Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Étude de la biologie du parasite responsable du paludisme et développement de vaccins anti-paludéens à l’aide de modèles murins MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
6 570 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour étudier le paludisme et développer un vaccin. Chacune peut recevoir des infections par Plasmodium, par injection ou par piqûres de moustiques infectés, des prélèvements sanguins quotidiens sur près de trois semaines, et pour certaines des chirurgies comme l'implantation d'un anneau de titane, une ablation de la rate ou une greffe de peau humaine. Le RNT classe ces manipulations répétées en souffrance légère. Les souris sont mises à mort avant l'apparition des symptômes du paludisme, que le porteur cherche à devancer.
Objectifs
Notre but majeur est la compréhension fonctionnelle des interactions parasite-hôte qui surviennent lors de la phase initiale de l’infection palustre dans le but ultime de développer un vaccin anti-paludique pré-érythrocytaire. A cet effet, nous utilisons une combinaison d’outils de génétique moléculaire, de biologie cellulaire et d’imagerie intra-vitale afin de comprendre comment l’animal est infecté et comment il monte une réponse immunitaire protectrice contre le parasite. Tous ces sujets doivent être abordés in vivo, en utilisant l'expérimentation animale, car la complexité de l'infection et de l'immunité ne peut être reproduite in vitro. Par conséquent, en utilisant principalement P.berghei et P.yoelii dans un modèle murin de paludisme, notre travail se décline selon trois axes majeurs : 1. Imagerie fonctionnelle de la phase pré-érythrocytaire de l’infection. 2. Compréhension de la mise en place de la protection contre la phase pré-érythrocytaire 3. Développement préclinique d'un vaccin pré-érythrocytaire contre le paludisme.
Bénéfices attendus
Dans ce projet nous espérons (i) mieux comprendre les premières étapes de l’infection en utilisant des approches de biologie cellulaire et moléculaire ainsi que la microscopie intra-vitale pour identifier les composants essentiels du parasite susceptibles de constituer des cibles pour de nouveaux médicaments et vaccins, (ii) mieux comprendre comment une immunité protectrice contre le parasite peut se développer et identifier de nouvelles cibles vaccinales, et (iii) développer pré-cliniquement un vaccin plus efficace contre le paludisme.
Procédures
[MODIFICATION] IMMUNISATIONS POUR VOIE INTRANASALE et DUREE DU PROJET Afin d’identifier et d’évaluer l’activité protectrice de nouvelles cibles vaccinales ou plateformes d’administration et d’élucider leur mécanisme d’action, les souris impliquées dans cette procédure expérimentale pourront être soumises à des injections sous-cutanées (15 sec), intrapéritonéales (15 sec), intramusculaires (15 sec) ou intraveineuses (30 sec) ainsi qu’à des prélèvements sanguins et un ou plusieurs challenges infectieux par des parasites de Plasmodium. Bien que susceptibles d’être répétées, ces manipulations sont toutes considérées de sévérité légère et seront, de plus, suffisamment espacées dans le temps pour limiter le stress infligé aux animaux. Pour infecter les souris vigiles avec des sporozoïtes, le parasite sera micro-injecté dans le coussinet plantaire (15 sec) ou par la voie intraveineuse (30 sec). Les souris anesthésiées seront infectées par micro-injection dans la peau du pavillon auriculaire (15 sec) ou par des piqûres de moustiques infectés. Après infection, la parasitémie des animaux est contrôlée par frottis sanguins ou cytométrie en flux, à partir d’une goutte de sang prélevée par ponction de la veine caudale de la queue (30 sec). Pendant la phase de croissance exponentielle du parasite, qui se produit normalement entre le 3ème et le 6ème jour post-infection les prélèvements seront réalisés quotidiennement. Alternativement, l’infection hépatique sera mesurée de manière non invasive par bioluminescence, ou par microscopie/ RT-PCR dans le foie disséqué. Des souris anesthésiées seront soumises à un acte chirurgical sans réveil (20 min) pour réaliser l’imagerie à court terme dans le foie ou la rate. Des souris anesthésiées et analgésiées seront soumises à un acte chirurgical avec réveil pour l’implantation abdominale d’un anneau en titane (imagerie longitudinale – foie, rate) (45 min), pour une splenectomie (45 min), ou pour la greffe de la peau humaine (30 min) (imagerie longitudinale de P. falciparum – peau).
Impact sur les animaux
Le rongeur vigile pourra souffrir de l'inconfort causé par des injections (intrapéritonéale, sous-cutané, intramusculaire, intraveineuse), par la micro-injection dans la peau, ainsi que par le prélèvement d'échantillons de sang à la queue, au menton ou à la joue. Bien que susceptibles d’être répétés, les prélèvements seront suffisamment espacés dans le temps pour limiter le stress infligé aux animaux : les prélèvements d’un volume sanguin de 25 µL à 50 µL au niveau d’un même site (joue, menton, veine caudale) seront espacés au minimum d’une semaine et les prélèvements d’une goutte de sang à l’extrémité de la queue pourront être répétés au plus quotidiennement pendant 20 jours consécutifs mais en aucun cas le volume prélevé n’excèdera 20 µL par période glissante de 7 jours. Les animaux infectés par le parasite seront mis à mort par la dislocation cervicale ou par exposition au CO2, avant l'apparition des symptômes du paludisme expérimental.
Devenir
Toutes les souris utilisées dans les procédures expérimentales seront infectées par des parasites type Plasmodium. Il ne sera donc pas possible de les maintenir en vie ou les réutiliser. Les souris seront mises à mort avant la phase symptomatique du paludisme. Seulement méthodes de mis à mort validées par le comité étique seront utilisées.
Remplacement
Les processus conduisant à l'infection de l'hôte par les différents stades parasitaires ou à la protection de l'hôte contre ces stades par le biais de la vaccination sont extrêmement complexes. Dans la phase initiale de l’infection, ils impliquent des interactions multiples et dynamiques entre le parasite et plusieurs types cellulaires dans la peau, les ganglions, les vaisseaux, le sang, la rate et le foie, qu'il est impossible de répliquer dans leur ensemble dans un système in vitro. L’étude approfondie de cette phase nécessite donc l’utilisation de modèles animaux pour appréhender cette incroyable complexité. Depuis les années 1950, les espèces de Plasmodium qui infectent les rongeurs, P. berghei et P. yoelii, sont devenues les espèces de choix pour étudier cette phase, et ont notamment permis la découverte des candidats vaccins les plus importants contre le paludisme. Pour évaluer les activités cellulaires des sporozoïtes (motilité, traversée cellulaire, infection cellulaire), et les effets neutralisants des effecteurs immunitaires ou antipaludiques, les expériences seront effectuées in vitro. Malheureusement, certains effets observés in vitro ne correspondent pas à ce qui est observé in vivo, nous obligeant à valider les résultats obtenus in vitro dans des modèles expérimentaux animaux.
Réduction
Nous utilisons le nombre minimum possible d’animaux pour nos expériences calculé à l'aide d'un logiciel développé à l'Institut Pasteur (shade.pasteur.fr) qui compare deux moyennes de groupes non jumelés à l'aide d'un test bilatéral paramétrique, en tenant compte des données expérimentales. Pour l’analyse statistique de nos expériences, nous appliquerons un test paramétrique ANOVA non jumelé, si nécessaire, ajusté pour comparaison multiple. Nous normaliserons les tests statistiques sur un effet "répétition/cage" grâce à l'utilisation de modèles mixtes. Également, nous rechercherons toujours à réduire ce nombre en améliorant les procédures, par exemple, en développant des méthodes d'imagerie intravitale non invasive pour diminuer le nombre de souris utilisées dans les études longitudinales.
Raffinement
Nos points limites sont établis de manière à éviter la phase symptomatique du paludisme chez les animaux infectés. Les souris auxquelles sont inoculées les espèces de Plasmodium adaptées aux rongeurs de laboratoire sont suivies quotidiennement durant la phase sanguine de l’infection afin de déterminer leur niveau de parasitémie. Les animaux sont mis à mort avant que n’émergent des symptômes signant des dommages systémiques – prostration, aspect du pelage, perte de poids - et témoignant du développement asexué non contrôlé du parasite dans le sang. Il est important de souligner que la phase de l’infection que nous analysons est asymptomatique, et que lorsque les procédures expérimentales nécessitent d’atteindre la phase érythrocytaire de l’infection, les animaux sont sacrifiés avant la survenue de symptômes ou complications létales- neuropaludisme, anémie prolongée. Nous utiliserons la grille comportementale/clinique de la SBEA pour évaluer l'état de santé des souris. Les souris avec plus de 1% de parasitémie seront observées quotidiennement, les autres seront suivies hebdomadairement. Les animaux obtenant un score de deux points (ex : poil hérissé, prostration) bénéficieront de mesures d'amélioration des conditions d'hébergement (enrichissement, chaufferette), de l'aliment (gel diététique) ou de traitements médicamenteux (analgésie). Les souris présentant un score supérieur à deux seront mises à mort par exposition au CO2.
Choix des espèces
Les hôtes naturels des parasites P. berghei et P. yoelii sont des espèces de rongeurs sauvages (Grammomys, Thamnomys) d’Afrique Centrale. Des isolats de ces parasites ont été transmis et adaptés aux souris et rats de laboratoire depuis de nombreuses années par plusieurs équipes. Il est reconnu dans la communauté scientifique que l’infection des rongeurs avec ces parasites est un modèle biologiquement pertinent pour étudier plusieurs aspects du paludisme chez l’Homme. La preuve de l’intérêt d’une recherche rigoureuse chez le rongeur pour éclairer ou informer la recherche chez l’Homme n’est plus à faire. Nous privilégions l’utilisation de souris dans nos études car la plupart des concepts issus des modèles souris, en particulier dans le domaine de la vaccinologie anti-palustre, se sont révélés exacts chez l’Homme. De plus, la disponibilité de diverses souris transgéniques rend cette espèce adaptée aux études fonctionnelles des voies impliquées dans l'infection et la protection de l'hôte. Les inoculations de parasites aux souris seront réalisées sur de jeunes adultes de 4 semaines car ils ne sont pas immunocompétents, ce qui favorise l’infection par le parasite. Les expériences d’imagerie in vivo seront réalisées sur des souris de 4-12 semaines. Les expériences sur les réponses immunitaires seront réalisées sur des souris adultes immunocompétentes âgées de plus de 6 semaines.
Rôle du métabolisme des phosphoinositides dans la physiopathologie de la myopathie centronucléaire liée au chromosome X (1/2)
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
1 217 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Modifiées pour perdre une protéine musculaire, elles développent une myopathie qui les affaiblit jusqu'à la perte de mobilité et la mort vers treize semaines, et subissent des tests répétés de force, de course sur tapis et de motricité. Le porteur affirme que la maladie ne provoque pas de douleur, tout en décrivant une dégradation musculaire qui mène à la mort. Les bénéfices thérapeutiques restent suspendus à de futurs essais, quand la dissection des muscles après mise à mort, elle, est programmée.
Objectifs
La myopathie centronucléaire liée au chromosome X est une maladie grave, touchant les garçons dès la naissance, qui rend les muscles très faibles et pour laquelle il n’existe malheureusement pas encore de traitement. Elle est causée par des mutations d’un gène codant une protéine qui contrôle le métabolisme de certains types de lipides. Lorsque la protéine ne fonctionne pas bien, les muscles perdent leur force et deviennent plus petits. Afin de mieux comprendre le rôle de cette protéine dans le fonctionnement du muscle et dans le développement de la myopathie centronucléaire, nous avons créé une nouvelle lignée de souris dans laquelle cette protéine a perdu sa fonction. Ces souris commencent à montrer des signes de myopathie vers 6 semaines et vivent moins longtemps que les souris normales. Dans leurs cellules musculaires, deux fonctions semblent particulièrement perturbées : la fonction mitochondriale et la fonction lysosomale. L’objectif du projet est de mieux caractériser l’évolution de la fonction musculaire chez ces souris au cours du développement de la myopathie centronucléaire et de comprendre comment les fonctions mitochondriale et lysosomale sont contrôlées par cette protéine. Nous testerons également plusieurs traitements pour restaurer les fonctions mitochondriale et lysosomale lorsque la protéine ne fonctionne plus afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques contre cette maladie. Le projet se deroulera dans deux établissements utilisateurs : les tests auront lieu dans l’EU 1 et la mise à mort sera effectuée dans l’EU 2.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre comment la perte de fonction de la protéine perturbe le fonctionnement normal du muscle et provoque la myopathie centronucléaire liée au chromosome X (XLCNM). Plus précisément, il permettra d’étudier le rôle des fonctions mitochondriale (production d'énergie pour la cellule) et lysosomale (recyclage des déchets cellulaires) dans le développement de la maladie. De plus, il permettra de tester de nouveaux traitements potentiels en vérifiant qu’ils ne sont pas toxiques et qu’ils sont efficaces pour empêcher ou ralentir le développement de la XLCNM. Si les résultats sont positifs, ils pourront être proposés pour de futurs essais chez les patients atteints de myopathie centronucléaire.
Procédures
Sur le 1er groupe d’animaux, 4 fois (semaines 4-7-10-13), sur animal vigile sauf si mention contraire : -mesure de composition corporelle : contention dans l’appareil de mesure de la composition corporelle, 2 minutes -test de force (force d'agrippement des 4 membres à une grille reliée à un dynamomètre): 5 x 1 seconde, avec au moins 1 minute de repos entre 2 essais -test de course sur tapis roulant : 10-45 minutes selon la capacité des animaux -test de motricité (temps mis pour franchir un obstacle de type "échelle horizontale" en marchant): 3 x 30 secondes à 5 minutes selon la capacité des animaux -test de la fonction de la jonction neuromusculaire (animal anesthésié) : stimulation électrique 8 x 0,2 millisecondes Sur le 2ème groupe d’animaux, 1 fois : 1 injection sur animal anesthésié, 10 secondes Sur le 3ème groupe d’animaux : -injection intrapéritonéale : 1 / jour pendant 28 jours consécutifs, 28 x 10 secondes -test de force: 5 x 1 seconde, avec au moins 1 minute de repos entre 2 essais ; toutes les 2 semaines, entre 6 et 10 fois (selon de combien de temps le traitement retarde l’apparition des symptômes sévères) -test de motricité : 3 x 30 secondes à 5 minutes selon la capacité des animaux ; toutes les 2 semaines, entre 6 et 10 fois (selon de combien de temps le traitement retarde l’apparition des symptômes sévères) Sur le 4ème groupe d’animaux : -test de force: 5 x 1 seconde, avec au moins 1 minute de repos entre 2 essais ; toutes les 2 semaines, entre 6 et 10 fois (selon de combien de temps le traitement retarde l’apparition des symptômes sévères) -test de motricité : 3 x 30 secondes à 5 minutes selon la capacité des animaux ; toutes les 2 semaines, entre 6 et 10 fois (selon de combien de temps le traitement retarde l’apparition des symptômes sévères) Toutes ces interventions seront réalisées dans l’établissement EU 1.
Impact sur les animaux
La myopathie centronucléaire chez l’Homme se caractérise par une faiblesse musculaire dès la naissance, sans douleur, due à l’absence d’une protéine. La faiblesse musculaire s’aggrave progressivement jusqu’ à ce qu’ils ne puissent plus respirer et meurent vers l’âge de 2,5 ans. La souris que nous avons créée, dont la protéine n’est plus fonctionnelle, développe les premiers symptômes autour de 6 semaines. D’après nos premiers résultats, ces symptômes deviennent sévères rapidement pour aboutir à une perte de mobilité des membres inférieurs et à la mort des animaux autour de 13 semaines en moyenne. Ponctuellement, les souris seront soumises à des stress et de l’inconfort pour des durées très courtes (contention nécessaire aux injections et injections elles-mêmes, mesures de composition corporelle et de force) ou courtes avec fin immédiate du stress et de l’inconfort à l’arrêt de la manipulation (tests d’endurance). Les traitements viseront tous à améliorer le phénotype musculaire et à prolonger la durée de vie. Deux d’entre eux ont déjà été largement utilisés dans des modèles animaux et testés lors d’études cliniques. Concernant le troisième, son absence de toxicité à haute dose à court et moyen termes (4 mois) a déjà été testée et validée sur des souris. Afin de déterminer les conditions de traitement optimales, la présente demande inclut une expérience préliminaire au cours de laquelle des petits groupes de souris seront traités selon différentes modalités, mais à des doses inférieures ou égales à celle déjà testée. Enfin, l’injection par voie intraveineuse d’un virus spécial (utilisé chez l’Homme en thérapie génique), qui permettra de faire briller une protéine dans certaines parties de la cellule, bien que réalisée sous anesthésie, pourrait entraîner un inconfort léger au réveil. Pour éviter cela, nous utiliserons un gel analgésique localement.
Devenir
A l’issue des procédures, les animaux seront mis à mort et leurs muscles disséqués pour réaliser des analyses histologiques et moléculaires ou pour préparer des cultures de cellules musculaires in vitro.
Remplacement
Le but principal de ce projet est d’étudier un nouveau modèle de la myopathie centronucléaire pour mieux comprendre comment les muscles sont touchés. Ensuite, ce modèle servira à tester plusieurs traitements qui pourraient aider les muscles à mieux fonctionner. Pour cela, nous devons mesurer des paramètres importants du fonctionnement du muscle comme la force, l’endurance, la façon dont les souris bougent mais aussi combien de temps elles vivent. Ces paramètres ne peuvent pas être mesurés avec d’autres méthodes. Les autres méthodes disponibles sont des cellules musculaires qui poussent dans une boîte en plastique au laboratoire, mais ces cellules ne deviennent jamais aussi développées, ni aussi fortes, que de vrais muscles dans un corps vivant. Elles ne peuvent même pas vraiment se contracter comme un vrai muscle. Elles ont quand même été utiles pour comprendre ce qui ne marche plus quand la protéine d’intérêt est absente, et pour trouver quelles parties de la cellule sont perturbées (par exemple, les mitochondries et les lysosomes). Ces cellules seront d’ailleurs à nouveau utilisées plus tard pour comprendre comment elles réagissent aux traitements, mais pour bien étudier l’effet des médicaments sur les muscles, il faut utiliser les souris du modèle de myopathie centronucléaire.
Réduction
Nous avons utilisé des méthodes statistiques pour calculer combien de souris utiliser pour chaque expérience afin d’être sûrs d’obtenir des résultats fiables, tout en utilisant le moins d’animaux possible. Tout d’abord, nous comparerons la force des muscles entre les souris saines et les souris malades au cours de l’évolution de la maladie. D’après nos tests précédents, il faut environ 21 souris par groupe pour voir une vraie différence. Nous incluerons 2 souris de plus dans le groupe malade au cas où certaines souris meurent plus tôt à cause de la myopathie. Des souris seront également nécessaires pour étudier ce qui se passe à l’intérieur des muscles aux différentes étapes du développement de la maladie, c’est-à-dire aux âges de 4, 7, 10 et 13 semaines. Pour ces analyses, nous aurons besoin de 9 souris par groupe. Ensuite, nous ferons un essai pour vérifier une nouvelle technique qui permet de « marquer » certaines parties des cellules musculaires (mitochondries et lysosomes) avec un virus spécial. Pour ça, nous utiliserons seulement 3 souris saines par groupe. Pour comparer les protéines et les petites molécules dans ces mitochondries et ces lysosomes chez les souris saines et les souris malades, nous utiliserons 6 à 12 souris par groupe selon la variabilité des mesures. Les groupes de souris malades auront une souris de plus au cas où l’une meure plus tôt à cause de la myopathie. Puis nous testerons différents traitements (3 médicaments, donnés à différents moments au cours du développement de la maladie) pour essayer d’améliorer la force des muscles et augmenter la durée de vie des souris. Pour cela, nous aurons besoin de plusieurs groupes de souris pour comparer les effets de ces traitements à des souris saines et à des souris malades non traitées. Nous aurons besoin de 19 souris par groupe pour détecter une différence intéressante, et nous ajouterons 2 souris de plus dans les groupes de souris malades au cas où certaines souris meurent plus tôt à cause de la myopathie. Enfin, des souris serviront à préparer des cellules musculaires en laboratoire pour comprendre ce qui se passe à l’intérieur des cellules et comment elles réagissent aux traitements.
Raffinement
La myopathie centronucléaire, chez les souris comme chez les patients, ne provoque pas de douleur au niveau des muscles, ni ailleurs. Nous serons quand-même attentifs à ce que les souris ne souffrent pas durant nos expériences. Pour cela, nous leur permettrons d’avoir un comportement aussi naturel que possible dans leurs cages en leur donnant du matériel leur permettant de ronger et de faire un nid, et elles seront plusieurs par cage afin de ne pas souffrir d’isolement. Lorsque leurs muscles deviendront faibles et qu’elles auront du mal à se déplacer, nous leur fournirons la nourriture et l’eau directement au fond de la cage pour qu’elles n’aient aucun effort à faire pour s’alimenter. Avant de réaliser les tests de la fonction musculaire, nous les habituerons aux systèmes utilisés pour qu’elles ne soient pas stressées au moment de faire les tests. Lorsque des anesthésies seront nécessaires, nous les placerons sur un tapis chauffant pour ne pas qu’elles aient froid durant l’expérience. Suite aux injections intraveineuses de virus, nous utiliserons un analgésique local.
Choix des espèces
La myopathie centronucléaire est une maladie musculaire due à l’absence d’une protéine dans le muscle. Nous avons donc créé une nouvelle lignée de souris chez laquelle cette protéine ne fonctionne pas dans le muscle afin d’étudier comment la protéine provoque la maladie. Ces souris ne présentent initialement pas de symptômes ; à partir de 6 semaines, leur fonction musculaire commence à se dégrader et elles meurent en moyenne vers 13 semaines. Dans les expériences sans traitement, nous utiliserons des souris âgées entre 4 et 13 semaines, c’est-à-dire avant le moment où elles risquent de mourir de la maladie. Dans les expériences avec traitements, ceux-ci auront pour objectif d’améliorer la fonction musculaire, mais également d’augmenter la durée de vie. Si ces traitements fonctionnent, nous serons donc amenés à étudier les souris au-delà de 13 semaines, plus ou moins longtemps en fonction de l’efficacité des traitements pour maintenir la fonction musculaire.
Diffusion de molécules à l’oreille interne par sonoporation sur modèle ovin – MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Anesthésiées trois heures pour une première chirurgie de l'oreille interne, puis à nouveau trente minutes pour un prélèvement, 27 brebis vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'étude compare deux méthodes de diffusion d'un produit dans l'oreille interne, chaque brebis servant de son propre témoin. Cette version modifiée ajoute quatre animaux pour valider une nouvelle sonde. Les brebis sont mises à mort parce que l'intervention leur laisse une surdité irréversible, des vertiges et une paralysie faciale qui empêche de s'alimenter normalement.
Objectifs
L'objetif principal de notre projet vise à étudier la diffusion de molécules de gadolinium au sein de l'oreille interne en comparant les injections transtympaniques classiques versus l'utilisation d'ultrasons. Les objectifs secondaires sont de vérifier l'absence de retentissement sur la fonction auditive après la réalisation des séances de ces techniques et à distance (J7 de la délivrance), une conservation de l'quilibre et de la symétrie du visage, et l'absence d'altération de la composition des liquides de l'oreille interne suite à ces procédures.
Bénéfices attendus
Si les résultats du projet sont démontrés, c'est-à-dire une amélioration de la diffusion du gadolinium à l'oreille interne par sonoporation (avec ou sans microbulles chargées) avec absence d'effets indésirables à court et long terme, cela permettra de proposer un nouveau mode de diffusion chez l'Homme. Cette méthode permettrait d'obtenir une meilleure diffusion le long de la cochlée et des concentrations plus élevées d'agents thérapeutiques au sein de la cochlée. Par la suite, il sera nécessaire de développer une sonde spécifique pour l'Homme, de réaliser de nouvelles expérimentation avec d'autres molécules. Cependant, cette étape préliminaire reste indispensable à la poursuite du projet. Cette voie de délivrance par sonoporation à l'oreille interne pourrait par la suite avoir un rôle thérapeutique notamment pour traiter certaines atteintes de l'oreille interne comme la surdité brusque, la maladie de Menière où actuellement les injections transtympaniques sont privilégiées. Il pourrait aussi s'agir d'une voie de délivrance dans le cadre de la thérapie génique pour les surdités d'origine génétique.
Procédures
La majorité des actes auront lieu sous anesthésie générale, il s'agit de la mesure des seuils auditifs, de l'abord chirurgical avec la délivrance de molécule, de l'imagerie et du prélèvement de liquide de l'oreille interne. La durée de la première anesthésie générale sera de 3H (1H de chirurgie et 2 H d'imagerie). La seconde anesthésie générale durera 30 minutes, il sera effecué le prélèvement de liquide de l'oreille interne au cours de cette chirurgie.
Impact sur les animaux
Les brebis incluses subiront deux anesthésies générales. Lors de la première, il sera effectué une mastoïdectomie avec délivrance de molécules. Lors de la seconde, il sera effectué un prélèvement de périlymphe. La contention effectuée pour l'induction des 2 anesthésies peut engendrer du stress pour l’animal, et l'injection de produit anesthésiant par voie intraveineuse à la jugulaire peut provoquer un hématome.
Devenir
L'ensemble des brebis seront euthanasiées suites aux procédures compte tenu de la perte de la fonction auditive irréversible, de vertiges incoercibles empêchant une mobilité normale et d'une paralysie faciale empêchant une alimentation normale. Ainsi ces pertes de fonctions auront un retentissement majeur dans la vie quotidienne des brebis.
Remplacement
Des études pré-cliniques chez l'animal sont nécessaires afin de s'assurer de la bonne diffusion des molécules utilisées suite à la sonoporation au sein de l'oreille interne. L'utilisation de modèles animaux autorise aussi la vérification de l'absence d'évènements indésirables, et le prélèvement de liquide de l'oreille interne. Cette étude permettra de s'assurer de la supériorité de la sonoporation pour la diffusion du gadolinium au sein de l'oreille interne et de vérifier l'absence de déficit (auditif, vestibulaire ou de la fonction faciale). Le modèle animal ne peut être substitué par un modèle in-vitro ou in silico à ce jour.
Réduction
Sur la base d'une étude statistique et bibliographique, notre étude nécessite l'inclusion de 27 animaux. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, chaque brebis sera son propre témoin avec un côté où il sera effectué une délivrance de gadolinium par sonoporation et un autre une délivrance par injection en regard de la fenêtre ronde pour vérifier l'hypothèse d'une meilleure diffusion par sonoporation. L'hypothèse d'une amélioration de la diffusion de 60% +/- 30 % du gadolinium par la sonoporation sera vérifiée par un test statistique approprié, ainsi que l'absence de baisse des seuils auditifs. Le calcul d'effectif indique qu'un groupe de 6 sera suffisant pour confirmer cette hypothèse. En métabolomique (pour l'analyse de la périlymphe), il n'existe pas de recommandation sur le nombre minimum de sujets. Cependant nos précédentes études sur le sujet ont montré que l'inclusion de 6 sujets avait permis de faire ressortir des groupes statistiquement différents en utilisant des analyses statistiques adaptées. Notre expérience, sur le prélèvement de périlymphe, nous a permis de le réaliser systématiquement sur une oreille normale jamais opérée. La principale contrainte était le faible volume prélevé qui a été résolu par validation de la technique d'analyse. Ainsi, nous estimons que 12 brebis incluses au total serait raisonnnable pour ne pas augmentrer le nombre d'animaux tout en ayant des résultats si nos hypothèses se vérifient. 2 animaux supplémentaires seront prévus en cas de problème. 4 ANIMAUX SUPPLEMENTAIRES SONT DEMANDES POUR VALIDER LA NOUVELLE SONDE DEVELOPPEE SPECIFIQUEMENT POUR CE PROTOCOLE, D'UN DIAMETRE INFERIEUR (3 MM VS 15 MM).
Raffinement
Anesthésie : les animaux arriveront la veille de la 1ère anesthésie, et seront mis à jeun 15h avant l’intervention, avec abreuvement adlibitum. Induction intraveineuse, puis maintien au masque avec inhalation d’un mélange gazeux d’oxygène et de gaz anesthésiant pour obtenir un relachement musculaire suffisant avant intubation. Chirurgie et Per-imagerie - Anesthésie : Les brebis seront maintenues sous O2 à la fin de la première anesthésie pour améliorer la qualité et la rapidité du réveil. Dès que l’animal présentera les premiers signes de déglutition ou de clignement des paupières, il sera extubé. Les animaux sont logés en cases collectives sur paille, et manipulés dans le calme. Le monitoring des constantes sera effectué lors de l'anesthésie générale afin de détecter une douleur peropératoire nécessitant une adaptation de l'analgésie et/ou de la profondeur de l'anesthésie. La réalisation d'une anesthésie locale permettra de minimiser la douleur per opératoire. Ces injections seront renouvelées en cas de douleur de l'animal . Une table chauffante sera utilisée pendant la durée de l'anesthésie générale pour éviter tout épisode d'hypothermie. La douleur post-opératoire sera aussi monitorée avec l'échelle visuelle en pièce jointe et l'analgésie revue en cas de douleur.
Choix des espèces
La brebis est l'animal que nous désirons utiliser pour ces recherches sur l'oreille interne car elle présente un spectre auditif comparable à l'Homme et une anatomie de l'oreille interne semblable à l'Homme en terme d'anatomie et de dimensions. La chirurgie de la brebis est comparable à celle de l'homme pour l'accès à l'oreille interne. Le sexe féminin est à privilégier compte tenu des difficulté d'accès à l'oreille interne chez le bélier. En effet, l'épaisseur de la corticale du bélier rend le fraisage difficile et très long. Enfin, le volume de liquide endocochléaire prélevé chez la brebis est comparable au volume qu'il est possible de prélever chez l'Homme rendant possible les études en métabolomique sur ce liquide. Les animaux utilisés seront âgés de plus d'un an car à cet âge, la maturation du système auditif est atteinte. Afin de constituer un groupe homogène, les brebis seront âgées de 2 à 3 ans.
Recherche des paramètres d’exposition sonore et médicamenteuse induisant un déficit auditif léger chez le rat
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Quatre semaines d'exposition sonore à raison de huit heures par jour cinq jours sur sept, ou des injections répétées de molécules toxiques pour l'oreille : 264 rats vont être utilisés, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. L'objectif est de calibrer des doses de bruit, d'anticancéreux et d'antibiotiques provoquant une perte auditive légère, ces molécules pouvant aussi entraîner une toxicité rénale et digestive. Le RNT reconnaît que la mort d'un petit nombre d'animaux ne peut être exclue. Tous les rats sont mis à mort pour le prélèvement des oreilles et du sang.
Objectifs
Le bruit n’est pas la seule nuisance pouvant endommager le système auditif. Des substances chimiques peuvent également altérer l’audition en détruisant les cellules sensorielles de l’oreille. Parmi elles figurent, entre autres, des substances industrielles (métaux, solvants, …) et des médicaments. Les études révèlent que l’exposition simultanée au bruit et aux médicaments peut entraîner des pertes auditives plus importantes que la simple addition des effets de chaque facteur pris isolément. Le projet actuel s’intéresse à deux familles de médicaments, les anticancéreux et les antibiotiques, qui sont suspectés de persister de longues périodes dans l’oreille, et pourraient donc fragiliser l’oreille vis-à-vis du bruit sur le long terme. L’objectif du projet est de déterminer si des rats préalablement exposés à ce type de médicaments sont plus sensibles au bruit, et si oui, pour combien de temps après la fin des traitements. Avant de mettre en œuvre ces expérimentations, il est nécessaire de déterminer des niveaux de bruit et des doses de médicaments permettant d’obtenir des pertes auditives légères, tout en minimisant la toxicité générale (dans le cas des médicaments). L’objectif est de générer des pertes auditives suffisamment faibles pour ne pas endommager massivement l’oreille, et permettre d’observer une augmentation des pertes lors d’une exposition différée au bruit. C’est l’objet de cette demande d’autorisation de projet.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de développer des modèles de déficit auditif léger, induits soit par une exposition sonore répétée représentative des conditions rencontrées en milieu professionnel, soit par l’administration de médicaments toxiques pour l’oreille, reproduisant au mieux les protocoles cliniques. Pour chaque nuisance, plusieurs doses ou protocoles d’administration seront testés afin de déterminer celui permettant d’obtenir une perte auditive légère. Ces modèles seront utilisés dans le cadre d’une future étude qui visera à mettre en évidence si des rats traités préalablement avec ces médicaments sont plus vulnérables au bruit après la fin du traitement, et ce pour combien de temps. Ces informations, aujourd’hui absentes de la littérature scientifique, apporteront des informations précieuses sur la vulnérabilité au bruit des personnes ayant été traitées avec ce type de médicaments, et reprenant leur activité professionnelle.
Procédures
Deux groupes de 16 animaux (8 mâles et 8 femelles) seront exposés, dans leur cage d’hébergement, à des bruits industriels conçus pour induire des pertes auditives légères. L’exposition sonore durera 4 semaines (8h/j, 5j/semaine). Un groupe contrôle (6 mâles et 6 femelles) sera exposé au bruit ambiant de l’animalerie sur la même période. Un groupe exposé (n=16) et un groupe contrôle (n=12) seront ajoutés uniquement si les pertes auditives mesurées ne correspondent pas aux pertes attendues. Deux groupes de 24 animaux (12 mâles et 12 femelles) recevront une molécule anticancéreuse toxique pour l’oreille par 4 injections réparties sur 6 semaines. Chaque injection demande une contention de quelques secondes. Les doses seront ajustées pour induire une perte auditive légère. Un groupe contrôle de 12 animaux (6 mâles et 6 femelles) recevra 4 injections de liquide physiologique sur la même période. Un groupe traité (12 mâles et 12 femelles) et un groupe contrôle (6 mâles et 6 femelles) pourront être ajoutés si les doses initiales ne permettent pas d’induire la perte auditive visée. Deux groupes de 24 animaux (12 mâles et 12 femelles) recevront un antibiotique toxique pour l’oreille, à raison de 10 injections consécutives sur 10 jours. Chaque injection demande une contention de quelques secondes. Les doses seront ajustées pour induire une perte auditive légère. Un groupe contrôle (6 mâles et 6 femelles) recevra 10 injections de liquide physiologique sur la même période. Un groupe traité (n=24) et un groupe contrôle (n=12) pourront être ajoutés si les doses initiales ne permettent pas d’induire la perte auditive visée. L’audition des rats sera évaluée par une méthode non invasive réalisée sous anesthésie qui nécessite une injection et une contention de quelques secondes. Ce test dure environ 20s par animal : • Rats exposés au bruit : Les mesures seront effectuées avant l’exposition, toutes les 2 semaines pendant l’exposition, puis 4 semaines plus tard. • Rats traités avec l’anticancéreux : Les mesures auront lieu avant le traitement, toutes les deux semaines pendant la durée du traitement, puis 4 semaines plus tard. • Rats traités avec l’antibiotique : Les mesures seront réalisées avant le traitement, à la fin du traitement, puis 4 semaines plus tard. À l’issue des mesures, les animaux seront mis à mort pour prélèvements de sang (analyses biochimiques) et des oreilles pour évaluer les dommages aux cellules auditives.
Impact sur les animaux
L’exposition des rats à différents bruits, au sein même de leur cage d’hébergement, pourra induire un stress modéré et réversible, sans atteinte majeure de l’état de santé des animaux, mis à part une perte auditive. Le traitement des rats par un anticancéreux ou un antibiotique peut générer une toxicité au niveau du système auditif (effet attendu) mais également générer une toxicité rénale. Ces deux molécules peuvent également entrainer des troubles digestifs et une diminution de la prise alimentaire. La mort d’un petit nombre d’animaux ne peut pas être totalement exclue. Les mesures auditives répétées impliquent des anesthésies successives. Un stress léger lié à la récurrence de cette manipulation peut survenir. C’est également le cas pour les injections répétées de médicaments.
Devenir
Les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort afin de prélever les oreilles pour analyse des tissus. Pour les animaux ayant reçu des médicaments, un prélèvement sanguin sera également pratiqué au moment de la mise à mort pour analyse biochimique.
Remplacement
L’utilisation d’un modèle animal est indispensable car l’étude des médicaments toxiques pour l’oreille et de l’exposition au bruit nécessite un système auditif complet ainsi qu’un métabolisme actif. Les réponses physiologiques de l’oreille interne impliquent des mécanismes complexes qui ne peuvent pas être reproduits de manière satisfaisante par des modèles cellulaires ou informatiques. Par exemple, ces modèles ne permettent pas d’étudier l’impact combiné du bruit et des médicaments dans un organisme entier, ni d’évaluer l’évolution temporelle d’un déficit auditif. Le rat constitue un modèle pertinent et reconnu pour l’étude des effets du bruit et des substances toxiques pour l’oreille, ce qui permettra une comparaison avec les données de la littérature.
Réduction
Le protocole a été construit de telle sorte que le nombre d’animaux soit réduit au minimum tout en garantissant d’observer l’effet attendu et en prenant en compte le risque de toxicité. - Grâce à une analyse de la littérature scientifique et de nos données historiques, nous avons pu identifier des gammes de doses suffisamment réduites pour limiter le nombre de doses/niveaux testé(e)s à 3 par type de nuisance. - Certaines doses de médicaments et niveaux de bruit seront testés en plusieurs phases, afin de s’offrir la possibilité de ne pas réaliser certains essais si la dose optimale a été identifiée précocement. - Les effectifs par groupe et par sexe ont été définis comme le nombre minimal d’animaux nécessaire pour qu’une perte auditive légère soit mesurable par rapport au niveau initial, connaissant la dispersion des mesures individuelles, et en faisant l’hypothèse que les effets du bruit multiplient par deux cette dispersion et les médicaments par trois.
Raffinement
Après la période d’acclimatation d’une semaine à l’animalerie, une technique de manipulation positive dite de « tickling » (ou « chatouilles » en français) sera mise en place pendant 5 jours. Cette méthode consiste à reproduire, par des stimulations tactiles douces et répétées, les comportements de jeux sociaux entre jeunes rats et à créer des états émotionnels positifs. Le « tickling » sera ensuite pratiqué avant chaque manipulation de l’animal pendant toute la durée du protocole. Tout au long du protocole, les rats seront régulièrement placés, en groupe, dans une aire de jeu sécurisée comportant des tunnels, abris et différents éléments d’exploration. Cet environnement favorise les interactions sociales, stimule l’activité exploratoire naturelle et contribue à réduire le stress lié à l’hébergement et aux manipulations expérimentales, améliorant ainsi le bien-être général des animaux. Compte tenu des risques d’effets secondaires pour le rein causés par les traitements médicamenteux, les animaux recevront des injections sous-cutanées de solution de réhydratation pendant le traitement. Par ailleurs, pendant la période de traitement, des aliments gélifiés appétents complémentés de friandises seront disposés à l’intérieur des cages. Enfin, toutes les procédures seront réalisées dans l’enceinte de l’animalerie, y compris les expositions au bruit et aux médicaments, ce qui permettra de minimiser le déplacement des rats et le stress associé.
Choix des espèces
Le rat est un mammifère qui a un système auditif qui présente un fort degré de ressemblance biologique avec l’Homme, contrairement aux espèces non mammifères (oiseaux, poissons ou insectes) qui sont pertinentes pour l’étude de la toxicité pour les molécules ou les cellules, mais qui sont peu adaptées à l’étude de la fonction auditive dans son ensemble. Ainsi, le rat est un animal couramment utilisé pour modéliser les anomalies auditives. Son oreille interne présente également un volume suffisant pour permettre une dissection et une analyse des tissus relativement aisées. Les rats choisis sont pigmentés. Ils ont donc un pigment coloré dans l’oreille, contrairement aux rats albinos. Cette caractéristique les rapproche davantage de la physiologie humaine. Ce choix permet ainsi une meilleure validité des résultats pour l’Homme. Les rats utilisés seront des jeunes adultes (16 semaines). Cet âge a été choisi pour que leur cerveau, leur métabolisme et leur oreille interne soient complètement développés et pour modéliser des humains d’âge adulte.
Modélisation et caractérisation de modèles murins précliniques d’infection par les virus Influenza de type A : étude des mécanismes physiopathologiques et évaluation de candidats thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
3 600 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, infectées par des virus Influenza A avec, pour une partie, une co-infection au SARS-CoV-2. Les animaux peuvent développer perte de poids, détresse respiratoire et fièvre, avant d'être mis à mort pour le prélèvement des organes. Le protocole prévoit de ne leur administrer aucun anti-inflammatoire, pour ne pas altérer la réponse immunitaire étudiée. Le RNT décrit par ailleurs un projet garantissant "le meilleur niveau possible de bien-être animal".
Objectifs
Ce projet a pour objectif de mieux comprendre comment les virus Influenza de type A responsables de la grippe provoquent la maladie, et de tester de nouvelles façons de la prévenir ou de la traiter. Pour cela, nous utiliserons des modèles de souris qui permettent de reproduire certains aspects de la maladie observés chez l’être humain. L’étude s’intéressera d’abord à la manière dont le virus se multiplie et se propage dans le corps, puis à la façon dont l’organisme réagit pour se défendre. Le système immunitaire peut être comparé à une armée de défense : il est constitué de cellules et de molécules qui reconnaissent le virus et essaient de l’éliminer. Cependant, si cette réponse est trop forte ou mal contrôlée, elle peut provoquer une inflammation importante et abîmer certains organes. Comprendre cet équilibre est essentiel pour savoir pourquoi certaines personnes guérissent facilement, alors que d’autres développent des formes plus graves ou durables de la maladie. Différentes stratégies thérapeutiques seront testées notamment des molécules capables de réguler la réponse immunitaire afin de limiter la multiplication du virus, réduire les symptômes et prévenir les complications. Pour anticiper les conséquences d'une potentielle co-circulation saisonnière du virus Influenza de type A et du SARS-CoV-2, nous réaliserons des doubles infections séquentielles chez l'animal. Cette approche déterminera si la primo-infection exerce un effet protecteur ou aggravant sur la pathologie consécutive au second challenge viral. Ce projet respectera strictement le principe des 3R, qui sont au cœur de la recherche animale responsable : - Remplacer : Utiliser des méthodes alternatives chaque fois que cela est possible, telles que la culture cellulaire ou encore la modélisation informatique. - Réduire : Limiter le nombre d’animaux utilisés en ne réalisant que les expériences indispensables. - Raffiner : Adapter les techniques et assurer un suivi attentif des animaux pour réduire au maximum leur douleur, stress et inconfort. L’objectif global est d’améliorer la compréhension de la maladie afin de développer plus rapidement des traitements sûrs et efficaces pour l’être humain, tout en garantisant le meilleur niveau possible de bien-être animal.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de mettre au point de nouveaux modèles de souris pour mieux comprendre comment la grippe causée par les virus Influenza de type A se développe et évolue. Ces modèles permettront aussi de savoir pourquoi certains modèles de souris, et par corrélation certaines personnes tombent plus gravement malades que d’autres. Une fois ces modèles établis, ils serviront à tester de nouvelles stratégies de prévention et de traitement, comme des vaccins, des anticorps ou des médicaments destinés à bloquer le virus ou à aider le corps à mieux se défendre. Les résultats attendus permettront d’améliorer les étapes de recherche avant les essais chez l’humain et de favoriser le développement de traitements plus sûrs et plus efficaces contre la grippe. A terme, ce projet contribuera à mieux protéger la santé humaine tout en respectant le bien-être animal.
Procédures
Les souris recevront différents traitements selon le protocole étudié et la nature des molécules testées. Les produits pourront être administrés par différentes voies : - Par la bouche : Une à deux fois par jour pendant quelques jours - Par injection dans le ventre : Une à plusieurs reprises selon le calendrier prévu - Par injection sous la peau : Une à plusieurs reprises selon le calendrier prévu - Par le muscle : Réalisée avec précaution par du personnel spécialement formé. - Par le nez : Réalisée avec précaution par du personnel spécialement formé. - Par voie intraveineuse : Réalisée avec précaution par du personnel spécialement formé. L’état général des animaux sera observé attentivement avant et après chaque manipulation afin de s’assurer de leur bon rétablissement. Des prélèvements sanguins pourront être effectués à différentes étapes (avant et après infection) afin de suivre la réponse de l’organisme. Les fonctions respiratoires seront mesurées à l’aide d’un appareil permettant d’enregistrer la respiration de la souris sans la contraindre : l’animal reste éveillé et peut bouger à l’intérieur de la chambre. Une observation clinique sera réalisée avant et après chaque mesure pour vérifier qu’il n’y a pas de signe d’inconfort. Certaines procédures nécessiteront une anesthésie, réalisée avec des produits adaptés au poids de l’animal. Dans certains cas, un antidouleur (buprénorphine) sera administré avant l’anesthésie afin d’éviter toute douleur. En fin d’étude, une anesthésie profonde sera pratiquée avant la perfusion terminale, qui consiste à faire circuler une solution dans les organes pour pouvoir ensuite les prélever et les analyser. Cette étape est effectuée uniquement lorsque l’animal est totalement endormi et insensible.
Impact sur les animaux
A la suite de l’infection des animaux par les virus Influenza de type A, plusieurs effets indésirables peuvent être observés. Les principaux signes attendus incluent une perte de poids, des altérations comportementales (ex. baisse d’activité), ainsi que des signes de détresse respiratoire (respiration rapide, irrégulière ou superficielle). Des réactions locales peuvent également survenir au niveau des sites d’injection, se manifestant par une irritation, une légère inflammation ou un saignement transitoire. Les prélèvements sanguins peuvent provoquer une gêne légère et passagère au point de ponction, rapidement résolue après compression locale. Les manipulations répétées, telles que les mesures de fonction respiratoire ou les anesthésies, peuvent induire un stress léger à modéré lié à la restriction de mouvement et à l’isolement temporaire. La récupération post-anesthésie chimique est plutôt lente s’accompagnant d’une baisse d’activité temporaire, de frissions, d’une diminution de l’appétit et plus rarement d’une respiration ralentie. Chez les animaux génétiquement modifiés, les réponses inflammatoires ou les troubles respiratoires peuvent être plus marqués ou durer plus longtemps. Un épisode de fièvre est possible ; en l’absence de mesure directe, un soutien thermique est assuré par l’enrichissement des cages (ajout de coton) au moment de l’anesthésie et de l’infection. L’état des animaux sera évalué quotidiennement à l’aide d’une grille de suivi qui inclue l’état respiratoire, l’apparence générale, des yeux et des poils ainsi que des comportements spontanés. Tout changement significatif sera consigné et les individus présentant des signes d’alerte feront l’objet d’une surveillance accrue assurée conjointement par le personnel animalier et les ingénieurs responsables des protocoles expérimentaux.
Devenir
Pour toutes les procédures prévues dans ce projet, les animaux sélectionnés seront sacrifiés par euthanasie conformément aux recommandations réglementaires, afin de permettre le prélèvement des organes et leur analyse.
Remplacement
À l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet de reproduire de manière satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans l’initiation des réponses immunitaires lors d’une infection naturelle ou après une vaccination. En effet, les modèles in vitro ne parviennent pas à capturer la complexité des interactions entre les différents types cellulaires, les tissus et les mécanismes systémiques qui se produisent dans un organisme vivant. C’est pourquoi il est indispensable de recourir à des modèles animaux, qui permettent une étude plus fidèle des réponses immunitaires dans un contexte biologique complet et dynamique. Ces modèles animaux offrent une plateforme essentielle pour mieux comprendre les mécanismes de défense de l’organisme et pour tester l’efficacité des traitements et des vaccins avant toute application clinique.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour chaque type de procédure sera précisé dans le protocole. Les effectifs sont déterminés sur la base d’expériences antérieures et/ou de calculs de puissance statistique, afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Nous utiliserons des animaux des deux sexes, âgés de 6 à 20 semaines et répartis en groupes homogènes pour garantir des analyses statistiques pertinentes. Lorsque possible un même groupe témoin sera partagé entre plusieurs expériences afin de réduire encore le nombre d’animaux.
Raffinement
Les souris sont élevées dans des conditions optimales, avec un soin ainsi qu’un respect constant, et sont exposées à divers éléments d'enrichissement pour favoriser leur bien-être. Elles seront hébergées en groupes de 2 à 5 souris afin de prévenir le stress lié à l'isolement. Les cages seront systématiquement enrichies par l'ajout d'éléments comme un dôme en carton, offrant aux animaux un abri, et de la nourriture hydratée, qui sera fournie dès que nécessaire pour pallier toute perte de poids ou déshydratation durant leur hébergement. Les souris en expérimentation feront l'objet d'une surveillance quotidienne par du personnel qualifié et formé pour mener ces expérimentations. L'utilisation d'une grille de score spécifique et un suivi pondéral quotidien permettront de détecter rapidement tout signe de souffrance. Des mesures appropriées, y compris la mise à mort lorsque nécessaire, seront mises en œuvre sans délai afin d’éviter toute aggravation de l’état des animaux. Etant donné que notre étude porte sur la réponse immunitaire, il est impératif de ne pas administrer d’anti-inflammatoires aux souris. En effet, ces molécules pourraient interférer avec nos résultats en altérant l’expression de marqueurs d’intérêt ce qui pourrait fausser l’interprétation des réponses immunitaires observées.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser le modèle murin (la souris) car c’est un mammifère dont 99% des gènes sont similaires à ceux de l’Homme. La souris un animal de petite taille, se reproduisant rapidement et facile à élever. De plus, son anatomie, sa physiologie et sa biologie sont aujourd’hui très bien connues, ce qui en fait un modèle de référence pour la recherche scientifique. La souris est particulièrement adaptée à l’étude du système immunitaire grâce aux nombreuses connaissances déjà acquises et aux outils largement disponibles pour ce modèle. Pour nos expérimentations nous utiliserons des souris adultes âgées de 6 à 12 semaines. Ce critère garantit que les animaux possèdent un système immunitaire pleinement développé, ce qui permet de limiter les variations naturelles qui ne seraient pas liées à l’étude elle-même.
Impact de polluants anthropiques sur le comportement et la cognition chez les jeunes poissons cichlides
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
576 jeunes poissons cichlidés vont être utilisés, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour mesurer l'effet de polluants sonores et chimiques sur leur comportement et leur cognition. Les alevins sont exposés quatre semaines à du bruit ou à des contaminants avant une batterie de tests. Sur les procédures infligées, le RNT se limite à mentionner une "manipulation des animaux pour les tests comportementaux pouvant engendrer un stress", sans préciser davantage. Après anesthésie et mise à mort, cerveau et corps sont prélevés pour analyse.
Objectifs
Les animaux évoluent dans des environnements riches en signaux sensoriels d’origine abiotiques (lumière, température, courants, vibrations, champs géomagnétiques) et biotiques (signaux visuels, acoustiques, chimiques, tactiles ou électriques). La capacité à distinguer les informations pertinentes de celles qui ne le sont pas est essentielle à leur survie et à leur reproduction. Toutefois, l’intensification des activités humaines introduit de nouveaux signaux anthropiques, tels que les polluants chimiques et le bruit, qui peuvent masquer ou perturber les signaux biologiquement importants et provoquer des réponses de stress affectant la croissance, la reproduction, le comportement et la survie des organismes. La majorité de ces travaux portent sur des périodes courtes (stress aigü) et sur les individus adultes. Les effets chroniques de ces pollutions acoustique et/ ou chimique durant les jeunes stades de vie ou du développment restent encore peu étudiés. Pour aborder cette question, nous développons au sein du laboratoire une approche expérimentale et pluridisciplinaire sur une espèce de poisson Cichlidé (Maylandia zebra) endémique du lac Malawi, mêlant neurophysiologie et éthologie. Cette espèce, étudiée depuis plusieurs années au sein du laboratoire, utilise plusieurs canaux sensoriels pour communiquer, dont les canaux acoustique et olfactif, et possède des comportements très stéréotypés dans différents contextes comme par exemple la défense du territoire . De plus, l’incubation des oeufs, jusqu’au stade alevin, est réalisée dans la bouche de la mère pendant 21 jours, ce qui permet, en laboratoire, outre un contrôle des naissances, de suivre très précisémenent le développement et le devenir des couvées en environnement contrôlé. L’objectif du projet présenté ici, est d’évaluer les capacités cognitives et de mémorisation de jeunes alevins de poissons cichlidés soumis ou non à des polluants chimique et/ou sonore. Le niveau d'activité, le comportement exploratoire, les interactions sociales, les traits comportementaux ainsi que les capacités d’apprentissage et de mémorisation des animaux seront estimés à l’aide de tests éthologiques classiques ainsi que des tests de conditionnement.
Bénéfices attendus
Ces dernières années les études sur la pollution sonore se sont largement développées et nous savons qu'il existe des effets sur les comportements, la communication, la physiologie des populations aquatiques (poisson, invertébrés..). Toutefois, les études plus fines au niveau de l'individu et notamment au niveau des capacités cognitives ou de mémorisation des poissons sont rares et commencent à émerger. Ce projet vise également à produire des connaissances et un seuil de toxicité des effets de la contamination durant premiers stades de vie. Enfin, très peu d’études aujourd’hui concerne l’impact couplé de deux facteurs polluants anthropogéniques, c’est-à-dire liés à l’activité humaine.
Procédures
Manipulation des animaux pour les tests comportementaux pouvant engendrer un stress
Impact sur les animaux
L’environnement bruité ou le conditionnement pavlovien pourraient engendrer un stress pour l'animal : le comportement des animaux sera suivi (et enregistré) pendant toute la durée de l'expérimentation. Si un comportement anormal est observé l'expérience sera immédiatement stoppée. Un comportement anormal peut être: arrêt total de la nage (le poisson reste prostré dans un coin); nage en surface bouche ouverte; nage saccadée.... Concernant l’impact sur les poissons aux stades embryo-larvaires, compte tenu du peu de connaissance, nous pouvons supposer que les effets devraient être modérés car les doses testées sont des doses environnementales. La seule étude à notre connaissance portant sur les premiers stades de vie a été réalisée sur les larves de zebra fish, où peu de mortalité a été observée.
Devenir
Après anesthésie et mise à mort des prélèvements tissulaires seront effectués pour histologie
Remplacement
L’évaluation de l’impact des facteurs polluants sur les capacités cognitives et de mémorisation reposent sur des techniques d'apprentissage suivi de l'observation de séquences comportementales : l'animal ne peut pas être remplacé.
Réduction
Les analyses statistiques envisagées seront des analyses de variances et des modèles linéaires à effets mixtes. De plus, nous souhaitons avoir des données comportementales indépendantes (et non pas des mesures répétées) afin d’avoir des données plus facilement exploitables statistiquement et d’améliorer le bien-être des poissons : un individu donné ne sera soumis qu’à un seul test comportemental. Pour ce faire nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux testés (12 par test comportemental). A partir d’un individu, plusieurs tissus seront prélevés (cerveau, corps) afin de réaliser l’analyse transcriptomique et la mesure du stress oxydatif.
Raffinement
Afin d’optimiser le bien-être des animaux, les aquariums seront enrichis avec du sable et des abris adaptés (utilisation de galets). Les densités utilisées dans les aquariums respecteront les règles sanitaires (soit 6 juveniles de 1,5cm dans un aquarium de 10 litres). Enfin, les conditions de température, lumière, pH et Nitrates seront contrôlées et se rapprocheront au mieux de l'environnement dans le milieu naturel garantissant la qualité de l'habitat et le suivi des animaux (présence de filtration, chauffage, oxygénation, fréquence et type de nourriture adaptée aux jeunes poissons). Si une de ces conditions devient inadaptée des changement d'eau seront envisagés. D'autre part ltous les animaux seront anesthésiés avant la mise à mort et les points limites stricts et spécifiques du projet seront appliqués.
Choix des espèces
Notre modèle est un poisson cichlidé social, grégaire présentant une forte hiérachie. En contexte de défense du territoire et de parade nuptiale, ce poisson communique via les canaux visuels, acoustique et olfactif, ce qui en fait un modèle de choix pour l'étude des interactions sociales et de lacommunication multimodale. De plus, l'incubation des oeufs se fait dans la bouche de la femelle, ce qui facilite l'étude de l'effet de paramètres environnementaux au cours du développement embryonnaire. Il est étudié au laboratoire depuis plus de 15 ans : les comportements de ce poisson, dans différents contextes, sont bien connus de l'équipe : toute modification comportementale liée à l'envoi de stimuli sonores (bruits de bateaux) ou chimiques sera donc facilement identifiable. L'objectif de cette étude est de mesurer l'impact de la pollution sonore et/ou chimique sur le comportement, les capacités cognitives et de mémorisation chez les poissons pendant les premiers stades de vie. Après la sortie de l’incubation buccale de la mère, les juvéniles seront soumis pendant 4 semaines à une pollution sonore et/ou chimique. Ensuite les juvéniles âgés de 1 mois (ils mesurent alors environ 2cm de long) seront soumis à des tests comportementaux.
Evaluation de l’efficacité, de l’innocuité et de la durabilité de nouvelles méthodes et techniques pour l’hémostase – 1/2
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
Moutons : 100
200 animaux, 100 porcs et 100 brebis, vont être utilisés, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des prélèvements sanguins réguliers puis des interventions chirurgicales sous anesthésie, parfois de plusieurs heures, pour implanter et évaluer des dispositifs destinés à arrêter les hémorragies chez l'humain. Le porteur décrit l'expérimentation sur "l'organisme entier" comme "incontournable" et rappelle qu'elle répond à une obligation réglementaire. Porcs et brebis sont retenus pour la ressemblance de leur système cardiovasculaire avec celui de l'humain, avant une nécropsie et une analyse des tissus après mise à mort.
Objectifs
Les dispositifs implantables chirurgicalement sont des dispositifs médicaux conçus pour être insérés en totalité ou partiellement dans le corps humain, ou à remplacer une surface épithéliale, grâce à une intervention chirurgicale et à demeurer après l'intervention de façon temporaire ou définitive, pour soutenir les fonctions d'organes ou de tissus spécifiques, surveiller les activités physiologiques ou administrer des médicaments. L'hémostase est l'ensemble des mécanismes biologiques pour le maintien du sang à l'intérieur des vaisseaux, qui se mettent en place pour arrêter le saignement après la lésion d'un vaisseau, qu'elle soit d'origine traumatique, pathologique ou iatrogène. Quand les techniques conventionnelles sont insuffisantes, l’hémostase peut être améliorée en chirurgie par les hémostatiques dits chirurgicaux. Les hémostatiques chirurgicaux regroupent des médicaments et des dispositifs médicaux qui ont un champ d’utilisation très large à l’hôpital. Ceci est expliqué par les nombreux facteurs de risques hémorragiques liés aux patients ainsi qu'à la chirurgie. A ce jour, il n’existe encore aucune stratégie thérapeutique validée pour orienter le chirurgien vers le choix de produit le plus adapté à chaque situation. Ce projet de recherche s’intéresse au traitement des plaies vasculaires et à l’hémostase chirurgicale et se déroulera dans deux Etablissements Utilisateurs (EU 1 et 2). Il a pour objectif ultime de développer de nouvelles approches multimodales de prise en charge. Ces stratégies intéressent directement le développement de modèles animaux pertinents afin de valider de nouvelles approches thérapeutiques pour s'assurer de l'innocuité et de l'efficacité de ces dispositifs d'hémostase. En l'absence de méthodes de remplacement pour reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire, l'évaluation et le développement des nouveaux dispositifs et techniques pour l’hémostase chirurgicale par des méthodes de chirurgie standard et mini-invasives requièrent une phase préclinique de recherche et de développement sur l'animal vivant. Les objectifs du projet sont doubles : raffiner les prototypes pour en geler les versions jugées efficaces (efficacité) et sécuritaires (innocuité) dans la phase initiale du projet, puis ces versions entreront alors dans la phase règlementaire du projet pour valider les dispositifs, méthodes et techniques selon la règlementation en vigueur (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58).
Bénéfices attendus
L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patients, une amélioration de la durabilité, de l’efficacité et de la sécurité des implants pour améliorer leur tolérance et éviter leur rejet et ainsi les ré opérations parfois multiples des patients, pour réduire les temps de cicatrisation et le traumatisme tissulaire, corollaires de ces interventions et qui handicapent les patients, ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections grâce au recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients avec des durées d'hospitalisation et de convalescence réduites.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet. Dans ce projet, les actes d'imagerie pourront être réalisés dans les EU 1/2 et 2/2. La période d'acclimatation d'une durée de 7 jours se fera dans l'EU 2/2. Les actes chirurgicaux d'implantation de dispositif et/ou d'évaluation de technique chirurgicale avec ou sans réveil seront réalisés dans l'EU 1/2. Le suivi clinique et fonctionnel des animaux après les procédures chirurgicales ainsi que les administrations de soins pourront être réalisées dans les EU 1/2 et 2/2. Pour les études chroniques, les évaluations finales avec euthanasie pourront être réalisées dans les EU 1/2 et 2/2.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - La faim ,lors de la mise à jeun (12 heures pour les porcs, 12 à 16 heures pour les ovins) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - En fonction des besoins et préalablement à la procédure d'évaluation du dispositif, l'induction d'une lésion à la faveur d'une intervention chirurgicale mini-invasive, - La douleur en phase postopératoire : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique, pour ces derniers points, des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple le recours systématique à l'anesthésie générale avec prise en charge multimodale de l'analgésie per, et post-opératoire avec l'usage systématique de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur opiacés avec ajout d'anesthésiques locaux pour certains actes chirurgicaux, la protection et la surveillance des plaies, la surveillance du reveil d'anesthésie dans des espaces calmes et spécialement aménagés avec évaluation et scoring de la douleur réguliers, ou la mise en place d'un suivi clinique quotidien des animaux avec surveillance des signes de douleur par des Techniciens spécialement formés supervisés par des Véterinaires).
Devenir
Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.
Remplacement
La validation des dispositifs médicaux implantables et des méthodes techniques innovantes dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. Le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes afin de reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients est indispensable. En effet leur utilisation in fine chez les patients représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur l'animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.
Réduction
Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.
Raffinement
Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en oeuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateaux techniques opératoires et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Un suivi de la température est réalisé pendant toute la procédure d'implantation chirurgicale et des dispositifs de maintien de la normothermie tels que le système de couverture de réchauffement Bair Hugger© ou des tapis chauffants sont utilisés. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, des protocoles de prises en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (AINS et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques sont appliqués tout au long du projet. Les transports d'animaux réalisés entre les 2 EU (35 km) seront réalisés à l'aide de véhicules de types camionnettes fermées ayant reçu une autorisation AT1 délivrée par la DDPP, ventilés, climatisés et spécialement équipés pour le transport des animaux vivants (dispositifs d'abreuvement, tapis antidérapants ou cages de transport, suivi et enregistrement des températures lors des trajets, système de surveillance vidéo des animaux). Les personnels en charge sont formés et titulaires du certificat de convoyeur (CCTROV) et le transport est validé par un Vétérinaire. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.
Choix des espèces
Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie semblable à celle de l’Homme avec les mêmes dimensions. Les modèles utilisés ont fait l'objet d'études similaires et sont considérés comme pertinents et appropriés à cette fin. - Les systèmes cardio-vasculaires du mouton et du porc reproduisent fidèlement la physiologie et l'anatomie humaines (taille des vaisseaux, fonction cardiaque, pression et débits,...) et les processus d'hemostase et de cicatrisation sont similaires à ceux observés chez l'homme. - La taille relative de ces modèles animaux permet une visualisation à l'aide d'équipements de chirurgie interventionnelle et d'imagerie standards utilisés chez l'Homme. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille, une physiologie ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.
Performances et sécurité de nouveaux agents d’embolisation artérielle (Modification)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles urogénitaux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Pour constituer les dossiers réglementaires d'autorisation de mise sur le marché de nouveaux dispositifs d'embolisation, 47 porcs vont être utilisés, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie sous anesthésie sans réveil. Chaque animal subit une anesthésie générale et une embolisation guidée par imagerie de 30 à 40 minutes, avec pour certains une incision d'un vaisseau du rein provoquant une ischémie rénale douloureuse. Le porteur qualifie le recours à l'animal vivant d'"indispensable" et présente ces données comme exigées par les agences sanitaires. Tous les porcs sont mis à mort pour prélever des organes destinés à l'analyse histologique.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité et la sécurité de nouveaux agents d’embolisation utilisés en radiologie interventionnelle (RI), avant leur application chez les patients. La RI est une spécialité médicale qui associe une technique d’imagerie (rayons X, ultrasons, résonnance magnétique) à un geste mini- invasif pour diagnostiquer et/ou traiter un large éventail de maladies, dont les cancers. L’embolisation est une procédure de radiologie qui consiste à injecter à l’intérieur d’un vaisseau un produit pour l’occlure. Le but visé est, soit d’arrêter un saignement (traumatisme, hémorragie du post-partum, hémoptysie…), soit de dévasculariser un tissu pathologique irrigué par ce vaisseau en le privant d’apport sanguin (fibrome utérin, adénome de la prostate, tumeur hépatique, malformation vasculaire…). De nouveaux matériaux sont actuellement à l’étude pour améliorer les traitements par embolisation. On peut notamment citer les matériaux dégradables, la fonctionnalisation des matériaux ou l’introduction d’adjuvants pour rendre les dispositifs visibles en imagerie ou encore chargeables avec des principes actifs. Tous ces agents d’embolisation sont des dispositifs médicaux implantables pour lesquels la performance et l’innocuité doivent être évalués chez l’animal avant de les utiliser en clinique. Les résultats obtenus seront versés aux dossiers réglementaires pour les demandes d’autorisation de mise sur le marché.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont d’ordre technologique et médical. Il s’agit de tester de futurs produits de santé destinés à une utilisation chez l’homme. La radiologie interventionnelle a révolutionné la pratique de la médecine moderne grâce à l'introduction, au développement et à la validation de thérapies peu invasives, dont beaucoup ont non seulement remplacé des procédures invasives, mais ont également offert de nouvelles solutions diagnostiques et thérapeutiques là où il n'en existait pas auparavant. La radiologie interventionnelle s’inscrit de plus en plus dans les perspectives curatives de maladies cancéreuses, que ce soit par l’efficacité propre de ses méthodes ou dans le cadre de traitements combinés avec d’autres techniques. Ce projet bénéficiera donc directement aux patients, les nouveaux agents d’embolisation testés pourront être appliqués en clinique dès leur sécurité d’utilisation établie selon les bonnes pratiques de laboratoire.
Procédures
Chaque animal sera soumis à une anesthésie générale pendant laquelle une prise de sang et une intervention chirurgicale mini-invasive guidée par l’imagerie (embolisations 30-40 minutes) sera réalisée. Un groupe d'animaux sera mis à mort à l'issue de cette procédure sans réveil de l'anesthésie, un autre groupe sera réveillé et observé quotidiennement, de 1 semaine à 3 mois selon les lots, avant une deuxieme anesthésie générale sans réveil pour un contrôle angiographique et un prélèvement sanguin. MODIFICATION Chez un autre groupe d’animaux, la même chirurgie, avec ajout d’une incision au niveau d’un vaisseau du rein, sera réalisée.
Impact sur les animaux
Les nuisances pour les animaux sans réveil sont liées à l’induction de l’anesthésie : stress à la contention, injection intramusculaire. Pour les animaux suivis en post opératoire, le réveil de l’anesthésie peut s’accompagner de nausées, désorientation, hypothermie, irritation trachéale. L’intervention chirurgicale par voie endovasculaire est mini invasive, l’embolisation de branches de l’artère rénale induit une ischémie qui peut amener des douleurs et occasionner une perte d’appétit passagère. Les effets indésirables consécutifs à l’accès vasculaire sont un hématome et éventuellement une boiterie.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour prélever des organes à but d'analyses histologiques.
Remplacement
Plusieurs mesures alternatives ont été mises en œuvre en amont des tests in vivo: Lors de l’étape de design du dispositif, les fabricants cherchent les données de biocompatibilité disponibles pour les matériaux utilisés. Ceux dont les effets et les doses toxiques sont connus sont éliminés de la composition de l’implant, afin de réduire le risque d’effets pathologiques locaux. Des tests in vitro de performances ou de cytotoxicité permettent également d’exclure certaines compositions qui ne répondent pas aux spécifications du dispositif, et de diminuer le nombre de prototypes à tester in vivo. Après ces tests préalables sur modèles non-vivants, nous arrivons à un stade de développement des dispositifs où un certain nombre de conditions du vivant ne peuvent être modélisées dans des systèmes in vitro : contact avec le sang, déformation des vaisseaux, réaction tissulaire et dégradation des produits, ré-ouverture des vaisseaux ; cicatrisation, persistance de la fonction rénale… Le recours à l’animal vivant devient alors indispensable, les modèles in vitro sont insuffisants du point de vue réglementaire pour envisager des essais cliniques chez l’Homme: des essais sur animaux vivants sont exigés par les agences sanitaires pour apporter des données supplémentaires fiables sur le comportement des dispositifs implantables dans les tissus vivants.
Réduction
Tous les moyens ont été mis en œuvre pour réduire le nombre d’animaux, à savoir premiers essais initiés sur modèles alternatifs, progression par étapes avec amélioration et raffinement des dispositifs, détermination des effectifs sur la base des attentes réglementaires, progression par étapes avec amélioration et raffinement des dispositifs. Le nombre total d’animaux est aussi optimisé en traitant les deux reins et en réalisant plusieurs embolisations par coté (tout en maintenant une fonction rénale de 50%).
Raffinement
Toutes les interventions (prise de sang, angiographie, embolisations) se font sous anesthésie générale avec traitement de la douleur. Les animaux sont hébergés en groupe social dans un environnement contrôlé en température et hygrométrie. Ils reçoivent une alimentation adaptée à leurs besoins, de l’eau à volonté, des jouets et dispositifs favorisant leurs comportements naturels comme le fouissage et mâchouillement. Un temps d'habituation avec douche tiède, promenade et distribution de récompenses permet leur familiarisation et la réalisation des examens cliniques sans contrainte (prise de température, palpation, auscultation...). Une équipe compétente de zootechniciens, vétérinaire et médecins assure au quotidien l’entretien, la surveillance et les soins. Une vidéosurveillance 24h/24 permet d'observer les comportements en animalerie et d'intervention rapidement en cas d’anomalie. Une grille d’évaluation de la douleur est établie avec la conduite à tenir en cas de complications. Des points limites sont définis pour arrêter la procédure en cas de souffrance. La Structure en charge du bien-être animal accompagne le suivi des animaux. Avec le vétérinaire désigné, elle conseille les responsables dans l’amélioration de leurs pratiques en faveur du bien-être des animaux et de l’application des 3R.
Choix des espèces
Parmi les différentes espèces animales, le porc est l’espèce de choix pour les études impliquant de la chirurgie en raison de sa grande taille et de ses ressemblances anatomiques avec l'homme. Les similitudes vasculaires (arborescence générale, calibres des vaisseaux, flux sanguins) permettent de reproduire fidèlement chez le porc les scénarios d’administration vasculaire des agents d’embolisation en radiologie interventionnelle, avec des imageurs et matériels identiques à ceux utilisés pour les patients. De jeunes porcs charcutiers, âgés de 3 à 5 mois, seront utilisés. A cet âge les animaux ont atteint une taille suffisante pour réaliser les procédures de cathétérisme et embolisation avec le même matériel que chez l’homme.
Étude d’un modèle murin d’infection à Tropheryma whipplei et du rôle du facteur de transcription FoxP1 dans la réponse immunitaire
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Pour comprendre pourquoi certaines personnes développent la maladie de Whipple, 60 souris porteuses d'une mutation d'un gène immunitaire sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles sont infectées par voie orale par la bactérie Tropheryma whipplei, après un prélèvement de sang et une habituation à boire une solution sucrée à la micropipette. Le porteur attend des effets modérés et transitoires, perte de poids et baisse d'activité, sans mortalité liée à l'infection. Toutes les souris sont tuées pour prélever fluides et organes, l'étude comparant des animaux mutés à des témoins.
Objectifs
Tropheryma whipplei est l’agent responsable de la maladie de Whipple, une maladie chronique rare pouvant être grave en l’absence de traitement. Bien que cette bactérie soit relativement fréquente dans la population générale et souvent portée sans symptôme, seule une minorité de personnes développe la maladie. Cela suggère l’existence de facteurs individuels de susceptibilité. Des études récentes ont mis en évidence l’implication possible d’un gène, FOXP1, qui joue un rôle dans le fonctionnement du système immunitaire, notamment dans certaines cellules impliquées dans la défense contre les infections. Toutefois, son rôle précis dans la réponse immunitaire contre Tropheryma whipplei reste encore mal compris. Nous faisons l’hypothèse qu’une altération de ce gène pourrait perturber la réponse immunitaire et favoriser l’installation ou la persistance de l’infection. L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact de cette altération génétique sur les mécanismes de défense de l’organisme à l’aide d’un modèle expérimental d’infection. Cette approche repose sur l’identification de variations rares de ce gène chez des patients atteints de la maladie de Whipple. Nous analyserons le développement de l’infection, son évolution dans le temps ainsi que les différentes étapes de la réponse immunitaire, en comparant des modèles porteurs de cette altération génétique à des modèles témoins. L’utilisation de ce type de modèle est essentielle pour étudier de manière intégrée la complexité des interactions immunitaires et la dynamique de l’infection à l’échelle de l’organisme, ce qui ne peut être reproduit par des systèmes simplifiés. Ce projet vise ainsi à mieux comprendre le rôle de FOXP1 dans l’immunité contre Tropheryma whipplei et à éclairer les mécanismes expliquant la susceptibilité à la maladie de Whipple.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre la mise en place et la physiopathologie de la maladie de Whipple. Il permettra également de développer des outils diagnostiques et de prise en charge des patients atteints de maladie de Whipple. Les résultats de ce projet permettront d’améliorer la compréhension des mécanismes immunitaires impliqués dans l’infection à T. whipplei et du rôle de FoxP1 dans la régulation de la réponse immunitaire. Ces données pourraient contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques associés aux infections chroniques et aux dysfonctionnements de la réponse immunitaire.
Procédures
Un prélèvement sub mandibulaire sera effectué une seule fois avant l’infection sur souris vigile à l'aide d'une lancette (Golden Rod4MM). Quelques gouttes (100 microlitres environ) de sang sera prélevé sans dépasser le rapport volume/ poids réglementaire. D'autres prélèvements seront réalisés sur animaux morts. La durée de ce geste par le personnel formé et expérimenté n’excèdera pas 1 minute. Le gavage et le MDA font partis des nuisances possibles bien que nous ne pratiquerons le gavage qu’en cas de problème d’habituation à la méthode MDA « Micropipette-guided Drug Administration ». L’habituation au MDA consiste à présenter la solution sucrée à la souris (500microL) le jour 1 en état de contention. La durée de la prise de ce petit volume et la mise sous contention (maintien par le cou) ne devrait pas excéder 1 minute. Le deuxième jour, la souris est légèrement immobilisée en lui maintenant la queue et en lui présentant la boisson. La durée peut être légèrement variable d’un animal à l’autre. L’estimation est de 1 à 2 minutes maximum. A J3, d’après les auteurs de ce processus, la souris boit sans contrainte la boisson. La durée dépendra de chaque souris comme précédemment mais ne devrait pas excéder 2 minutes. Chaque souris se verra proposer seulement le jour de l’infection, cette eau de boisson avec soit du PBS soit la bactérie T. whipplei.
Impact sur les animaux
L’infection orogastrique par T. whipplei est susceptible d’induire des effets indésirables faibles à modérés chez les animaux. Les effets attendus incluent principalement une altération transitoire de l’état général, une légère perte de poids ou un ralentissement de la prise de poids, ainsi qu’une baisse temporaire de l’activité. Des effets digestifs légers, tels qu’une modification transitoire du transit, peuvent également être observés. Ces effets sont généralement modérés, transitoires et réversibles. Aucun effet indésirable sévère n’est attendu, notamment en termes de douleur intense, de détresse respiratoire, de signes neurologiques ou de mortalité liée à l’infection. Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière afin de détecter précocement tout signe de souffrance et de mettre en œuvre, si nécessaire, des mesures adaptées. En cas de signes de douleur, de souffrance ou d’angoisse suite à l’infection, un analgésique (buprenorphine) sera injecté en sous-cutané, à raison de 0.2 mg/kg de poids corporel.
Devenir
Euthanasie de tous les animaux pour prélèvements de fluides et organes.
Remplacement
Il est nécessaire de tester nos observations dans un modèle murin afin de se rapprocher des conditions physiopathologiques de l’infection par T. whipplei et de comprendre les mécanismes immunitaires sous-jacents, dans le but de fournir des pistes diagnostiques et thérapeutiques pour la prise en charge des patients. En particulier, ce modèle permet d’évaluer l’impact d’une perte de fonction hétérozygote de Foxp1 sur l’installation de l’infection, sa persistance et la qualité de la réponse immunitaire au niveau de l’organisme entier. À ce jour, aucune lignée cellulaire ni modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité des interactions entre T. whipplei et les différentes populations immunitaires, notamment les cellules T CD4+ et les macrophages, ni leur coordination dans le contrôle de l’infection. Les approches in vitro ne permettent pas non plus d’étudier la cinétique de l’infection, sa dissémination tissulaire, ni les mécanismes intégrés impliquant plusieurs organes et compartiments immunitaires. De plus, FOXP1 étant un facteur de transcription impliqué dans la régulation de multiples types cellulaires, son rôle ne peut être pleinement compris qu’à l’échelle d’un organisme intact. Le modèle murin constitue donc une approche indispensable et complémentaire aux études génétiques humaines ayant identifié FOXP1 comme gène de susceptibilité à la maladie de Whipple. Il permet de valider fonctionnellement ces observations, d’établir un lien de causalité entre le déficit en Foxp1 et l’altération de l’immunité anti-T. whipplei, et d’identifier les mécanismes impliqués. Ces données sont essentielles pour améliorer l’identification des individus à risque et orienter le développement de nouvelles stratégies diagnostiques et thérapeutiques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit grâce à la mutualisation des techniques et analyses sur un même animal. De plus, du fait de notre expérience (effets modérés de l’infection à T. whipplei), nous avons déterminé que 10 animaux/groupe/temps sont nécessaires à notre étude pour observer une différence statistique significative entre les groupes (p < 0.05) avec une puissance au moins supérieure à 80%.
Raffinement
La mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel ainsi que le suivi quotidien de l’état de santé des animaux permettront le raffinement de ce projet. Ainsi, les animaux seront hébergés en respectant le nombre maximum d’individus par cage, dans des cages équipées afin d’offrir un environnement enrichi et approprié. Tout au long de l’étude, les animaux seront surveillés quotidiennement, ce qui nous permettra d’intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en envisageant l’utilisation d’antalgiques. Dès lors qu’un animal aura atteint un point limite, la souris sera euthanasiée dans le but de réduire toute douleur, souffrance et angoisse.
Choix des espèces
La souris est le modèle animal de choix pour l’étude du système immunitaire.L’étude de l’infection à Tropheryma whipplei implique des interactions complexes entre l’agent infectieux, le système immunitaire et différents tissus, qui ne peuvent pas être reproduites de manière fiable par des méthodes alternatives in vitro ou in silico. Le recours à un modèle animal est indispensable pour étudier la dynamique de l’infection, la dissémination bactérienne et la réponse immunitaire dans un organisme entier. La souris a été choisie en raison : • de la disponibilité de modèles génétiques pertinents, notamment les souris porteuses d’une mutation hétérozygote perte de fonction du gène FoxP1, • de la bonne caractérisation de son système immunitaire, • de l’existence de données bibliographiques soutenant son utilisation dans l’étude des infections bactériennes. Afin de limiter les variations dues à des différences d’âge, des souris adultes de 6 à 8 semaines seront utilisées.
Caractérisation d’un modèle humanisé de myopathie myotubulaire liée à l’X
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Les souris mâles malades atteignent un point limite entre sept et huit semaines, marqué par une paralysie des membres postérieurs et une forte perte de poids. 94 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Elles subissent des mesures hebdomadaires de force, puis un test contractile final sous anesthésie sans réveil, pour caractériser un nouveau modèle humanisé de myopathie myotubulaire. Le porteur reconnaît que les animaux issus du croisement pourraient présenter un phénotype encore inconnu, traité par précaution comme dommageable.
Objectifs
La myopathie myotubulaire liée à l’X (XLMTM) appartient à un groupe de maladies génétiques appelées les myopathies centronucléaires (CNM), caractérisées par une altération sévère de la fonction des muscles squelettiques, touchant exclusivement les individus de sexe masculin. Cette pathologie entraîne une atteinte sévère de la qualité de vie des patients, avec un décès prématuré avant l’âge de 18 mois dans environ la moitié des cas, ou plus tardivement au cours de la petite enfance. À ce jour, aucune thérapie curative n’est disponible. Des travaux antérieurs ont mis en évidence deux variations génétiques susceptibles d’être ciblées, présentes chez près de 70 % des patients atteints de myopathies centronucléaires, dont la myopathie myotubulaire. L’objectif de ce projet est de générer un nouveau modèle murin humanisé de la myopathie XLMTM, porteur de ces variations génétiques humaines, afin de permettre le développement ultérieur d’une stratégie thérapeutique applicable chez l’homme. Ce modèle constituerait un outil pertinent pour l’évaluation préclinique de thérapies géniques dans un contexte de souris humanisée présentant la pathologie.
Bénéfices attendus
La progéniture de ce croisement permettra d’évaluer une preuve de concept thérapeutique ciblant les variations génétiques humaines chez plus de 70 % des patients atteints de CNM, notamment les formes sévères. Ce modèle permettra de valider une approche applicable à diverses formes de CNM.
Procédures
Le projet est divisé en 2 groupes d’animaux : (Groupe 1) : Évaluation de la surexpression d’un gène d’intérêt sur la survie des souris. Un suivi non invasif des souris sera mis en place avec la mesure de la force du corps durant 3 fois 1 minute réalisé une fois par semaine, un test de mesure de la force des pattes durant 3 fois 1 minute réalisé une fois par semaines et une pesée régulière, une fois par semaine de 2 à 4 semaines d’âge, tous les 2 à 3 jours à partir de 4 semaines d’âge et tous les 1 à 2 jours à partir de 6 semaines. Ensuite, (Groupe 2) Évaluation de la surexpression d’un gène d’intérêt sur la force des souris : Chaque semaine, deux tests seront effectués : un test non invasif de la force du corps et un test non invasif de la force des pattes. Ces tests dureront 3 fois 1 minute et seront répétés une fois par semaine, de la 4ᵉ à la 7ᵉ semaine. Chaque semaine, une mesure de la coordination motrice sera répétée de la 4e à la 7e semaine. Pour finir, un test de mesure contractile du muscle, réalisé une fois sous anesthésie générale à la fin de l’étude, durant au maximum 1 heure. Une pesée régulière sera mise en place une fois par semaine, de 2 à 4 semaines d’âge, puis tous les 2 à 3 jours à partir de 4 semaines d’âge, et tous les 1 à 2 jours à partir de 6 semaines d’âge. Le test de mesure de la force contractile est une procédure chirurgicale sans réveil, au terme de laquelle les animaux seront mis à mort.
Impact sur les animaux
Les souris transgéniques humanisée utilisées pour ce croisement ne présentent pas de phénotype dommageable. En revanche, les souris mâles atteintes du modèle de la maladie développent une atteinte locomotrice progressive à partir de 4 à 5 semaines de vie et atteignent généralement un point limite entre 7 et 8 semaines. Cette atteinte se traduit notamment par une paralysie des membres postérieurs et une perte de poids importante. Les souris issues du nouveau croisement pourraient présenter un phénotype encore inconnu. Par précaution, ces animaux seront considérés comme potentiellement dommageables dans l’attente des premières données expérimentales et feront l’objet du même protocole de surveillance et des mêmes critères de point limite que les souris malades du modèle. Les nuisances associées aux tests phénotypiques pourront inclure la peur de la chute lors du test de mesure de la force du corps, le stress lié à la contention ainsi qu’une douleur potentielle lors des injections nécessaires à certaines mesures expérimentales (mesure de la force des pattes et de la coordination motrice). Les souris malades présentent des difficultés locomotrices à partir de 4 semaines, entraînant une paralysie des membres postérieurs et une perte de poids vers 7 à 8 semaines. Il n’est pas exclu que les animaux puissent ressentir de la douleur liée à des problèmes musculaires (comme des crampes). Les nuisances liées aux tests incluent du stress lors des différents tests pour évaluer le phénotype musculaire, et lors de la contention durant les injections, ainsi qu’une douleur lors de l’insertion de l’aiguille.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les muscles et organes nécessaires aux études histologiques et moléculaires.
Remplacement
Le modèle murin est physiologiquement et structurellement proche de l’Homme, ce qui nous permettra d’étudier, d’une part, la physiopathologie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne suffirait pas à elle seule, car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire seraient impossibles à mesurer.
Réduction
Le nombre d’animaux a été choisi sur la base des données de la littérature, afin de détecter une différence statistiquement significative entre les différents groupes d’animaux (malades, sains, etc.). Lorsque cela est possible, des animaux de la procédure 2 pourront être utilisés pour réduire le nombre nécessaire à la procédure 3. Les tests de mesure de la force du corps, de la force des pattes et de la coordination motrice sont non invasifs ; ils permettent de réutiliser les mêmes animaux à chaque point dans le temps, et un même animal pourra donc produire des données de force globale et contractile, ainsi que des données histologiques et moléculaires.
Raffinement
Pour prévenir toute malnutrition qui pourrait être due à des difficultés locomotrices, de la nourriture hydratée en gelée sera placée dans la cage dès l’apparition des premiers symptômes à 4 semaines. Lors du test sous anesthésie générale, la température corporelle de l’animal sera maintenue à l’aide d’une plaque chauffante. Pour les nouveau-nés, leur capacité à se mouvoir et le comportement maternel seront observés quotidiennement durant la première semaine de vie À partir de l’âge de 2 semaines, les animaux seront pesés de manière hebdomadaire. La fréquence de pesée sera augmentée à tous les 2 à 3 jours dès l’âge de 4 semaines, correspondant au début d’apparition du phénotype, puis à tous les 1 à 2 jours à partir de 6 semaines en raison de l’aggravation progressive du phénotype. En cas d'infection importante, à la suite d’une bagarre par exemple, les animaux seront euthanasiés sur avis vétérinaire.
Choix des espèces
Le modèle de souris récapitule fidèlement le phénotype locomoteur et histologique présent chez les patients, et constitue donc un bon modèle pour l’étude des mécanismes pathologiques et l’évaluation de thérapies. La maladie affectant les hommes, seuls les animaux mâles seront étudiés. Les défauts locomoteurs apparaissent à 4 semaines et progressent jusqu’à 8 semaines. Le suivi longitudinal de force globale sera donc effectué à partir de 4 semaines, avec un test contractile final à 7 semaines, précédant la paralysie des membres postérieurs, dans le cas du groupe 2. Pour les études de survie (groupe 1), le suivi de la force est prolongé jusqu'à atteinte d'un point limite. Tous les animaux sont pesés régulièrement dès 2 semaines d'âge pour détecter toute détresse animale au plus vite
Modulation thérapeutique de l’architecture nucléaire par AAV dans un modèle murin de myopathie centronucléaire et wild type
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Atteintes d'une forme grave de myopathie qui les tue spontanément vers six ou sept semaines, une partie des 224 souris de ce projet développe faiblesse musculaire et perte de poids indépendamment du traitement. Le niveau de souffrance déclaré va de modéré à sévère, et toutes les souris, malades comme témoins, sont tuées en fin d'expérience pour analyse des muscles. Elles reçoivent une injection unique de thérapie génique par virus sous anesthésie légère, puis des tests de force et de marche. Seuls des mâles sont utilisés, la maladie étant liée au chromosome X.
Objectifs
Ce projet a pour but de tester si l’injection d’un traitement génétique peut améliorer le phénotype musculaire de souris atteintes d’une forme grave de myopathie rare. Cette maladie ne dispose actuellement d’aucun traitement curatif. Pour cela, on utilisera des virus inoffensifs capables de transporter soit de petites molécules destinées à bloquer certains gènes susceptibles d’aggraver la maladie, soit des copies complètes de ces mêmes gènes, afin d’en étudier les effets dans des souris contrôles et dans des souris malades. Le traitement sera administré après la naissance afin de corriger le fonctionnement des muscles altérés ou d’analyser les conséquences de cette modulation génétique dans un contexte musculaire sain et pathologique. En complément de ces approches, une étude pilote sera réalisée à l’aide d’une autre méthode de blocage génétique. Cette technique vise à bloquer spécifiquement une molécule d’ARN soupçonnée de jouer un rôle dans la maladie. Ce traitement sera injecté localement dans le muscle afin d’en évaluer l’efficacité.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait démontrer qu’il est possible de corriger certains défauts musculaires en ciblant des gènes spécifiques, ou que l’augmentation de l’expression de certains gènes a un effet positif ou négatif sur la fonction musculaire. À terme, cela pourrait contribuer au développement de nouveaux traitements pour des maladies musculaires génétiques sévères qui ne disposent aujourd’hui d’aucun traitement curatif. Ce projet permettra aussi d’identifier des gènes à privilégier ou à éviter dans une approche thérapeutique.
Procédures
Les animaux recevront une injection unique par voie systémique ou intramusculaire sous anesthésie légère. L’injection durera moins de cinq minutes par animal. Aucun geste chirurgical lourd ne sera réalisé. Des tests fonctionnels non invasifs (force de préhension, analyse de la démarche, test d’endurance) seront effectués pour évaluer l’effet des traitements. À la fin de l’expérience, après anesthésie et euthanasie, des prélèvements musculaires seront réalisés pour analyses histologiques et moléculaires.
Impact sur les animaux
Les injections peuvent entraîner un léger inconfort transitoire au point d’injection (rougeur, légère inflammation) ou un stress momentané lié à la manipulation. Chez les souris malades, des signes cliniques sévères sont attendus indépendamment du traitement, en lien avec la maladie : perte de poids progressive, faiblesse musculaire marquée, réduction de la mobilité, difficultés d’alimentation et mortalité spontanée entre 6 et 7 semaines d’âge. Chez les animaux sains comme chez les animaux malades, la diminution ou l’augmentation de l’expression de certains gènes candidats pourrait entraîner une faiblesse musculaire, une baisse d’activité, une altération de la marche ou une aggravation du phénotype musculaire. Ces effets, difficiles à prédire, feront l’objet d’une surveillance attentive.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérience afin de permettre l’analyse détaillée des muscles et d’autres organes aux niveaux histologique, cellulaire et moléculaire. Ces analyses post-mortem sont indispensables pour évaluer précisément l’effet des traitements et comprendre les mécanismes biologiques impliqués. L’euthanasie sera réalisée sous anesthésie profonde afin d’éviter toute souffrance.
Remplacement
Il n’est pas possible d’utiliser uniquement des cellules en culture à la place des souris, car les phénomènes étudiés (comme la position des noyaux, la force musculaire ou les effets généraux d’une modification de l’expression de certains gènes) nécessitent un organisme entier pour être correctement observés.
Réduction
Le nombre de souris utilisées a été soigneusement calculé pour être le plus faible possible tout en permettant d’obtenir des résultats fiables. Des méthodes statistiques seront utilisées pour s’assurer que ce nombre est suffisant, y compris pour les groupes recevant une augmentation de l’expression de certains gènes. Des tests fonctionnels complémentaires (force de préhension, tapis roulant, analyse de la démarche et évaluation de la fonction musculaire) contribueront également à l’évaluation globale des effets du traitement.
Raffinement
Les procédures susceptibles de provoquer de la douleur ou du stress sont réalisées sous anesthésie afin de limiter au maximum la souffrance. Les cages sont enrichies (abris, nourriture en gel facilement accessible) et les animaux sont surveillés régulièrement. Des critères précis ont été définis pour repérer rapidement tout signe de souffrance. Si nécessaire, la procédure est interrompue et l’animal est euthanasié sans délai afin d’éviter toute souffrance excessive.
Choix des espèces
Le modèle choisi reproduit de manière pertinente la maladie humaine étudiée (une forme grave de myopathie) : les souris présentent des noyaux mal positionnés dans leurs muscles (au centre plutôt qu’en périphérie), une faiblesse musculaire et une mort précoce, ce qui permet d’étudier la maladie dans des conditions réalistes. Seuls les mâles seront utilisés car cette maladie génétique touche principalement les mâles (elle est liée au chromosome X). L’utilisation de femelles n’aurait donc pas d’intérêt scientifique dans cette étude. Les souris seront traitées entre 2 et 5 semaines d’âge, ce qui correspond à une période où les muscles sont encore en cours de développement. Cela permet une bonne efficacité du traitement. Les souris malades ne vivent généralement que jusqu’à 6 ou 7 semaines ; il est donc important d’intervenir tôt pour évaluer les effets du traitement avant que la maladie ne soit trop avancée. Les souris contrôles (WT), y compris celles recevant des vecteurs de surexpression, suivront le même protocole d’injection afin que les groupes soient comparables.
Prévention de l’épilepsie dans un modèle de souris. MODIFICATION
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Biopsie de la queue sur les souriceaux, injections répétées, chirurgie de quarante-cinq minutes sur des femelles gestantes, injection sur les embryons, puis induction de crises d'épilepsie : 4 084 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance allant de léger à sévère, 672 en gravité sévère. Le test d'induction de l'épilepsie provoque une détresse chez l'animal, et la biopsie une douleur modérée. Une partie des souris est gardée vivante pour la reproduction, dont cinquante-deux femelles réengagées dans une autre procédure, le reste étant tué pour prélèvement. Le projet teste une protéine censée réduire la sévérité de l'épilepsie, avec des objectifs décrits en deux phrases très brèves.
Objectifs
Le projet a pour objectif de mieux comprendre l’influence d’une population neuronale transitoire sur le développement de crise d’épilepsies. Nous voulons également tester un nouveau traitement potentiel pour protéger des crises d’épilepsie.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu du projet est de tester un nouveau traitement contre l’épilepsie et d’étendre nos connaissances sur le rôle de nos cellules neuronales d’intérêt sur leur survenance. En outre la modification apportée à cette demande vise à tester une protéine en particulier dans sa capacité à rèduire la sévérité de l'épilepsie.
Procédures
- Les souriceaux, immobilisés pendant quelques secondes, subiront une biopsie à la queue (moins d'une seconde). - Les femelles gestantes subiront une injection d’une durée de 5 secondes une fois par jour pendant 3 jours et une intervention chirurgicale de 45 minutes sous anesthésie générale. - Les embryons subiront une injection d'une durée de 5 secondes. - Des animaux subiront une anesthésie générale suivie d'une injection pendant 20 minutes. - Des animaux subiront une intervention chirurgicale de 1 heure sous anesthésie générale et des points de sutures. - Des animaux subiront une injection (1x10 sec). Des animaux subiront 7 injections intrapéritonéales pendant 2 semaines (7 x 10sec).
Impact sur les animaux
- La biopsie à la queue provoque une douleur modérée. - Les injections peuvent induire une douleur légére et brève. - Les étapes d’anesthésie et de contention peuvent également provoquer un stress chez l’animal. - Le test d’induction de l’épilepsie peut provoquer une détresse chez l’animal.
Devenir
Les animaux de la procédure 1 sont gardés en vie pour des accouplements ultérieurs et 52 femelles subiront la Procédure4. Les animaux des autres procédures seront mis à mort pour prélèvement.
Remplacement
Les questions abordées dans ce projet nécessitent un modèle animal. Le développement cérébral et l’épilepsie ne peuvent être étudiés qu’à l’échelle de l’organisme car aucun modèle cellulaire ne reproduit la complexité des interactions entre les types cellulaires du cerveau.
Réduction
Les effectifs ont été déterminés par une approche statistique, ainsi que par des expériences antérieures sur ce type d’études de modèles animaux. Ce nombre a été réduit au minimum nécessaire pour atteindre des résultats statistiquement significatifs. L’analyse statistique sera réalisée par un test statistique adéquat.
Raffinement
Tous les animaux vivent en groupes familiaux ou sociaux dans un environnement enrichi avec eau et nourriture illimitées. Lors des chirurgies, les souris placées sur une plaque chauffante sont anesthésiées et reçoivent des injections d'antidouleurs avant et après l'opération. Un gel ophtalmique est également utilisé pour éviter un dessèchement des yeux. Après l'opération, la surveillance des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance. Une grille d'évaluation de la santé des animaux est mise en place. L’application stricte des points limites spécifiques aux expériences réalisées conduira à une prise en charge de la souffrance éventuelle des animaux.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le développement et le fonctionnement du système nerveux, principalement en raison de sa similarité avec l’Homme. Pour la biopsie, les souriceaux ont entre 4 et 7 jours ce qui permet de connaitre leur génotype avant le sevrage et le traitement commençant au 10ème jour. Les femelles gestantes sont des adultes de 2 à 6 mois. Les expérimentations sont menées sur des animaux aux stades de développement embryonnaire et postnataux où interviennent les phénomènes étudiés.