Recherche appliquée

Dépourvues de système immunitaire et irradiées, 2 580 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. On leur injecte des cellules d'une leucémie humaine de mauvais pronostic, puis on suit la maladie par prélèvements de sang et de moelle osseuse, jusqu'à quinze fois. Le développement de la leucémie provoque fatigue, douleurs et baisse de mobilité. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit l'auto-renouvellement des cellules souches leucémiques, qui exige des greffes en série chez l'animal.

Objectifs

Les hémopathies à cellules dendritiques plasmocytoïdes (pDC) sont divisées en deux principales entités : la leucémie à pDC (LpDC) et les leucémies aiguës myéloïdes avec excès de pDC (LAM-pDC). La LpDC est une maladie de mauvais pronostic : seulement 17 % des patients, tout traitement confondu, sont encore en vie après 5 ans et des rechutes sont observées dans 75 % des cas. Les LAM-pDC semblent être associées à un pronostic plus défavorable que les LAM sans excès de pDC, avec des taux de survie globale et sans rechute plus faibles décrits dans la littérature. En hématologie, de façon générale, il est décrit l’existence de cellules initiatrices de la leucémie (aussi appelées cellules souches leucémiques) qui sont capables de générer la maladie in vivo dans des modèles de souris dépourvues de système immunitaire. La présence de ces cellules est associée à un pronostic péjoratif chez les patients, avec des rechutes et une résistance au traitement plus fréquentes lorsqu’elles sont retrouvées en excès. A ce jour, les cellules souches leucémiques ne sont pas décrites dans ces deux hémopathies. Les objectifs du projet sont donc d’étudier les capacités de génération de la leucémie de différentes fractions cellulaires d’intérêt contenues dans des échantillons de LpDC ou de LAM-pDC. Le but de ces expérimentations est de mettre en évidence une population initiatrice de la leucémie afin de la caractériser pour pouvoir la cibler sur le plan biologique et thérapeutique chez les patients atteints de ces leucémies. Dans une deuxième partie du projet, les modèles mis en place par la sélection de populations cellulaires particulières permettront d’évaluer l’efficacité chez les animaux de thérapies mises en place et déjà évaluées en culture cellulaire par l’équipe, ainsi que d’autres thérapies déjà disponibles sur le marché, afin d’ouvrir de nouvelles perspectives dans le traitement de ces hémopathies.

Bénéfices attendus

Plusieurs bénéfices sont attendus à la suite de ce projet : - La mise en évidence de nouvelles populations cellulaires à l’origine du développement des hémopathies à pDC dans un but de les mettre en évidence sur le plan biologique au diagnostic et, éventuellement, à la rechute - La mise en évidence de nouvelles voies biologiques et/ou biomarqueurs permettant de proposer de nouvelles alternatives thérapeutiques ou le développement de nouveaux médicaments - La compréhension des mécanismes biologiques sous-tendant la résistance aux traitements et la rechute chez les patients atteints d’hémopathies à pDC La validation de l’efficacité et l’évaluation de la toxicité de nouvelles approches thérapeutiques développées dans l’équipe avant d’envisager un passage chez l’être humain

Procédures

Les animaux seront irradiés le jour précédant l’injection des cellules leucémiques (1 fois, moins de 5 minutes). L’injection des cellules leucémiques sera réalisée en intra-veineux (1 fois, environ 1 minute par animal). L’injection de thérapies à évaluer sera réalisée en intra-veineux (1 fois, environ 1 minute). Le suivi de l’apparition de la leucémie sera réalisé par prélèvement de sang veineux périphérique au niveau de la veine faciale après anesthésie gazeuse (animal endormi, moins d’1 minute, 1 fois par mois et de façon plus rapprochée en cas de signes cliniques ou de suivi du taux de cellules leucémiques, en respectant un délai d’une semaine entre deux prélèvements, sans que cela dépasse 15 prélèvements durant le temps de suivi de l’animal). Le cas échéant, le suivi pourra être réalisé par prélèvement médullaire après anesthésie gazeuse et analgésie (animal endormi, environ 5 minutes, 1 fois dans la vie de l’animal au maximum, en cas de signes cliniques et en l’absence de détection dans le sang périphérique de la leucémie). Pour les animaux ayant reçu une lignée cellulaire dont le suivi peut être réalisé par imagerie, une injection de produit de traçage sera réalisée après analgésie (moins d’1 minute, au maximum 1 fois par semaine) suivi par une anesthésie gazeuse pour le placement dans l’appareil d’imagerie (animal endormi, environ 5 minutes, au maximum 1 fois par semaine).

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés n'ont pas de système immunitaire ce qui entraîne un risque accru d’infections s’ils sont exposés à un environnement non contrôlé. Les animaux issus d’élevage en dehors de notre établissement utilisateur subiront une période de stress en lien avec le changement de lieu d’hébergement. L’injection des cellules leucémiques chez les animaux entraînera l’apparition des maladies chez ceux-ci. Le développement des leucémies pourra provoquer un inconfort chez la souris, avec une diminution de la mobilité, une fatigue ou des douleurs. L’injection de ces mêmes cellules ou des thérapies à évaluer, par voie intra-veineuse, pourra être à l’origine d’une douleur au point d’injection ou d’un saignement bref. Les pesées régulières et les manipulations associées pourront également entraîner un stress modéré mais de courte durée. Les prélèvements veineux sanguins périphériques, réalisés au niveau mandibulaire, seront à l’origine d’une douleur modérée et éventuellement d’un hématome. De la même manière, les prélèvements de moelle osseuse réalisés au niveau de l’os fémoral pourront être à l’origine d’une douleur et d’un inconfort en lien avec un hématome pouvant gêner la locomotion de façon brève et résolutive. L’injection du produit de traçage qui sera réalisée chez les animaux suivis par imagerie pourra provoquer une douleur ou un inconfort dans les suites de l’injection.

Devenir

Pour les deux procédures, les réponses aux objectifs scientifiques doivent être apportées par le prélèvement et l'étude des organes (moelle osseuse et rate en particulier). Les animaux seront donc mis à mort sans possibilité d’intégrer un autre projet.

Remplacement

La partie du projet évaluant les capacités d’initiation de la leucémie de différentes populations cellulaires nécessite l’utilisation d’animaux pour valider fonctionnellement cette capacité, en particulier la souris. Il n’existe à l’heure actuelle aucun autre modèle animal validé et utilisable dans les leucémies permettant d’évaluer de façon précise ces propriétés. De plus, il n’existe pas de modèles robustes utilisables en culture cellulaire (in vitro) permettant de reproduire ce qui est observé chez la souris de façon fiable avec ce type d’hémopathies (survie faible des cellules leucémiques, absence de modèles en trois dimensions ou autres disponibles pour reproduire de façon fiable l’environnement leucémique). Les capacités d’auto-renouvèlement des cellules souches devant être mises en évidence par des greffes en série, il n’est, là non plus, pas possible de se passer de l’utilisation d’animaux. Concernant la partie évaluant l’efficacité de thérapies anti-leucémiques, des expériences in vitro avec des résultats encourageants ont déjà été réalisées mais ces modèles ne permettent pas, à l’heure actuelle, d’évaluer l’ensemble des paramètres que l’on retrouve dans les modèles animaux. Ainsi, des modèles animaux sont nécessaires afin de se rapprocher au mieux des conditions que l’on retrouve chez l’être humain et d'espérer un emploi des thérapies à évaluer pour traiter les patients.

Réduction

Pour chaque expérimentation nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaires pour observer un effet significatif sur le plan statistique sans avoir recours à des animaux en excès. Pour calculer le nombre d’animaux par lot, nous nous basons sur des résultats d’expériences que nous avons réalisées précédemment sur ces modèles ainsi que sur des données de la littérature où sont réalisées des expériences similaires.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe afin de respecter leur caractère social, sans dépasser la limite recommandée d’individus par cages en termes de surface au sol. L’hébergement des animaux dépourvus de système immunitaire est réalisé dans des cages stériles avec de la nourriture, de la litière et de l’eau stériles, entreposées dans des portoirs ventilés permettant de les protéger de l’environnement extérieur. L'environnement d'hébergement est contrôlé en termes de température, d’hygrométrie et respecte des cycles jour/nuit réguliers. Pour leur bien-être, l’eau et la nourriture sont accessibles aisément et à volonté. Afin de leur permettre d’exprimer leur comportement physiologique (fouissage, nidification) une litière abondante ainsi que des matériaux spécifiques seront mis en place. Un enrichissement structural (tunnel en carton, pot en verre) sera également proposé afin d’éviter l’apparition de comportements stéréotypés. Une évaluation au minimum hebdomadaire du poids et de l’état de santé global à l’aide d’échelles spécifiques sera réalisée afin de détecter toute altération de l’état général des animaux. Les procédures expérimentales potentiellement douloureuses seront encadrées par une anesthésie et/ou une analgésie le cas échéant. L’apparition d’une potentielle douleur en lien avec les procédures expérimentales sera appréciée par une échelle d’évaluation de la douleur. Lorsque cela sera possible, des techniques d’imagerie seront privilégiées pour le suivi de la maladie à la place de prélèvements sanguins ou de moelle osseuse. Toutes les expérimentations seront réalisées sous poste de sécurité microbiologique afin d’éviter l’infection des animaux par des pathogènes environnants. Enfin, des points limites seront mis en place, prenant en compte plusieurs paramètres tels que la perte de poids, l’état du pelage ainsi que la capacité de locomotion. Ces points limites permettront, lorsqu’ils sont atteints, de mettre à mort immédiatement les animaux.

Choix des espèces

La communauté scientifique privilégie l’utilisation de modèles murins pour l’étude des cellules souches leucémiques et pour l’évaluation de la réponse aux traitements. Les résultats obtenus chez la souris dans l’étude des processus hématopoïétiques pathologiques sont souvent extrapolables à l’être humain avec de nombreuses données issus de modèles animaux ayant abouti à de véritables stratégies de suivi de la maladie et de choix thérapeutiques. Les souris permettent aussi l’accès à des modèles modifiés génétiquement, pour ne plus avoir de système immunitaire, nécessaires au déroulement de notre projet. Les animaux utilisés seront des souris âgées de 6 à 12 semaines au maximum car il s’agit de la période du développement la plus optimale pour la génération d’une leucémie à partir d’échantillons de patients atteints de leucémies. De plus, l’utilisation de souris plus âgées n’est pas recommandée car certains échantillons de patients atteints de leucémie sont associés à un développement lent de la maladie (parfois plus d’un an) ce qui ne permet pas d’avoir une période d’expérimentation assez longue pour exploiter des résultats avec ces animaux.

Le projet vise à produire du sérum et des tissus de référence à partir de hamsters immunisés. 112 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chaque animal reçoit trois immunisations puis une ponction de sang directement dans le cœur sous anesthésie profonde. Le porteur justifie l'espèce par sa bonne réponse immunitaire et présente les cultures cellulaires comme une piste future de réduction, la mise à mort servant à collecter sang et organes.

Objectifs

De plus en plus d’études montrent que des virus circulent ou apparaissent chez les chauves-souris européennes, dont certains sont particulièrement préoccupants en raison de leur capacité connue à se transmettre d'une espèce à l'autre et à provoquer des maladies graves chez l'Homme. Les méthodes de détection disponibles, développées pour des virus humains (ex. le virus de la rage), sont rarement validées pour les virus trouvés chez les espèces de la faune sauvage tel que les chauves-souris ou les musaraignes, ou ne sont pas adaptées aux échantillons collectés sur le terrain. Pour cela, il apparait nécessaire de développer de nouveaux outils de détection des virus circulant dans la faune sauvage permettant ainsi d’appréhender plus rapidement le risque pour l’Homme. De plus, l'absence de matériaux de référence ou de valeurs seuils communes complique l'interprétation des résultats et leur comparaison entre les groupes de recherche. Le modèle hamster est un modèle sensible à certains virus et peut facilement être utilisé pour produire des matériaux de référence comme du sérum et des tissus. Ces matériaux de référence issus de sérums/organes d’animaux immunisés ou non-immunisés permettront de développer un panel d’outils de détection de ces virus. La collecte des organes, permettra de développer de nouvelles méthodes de recherche d’anticorps intratissulaires pour chaque virus quand l’obtention de sérum ne sera pas possible. Ils permettront également de mettre au point des cultures de cellules en 3 dimensions mimant les caractéristiques et fonctionnalités des organes en vue de constituer une banque biologique limitant ainsi l’utilisation d’animaux par la suite. Ce projet ne nécessite pas d’analyse statistique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de développer et valider des outils de détection sérologiques adaptés à chaque virus et aux investigations chez les chauves-souris et musaraignes, réservoirs de ces virus (microprélèvements, organes/tissus d’intérêt…). La collecte des différents tissus permettra de rechercher les marqueurs d’une infection passée (anticorps) pour chaque virus et dans différents organes lorsque l’obtention de sérum ne sera pas possible dans les conditions du terrain. Le travail innovant sur les cultures de cellules en 3 dimensions permettra l’étude des mécanismes d’infection d’un agent pathogène sur une espèce sensible, limitant ainsi l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques. Dans un second temps, ce travail pourra être étendu aux chauves-souris afin de tester la réceptivité/sensibilité de ces espèces vis-à-vis de nouveaux virus et de caractériser les relations hôtes-pathogènes. Dans cette optique, et sur le long terme, cela permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés. Ces modèles pourront ensuite être utilisés dans d’autres études ou pour tester d’autres agents pathogènes.

Procédures

Les hamsters seront immunisés trois fois par voie intra-péritonéale ou par voie sous-cutanée (animaux anesthésiés- durée =10 secondes environ). Une prise de sang intracardiaque sous anesthésie profonde (+ analgésie) est effectuée sur tous les hamsters (durée 3 minutes)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont celles liées au stress de la contention de l'animal, et à l'anesthésie gazeuse et celles lisées à la douleur liées aux injections par voie intra-péritonéale ou sous-cutanée (légères de courtes durées mais répétées).

Devenir

Mise à mort pour collecte de sang et tissus

Remplacement

Le modèle hamster nous permettra de collecter des échantillons pour développer des outils sérologiques et cellulaires adaptés à leur détection ou à leur étude dans d’autres espèces animales. De plus, l’étude in vitro des mécanismes de franchissement de la barrière d’espèce de ces virus dans la faune sauvage nécessite la mise en place de cultures de cellules en 3 dimensions. Seuls des organes rapidement prélevés sur l’animal permettront la mise au point de ce type de modèle in vitro (poumon, cerveau, foie, rate…). Il n’y a donc pas d’alternative non animale disponible à ce jour dans ce domaine.

Réduction

Le nombre de hamsters a été confirmé par les premiers résultats obtenus d'un précedent projet pour pouvoir mener à bien le développement et la validation des différentes techniques qui permettront une meilleure compréhension de la réponse immunitaire induite suite à l’immunisation avec chaque espèce virale. Aucune analyse statistique n’est réalisée. La collecte des organes sera effectuée sur l’ensemble de ces hamsters afin de disposer de matériel qui pourra être utilisé pour la mise au point de méthodes de détection sérologiques sur des matrices alternatives au sérum mais également pour le développement de cultures de cellules en 3 dimensions, qui à moyen terme, permettra des études in vitro, réduisant ainsi l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques. Suite à l'obtention de premiers résultats, nous avons modifié le protocole d’immunisation des animaux afin d’avoir une meilleure réponse immunitaire sans qu’il soit nécessaire d’augmenter le nombre d’animaux par espèce virale.

Raffinement

Les hamsters seront hébergés en cage de 2 individus avec un enrichissement composé de nombreux tunnels, abris (afin de satisfaire leur besoin de cachette), cellulose, et de bâtonnets de bois à ronger. Un contrôle de leur état de santé sera assuré tous les jours. Aucun signe clinique n'est attendu dans la mesure où les animaux seront immunisés par des suspensions non pathogènes ou faiblement réplicatives (virus inactivés, faiblement réplicatifs ou protéine virale vectorisée ou protéine adjuvée).

Choix des espèces

Plusieurs études scientifiques menées sur les lyssavirus et sur des protéines virales vectorisées ou adjuvées d’intérêt ont montré que le hamster doré était un modèle expérimental qui présentait une bonne réponse immunitaire humorale et permettait l’obtention de sérums spécifiques. Le hamster est donc un très bon modèle pour réaliser ces tests d’immunisation. D’après la littérature des hamsters âgés entre 7 et 10 semaines le jour de l’immunisation sont connus pour avoir une bonne réponse immunitaire humorale. Nous utiliserons donc des hamsters adultes de 7 semaines à réception.

Soumises à des injections intrapéritonéales et à une chirurgie de quarante minutes, 810 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reproduisent une anomalie protéique observée dans les maladies des petits vaisseaux du cerveau, pour lesquelles aucun traitement n'existe. Les cerveaux sont prélevés à différents âges après la mise à mort, afin de suivre l'évolution des lésions. Le porteur conclut que ces interactions vasculaires ne peuvent être reproduites ni sur cellules isolées ni par ordinateur, et que le recours à l'animal ne peut donc "pas être substitué".

Objectifs

Les maladies des petits vaisseaux cérébraux sont une cause majeure d’accidents vasculaires cérébraux récurrents chez l’homme, et aucun traitement spécifique n’est actuellement disponible. Ce projet vise à étudier le mécanisme des lésions vasculaires dans des modèles souris reproduisant une anomalie protéique fréquemment observée dans ces maladies. Des analyses moléculaires, biochimiques et histologiques seront effectuées sur des cerveaux prélevés à différents âges après la mise à mort des animaux, afin d’examiner l’évolution des lésions aux divers stades de la maladie. Ces études sont essentielles pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents et pour concevoir de nouvelles stratégies thérapeutiques

Bénéfices attendus

Santé humaine : Ce projet apportera des avancées significatives dans la compréhension et le traitement des maladies des petits vaisseaux cérébraux. À court terme : Valider la pertinence de 2 modèles chez la souris pour évaluer les conséquences d’une anomalie protéique fréquemment observée dans ces maladies. À moyen terme : Mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans ces maladies afin de développer des approches thérapeutiques adaptées.

Procédures

Injections intrapéritonéales, moins de 5/animal, 10 secondes. Chirurgie sous analgésie et anesthésie (40 minutes)

Impact sur les animaux

Stress et douleur légère de courte durée (environ 10 secondes) lors des injections intrapéritonéales

Devenir

Les animaux des lots expérimentaux et de génotype d'intérêt sont mis à mort afin de pouvoir prélever le cerveau et réaliser les analyses moléculaires, biochimiques et histologiques.

Remplacement

La surexpression de la protéine X a été mise en évidence par l’analyse globale des protéines présentes dans les tissus. À ce jour, il n’existe pas de modèle sur cellules en culture permettant d’étudier de manière pertinente l’impact de cette surexpression sur les vaisseaux cérébraux. Les interactions entre les vaisseaux sanguins, le cerveau et la régulation du débit sanguin sont complexes et impliquent de nombreux mécanismes interdépendants. Il est donc nécessaire d’étudier ces anomalies chez l’animal vivant, afin d’analyser ces phénomènes dans un organisme intact, où l’ensemble des systèmes de régulation fonctionne de manière intégrée. En raison de cette complexité, il n’est actuellement pas possible de reproduire fidèlement ces interactions en laboratoire sur des cellules isolées ni à l’aide d’un modèle informatique. Pour ces raisons, le recours au modèle animal ne peut pas être substitué par un modèle sur cellules ou par une modélisation informatique.

Réduction

Les âges d’analyse et les tailles d’échantillons ont été définis sur la base de jeux de données issus d’expériences antérieures. Le projet est en outre structuré de manière séquentielle, permettant d’adapter la poursuite des travaux en fonction des résultats intermédiaires. Les comparaisons statistiques sont réalisées avec les tests appropriés.

Raffinement

Les animaux sont maintenus en groupes sociaux dans un environnement enrichi. Afin de minimiser le risque de rejet par la mère après injection chez les souriceaux, de la sciure provenant de la cage est saupoudrée sur les souriceaux, de manière à ne pas perturber leur reconnaissance par la mère. Une grille de score ainsi qu’une liste de points limites ont été établies pour assurer le suivi du bien-être animal. La chirurgie est réalisée sous analgésie et anesthésie.

Choix des espèces

La souris est un animal vertébré chez lequel, d'une part, l'organisation du système vasculaire cérébral est assez proche de l'homme et d'autre part les manipulations génétiques sont aujourd’hui réalisables. Ces manipulations génétiques sont indispensables pour la réalisation de ce projet. Souriceaux de 7 à 8 jours, prépubères, adultes de 2 mois à 9 mois pour étudier les différents stades de la maladie

3 496 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur foie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées, une greffe de tumeur sous la peau, des séances d'imagerie sous anesthésie et jusqu'à douze prélèvements sanguins, pour tester une nanoparticule censée détourner le foie et mieux diriger les médicaments vers les tumeurs. Les retombées annoncées pour les patients, des doses plus faibles et moins de toxicité, restent renvoyées au conditionnel et au long terme. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou informatique ne reproduit la distribution d'un médicament dans un "organisme entier" et conclut à la nécessité de la souris.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer une stratégie visant à améliorer l’efficacité des traitements administrés par voie intraveineuse (IV) tout en réduisant leur toxicité périphérique, en modulant la façon dont ces traitements se répartissent dans l’organisme, grâce à leur association à une nanoparticule lipidique conçue à cet effet. Après injection, de nombreux médicaments sont rapidement éliminés par le foie, principal mécanisme de détoxification de l’organisme. Cette élimination précoce peut limiter la quantité atteignant les tissus à traiter, notamment les tumeurs, tout en favorisant une accumulation hors cible susceptible d’induire des effets indésirables. La nanoparticule lipidique est administrée par voie IV, elle est conçue pour occuper de manière transitoire les voies hépatiques impliquées dans la clairance des médicaments. Cette occupation temporaire vise à augmenter la biodisponibilité systémique des agents administrés secondairement, à favoriser leur accumulation dans les tissus cibles et à réduire leur captation hépatique. Les objectifs de cette étude sont : (1) d’évaluer l’impact de la nanoparticule lipidique sur la biodisponibilité et la distribution hépatique de différents composés thérapeutiques chez des souris saines et/ou porteuses de xénogreffes tumorales ; (2) de caractériser la distribution de la nanoparticule lipidique et des composés associés au sein des principales populations cellulaires hépatiques ; (3) d’analyser l’accessibilité tumorale des composés avec ou sans prétraitement par la nanoparticule lipidique ; (4) d’évaluer l’effet de cette stratégie sur la croissance tumorale. Les résultats attendus permettront de mieux comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans la modulation de la clairance hépatique, d’optimiser les paramètres d’administration (dose, séquence d’injection) et d’identifier un modèle tumoral pertinent ainsi qu’un composé thérapeutique adapté. L’étude, incluant des administrations répétées et une optimisation des modalités de traitement, vise également à répondre aux exigences réglementaires afin de se rapprocher des conditions cliniques d’utilisation.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront d’évaluer l’impact de la nanoparticule lipidique sur la façon dont les agents thérapeutiques se répartissent dans l’organisme, et sur l’amélioration de leur effet antitumoral. À court terme, ils contribueront à une meilleure compréhension du design des nanomédecines et à l’optimisation des modalités d’administration et les caractéristiques des formulations, afin d’améliorer leur efficacité et leur équilibre bénéfice et effets indésirables. À plus long terme, cette stratégie pourrait lever une barrière biologique majeure liée à l’élimination rapide des médicaments par le foie, faciliter l’accès clinique à des molécules prometteuses et améliorer l’efficacité de traitements existants à des doses plus faibles, réduisant ainsi la toxicité pour les patients.

Procédures

Deux injections d’agents thérapeutiques par voie intraveineuse ou une injection intraveineuse et une injection par voie intrapéritonéale seront effectuées sur animaux éveillés (durée 1-4 min). Ce procédé se fera une seule fois (injection unique) ou de façon répétée (une à deux fois par semaine sur une période à définir pouvant aller jusqu’à 3 mois). Examen d’imagerie non invasive sous anesthésie (cinétique sur 30 minutes maximum). Prélèvement sanguin d'un faible volume (1% volume sanguin total) maximum 5 fois par semaine sur animaux éveillés (Durée 1-4 min) ou volume de 7.5% du volume sanguin total une fois par semaine (Durée 1-4 min - Max 12 prélèvements). Injection de cellules tumorale sous cutanée sur animal vigile (une fois - durée 1 min). Une à deux semaines plus tard selon la croissance tumorale, une à deux injections d’agents thérapeutiques par voie intraveineuse ou une injection intraveineuse et une injection par voie intrapéritonéale seront effectuées sur animaux éveillés (durée 1-4 min). Ce procédé se fera une seule fois (injection unique) ou de façon répétée (une fois par semaine sur une période à définir pouvant aller jusqu’à 3 mois).

Impact sur les animaux

La contention des souris peut induire un stress de courte durée. Les injections peuvent entraîner une douleur de courte durée ainsi qu’un stress transitoire. Les anesthésies de courte durée peuvent provoquer une hypothermie limitée et, dans de rares cas, une diminution transitoire de la respiration et/ou du rythme cardiaque. Par ailleurs, la croissance tumorale peut altérer l’état général des animaux, entraîner une gêne liée au volume tumoral et, dans certains cas, s’accompagner de phénomènes de nécrose tumorale. Les souris immunodéficientes présentent une susceptibilité accrue aux infections opportunistes et au stress expérimental. Les procédures peuvent entraîner une altération modérée de l’état général (perte de poids, diminution d’activité, inconfort post-procédure).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour prélèvement du foie

Remplacement

Les modèles in silico reposent sur des équations et des hypothèses dérivées de données biologiques existantes, et ne peuvent donc pas prédire des phénomènes qui n’ont jamais été observés ou correctement paramétrés (ex. interactions spécifiques nanoparticules–foie ou nanoparticules–foie–tumeur, effets du prétraitement sur le microenvironnement vasculaire et immunitaire). De plus, la biodistribution implique des processus complexes à plusieurs niveaux (circulation sanguine, passage à travers les vaisseaux, élimination par le foie, captation par certaines cellules, hétérogénéité tumorale, etc.) qui dépendent de l’organisation tissulaire tridimensionnelle, du système immunitaire fonctionnel et de l’état physiologique global de l’animal, éléments qui ne sont pas intégralement capturables à ce jour par des modèles informatiques seuls. L’utilisation du modèle murin est justifiée par la nécessité d’évaluer la biodistribution de molécules thérapeutiques dans un organisme entier, disposant d’un système vasculaire, immunitaire et hépatique fonctionnel. Les approches in vitro, bien qu’utiles en phase de criblage initial, ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions systémiques impliquées dans l’absorption, la distribution, la métabolisation et l’élimination des composés thérapeutiques. En particulier, la clairance hépatique, la perfusion tissulaire et la contribution des différentes populations cellulaires du foie ne peuvent être étudiées de manière pertinente qu’au sein d’un organisme vivant. Le modèle murin, largement utilisé et bien caractérisé, constitue donc l’option la plus pertinente pour générer des données transposables.

Réduction

Pour limiter le recours aux animaux, les agents thérapeutiques candidats sont d’abord évalués in vitro afin de ne retenir que ceux ne présentant pas de toxicité cellulaire. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé à l’aide d’analyses statistiques adaptées, afin de garantir la soliditéet la fiabilité des résultats, tout en utilisant le nombre minimal d’animaux nécessaire. Par ailleurs, le suivi répété de la répartition des composés chez un même animal au cours du temps (imagerie in vivo) contribue à réduire le nombre d’animaux nécessaires au cours de l’étude

Raffinement

Les animaux bénéficient d’une période d’acclimatation préalable et sont hébergés dans des conditions contrôlées, en groupe, avec un environnement adapté et enrichi, favorisant leur bien-être. Ils sont suivis quotidiennement par du personnel qualifié, incluant le suivi du poids, de l’état général et, le cas échéant, de la croissance tumorale. Un enrichissement adapté à l’espèce sera fourni dans toutes les cages, depuis l’arrivée des animaux jusqu’à la fin de l’étude (ex. : lanières de Kraft, coton). Un vétérinaire sera présent à l’animalerie plusieurs jours par semaine, et des soins vétérinaires d’urgence seront disponibles, y compris en dehors des jours ouvrés. Une attention particulière est portée à l’évaluation de tout signe d’inconfort, de douleur ou de détresse, et des critères d’arrêt anticipé sont appliqués strictement. Une anesthésie est réalisée lorsque nécessaire et le recours à des antalgiques est mis en œuvre afin de limiter la douleur associée aux manipulations. Pour les souris immunodéficientes (nude), l’hébergement se fait en portoirs ventilés et les manipulations sont réalisées dans des conditions d’hygiène renforcées, avec des instruments désinfectés avant utilisation, afin de limiter les risques d’infection.

Choix des espèces

Le modèle murin constitue une référence préclinique pour l’étude de la biodistribution des agents thérapeutiques, en raison de sa physiologie bien caractérisée, de la disponibilité de nombreuses souches génétiquement définies et de la possibilité de réaliser des injections systémiques suivies d’analyses tissulaires détaillées. Deux modèles murins seront utilisés : des souris immunocompétentes et des souris Nude immunodéficientes. Les souris immunocompétentes, dotées d’un système immunitaire fonctionnel, constituent un modèle de référence en pharmacologie et permettent d’étudier les mécanismes de clairance hépatique dans un contexte immunocompétent. Les souris Nude, immunodéficientes en raison de l’absence de thymus, sont couramment utilisées pour les études d’efficacité impliquant des xénogreffes tumorales. Certains agents thérapeutiques de ce projet étant développés pour des applications oncologiques, leur efficacité sera évaluée sur des modèles Nude. La réalisation d’études de biodistribution sur ce même modèle permettra d’assurer la cohérence et la transposabilité des résultats obtenus. Les souris utilisées dans ce projet seront à un stade adulte (entre 7 et 10 semaines) avec un poids minimal de 20 grammes, afin d’évaluer la distribution hépatique des agents thérapeutiques sur des animaux ayant un système immunitaire et des organes développés et matures.

Pour comparer deux schémas d'administration d'une immunothérapie associée à la radiothérapie, 1 740 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe tumorale, des injections d'anticorps et une à trois séances d'irradiation sous anesthésie. L'objectif est de savoir si moins d'injections suffisent à conserver l'effet antitumoral. Parmi les bénéfices avancés figure la réduction du coût des traitements, présentée à côté de l'intérêt pour les patients.

Objectifs

L’objectif principal de ce projet est d’optimiser les modalités d’administration de traitements immunothérapeutiques à base d’anticorps, utilisés seuls ou en association avec la radiothérapie, afin de conserver une efficacité antitumorale satisfaisante tout en réduisant la charge thérapeutique et les effets indésirables pour l’animal. Les traitements par anticorps immunomodulateurs ont montré une efficacité importante en cancérologie, mais leur administration répétée peut être associée à des effets secondaires systémiques et à une augmentation des contraintes expérimentales. Par ailleurs, plusieurs données suggèrent que l’association avec la radiothérapie peut renforcer la réponse immunitaire antitumorale, ce qui soulève la question de la nécessité d’injections répétées pour obtenir un effet optimal. Dans cette étude préclinique, nous comparons deux schémas d’administration avec plusieurs modèles de tumeurs solides afin d’évaluer le contrôle de la croissance tumorale, l’évolution clinique des animaux et les modifications de la réponse immunitaire induites par les différents schémas de traitement.

Bénéfices attendus

Si les hypothèses de travail sont confirmées, ce projet pourrait montrer qu’une réduction du nombre d’administrations d’immunothérapie, lorsqu’elle est combinée à la radiothérapie, permet de conserver une efficacité antitumorale comparable aux schémas standards, tout en limitant les effets indésirables systémiques. Ces résultats pourraient contribuer à l’optimisation des stratégies thérapeutiques combinées en clinique humaine, en favorisant des protocoles plus sûrs et mieux tolérés. Par ailleurs, la diminution du nombre d’injections d’anticorps pourrait également représenter un bénéfice économique important, en réduisant le coût global des traitements immunothérapeutiques. Cet aspect est particulièrement pertinent dans un contexte de généralisation de ces traitements, où leur coût constitue un enjeu majeur pour les systèmes de santé. Enfin, l’identification de schémas d’administration plus courts et plus efficaces pourrait améliorer la compréhension des mécanismes d’activation immunitaire induits par la radiothérapie et aider à mieux définir les conditions nécessaires à une réponse thérapeutique optimale. À terme, ces données pourraient soutenir le développement de stratégies thérapeutiques plus personnalisées et plus durables pour les patients.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : • Injections de cellules tumorales : – une injection pour les modèles à une tumeur ; – deux injections pour les modèles à deux tumeurs ; (durée approximative : 30 secondes par injection). • Traitements par immunothérapie : les anticorps seront administrés par injection intrapéritonéale, tous les 2 ou 3 jours selon le protocole expérimental, pour un maximum de quatre injections par animal (durée approximative : 30 secondes par injection). • Radiothérapie : les animaux recevront une anesthésie générale à l’isoflurane afin d’être placés dans les dispositifs d’irradiation : une séance d’irradiation localisée (n = 1), durée ~12 minutes ; ou (pour un autre modèle) trois séances d’irradiation localisée (n = 3), durée ~12 minutes chacune ; d'autres animaux auront une irradiation corporelle totale : une séance unique, durée ~12 minutes. Prélèvements sanguins : un prélèvement sanguin terminal pourra être réalisé sous anesthésie générale profonde à l’isoflurane, par ponction de la veine sous-mandibulaire, au moment de l’euthanasie (durée approximative : 1 minute).

Impact sur les animaux

L’injection tumorale peut entraîner une gêne mécanique et une diminution d'appétit modérées liée à la croissance tumorale. Les injections d’anticorps peuvent induire un inconfort bref. La radiothérapie, réalisée sous anesthésie générale de courte durée, peut être associée à des effets transitoires tels qu’une fatigue passagère, une diminution temporaire légère de l’appétit ou un érythème local. Les études de toxicité peuvent entraîner des symptômes de garvité modérée tels que perte de poids, hyopthermie et prostration.

Devenir

À l’issue de chaque procédure (injection tumorale, traitement, irradiation), les animaux seront maintenus en vie jusqu’à la fin du suivi expérimental ou jusqu’à l’atteinte des critères de fin humanitaires prédéfinis. Tous les animaux seront ensuite euthanasiés sous anesthésie générale pour la collecte des tissus destinés aux analyses immunologiques, histologiques et moléculaires.

Remplacement

Aucune méthode in vitro ou in silico ne permet actuellement de reproduire de manière fiable l’interaction complexe entre la radiothérapie, l’immunothérapie (anti-PD-1/PD-L1) et le système immunitaire entier. Les modèles cellulaires 2D ou 3D, bien qu’utiles pour des études mécanistiques partielles (cytotoxicité, signalisation), ne peuvent pas refléter la dynamique du microenvironnement tumoral, la réponse immunitaire adaptative ni la toxicité systémique observée in vivo. L’utilisation de modèles murins syngéniques immunocompétents est donc indispensable pour évaluer l’efficacité thérapeutique, la tolérance et les effets immunologiques globaux des traitements combinés. Les animaux seront utilisés uniquement lorsque cela est scientifiquement justifié, et le nombre sera limité au strict nécessaire selon un calcul de puissance statistique. En parallèle, les résultats obtenus pourront contribuer à réduire le recours futur aux modèles animaux en identifiant des schémas thérapeutiques plus courts et plus sûrs.

Réduction

Afin de pouvoir observer des différences qui soient statistiquement interprétables entre les différents groupes de traitements, nous avons besoin d’utiliser des tests statistiques solides et adéquats. Ces tests exigent l’utilisation d’un nombre minimum d’animaux par groupe. Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux à utiliser nous permettant d’atteindre les objectifs du projet, nous avons réalisé une analyse statistique à priori, (avec G*Power) afin de calculer le nombre d’animaux nécessaires pour détecter des différences significatives pour chaque procédure expérimentale. De plus, notre expertise dans le domaine de la radiobiologie ainsi que les données de la littérature nous permettent de réduire les conditions expérimentales et donc réduire le nombre d’animaux. Le critère de jugement principal pour le calcul de puissance est la taille tumorale . De plus, une taille moyenne de 80-100mm3 a été fixée comme critère de démarrage pour randomiser les animaux. La randomisation est réalisée de façon à avoir la même moyenne taille tumorale dans chaque groupe de traitement

Raffinement

Toutes les manipulations expérimentales seront menées en veillant à adhérer aux normes les plus élevées pour minimiser la douleur et le stress chez les animaux. Une anesthésie (isoflurane/Lidocaïne) adéquate sera utilisée pendant les expériences pour soulager ou éliminer la douleur en particulier lors des injections intrapéritonéales. Les conditions d'hébérgement des animaux seront optimisées, en fournissant l'environnement et la nourriture nécessaires. Le comportement et l'état de santé des animaux seront surveillés quotidiennement, pour identifier et traiter toute anomalie. Les souris seront hébergées en groupes sociaux. Une pesée sera effectuée régulièrement. Les points limites précoces seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie et des réponses immunitaires pendant le développement tumoral. De plus, pour des raisons de taille, de prix et de temps nous avons choisi cette espèce. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues et de nombreuses études ont déjà validé des découvertes faites chez la souris en les appliquant pendant des essais cliniques, ce qui promeut et facilite le transfert des résultats obtenus chez la souris en clinique. Les souris seront utilisées à un âge de 7 semaines, ce qui correspond à l’âge adulte, à la fois physiologiquement et immunologiquement. À cet âge, le système immunitaire des souris est pleinement développé, ce qui est essentiel pour des études impliquant des réponses immunitaires. En particulier, les interactions entre les cellules immunitaires et les tumeurs, ainsi que l’évaluation des thérapies immunomodulatrices, nécessitent un système immunitaire mature pour fournir des résultats fiables et transposables. L’utilisation de souris plus jeunes pourrait entraîner des réponses immunitaires immatures, tandis que des souris plus âgées pourraient présenter des modifications immunitaires liées à l’âge, ce qui pourrait biaiser les résultats. Par conséquent, cet âge est idéal pour garantir la pertinence des résultats immunologiques dans le cadre de notre étude