réduction
100 animaux au total maximum, comprenant les animaux hétérozygotes servant de reproducteurs et les animaux homozygotes MPS3B qui seront inclus dans les études thérapeutiques ultérieures. De plus, autant que faire se peut, nous privilégierons l’utilisation de paillettes de semences congelées pour les inséminations, afin de diminuer le nombre d’animaux reproducteurs nécessaires.
Raffinement
Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, les procédures sont réalisées par du personnel formé et expérimenté. Les animaux sont hébergés en groupe et recevront un enrichissement adapté. Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens animaliers. Une observation journalière sera faite tout au long du projet. A la moindre anomalie un avis vétérinaire sera demandé et un traitement mis en place si nécessaire. Egalement pour suivre efficacement l'état de santé des animaux et pour pouvoir rapidement mettre en place une action une liste de points limites a été établie. Elle permet de définir une conduite à tenir afin d’arrêter, minimiser ou diminuer toute souffrance à l’aide de mesures telles que l’euthanasie ou par un traitement adapté. Cf. Grille en annexe de la saisine.
Choix des espèces
Le modèle de chien choisi (MPS3B) porte la même mutation génétique que l’Homme, mutation génétique provoquant la maladie de San Fillipo. Des plans de reproduction seront établis au fur et à mesure des naissances afin d’obtenir des animaux MPS IIIB. Les mâles et femelles hétérozygotes porteurs (-/+) MPSIIIB et sains (WT) seront inclus en tant que reproducteurs. Les animaux pourront rentrer en reproduction entre 18 et 24 mois, et plus exactement lors des secondes chaleurs des chiennes. Les mâles seront également matures sexuellement à cet âge-là et pourront intégrer les cycles de reproduction pour inséminer les femelles à partir de ce moment.
Épidémiologie descriptive et biocontrôle des mouches gastérophiles dans un contexte de réduction de l’usage des traitements chimiques
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Pour repérer à leur odeur les chevaux porteurs de larves de mouches gastérophiles, parasites de l'estomac, 100 équidés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis tous gardés en vie pour être réutilisés. Trois fois dans l'année, chaque cheval subit un prélèvement de matières fécales dans le rectum et une gastroscopie sous sédation, la sonde passant de la narine à l'estomac après 24 heures de jeûne. Une fois par an, après un vermifuge, il reste 96 heures isolé de son groupe dans un box sans paille, sur des tapis de mousse, avec une sortie quotidienne en paddock, pendant que l'équipe compte les larves qu'il expulse. Le porteur range l'ensemble parmi des "actes d'élevage couramment utilisés" et promet des "solutions innovantes à la filière équine".
Objectifs
Par manque de diagnostic spécifique et efficace, le contrôle des endoparasites des chevaux se fait en utilisant des antiparasitaires de synthèse en routine et sans évaluation préalable. Cette utilisation non raisonnée des vermifuges sélectionne des isolats parasitaires résistants. De plus, les résidus de ces traitements sont relargués dans l’environnement et constituent une source importante de pollution. Une réduction de leur usage est donc souhaitable mais il n'existe pas de solutions alternatives de contrôle pour la gestion de ces mouches. Ces mouches sont responsables d'ulcères de l'estomac des chevaux. Pour mieux raisonner les usages, nous proposons d’associer le statut physiologique et parasitaire de l’hôte à la signature odorante des équidés. Les composés odorants isolés permettront d’identifier les animaux ayant un besoin de traitement ou de mettre en place des stratégies de piégeage des mouches dans les prairies.
Bénéfices attendus
Les connaissances qui seront acquises à la fin de ce projet seront très originales et apporteront des solutions innovantes à la filière équine en santé animale. L’innovation de notre projet et notre ambition sont d’établir les bases pour un diagnostic du parasitisme grâce aux odeurs émises par les équidés parasités. Nos résultats combleront également l’ignorance sur des sujets comme les interactions de la faune gastrointestinale des équidés et proposeront des mesures concrètes pour évaluer le parasitisme. Jusqu’à présent, le problème émergent des gastérophiles restait invisible grâce à leur traitement opportuniste en même temps que le traitement des nématodes gastrointestinaux. Ainsi, nous n’avions à disposition aucun moyen diagnostique du problème. Le suivi du changement des odeurs lorsqu’un animal est parasité aidera aussi à définir de nouveaux seuils de parasitisme acceptables pour le bien-être animal. Cette nouvelle approche de gestion du parasitisme se veut adaptée à l’état physiologique de l’animal et à ses besoins de traitement. Ceci nous permettra de limiter l’utilisation de molécules chimiques. Dans le cadre du concept One Health, notre équipe proposera des nouvelles molécules naturelles, issues de la chimiosensation des parasites (habilité de détecter des molécules présentes dans l’environnement et pour la plupart impliquées dans des fonctions vitales pour l’organisme), qui viendront appuyer les efforts pour le développement de moyens de lutte plus respectueux de l’environnement et du bien-être animal. Ces stratégies alternatives de lutte ne sont pas incompatibles avec les traitements actuels et aideront à diminuer progressivement les traitements pharmacologiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à des gastroscopies sous sédation (intervention de 20 min) et des prélèvements de matière fécale intra-rectale. Chaque acte sera effectuée 3 fois dans l'année pour chaque animal.
Impact sur les animaux
Les actes prévus par ce projet sont des actes d’élevage couramment utilisés (coproscopies, vermifugations, gastroscopies, tonte). Les effets indésirables pour les animaux pourraient venir des gastroscopies qui nous obligent de maintenir à jeun les chevaux pendant 24 heures. Les animaux sont ensuite sédatés pour pouvoir passer la sonde du gastroscope de la narine jusqu’à leur estomac. Avec la sédation nous essayons de minimiser les effets désagréables de l’endoscopie mais dans aucun cas ce protocole n’engendre un danger pour la santé de l’animal. Un autre effet désagréable pour les animaux est le maintien pendant 96h dans des boxes lors du comptage des larves de gastérophiles excrétées suite à la vermifugation. Des tapis en mousse sont fournies aux chevaux pour minimiser leur inconfort. L’inconfort peut venir de l’isolement de l’individu de son groupe et le manque de paillage au sol. Cette procédure ne se produit qu’une fois par an pour chaque cheval impliqué mais elle est nécessaire pour avoir le nombre exact de larves présentes dans l’estomac de chaque animal avant la vermifugation et établir ainsi la charge parasitaire qui caractérise chaque individu. L’animal a du foin ad libitum et il est sorti dans un paddock sablé tous les jours durant le protocole. Il voit plusieurs fois par jours les animaliers et les expérimentateurs qui surveillent de près son comportement.
Devenir
Les interventions réalisées dans ce projet correspondent à des actes d'élevage couramment utilisés, qui ne remettent pas en cause le bien-être ou la santé de l'animal.
Remplacement
Il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle alternatif de maintien du cycle d’infestation des gastérophiles in vitro. De plus, nos activités consiste à évaluer la charge parasitaire des animaux en lien avec différentts modes de lutte, ce qui n’est pas possible sans animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au minimum nécessaire pour mettre en évidence les effets recherchés. En revanche, chaque période de vermifugation recquiert des chevaux différents.
Raffinement
Suite à la vermifugation les animaux seront maintenus dans des boxes tapissés avec des tapis en mousse pour réduire leur inconfort dû à l’absence de paillage. Des visites régulières (toutes les heures durant la journée et une fois dans la nuit) seront effectuée par les animaliers pour surveiller le comportement des animaux et détecter d’éventuels signes de stress accru. La gastroscopies sont réalisées après sédation par deux vétérinaires spécialistes en médecine équine, référents pour le troupeau de l'établissement utilisateur.
Choix des espèces
Les gastérophiles sont des parasites inféodés aux chevaux. Notre projet porte sur toutes les classes d'âge rencontrées en élevage.
Nourrissage sanguin de colonies de mouches Phlébotomes
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
1 560 souris vont être utilisées, anesthésiées puis tuées avant tout réveil, pour nourrir des colonies de mouches phlébotomes élevées en laboratoire. Chaque souris endormie est placée jusqu'à trente minutes dans une cage d'insectes qui se gorgent de son sang, puis retirée et tuée sous anesthésie. Le porteur indique que ce gorgement massif d'insectes hématophages provoque des piqûres douloureuses et des démangeaisons intenses, raison invoquée pour tuer les souris sans les réveiller. Sur le remplacement, il décrit un nourrissage artificiel à travers une membrane testé en parallèle, mais le juge possiblement insuffisant pour maintenir les colonies et rappelle que le sang de mouton n'a pas été validé, contrairement au sang de souris.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de nourrir des colonies d’élevage de mouches Phlébotomes. Ces insectes ont besoin de repas sanguins, qui doivent être effectués sur des animaux vivants.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour bénéfice le maintien de colonies de Phlébotomes en élevage, qui sont utilisées dans le cadre de la recherche sur les leishmanioses, maladies provoquées par les parasites de la famille Leishmania, dont la transmission est effectuée par les Phlébotomes. Les bénéfices attendus sont une meilleure compréhension des mécanismes de transmission des leishmanioses et de l’interaction entre les insectes vecteurs et les parasites transmis.
Procédures
Les souris sont anesthésiées par injection d’un produit anesthésique (quelques secondes). Après 5 à 10 minutes, elles sont placées endormies dans les cages à insectes, pendant une durée maximum de 30 minutes, durant lesquelles les insectes vont se nourrir. A la fin de cette période, les souris, toujours sous l’effet de l’anesthésie, sont retirées de la cage puis immédiatement mis à mort.
Impact sur les animaux
L’injection intra-péritonéale de produits anesthésiques peut provoquer un inconfort temporaire léger des animaux.
Devenir
Les repas sanguins d’insectes en général et de Phlébotomes en particulier s’accompagnent de piqûres très désagréables qui provoquent des démangeaisons importantes et douloureuses. Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de leur éviter la douleur intense qui fait suite au nourrissage massif d’insectes hématophages. La mise à mort des animaux aura lieu alors qu’ils seront toujours sous l’effet de l’anesthésie, pour éviter toute douleur et inconfort dus au nourrissage.
Remplacement
En parallèle de ce projet sera testée la possibilité de nourrir les Phlébotomes exclusivement par nourrissage artificiel en utilisant du sang de mouton (commercial) à travers une membrane (peau de caille). La méthode de nourrissage à travers une membrane pourrait néanmoins se révéler insuffisante pour maintenir des colonies entières de Phlébotomes en routine. De plus le sang de mouton n’a pas été testé pour nourrir les phlébotomes, contrairement au sang prélevé par ponction intra-cardiaque sur des souris immédiatement après leur mise à mort.
Réduction
Le nombre de souris utilisées pour le nourrissage des Phlébotomes sera déterminé chaque semaine, en fonction du statut des colonies d’insectes. Nous utiliserons toujours le nombre le plus réduit possible d’animaux. Les volumes des repas sanguins varient de 200nl à 2µl chez les phlébotomes. Une souris sera utilisée pour nourrir environ 300 Phlébotomes femelles, afin de ne pas dépasser un volume sanguin maximal prélevé de 600µL par souris.
Raffinement
Le temps de nourrissage des insectes ne dépassera pas 30min, afin que les animaux soient toujours sous l’effet de l’anesthésie lors de la mise à mort. Les animaux utilisés seront des surplus de la zone d’élevage.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies pour ce projet en raison de leur disponibilité et de la facilité de leur manipulation. Des souris adultes seront utilisées.. Ce stade de développement est justifié par la plus grande facilité de manipulation des individus ainsi que leur taille et leur poids plus important leur conférant une volume corporel sanguin supérieur. L’utilisation de souris adultes permettra de réduire le nombre d’individus nécessaires lors de chaque nourrissage.
Evaluation de nouveaux candidats médicaments dans un modèle de crises fébriles chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
380 souris, dont de très jeunes non sevrées, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures à la souffrance déclarée modérée pour 30 et sévère pour 350. Elles sont chauffées près d'une source de chaleur jusqu'à provoquer des convulsions fébriles, jusqu'à quatre fois pour les modèles génétiques, avec administration de candidats médicaments et tests moteurs. Le porteur indique qu'une crise tonique, jugée possible, entraîne la mise à mort, et signale des effets d'hypothermie et de sédation liés aux produits. Il décrit des modèles murins des syndromes de Dravet et d'Angelman et présente le recours à l'animal comme "indispensable" pour démontrer l'efficacité avant mise sur le marché.
Objectifs
L'objectif du projet consiste à évaluer de nouveaux candidats médicaments pour inhiber les crises fébriles chez le jeune enfant. Les convulsions fébriles sont des contractions musculaires involontaires, saccadées, observées lors d'un épisode de fièvre, le plus souvent dû à une infection virale. Elles peuvent survenir chez les nourrissons ou les enfants (jusqu'à l'âge de 5 ans) en bonne santé (n'ayant pas de maladie neurologique connue ou d'infection cérébrale sévère). Ces crises peuvent aussi parfois être le premier signe de certains troubles neurologiques. Par exemple, le syndrome de Dravet est une épilepsie grave de l’enfant, d’origine génétique, qui débute avant l’âge d’un an par des crises convulsives souvent déclenchées par de la fièvre. Par la suite, les enfants ont des crises d’épilepsie de divers types, un retard de développement, des difficultés de langage, une mauvaise coordination des mouvements et des troubles du comportement. Les convulsions fébriles peuvent également être les premières manifestations épileptiques du syndrome d'Angelman, caractérisé par une déficience mentale, une apparence et un comportement caractéristiques, et souvent accompagnés d'autres signes tels qu'une épilepsie de gravité variable. Un modèle d'étude des convulsions fébriles chez la souris sera développé dans ce projet, permettant de tester dessus des candidats traitements pour ces crises.
Bénéfices attendus
Les modèles de crises fébriles permettent de tester l’efficacité de nouveaux médicaments avant leur mise sur le marché. La recherche de nouveaux traitements est indispensable pour traiter les convulsions fébriles complexes qui nécessitent un traitement préventif, une fois le risque de récidive identifié chez le nourisson (il est estimé qu'environ 30% des nourrissons ayant présenté un épisode de crise fébrile récidivera). Ces traitements peuvent également être développés pour soulager les symptômes associés aux différents syndromes comprenant des crises épileptiques, et pour lesquels aucun traitement n'existe à l'heure actuelle (la prise en charge actuelle incluant, en fonction des besoins, à la fois une rééducation psychomotrice, cognitive, orthophonique, comportementale, mais aussi des traitements médicamenteux contre les troubles du sommeil, les crises épileptiques, voire des tranquilisants).
Procédures
L'hyperthermie sera induite en plaçant l'animal proche d'une source de chaleur (temps estimé maximum 35 minutes) pour élever sa température corprorelle jusqu'à un seuil maximum tolérable. La température de ces animaux sera suivie tout au long du test et le test sera arrêté dès l'atteinte du seuil ou tout signe decrise fébrile. Dans le cadre de procédures modélisant la crise fébrile du nourrisson, ce test ne sera réalisé qu'une fois. Dans le cadre de modèles de syndromes génétiques, ce test pourra être réalisé 2 à 4 fois en veillant à la bonne récupération des animaux entre chaque session. Dans les modèles de syndromes complexes, des tests comportementaux pourront être envisagés pour évaluer les potentiels déficits moteurs (durée de quelques minutes à maximum 40 minutes, fréquence maximum 1 fois par semaine). Des prélèvements sanguins (en cours d'étude : prélèvements sub-mandibulaires, 1 fois/semaine maximum, durée du prélèvement : quelques secondes) peuvent également être envisagés pour compléter les données in vivo par des données biochimiques. Concernant l'administration des candidats traitements, les administrations par bolus rapide (voies orale, intraveineuse, sous-cutanée, intra-péritonéale, intramusculaire, intracranienne) durent quelques secondes; l'administration par perfusion lente (intraveineuse) peut durer quelques minutes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours, en fonction des spécificités du candidat traitement. Les administrations seront réalisées selon les bonnes pratiques vétérinaires.
Impact sur les animaux
Le protocole décrit dans ce projet peut conduire à l'apparition de convulsions. Dès l'observation de tout signe de convulsion, l'animal est retiré de la source de chaleur pour stopper la crise et tout le nécessaire sera mis en œuvre pour faire revenir la température corporelle de l'animal à sa normale. Bien qu'inattendue, l'apparition de crise tonique demeure possible. Dans ce cas, l'animal sera euthanasié. De par notre expérience, il n'est pas prévu de rejet par la mère suite aux administrations des animaux non-sevrés. Les principaux effets indésirables relatifs aux administrations de candidats médicaments sont une potentielle hypothermie et des effets sédatifs. Ils seront monitorés au cours de l'étude. Dans le cas de modèles de syndromes complexes, les animaux seront surveillés pour déterminer s'ils présentent des fonctions motrices altérées. L'évaluation de l'activité locomotrice n'induit pas de douleur et reste un test peu stressant pour les souris (stress principalement lié à la nouveauté ; dans le cas de l’évaluation de la coordination motrice, la hauteur du dispositif est suffisamment basse pour éviter toute blessure en cas de chute).
Devenir
Tous les animaux auront été soumis à une hyperthermie susceptible d'induire des convulsions. Ces procédures ne sont pas compatibles avec un maintien en vie dans de bonnes conditions de santé.
Remplacement
Dans le cadre du développement pharmaceutique, ce projet fait suite à l'évaluation de nouveaux candidats médicaments sur des modèles in silico et ex-vivo, exemple de modèles de cultures primaires de neurones ou de tranches cérébrales. Ces modèles sont utilisés afin de sélectionner les meilleurs candidats médicaments et donc limiter le nombre d'animaux utilisés. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (crises induites par hyperthermie et modèles animaux de syndromes génétiques) permettant ainsi l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement des animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Dans la procédure 2 (tests de candidats médicaments), le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement par rapport à un contrôle positif (substance de référence ou de comparaison). Les tests statistiques seront adaptés en fonction de la normalité des données obtenues. Pour les données quantitatives (e.g. température) il est prévu d'appliquer des tests paramétriques (e.g. : Student, ANOVA...) ou non-paramétrique (Mann-Whitney) et pour les données qualitatives (fréquence de réponse), le test exact de Fisher sera utilisé. Aussi, lorsque celà est possible, des prélèvements sanguins intermédiaires (autre que terminaux) peuvent être envisagés sur un même animal, permettant ainsi de générer des données sur la cinétique d'action de la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites spécifiques à ce projet permettant d’euthanasier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général et un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et fréquemment manipulés par des techniciens formés et attentifs. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Dans ce cadre, plusieurs méthodes seront testées pour la mesure de température corporelle (transmission sans contact via puce RFID ou prise de température rectale). Si les mesures par une puce RFID ne sont pas satisfaisantes, une sonde rectale sera utilisée, avec utilisation de vaseline pour limiter la douleur. Les animaux seront retirés de la source chaude dès l'apparition de convulsions ou que le seuil défini de température corporelle est atteint. S'ils doivent être gardés (modèles de syndromes complexes), les animaux seront surveillés et réhydratés avec une injection sous-cutanée ou intrapéritonéale de sérum physiologique à la fin du test. Si l'état des animuax le nécessite, des injections supplémentaires de sérum physiologique peuvent être réalisées si ces derniers ne s'hydratent pas suffisamment. Les animaux seront euthanasiés si ces derniers n'ont pas récupéré après quelques minutes (maximum 1 minute après bain tiède pour l'arrêt des convulsions, maximum 30 minutes pour retrouver un état comportemental normal). Pour les animaux n'ayant pas convulsé, ces derniers pourront être gardés et réhydratés, juste après le test (par accès au biberon ou injection).
Choix des espèces
Les substances anti-épileptiques mises sur le marché ont été découvertes en utilisant des modèles pré-cliniques chez le rongeur. Les études de crises fébriles sont effectuées chez la souris car ce modèle est translationnel et permet l'étude de modèles animaux de syndrome d'origine génétique observés chez l'Homme (e.g. modèles murins présentant une mutation du gène Scn1a pour modéliser le syndrome de Dravet, ou modèle murin présentant une mutation du gène ube3a pour le syndrome d'Angelman...). Les souris sont testés quelques jours après leur naissance jusqu'à 8 semaines. Les crises fébriles sont observées chez le nouveau-né, des souris jeunes sont donc utilisées pour ce type de protocole, comme décrit dans la bibliographie scientifique.
Pose de cathéter veineux central chez le lapin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
33 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés dans d'autres expériences. Ils subissent une chirurgie de vingt minutes sous anesthésie pour la pose d'un cathéter veineux central, destiné à faciliter les prélèvements et injections d'études ultérieures de pharmacocinétique, de toxicité ou d'efficacité menées en prestation pour d'autres chercheurs. Le porteur reconnaît un risque de perte importante de sang pendant l'opération mais affirme que les lapins supportent "très bien" le cathéter et le gilet, sans douleur attendue. Il justifie le recours au lapin par sa taille commode pour poser le matériel et présente le remplacement comme difficile, l'effectif pouvant augmenter selon la "demande d'industriels".
Objectifs
Un cathéter veineux central (CVC) est un tube mince et flexible, introduit dans une veine de la base du cou (jugulaire) ou du thorax (sous clavière) jusqu’à atteindre la veine cave supérieure. Ce dispositif, couramment mis en place chez l’homme en clinique, peut permettre l’injection de traitements par voie intra-veineuse (IV), la perfusion de sang ou de plaquettes, le prélèvement d’échantillons sanguins ou encore la mise en place d’une nutrition parentérale (injection d’éléments nutritifs par voie IV). Le but de ce projet est d’offrir les mêmes possibilités à notre modèle animal qu’est le lapin dans le cadre de prestations ou collaborations avec d’autres chercheurs. 33 lapins cathétérisés sont prévus pour l’année 2023.
Bénéfices attendus
La mise en place d’un CVC apporte plusieurs avantages : -réduction du nombre d’injections et de piqûres d’aiguille ; -atténuation de l’endolorissement/sensation de brûlure parfois causés par un traitement IV administré par une perfusion standard périphérique ; -accroissement du confort et réduction de l’anxiété chez les lapins nécessitant un traitement IV ou des prélèvements sanguins à répétition.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d’environ 20min sous anesthésie et analgésie pour la pose d’un cathéter veineux central.
Impact sur les animaux
La nuisance la plus importante est lié à l’opération chirurgical en elle-même. Durant cette dernière, les animaux sont susceptibles de perdre une quantité importante de sang pouvant entrainer une mauvaise récupération post-opératoire. Cependant, tout sera mis en œuvre pour limiter au maximum la douleur des animaux (anesthésie + analgésie pré et post-opératoire). D’après notre expérience, les animaux supportent très bien le cathéter ainsi que le gilet. Aucune douleur n’est attendue.
Devenir
Au terme de la procédure, tous les animaux seront utilisés pour des expériences nécessitant des prélèvements ou des injections qui seront facilités par le cathéter limitant ainsi les effets néfastes pour les animaux.
Remplacement
Différents types d’étude seront réalisés chez les lapins cathétérisés : analyse pharmacocinétique d’un nouveau composé, tests de toxicité, évaluation de l’efficacité de nouvelles thérapies. L’ensemble de ces utilisations met en jeu l’organisme dans son entièreté et rend le remplacement du modèle animal difficile.
Réduction
Dans un objectif de Réduction, le nombre d’animaux choisi correspond au minimum de lapins qui nous est habituellement commandé sur une année. Cependant il est possible que ce chiffre varie à la hausse (demande d’industriels). Dans le cas d’une demande plus importante, une nouvelle demande d’autorisation de projet sera rédigée. Le nombre de lapins sera de 33 sur 1 an.
Raffinement
Dans un objectif de Raffinement, la procédure de pose de cathéter sera réalisée sous anesthésie générale par du personnel qualifié. Le design du gilet utilisé pour le maintien du cathéter permet la libre circulation de l’animal dans sa cage sans risque d’arrachement. Les conditions d’hébergement ont également été optimisées par l’enrichissement du milieu. Enfin, l’utilisation de l’analgésique buprénorphine a été mise en place pour réduire la douleur liée à l’opération.
Choix des espèces
Le lapin est un modèle de choix pour les essais impliquant des actes chirurgicaux. Sa taille facilite la mise en place de matériel médical tels que les cathéters. De plus, le lapin est en certains points (notamment immunitaire), plus proche de l’homme que la souris, notamment pour les études s’intéressant aux infections bactériennes. Les lapins seront utilisés lorsqu’ils auront atteint un poids compris entre 2,8 et 3,3kg, soit environ 10-12 semaines. Le poids et l’âge de l’animal sont primordiaux. En effet, l’état immunitaire de l’animal est dépendant de son âge et de son poids. Des animaux avec une immunité mature sont souvent nécessaires. Enfin, tous les animaux doivent avoir un profil identique afin de ne pas induire de biais dans la comparaison des groupes.
Validation d’un protocole de thérapie génique et essai pré-clinique dans un modèle murin pour une neuropathie fatale chez l’Homme (EU 1/3)
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
314 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer les troubles moteurs et sensoriels d'une maladie neuromusculaire humaine, elles reçoivent un vecteur viral de thérapie génique, cinq prélèvements sanguins et cinq séries de tests comportementaux sur douze mois, avant le prélèvement de leurs organes. Le porteur qualifie le stress des tests de faible à modéré, sans détailler les cinq tests employés, et n'attend aucun autre effet indésirable. Il indique avoir déjà obtenu des résultats sur cellules et neurones en culture mais juge "essentiel" de valider la thérapie chez la souris, cette étape restant un "premier pas" avant l'humain.
Objectifs
Ce projet concerne le développement d’une thérapie génique pouvant constituer un traitement curatif pour une maladie neuromusculaire fatale chez l’Homme et pour laquelle, il n’existe aujourd’hui aucun traitement curatif. Cette maladie est provoquée par des mutations d’un gène, et cela entraine des troubles moteurs et sensoriels chez les patients dès l’enfance. La thérapie génique consiste donc à compenser le gène défectueux en important une copie du gène fonctionnelle dans l’organisme grâce à un vecteur viral. Précédemment, nous avons développé un modèle animal (souris) qui reproduit pour la première fois les troubles moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients. Nous avons élaboré une méthodologie avec ce modèle pour développer notre thérapie. Notre premier objectif est d’optimiser les conditions de notre protocole (choix du meilleur promoteur, doses à utiliser) en analysant les effets sur le comportement et l’organisme de nos souris (prélèvements sanguins, analyses moléculaires). Ensuite, notre deuxième objectif est d’évaluer les bénéfices de ce protocole thérapie génique grâce à un essai pré-clinique dans notre modèle sur une durée de 12 mois. Nous évaluerons ces bénéfices en évaluant le comportement et l’effet sur l’organisme de ces souris.
Bénéfices attendus
La validation de notre protocole et l’évaluation des bénéfices de notre thérapie génique chez la souris constituerait un premier pas vers une thérapie adaptable à l’Homme dans le cadre d’une maladie génétique. De plus, lors des analyses sanguines, nous aimerions pouvoir mettre en évidences des marqueurs sanguins de cette maladie. Ces marqueurs pourraient être utilisés également dans le cadre du diagnostic d’autres maladies neurodégénératives.
Procédures
Les souris recevront le vecteur viral (durée : 5mn) sous anesthésie générale. Les souris auront 5 prélèvements sanguins (durée : 5mn). Les souris réaliseront 5 fois la série de tests comportementaux (5 tests comportementaux, durée : entre 30s et 15mn) entre 1 mois et 12 mois. Ces tests permettront d’évaluer les capacités motrices et sensorielles des animaux permettant de rendre compte de l’efficacité de l’approche thérapeutique.
Impact sur les animaux
L’administration du vecteur viral, les prises de sang pourront induire un stress faible chez les animaux. Les tests comportementaux pourront induire un stress variable chez les animaux allant de faible à modérer. Aucun autre effet indésirable n’est attendu à l’issu de ces éléments.
Devenir
Ce projet compte 2 procédures. La première permettra de valider le protocole de thérapie génique sur les souris par des analyses comportementales et tissulaires, nécessitant leur mise à mort afin d’étudier le phénotype tissulaire (prélèvement d’organes post-mortem pour analyses). La deuxième permettra d’évaluer les bénéfices de la thérapie au niveau comportemental et tissulaire nécessitant la mise à mort des souris (prélèvement d’organes post-mortem pour analyses.
Remplacement
Le projet a pour but de valider un premier essai pré-clinique de thérapie génique pour une maladie neuromusculaire fatale et incurable chez l’Homme. Les modèles in vitro (cellules immortelles et neurones en culture) ont permis de mettre en évidence des effets au niveau moléculaire/cellulaire de cette approche. Elle nécessite à présenter être validée dans un organisme modèle de mammifère. Le tissu nerveux ne pouvant être accessible chez l’Homme et les essais thérapeutiques ne pouvant être testés directement chez l’Homme, il est essentiel de prouver l’efficacité de notre approche dans une étude pré-clinique chez la souris.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire au maximum le nombre d’animaux par condition expérimentale tout en conservant un nombre suffisant de souris par lot pour pouvoir analyses nos résultats de façon statistique et ne pas avoir besoin de reconduire ce type de projet.
Raffinement
Le phénotype de notre modèle murin ne diffère pas du modèle sauvage durant le temps de l’expérimentation (12 mois maximum) permettant un hébergement en cage collective pour respecter leurs besoins sociaux. L’administration du vecteur viral est réalisée sous anesthésie générale avec un réveil post-anesthésie dans une cage chauffée, du gel ophtalmique est appliqué post-injection et mise en place d’une analgésie si besoin. Les prises de sang sont effectuées sous anesthésie générale avec réveil post-anesthésie dans une cage chauffée et mise en place d’une analgésie si besoin. L’organisation des tests comportementaux seront précédés d’une phase d’entrainement et une période de récupération d’au moins une demi-journée voir 2 jours entiers est prévue afin de limiter au maximum le stress des animaux. Chaque animal sera surveillé de façon individuelle et de façon quotidienne. A chaque étape du projet, des points limites ont été établis pour soustraire l’animal à la souffrance.
Choix des espèces
Avec 98% d’identité protéique avec l’Homme, la souris constitue un modèle idéal pour reproduire les pathologies humaines afin de les étudier dans un contexte physiologique mais également de pouvoir tester et valider des approches thérapeutiques. L’étude réalisée sur notre modèle a montré qu’il reproduit pour la première fois les symptômes moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients, justifiant son utilisation valider notre approche de thérapie génique. Notre projet utilisera le stade juvénile (1 mois) et le stade adulte (2 à 12 mois). Notre modèle murin présente des défauts moteurs et sensoriels à partir de 3 mois ; il est donc nécessaire de débuter la stratégie à un stade précoce. La validation du protocole et l’évaluation des bénéfices au niveau comportemental et histologique doivent être évaluées au stade adulte pour évaluer les effets de la thérapie à moyen- et long-terme.
Evaluation du potentiel antibactérien de solutions alternatives à l’utilisation d’antibiotiques pour lutter contre l’infection à Aeromonas salmonicida chez la truite arc en ciel
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Maladies animales
900 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par injection d'une bactérie pathogène, une centaine servant d'abord à caler la dose qui tue la moitié des poissons, les autres à tester trois additifs alimentaires présentés comme des solutions de rechange aux antibiotiques. Le porteur indique que l'infection provoque une mortalité rapide, en 48 à 72 heures, et n'attend aucun effet indésirable des additifs. Il justifie le recours à l'espèce cible par la complexité du système hôte-pathogène, la finalité étant la pisciculture intensive de cette truite "à fort intérêt économique".
Objectifs
Les infections bactériennes en piscicultures intensives représentent un problème majeur pour le bien-être et la santé des animaux. S'il existe des antibiotiques et des autovaccins relativement efficaces pour un certain nombre de pathologies, certaines maladies restent néanmoins difficiles à combattre. Ce projet s'inscrit dans la recherche de bioalternatives aux traitements antibiotiques couramment utilisés et propose d'évaluer l'effet chez une espèce d'eau douce à fort intéret économique, la truite arc en ciel, et dans un contexte d'infection expérimentale avec une bactérie pathogène majeure, Aeromonas salmonicida, de 3 produits développés pour le marché des animaux de rente terrestres autorisés pour l'alimentation animale en Europe. Ce projet intègre 2 procédures : la première vise à développer le modèle infectieux truite arc en ciel / A. salmonicida et à déterminer la concentration bactérienne générant une mortalité de l’ordre de 50% par injection intra-péritonéale. La seconde testera l’effet des 3 bioalternatives sur la croissance et la survie d'animaux qui subiront une infection bactérienne à A. salmonicida.
Bénéfices attendus
L'analyse statistique des résultats permettra de déterminer si les bioalternatives testées ont ou non un effet significatif sur la survie des animaux traités et leur croissace durant cette phase d'infection expérimentale. En cas d'effets positifs, ces solutions pourront être proposées de manière plus systématique pour une utilisation en pisciculture.
Procédures
Les animaux subiront uniquement une anesthésie de courte durée (10 minutes maximum) à l'eugénol lors de la pesée et prise de taille initiale survenant avec le premier nourrissage avec les aliments formulés avec les bioalternatives et lors de la phase d'injection de la souche bactérienne pathogène, à laquelle sera couplée une prise de poids/taille individuelle. Les individus contrôles (non-infectés) subiront une prise de sang sous anesthésie au terme des 5 ou 6 semaines de nourrissage avec les bioalternatives (durée variable en fonction des produits). Des pesées seront également réalisées post-mortem.
Impact sur les animaux
Aucun effet indésirable des bioalternatives n'est attendu sur les animaux traités car ils ont été évalués en amont pour leur potentielle toxicité. L'infection par A. salmonicida induira une mortalité significative des animaux qui survient généralement très rapidement (48 à 72h) après l'inoculation de la souche.
Devenir
Animaux infectés expérimentalement avec une bactérie pathogène et donc ne pouvant être réutilisés.
Remplacement
Les tests d'efficacité antimicrobienne menés in vitro doivent obligatoirement être complétés par des tests in vivo sur l'espèce animale cible, tests plus représentatifs de la complexité d'un système biologique hôte / pathogène.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés sera limité à son maximum tout en permettant de garantir la pertinence scientifique des essais et de déterminer un potentiel effet significatif du peptide testé. Un total de 900 animaux maximum seront utilisés : 100 pour mettre en place le modèle d'infection et déterminer la dose létale permettant d'obtenir 50% de mortalité avec Aeromonas salmonicida sur le modèle truite arc en ciel et 800 pour déterminer l'efficacité du des bioalternatives dans un contexte d'infection expérimentale.
Raffinement
Les mesures de raffinement viseront à assurer des conditions optimales d’hébergement des animaux, à savoir, un volume d'eau adapté en circuit ouvert avec une oxygénation suffisante en fonction de la biomasse, un rythme jour/nuit naturel, la présence de suffisamment de congénères pour exprimer un répertoire comportemental riche, une alimentation adaptée à leur stade de développement. Les animaux présentant des signes de souffrance (comportement anormal, changement de couleur de robe, plaies cutanées, perte d'équilibre, ...) subiront une mise à mort compassionnelle.
Choix des espèces
La truite arc en ciel est l'espèce d'eau douce la plus produite en France et dans beaucoup de pays d'Europe. La furonculose touche principalement cette espèce. Nous utiliserons des animaux issus de la reproduction de Novembre 2021 (nés en Déc 2021) qui feront environ 15g au moment des essais. La furonculose touche tous les stades de vie mais les poissons jeunes sont plus fragiles.
Oncologie : modèles d’étude précliniques injectés en orthotopique
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 3300
13200 rongeurs, 9900 souris et 3300 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des cellules tumorales leur sont greffées directement dans divers organes, puis ils reçoivent des traitements jusqu'à quatre fois par jour, des séances de radiothérapie et une imagerie répétée. Le porteur décrit une perte de poids, une hypothermie, une distension de l'abdomen, des douleurs et des difficultés à respirer et à se nourrir, la présence des tumeurs ne permettant pas de garder les animaux en vie. Il présente le rongeur comme "essentiel", aucun système in vitro ne reproduisant selon lui le microenvironnement tumoral, et prévoit aussi de produire ces modèles pour d'autres laboratoires.
Objectifs
Le cancer est un problème de santé publique majeur et représente la deuxième cause de décès dans le monde. La complexité du microenvironnement tumoral, l'hétérogénéité moléculaire et biologique intra- et inter-tumorale, l'hétérogénéité des réponses immunitaires et métaboliques systémiques et tumorales, et la capacité des cellules souches initiatrices de cancers résistants aux médicaments à repeupler les cancers traités nécessitent des modèles prédictifs afin d’identifier de nouveaux traitements. Les modèles animaux de cancer humain et murin demeurent des éléments critiques dans la compréhension de la physiopathologie du cancer, l’identification de nouvelles cibles et de nouveaux candidats médicaments et la compréhension des mécanismes de résistance. Ce type de modèle permet d’analyser l’effet de molécules sur le microenvironnement « normal » des tumeurs mais aussi sur la formation de métastases, sachant que les métastases sont la principale cause de mortalité liée au cancer. Dès lors les modèles orthotopiques représentent des modèles d’intérêt en recherche translationnelle offrant une analyse plus prédictive de la réponse thérapeutique des substances à tester sur les différents stades de progression de tumeurs. L’objectif est de tester des candidats médicaments dans différents types de cancer (évaluation de leur efficacité et de leur potentielle toxicité).
Bénéfices attendus
Le projet consistera à développer des modèles de tumeur chez le rongeur pour les différentes indications en oncologie, qui permettra de tester l'efficacité d'anticancéreux. De plus, il permettra aussi d'évaluer l'expression de certains biomarqueurs en amont d'une étude de pharmacologie ou de générer des modèles animaux pour des procédures de test dans un autre laboratoire dans le cas de collaboration.
Procédures
Les animaux subiront une anesthésie d’environ 5 à 30 min pendant laquelle ils subiront soit une injection rapide (
Impact sur les animaux
Plusieurs effets indésirables inhérents au développement tumoral pourront apparaître pendant une étude : - Une perte de poids corporel - Un comportement amorphe marqué pendant les périodes de vigilance - Une hypothermie persistante - Une distension anormale de l’abdomen pouvant être le signe d’un épanchement - Des douleurs - Des problèmes de respiration pour l’animal - Une incapacité de se nourrir ou boire L’ensemble de ces symptômes sera monitoré pendant l’étude afin d’appliquer des mesures pouvant amener à l'euthanasie de l’animal avant la fin de l’étude pour raison éthique.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin d’étude car les animaux présentent des tumeurs cela ne permet pas un maintien des animaux en vie dans de bonnes conditions de santé.
Remplacement
Ce modèle ne peut pas être remplacé par des méthodes alternatives car l'induction de tumeur s'accompagne de modifications physiopathologiques et micro-environnementales spécifiques ne pouvant actuellement pas être reproduites in-vitro, ces modifications étant nécessaires pour l'étude d'efficacité d'anticancéreux. De plus, les traitements utilisés subissent toutes les différentes phases incluant administration, distribution, métabolisme et élimination, étapes ne pouvant être reproduites in-vitro.
Réduction
Des analyses in-vitro pourront être réalisées en amont de l'étude permettent de sélectionner des lignées/types de cellules présentant une sensibilité à la substance d'essai afin de limiter le nombre d'animaux. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet, la comparaison par rapport à une substance de référence, et un effectif suffisant de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. Dans cet objectif, une analyse sera réalisée afin d’estimer le nombre d’animaux nécessaire pour observer une diminution du volume tumoral mesuré d'au moins 50%.
Raffinement
Le raffinement des méthodes expérimentales afin de réduire au maximum la souffrance animale est mis en œuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids, …), permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse. Le programme d’anesthésie, d’analgésie et d'asepsie pour réduire les risques d'échec à la chirurgie (incluant oxygène à concentration ajustable et des tapis chauffants) est défini en accord avec un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de jouets, litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères... En cas de doute, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu’à normalisation ou jusqu’à atteinte des points limites. Tous les points limites et leur cotation sont décrits dans un formulaire interne. Cette observation inclut une surveillance de l'aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal sous stimulation, la respiration l’appétit, l’état d’hydratation, les tremblements ou convulsions… Une évaluation interne incluant la cellule de bien-être animal pourra permettre de réévaluer et d’adapter à posteriori la catégorie si nécessaire.
Choix des espèces
Les rongeurs rats et souris demeurent essentiel pour étudier les tumeurs in vivo et comprendre les mécanismes moléculaires de la pathogenèse du cancer. En effet, les tumeurs présentent une accumulation de multiples aberrations génétiques qui transforment les cellules, entraînant une croissance anormale, une prolifération et des métastases des cellules. Il n’est pas possible de reproduire ces éléments in vitro car requiert un système complexe comme les modèles animaux. Tous les animaux seront utilisés à partir de 5 semaines développement que ce soit des rats ou des souris. Dans certains cadres, les animaux pourront être utilisés avant sevrage pour des modèles génétiques ou de tumeurs pédiatriques.
Validation de nouvelles approches thérapeutiques dans les lymphomes grâce à l’établissement de modèles murins
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
679 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules de lymphome humain, sous la peau ou dans le tibia, puis des traitements répétés par gavage, injection ou voie intraveineuse et une imagerie hebdomadaire pendant trois à six mois. Le porteur décrit une douleur aux sites d'injection, une perte de poids et une mobilité réduite à mesure que la tumeur grossit, et programme la mise à mort dès l'atteinte de points limites. Il reconnaît utiliser des lignées cellulaires in vitro mais juge le modèle murin "indispensable", les retombées pour les patients atteints de lymphome restant renvoyées "à terme".
Objectifs
Les lymphomes NK/T extraganglionnaires de type nasal sont des entités rares de lymphomes T périphériques associés au virus Epstein Barr. Ils se localisent le plus souvent au niveau de la sphère ORL mais peuvent également atteindre d’autres organes dans le cadre de formes disséminées extranasales. La survie globale à 5 ans des formes localisées est actuellement de l’ordre de 70%, alors que celle des formes disséminées ne dépasse pas les 40%. Ceci justifie le développement de nouvelles approches thérapeutiques basées sur des thérapies plus ciblées incluant des approches d’immunothérapie. Les thérapies ciblées permettent en effet une meilleure tolérance au traitement par la réduction des effets indésirables toxiques mais également une meilleure éradication de la tumeur. Elles peuvent s'utiliser seules ou en association avec la chimiothérapie conventionnelle. La compréhension des mécanismes impliqués dans le développement des lymphomes NK/T est essentielle pour identifier et tester de nouvelles cibles pharmacologiques afin de compléter l’arsenal thérapeutique du clinicien et améliorer significativement les chances de guérison et de survie des patients. Plusieurs molécules candidates ont été identifiées grâce à des données préliminaires obtenues dans des modèles in vitro. Pour certaines d’entre elles, leur efficacité semble être modulée par la présence d’une mutation dans un gène d’intérêt. Ce projet a donc pour objectif de valider l’efficacité de ces molécules dans des modèles murins in vivo. Certaines molécules ont une action cytotoxique directe sur les cellules tumorales et peuvent donc être testées dans des modèles murins immunodéficients alors que d’autres ont pour mécanisme d’action une modulation de l’immunité anti-tumorale et doivent donc nécessairement être évaluées dans des modèles immunocompétents. Le projet se déroulera en deux étapes : -1ère étape : générer les modèles murins appropriés, qu’ils soient immunodéficients ou immunocompétents -2ème étape : tester l’efficacité des thérapies candidates dans ces modèles en évaluant l’impact du statut mutationnel pour notre gène d’intérêt.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront d’évaluer l’efficacité d'inhibiteurs pharmacologiques et d’immunothérapies déjà disponibles dans un modèle préclinique. L’objectif à terme sera de proposer un rationnel d’utilisation de ces médicaments dans les futurs protocoles cliniques de prise en charge des lymphomes NK/T.
Procédures
>Injection des cellules tumorales humaines (lignées) en sous-cutané : • sous anesthésie gazeuse par isoflurane • 1 seule fois par animal au cours de la procédure • durée : 1 min • 640 animaux >Injection des cellules tumorales humaines (cellules primaires) par voie intratibiale : • sous anesthésie gazeuse par isoflurane • 1 seule fois par animal au cours de la procédure • durée : 1 min • 39 souris >Prélèvement sanguin jugal : • souris vigile • bimensuelle puis hebdomadaire si présence de cellules tumorales circulantes, pendant 3 à 6 mois • durée : 1 min • 49 souris >Imagerie in vivo par bioluminescence : • sous anesthésie gazeuse par isoflurane • hebdomadaire pendant 3 à 6 mois • durée : 30 min • 679 souris >Administration de molécules thérapeutiques par gavage oral : • souris vigile • quotidien, à partir de J7-J10 post-injection, une fois par jour pendant 14 jours • durée : 30 secondes • 60 souris >Administration de molécules thérapeutiques par injection intrapéritonéale : • souris vigile • quotidien, à partir de J7-J10 post-injection, une fois par jour (ou tous les deux jours) pendant 14 jours (5 jours / semaine) • durée : 30 secondes • 450 souris >Administration de molécules thérapeutiques par voie intraveineuse caudale : • souris vigile • quotidien, à partir de J7-J10 post-injection, une fois par jour pendant 14 jours (5 jours / semaine) • durée : 30 secondes • 180 souris >Transfert adoptif de lymphocytes T OT-1 par voie rétroorbitaire : • sous anesthésie gazeuse par isoflurane • 1 seule fois par animal au cours de la procédure • durée : 1 min • 120 souris
Impact sur les animaux
Douleur aux sites d’injection des cellules tumorales (maxi : 3 jours) / Perte de poids / Mobilité réduite à cause de la croissance tumorale (1 semaine) / Stress lié à l’administration par gavage oral (14 jours)
Devenir
Mise à mort pour tous les animaux de toutes les procédures lorsque l’une des conditions ci-après est remplie : • Atteinte des points limites (cf grille de score établie pour chaque procédure) • Indication à une greffe dans des receveurs secondaires • Absence de prise de greffe au-delà de 3 ou 6 mois (selon les procédures)
Remplacement
Compte tenu du coût des études cliniques chez l’homme et de la réglementation actuellement en vigueur, une étape intermédiaire de vérification des hypothèses dans un modèle préclinique est indispensable. Dans le cadre de notre projet : •Les cellules tumorales de patients (dites cellules primaires) ne peuvent pas être obtenues en quantité suffisante pour tester in vitro l’efficacité des molécules d’intérêt. De plus, ces cellules sont fragiles et ne peuvent être maintenues en culture suffisamment longtemps pour pouvoir mener des expériences pharmacologiques in vitro. •Les lignées cellulaires n’étant pas le reflet exact de la biologie des hémopathies, il est indispensable de tenter d’amplifier les cellules primaires via un modèle murin afin d’objectiver la pertinence thérapeutique d’une drogue en tenant compte de sa pharmacodynamie et pharmacocinétique. •Pour évaluer la réponse immune anti-tumorale et de sa modulation par les immunothérapies, le rôle du micro-environnement tumoral est absolument majeur dans la réponse au traitement, une dimension qui ne peut naturellement pas être appréciée dans les études in vitro / ex vivo. Pour toutes ces raisons, la souris reste le modèle préclinique indispensable pour l’étude des lymphomes NK/T et pour tester l’efficacité in vivo de nouvelles thérapeutiques, et ce, avant de pouvoir les proposer aux humains dans le cadre d’essais cliniques.
Réduction
Méthologie de réduction du nombre des animaux nécessaires à l’expérimentation : •Evaluation pharmacologique in vitro approfondie sur lignées cellulaires pour optimiser les concentrations de drogues et pour sélectionner un nombre restreint de drogues d’intérêt (déjà réalisé) •Quantification de la viabilité cellulaire avant toute injection dans les souris •Optimisation du matériel issu de xénogreffe par productions multiples •Réduction du nombre d’animaux au minimum, après estimation des effectifs afin de garantir l’obtention de résultats statistiquement recevables. •Utilisation d’un même groupe de souris contrôles traitées par placebo pour évaluer l’efficacité de plusieurs drogues administrées selon la même voie •Utilisation de l’imagerie par bioluminescence : ce système d'imagerie optique préclinique permet d’évaluer la croissance tumorale. Des signaux de bioluminescence et/ou de fluorescence peuvent être suivis de manière longitudinale ce qui réduit le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
Tout au long de ce projet, nous serons attentifs au bien-être des animaux. Un suivi quotidien des souris sera effectué dans les 3 jours suivant l’injection des cellules tumorales. En cas de signes évocateurs d’infection ou de douleurs au site d’injection, du meloxicam sera administré. Nous avons également défini des points limites précoces, évaluables à l’aide d’une grille que nous avons établie, dans le but de ne pas causer de souffrance animale. Un suivi bihebdomadaire de ces points limites permettra de minimiser la douleur des animaux en programmant leur mise à mort si nécessaire. Les procédures seront par ailleurs raffinées par un enrichissement des cages d'animaux. Les cages seront enrichies à l’aide de coton et de cabanes, pour répondre aux besoins de nidification et ludiques des souris. Celles-ci seront également maintenues en communauté (2 à 5 souris par cage), en accord avec leurs besoins sociaux. Les souris NSG seront hébergées dans une zone SOPF, en portoirs ventilés et manipulées sous hotte ou PSM, leur permettant ainsi de ne pas exprimer de phénotype dommageable. Les injections de cellules en sous-cutané, rétroorbitaire ou intratibiale, les prélèvements sanguins et l’imagerie par bioluminescence nécessaires au suivi seront réalisés sous anesthésie. Concernant les traitements nécessitant un gavage oral, les souris seront habituées progressivement aux procédures de gavage avant la phase de traitement.
Choix des espèces
Les souris immunodéficientes ont été décrites dans la littérature scientifique depuis plusieurs années comme le meilleur modèle pour greffer les cellules hématopoïétiques humaines, étudier le développement des hémopathies humaines et servir de modèles précliniques pour l’évaluation de nouvelles thérapies. Concernant l’évaluation de la réponse immune anti-tumorale, le modèle de greffe dans des souris contrôles a déjà été validé dans la littérature. Pour les souris immunodéficientes : souris adultes entre 8 et 12 semaines, âge durant lequel la probabilité de prise de greffe est maximale selon les données de la littérature et l’expérience du laboratoire. Pour les souris contrôles : souris adultes entres 6 et 8 semaines, âge conforme aux données de la littérature
Evaluation de l’effet d’anticorps induits contre l’activateur tissulaire du plasminogène dans le contexte de l’AVC ischémique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent quatre injections pour induire des anticorps, puis un accident vasculaire cérébral provoqué par thrombine ou chlorure de fer, suivi d'une IRM et de tests comportementaux de récupération pendant deux semaines, avant le prélèvement de leur cerveau. Le porteur mentionne des déficits fonctionnels et cognitifs, des douleurs post-opératoires et une perte de poids, sans détailler les tests comportementaux employés. Il qualifie l'expérimentation animale de "stricte nécessité" et affirme qu'aucune méthode sans animal n'apporterait le même niveau d'information, la retombée pour les patients victimes d'AVC restant lointaine.
Objectifs
La présence d'auto-anticorps dirigés contre l'activateur tissulaire du plasminogène (tPA) a été décrite dans différentes pathologies telles que le Lupus Erythémateux Systémique, le Syndrome Primaire des Antiphospholipides, l'Hypertension Pulmonaire Primaire, les Maladies Inflammatoires Chroniques de l'Intestin ou encore les fausses couches à thrombi veineux et/ou utérins. Certaines des études ayant montré la présence de ces auto-anticorps ont également montré qu'ils étaient dirigés contre le domaine catalytique du tPA, sans pour autant démontrer leur impact sur les fonctions du tPA. Dans ce contexte, au sein du laboratoire, un outil de détection des auto-anticorps en cytométrie a été développé. Un modèle murin exprimant des anticorps induits contre le tPA a été développé au sein du laboratoire afin d'étudier cette thématique. Ce dernier a permi de montrer que les anticorps anti-tPA réduisent drastiquement l'activité profibrinolytique du tPA in vitro. Afin d'évaluer l'effet des anticorps induits dirigés contre le tPA dans le contexte de l'AVC (Accident Vasculaire Cérébral), nous avons la nécessité de remettre en place ce modèle d'immunisation active à des souris qui seraient ensuite soumises à des modèles d'AVC tels que le modèle basé sur l'utilisation de la thrombine ou le modèle basé sur l'utilisation de chlorure de fer.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre d'évaluer l'impact des anticorps dirigés contre l'activateur tissulaire du plasminogène (tPA) dans le cadre de l'AVC ischémique et va permettre d'améliorer à terme la prise en charge des patients victimes d'AVC. De plus, au vu des différentes pathologies au sein desquelles ces anticorps ont été détectés jusqu'à maintenant, ce projet permettra de mieux comprendre l'impact de ces anticorps anti-tPA sur les phénomènes de coagulation et de fibrinolyse.
Procédures
Chaque animal fera l'objet de 4 injections intrapéritonéales d'un mélange immunogène pendant 4 semaines pour induire la production d'anticorps. 2 semaines après la fin de ces injections, les animaux se verront induire un Accident Vasculaire Cérébral (AVC) avec un traitement nécessitant la pose de cathéter intraveineux au niveau de la queue. Ces protocoles d'AVC dureront entre 2h et 4h suivant les temporalités des traitements (précoce ou tardif). Un jour après l'induction de l'AVC, les animaux se verront à nouveau anesthésiés afin de passer un examen IRM durant près de 40minutes. En parallèle à l'induction des AVC ainsi qu'aux examens IRMs les animaux suivront des protocoles comportementaux d'évaluation de la récupération fonctionnelle post-AVC. Ces évaluations comportementales dureront jusqu'à 15jours après l'induction de l'ischémie. C'est au terme de ces évaluations comportementales que les animaux seront mis à mort.
Impact sur les animaux
L’hébergement des animaux s’effectue au moins 7 jours avant le début des procédures pour leur habituation et la gestion de leur stress. Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient : une perte de poids anormale, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels et/ou cognitifs.
Devenir
A l'issu de chaque procédure, les animaux seront mis à mort selon la dérogation ce qui permettra de prélever leurs cerveaux.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de l'aisance des expérimentateurs. Dans chaque phase du projet, le minimum d'animaux a été prévu afin d'arriver à des résultats qui soient en adéquations avec les tests statistiques prévus lors de ce projet en prenant en compte un pourcentage d'animaux nécessaire à l'apprentissage. Le nombre d’animaux pour chaque étude a été défini à partir d’une analyse de puissance et de nos données sur chaque modèle. De plus, l'utilisation de techniques d'imagerie non invasives permet de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux sont hébergés dans des cages standards aux normes européennes. Les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux est contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permettra de détecter tous signes cliniques de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun syndrome associé à un état maladif. Les animaux seront également placés dans un environnement enrichi au sein de cages aux standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) : 5 souris par cage, coton, paillettes, petites maisons. Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Les animaux seront pesés deux fois par semaine pour surveiller leur poids et éviter une perte de poids trop élevée qui serait associée à un état de souffrance anormal des animaux. Des échelles d’évaluation de la souffrance animale seront également utilisées, associées à l’utilisation de points limites adaptés, afin d’intervenir pour mettre un terme à une souffrance trop grande chez les animaux en protocole. Tout le matériel et consommables utilisés dans cette procédure expérimentale seront neufs (comme les seringues et aiguilles), soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser (pinces métalliques). Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du développement et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les expériences envisagées nécessitent l'utiliation du modèle à anticorps induits dirigés contre l'activateur tissulaire du plasminogène ayant été développé chez la souris. Il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Les souris utilisées dans cette étude seront commandées à l'âge de 7 semaines pour qu'elles aient 1 semaine d'acclimatation à l'animalerie. Le protocole d'immunisation débutera lorsque les souris auront atteint l'âge de 8 semaines. L'immunisation se fera sur 4 semaine et se terminera donc à l'âge de 11 semaines pour les souris. Les protocoles d'induction d'accidents vasculaires cérébraux seront réalisés 2 semaines après la fin de l'immunisation, soit à l'âge de 13 semaines. En effet, c'est 2 semaines après la fin de l'immunisation active que nous avons montré le pic de production d'anticorps induit anti-tPA dans ce modèle d'immunisation.
Entretien de souches de strongles digestifs et production de larves infestantes chez des ovins
- Recherche appliquée
- Maladies animales
20 béliers vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis vermifugés et replacés via une association. Ils sont infestés à répétition par un ver parasite hématophage sur 21 mois, avec jusqu'à 129 prélèvements de fèces par animal, pour produire des larves infestantes destinées à des centres de sélection ovine. Le porteur indique que l'infestation provoque une anémie faible, "généralement bien tolérée". Il présente le recours au petit ruminant comme "nécessaire", aucune production de ces larves n'étant possible in vitro, la finalité étant de réduire à terme l'usage d'antiparasitaires en élevage.
Objectifs
Dans les élevages ovins, les parasites du tube digestif, dont notamment les strongles gastro-intestinaux (SGI) peuvent être responsables de troubles sanitaires et de pertes économiques majeures. La lutte contre ces parasites a longtemps reposé quasi-exclusivement sur l'administration régulière de molécules chimiques à activité antiparasitaire aux animaux, mais le développement de résistance à ces produits parmi les populations de vers, les problématiques écologiques liées à leur utilisation et la demande sociétale croissante de réduction des intrants chimiques dans les élevages ont conduit les acteurs de la filière ovine à chercher des moyens de lutte alternatifs. La recherche et la mise en évidence d'un déterminisme génétique de résistance ou de sensibilité aux SGI chez les ovins s'est inscrit dans cette démarche, avec, pour finalité, la sélection d'animaux naturellement moins sensibles au parasitisme. Dans ce contexte, l’objectif du projet est de fournir aux organismes de sélection de la filière ovine, les quantités de larves infestantes d'un espèce de SGI nécessaires à la réalisation d’infestations de béliers reproducteurs afin d’estimer, chez ces individus, l'héritabilité du caractère de résistance, en première et en seconde infestation. La qualification de résistant ou de sensible, attribuée à des ovins, ne s’entend que s’ils ont été soumis à la même pression parasitaire, ce qui n’est pas possible dans les conditions naturelles d’infestation où le nombre de larves infestantes sur les pâtures dépend de facteurs climatiques et est réparti de façon hétérogène, d’où la nécessité de recourir à des infestations contrôlées dans lesquelles le nombre de larves administrées et la durée de l’infestation sont rigoureusement identiques pour tous les individus testés.
Bénéfices attendus
Les béliers infestés vont permettre de fournir durablement des larves infestantes d'Haemonchus contortus aux centres ovins engagés dans la sélection d’animaux résistants aux SGI. A long terme, cette démarche doit permettre de diminuer significativement l’utilisation d’antiparasitaires dans les élevages ovins, par diffusion du caractère de résistance aux SGI via des béliers sélectionnés, et donc de réduire leurs effets négatifs sur l'environnement.
Procédures
Interventions sur animaux vigiles : 1/ drogages par voie orale : au maximum 4 par bélier, correspondant à la vermifugation initiale, avant la première infestation puis les vermifugations à chaque fin de cycle d'infestation (3 au maximum), 3 minutes par intervention 2/ prélèvements de fèces dans le rectum : 1 avant chaque cycle (coproscopie de contrôle d'efficacité de la vermifugation) + 42 par bélier et par cycle d'infestation, soit au maximum 129 par bélier sur 21 mois (3 cycles) ; 3 minutes par prélèvement
Impact sur les animaux
Haemonchus contortus étant un parasite hématophage (qui se nourrit de sang), la dose infestante administrée va induire une anémie faible chez les béliers. Celle-ci est généralement bien tolérée par les animaux ; leur état général ne devrait donc pas être affecté.
Devenir
L'infestation expérimentale contrôlée ne devrait pas altérer la santé des animaux. Après vermifugation en fin de procédure, rien ne s'oppose donc à leur replacement par l'intermédiaire d'une association spécialisée (GRAAL).
Remplacement
Dans le cycle biologique d'Haemonchus contortus, l'hôte définitif, au sein duquel la reproduction sexuée du parasite a lieu, est un petit ruminant (ovin ou caprin). Le recours à une espèce de petits ruminants est nécessaire pour obtenir des larves infestantes d'Haemonchus contortus car il est actuellement impossible d'en produire in vitro ou ex vivo.
Réduction
Le nombre de béliers prévus (n=20) est le minimum nécessaire estimé pour permettre la production d'une quantité suffisante de larves d'Haemonchus contortus pour mener à bien les études sur le déterminisme génétique de la résistance aux strongles gastro-intestinaux, tout en restant à des niveaux d'infestation générant peu de troubles sanitaires chez les animaux et en se réservant la possibilité d'exclure temporairement, si nécessaire, un ou deux individus, sans mettre en péril le projet. Dans le détail, les besoins des organismes de sélection de la filière ovine sont de 20 millions de larves/an. Il est difficile d’avoir une estimation précise, a priori, de la production individuelle de larves car deux facteurs non maitrisables influent sur la production d’œufs par les nématodes présents dans la caillette : le taux d’implantation et l’intensité de la réponse immune de l’hôte. Malgré cette variabilité, d’après l’expérience passée que nous avons de ce modèle et en tenant compte du rendement du processus de coproculture (récupération de seulement 50 % des larves), une production attendue de 1 million de larves/animal/an nous semble réaliste.
Raffinement
Les béliers bénéficieront d'une période d'acclimatation de 4 semaines avant d'être infestés expérimentalement. Ils seront hébergés en groupe, sur litière paillée, dans des enclos équipés de brosses sur lesquelles ils pourront se frotter et de filets à foin. La contention et les prélèvements seront effectués par du personnel expérimenté. Au cours des prélèvements, les animaux garderont un contact visuel avec leurs congénères, ce qui limitera le stress.
Choix des espèces
Les ovins sont des hôtes définitifs naturels d'Haemonchus contortus. Les animaux utilisés seront âgés d'au moins 7 mois. Il s'agit de l'âge à partir duquel ils peuvent supporter une infestation expérimentale avec 10000 larves infestantes d'Haemonchus contortus sans que cela ait un impact sur leur développement staturo-pondéral.