Recherche appliquée

2 500 rongeurs, 2 000 souris et 500 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sur une plateforme d'irradiation ouverte à d'autres équipes. Chaque animal reçoit une ou plusieurs séances d'irradiation sous anesthésie, puis retourne dans son animalerie d'origine, son sort final dépendant du projet qui l'utilise. Le porteur indique que l'irradiation d'une tumeur peut entraîner des nécroses et que l'irradiation du corps entier peut provoquer des douleurs à long terme. Il affirme que le recours à l'animal reste "essentiel" malgré des cultures cellulaires en 2D ou 3D, et justifie le nombre d'animaux par le seul "minimum nécessaire pour assurer une étude statistique".

Objectifs

La radiothérapie est un traitement localisé qui consiste à utiliser des radiations pour détruire les cellules cancéreuses. Les dommages induits par les rayonnements vont bloquer la prolifération cellulaire, tout en préservant le plus possible les zones périphériques saines. A l’heure actuelle, elle est utilisée seule ou en combinaison avec la chirurgie et/ou la chimiothérapie et concerne aujourd’hui 60% des traitements contre le cancer. Ainsi, la radiothérapie représente une technique nécessaire aux équipes de recherche travaillant dans le domaine de la cancérologie pour la compréhension des mécanismes biologiques en jeux et l’amélioration des traitements. Ce projet a pour objectif de permettre l’accès à un équipement de radiothérapie dédié au rongeurs à la communauté scientifique.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans la recherche thérapeutique utilisant l’irradiation pour mieux comprendre les mécanismes en jeux et/ou pour le développement de nouveaux traitements. Ce projet s’inscrit de ce fait dans une volonté de faire progresser les connaissances sur le développement tumoral ainsi que d’améliorer le traitement des patients en augmentant ainsi aussi bien la qualité de vie que leur survie.

Procédures

L’ensemble des animaux sera soumis à une ou plusieurs séances d’irradiation sous anesthésie générale. La durée de l’irradiation avec mise en place, irradiation et retour dans la cage prendra au maximum 30 minutes. L’anesthésie générale durera au maximum 20 minutes et l’irradiation au maximum 15 minutes. Chaque session aura une durée courte et pourra être réitérée au maximum deux fois par jour sur une durée de 1 jour à plusieurs semaines.

Impact sur les animaux

L’irradiation n’induit pas d’effets indésirables directs. Néanmoins, l’irradiation de tumeurs peut induire des nécroses suite à l’évolution de la croissance tumorale post-traitement et l’irradiation totale d’un animal peut aussi induire des douleurs à long terme.

Devenir

Après irradiation chaque animal retournera dans son animalerie d'appartenance. L'issue finale des animaux dépendra de chaque projet et sera détaillée dans chacune des procédures expérimentales présentées dans les demandes de projet.

Remplacement

Nous tacherons dans la mesure du possible d’utiliser des cultures cellulaires en 2D ou 3D (sphéroïdes et organoïdes). Néanmoins, il est nécessaire de valider les résultats obtenus in vivo afin de prendre en compte toute la complexité du vivant et avant de pouvoir faire l’objet d’essai clinique sur l’homme. Ainsi, le recours à l’animal s’avère essentiel pour avancer dans la validation de nouveaux traitements.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est établi afin de correspondre au minimum nécessaire pour assurer une étude statistique.

Raffinement

L’irradiation n’induit pas de souffrance ni de douleur à l’animal pendant et directement après. Les séances d’irradiation seront réalisées sous anesthésie générale de l’animal avec maintien de leur température corporelle. La durée de l’irradiation prendra de 5 à 30 minutes maximum. De l’onguent ophtalmique sera déposé sur les yeux pour éviter leur dessèchement. En cas d’irradiation ciblée, l’animal sera protégé par un bouclier adapté en fonction de la zone à irradier. La structure en charge du bien-être animal accompagnera chaque projet séparément dans sa mise en œuvre avec les conseils du vétérinaire désigné qui prendra les dispositions nécessaires au maintien du bien-être des animaux. Si un animal (rat ou souris) venait à montrer des signes de problèmes respiratoires, il pourrait être euthanasié sur site. Cette procédure ne sera réalisée qu’après accord du porteur du projet.

Choix des espèces

La souris représente l’espèce la plus utilisée en expérimentation en oncologie. La raison la plus importante du choix de la souris est sa similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. Sa petite taille, sa prolificité, les facilités zootechniques, les risques sanitaires moindres et une littérature abondante sont autant d’arguments complémentaires en faveur du choix de cette espèce. Le rat est une alternative à l’utilisation de la souris de par sa taille permettant d’atteindre une maturité de tumeur plus importante nécessaire dans certaines études. Nous utiliserons des rongeurs à différents stades de développement pour couvrir le plus largement les situations rencontrées dans les services cliniques.

45 vaches laitières vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réintégrées au troupeau et susceptibles d'être réutilisées. Trente-six d'entre elles reçoivent une injection de lipopolysaccharide dans un quartier de la mamelle pour déclencher une inflammation, en plus de prises de sang répétées, afin de tester des compléments alimentaires censés prévenir les mammites. Le porteur indique que l'injection provoque une fièvre et une mamelle douloureuse de quatre à douze heures, et qu'aucun analgésique n'est administré car il interférerait avec l'inflammation étudiée. Il affirme que la réponse immunitaire doit être évaluée à l'échelle de "l'animal entier", ce qu'aucun système in vitro ne permettrait.

Objectifs

Les mammites sont parmi les maladies les plus fréquentes en élevage bovin laitier. Elles affectent les performances zootechniques et économiques et sont source de mal-être des animaux. La capacité des bovins laitiers à résister à l'établissement de mammites est liée, en partie, à l'efficacité de leur système immunitaire mais également au fonctionnement du tissu mammaire. Par ailleurs, les vaches laitières sont sujettes à un stress oxydant intense au démarrage de la lactation. Le stress oxydant interfère avec le système de défense immunitaire et peut également entrainer des dommages tissulaires au niveau mammaire. Alimenter les vaches laitières avec des extraits de plantes riches en antioxydant et en d’autres principes actifs susceptibles d’agir directement sur le système immunitaire pourrait permettre d’optimiser le statut immunitaire et antioxydant des vaches laitières et ainsi prévenir les mammites, cliniques ou sub-cliniques. Ainsi, les effets de ces extraits de plantes sur les mécanismes impliqués dans la réponse du système immunitaire et le fonctionnement mammaire méritent d’être objectivés pour permettre le développement de ces solutions sur le terrain. L’objectif de cette étude est de déterminer si des extraits de plantes ou un apport de vitamine E peut agir sur le statut immunitaire et antioxydant de la vache laitière en situation d’épreuve inflammatoire en réduisant le stress oxydant et l’inflammation et en améliorant l’intégrité de l’épithélium mammaire. La supplémentation en vitamine E correspond à une stratégie de prévention des mammites dont les effets ont été objectivés dans la littérature et constitue un témoin positif. Les supplémentations en vitamine E et en extrait de plantes seront comparées à un traitement témoin non supplémenté. Les extraits de plante testés ont vocation à être commercialisés en fermes laitières et à ce titre leur usage répond à toutes les réglementations en vigueur garantissant leur innocuité pour les animaux.

Bénéfices attendus

Les mammites sont le fait d’une pathologie courante en élevage laitier, notamment pendant les premières semaines de lactation. C’est aujourd’hui une des premières causes d’usage des antibiotiques dans ces élevages. L’adoption de stratégies alimentaires de prévention des mammites pourrait être un levier, à associer à d’autres, pour réduire le risque de mammites. Cependant, afin de définir les stratégies les plus efficaces possible, leurs effets méritent d’être objectivés. Le présent projet a pour objectif de mettre en évidence les mécanismes par lesquels ces stratégies peuvent favoriser un fonctionnement adéquate du système immunitaire face à une infection. Les bénéfices attendus sont une réponse inflammatoire améliorée avec les suppléments de vitamine E ou extraits de plantes. Cette réponse sera suivie par la mesure dans le lait des marqueurs de l’inflammation notamment la présence de cellules somatiques et le dosage de molécules de l’inflammation dans le sang et le lait. L’épreuve inflammatoire mise en œuvre dans ce projet peut être qualifiée de mécaniste par rapport à des approches épidémiologiques qui pourraient être une alternative. Elle se traduit par l’implication de peu d’individus dans l’objectif de mesurer l’effet des stratégies ciblées sur un mécanisme en amont de la déclaration des mammites (à savoir la réponse immunitaire) avec l’objectif de généraliser ces résultats. Ces travaux pourront permettre de donner de nouvelles recommandations pour une nutrition préventive des vaches laitières en début de lactation. La substitution des traitements antibiotiques par un ensemble de stratégie de prévention répond au concept de gestion intégrée de la santé aussi bien à destination des animaux, notamment en élevage, que des hommes.

Procédures

Durant ce projet, 45 vaches seront soumises à 2 prises de sang au niveau de la veine de la queue avant leur mise-bas. Parmi ces vaches, 36 seront soumises à l'injection d'un composé inflammatoire (lipopolysaccharide) dans un des quartiers de la mammelle en 5ième semaine de lactation et à 4 prises de sang au niveau de la veine jugulaire, une avant l'injection de LPS, les 3 autres, 4h, 28h et 76h après l'injection. En parallèle, des échantillons de lait seront également prélevés par traite partielle avant l’injection puis 0h, 4h, 7h, 10h, 28h, 52h et 76h après l’injection. L’injection de LPS dans un des quartiers de la mamelle des vaches déclenche une réaction inflammatoire aiguë, mais de courte durée, avec un retour en production des animaux dans la semaine qui suit le déclenchement de la réponse inflammatoire.

Impact sur les animaux

Entre quatre semaines avant la date prévue de vêlage et la fin de la 4ième semaine de lactation, les vaches seront conduites de la même façon que les autres vaches de la ferme, à la seule différente de la nature des stratégies de supplémentation destinées à prévenir les mammites. Le traitement ‘sans supplémentation’ se traduira par la non administration de suppléments alimentaires susceptibles d’aider les vaches à prévenir les maladies infectieuses, ce qui donnera lieu à un suivi rapproché afin de détecter précocement tout signe d’infection et de sortir rapidement les animaux de l’essai pour un traitement adapté. Les doses de vitamine E offertes seront toujours inférieures au maximum tolérable et l’extrait de plante utilisé a été évalué en amont de l’essai pour son absence de nocivité pour les vaches. Lors de cet essai, nous observons aussi les conséquences d’une injection d’un composé pro-inflammatoire dans un quartier de la mamelle. L’injection de lipopolysaccharide dans un des quartiers de la mamelle des vaches déclenche une réaction inflammatoire aiguë, mais de courte durée, avec un retour en production des animaux dans la semaine qui suit le déclenchement de la réponse inflammatoire. Compte-tenu des travaux antérieurs et des données de la littérature, l'injection du composé inflammatoire (LPS) induira une inflammation locale de courte durée (plus de signes locaux d'inflammation 12h après injection) accompagnée d’une fièvre de courte durée (pic de température rectale à 8h post-injection et retour à une température normale 12h post-injection). Le quartier injecté sera douloureux à la palpation entre 4h et 12h post-injection. L’état général, l’intensité de l’inflammation locale et la douleur sont évalués à l’aide d’une grille de notation. L’utilisation d’un médicament pour limiter la douleur (analgésique) n ‘est pas possible en raison de son impact sur le déroulement de l’inflammation. Les animaux seront par ailleurs suivis de près pour détecter dans les jours qui suivent tout cas de pathologie autre que cette injection pourrait masquer. Enfin, les animaux seront soumis à des prélèvements sur animaux vigils. Les prises de sang ne nécessitent qu’une contention minimale, les animaux étant habitués à la contention lors de la distribution des aliments. La douleur causée par l’aiguille ne nécessite pas d’anesthésie.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans ce projet seront réintégrés dans le troupeau des vaches laitières de la ferme expérimentale pour retrouver une vie de vache laitière similaire à celles que l’on peut trouver dans les troupeaux laitiers expérimentaux. Ces animaux sont donc susceptibles d’être réutilisés pour d’autres projets expérimentaux.

Remplacement

Même si des premières études sur cellules en culture ont permis de réaliser une première sélection des extraits de plantes susceptibles de moduler favorablement la réponse immunitaire et dont l’usage en ferme pourrait être envisagé, il n’est pas possible de remplacer entièrement l’utilisation d’animaux pour définir les modes d’actions des extraits de plantes. En particulier, l’amélioration de la réponse immunitaire et du statut antioxydant doit être évalués à l’échelle de l’animal entier afin de prendre en compte à la fois les régulations cellulaires mais aussi systémiques de ces réponses. La méthode proposée permet l'évaluation globale des premières étapes de la réponse au niveau de l’animal entier et permet de ré-introduire les animaux en élevage et donc de les garder en vie.

Réduction

L’objectif est de disposer de résultats sur 12 animaux par stratégie testée. Ce nombre a été évalué pour disposer d’une puissance statistique suffisante compte-tenu que chaque lot de vache ne recevra qu’un des trois traitements au cours de l’expérimentation. L’objectif est de disposer de suffisamment d’animaux pouvant détecter une différence entre les groupes en fonction des traitements et des réponses analysées. L’épreuve inflammatoire nécessitant de disposer d’animaux répondant à deux conditions qui sont difficiles à anticiper, des animaux de réserves (3 par stratégie) vont devoir être inclus. Les deux conditions sont de disposer au moment de l’épreuve de vaches à un même stade de lactation et ayant au moins un quartier de la mamelle avec un très bon niveau sanitaire constaté par une concentration faible de cellules somatiques dans le lait. Selon les dates effectives de vêlage et les résultats d’analyses de lait avant l’épreuve inflammatoire, certaines vaches pourront être remplacées par ces vaches de réserve pour l’épreuve inflammatoire. Des résultats expérimentaux passés permettent d'évaluer que 3 animaux de réserve par stratégie seront suffisants. Au final, le nombre d’animaux impliqués sera donc de 45, dont au maximum 36 seront soumis à l’épreuve. Les données seront analysées par analyse de variance en modèle mixte à l’aide du logiciel R. Nous étudierons l'effet des traitements en mesures répétées avec analyse de l’effet du temps et prise en compte de la vache en effet aléatoire.

Raffinement

La conduite d’élevage sera respectueuse du bien-être des animaux. Un suivi régulier du comportement et des paramètres indicateurs de la souffrance des animaux (fièvre supérieure à 40°C, animal couché faible, et les œdèmes de la mamelle qui engendre une sensibilité importante) sera mis en place pour détecter le plus rapidement possible tout signe de perturbations et traiter si besoin les animaux malades. Les parties du protocole pouvant entraîner de la souffrance chez les animaux sont clairement identifiées (prise de sang et épreuve inflammatoire). Le traitement visant à induire une inflammation dans un quartier de la mamelle est suivi d’une réponse inflammatoire de courte durée avec un retour en production des animaux dans la semaine qui suit le déclenchement de la réponse inflammatoire. L’utilisation d’un composé non infectieux pour le déclenchement de l’inflammation réduit l’intensité de cette inflammation. De plus, contrairement à une infection expérimentale, ce protocole permet de garder les animaux en vie tout en permettant de mimer les premières étapes d’une mammite. Les prises de sang réalisées ne nécessitent qu’une contention minimale, les animaux étant habitués à être contentionnés lors de la distribution des aliments. A la fin de l’essai tous les animaux réintègreront le troupeau de la ferme.

Choix des espèces

La problématique de l’étude, assez spécifique aux vaches laitières, nécessitera de travailler avec cette espèce. Les vaches seront de race Prim’ Holstein. Il s’agit de la race de vache laitière la plus répandue dans le monde. Les résultats de ce projet ont vocation à être diffusés au niveau international. L’incidence des mammites étant la plus forte et de façon nette en début de lactation, de même que le stress oxydatif, les vaches impliquées seront majoritairement en début de lactation.

220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une myopathie génétique liée au gène Bin1, elles subissent des injections dans le muscle ou l'abdomen, des mesures répétées de force musculaire sous anesthésie et des tests de suspension, pour tester une thérapie génique. Le porteur affirme n'attendre aucune douleur liée au phénotype et décrit une atrophie musculaire légère, tout en précisant que les souris sont tuées à la fin pour prélever leurs organes et que la maladie deviendrait sévère si elles étaient gardées vivantes. Il conclut que les cultures cellulaires ne reproduisent pas un "organisme entier" et juge le modèle murin "essentiel".

Objectifs

Les myopathies centronucléaires sont une classe de maladies génétiques qui détériorent la fonction des muscles squelettiques et handicapent fortement la qualité de vie des patients qui en sont atteints et aucune thérapie n’est à ce jour disponible. Le principal objectif de ce projet est de mettre au point une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires liées au gène Bin1. En parallèle nous souhaitons également étudier plus en détail les fonctions des différentes régions de la protéine BIN1 ainsi que ses effets à différentes étapes du développement musculaire.

Bénéfices attendus

Dans l’hypothèse où notre stratégie thérapeutique s’avèrerait efficace sur le phénotype de notre animal modèle, cette étude serait une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires liées au gène Bin1. Ce projet permettra également de faire avancer les connaissances scientifiques relatives aux fonctions des différentes régions de la protéine BIN1 ainsi que ses effets à différentes étapes du développement musculaire.

Procédures

Les 100 souris de la cohorte « Injections intra-musculaires » seront soumises aux procédures suivantes : - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, non-invasive, hebdomadaire de 6 à 12 semaines d’âge, 20min par animal. - Injections intra-musculaires sous anesthésie générale, non-invasive, unique à 8 semaines d’âge, 5min par animal. - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 12 semaines d’âge. Les 120 souris de la cohorte « Injections Intra-péritonéale » seront soumises aux procédures suivantes : - Injection intra-péritonéale, animal vigile, unique au premier jour post-natal, 1min par animal. - Test de suspension, animal vigile, non-invasif, hebdomadaire de 3 à 10 semaines d’âge, 5min par animal. - Test d’actimétrie, animal vigile, non-invasif, unique à 10 semaine d’âge, 24h par animal. - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 10 semaines d’âge.

Impact sur les animaux

Les animaux présentent une légère atrophie et faiblesse musculaire mais qui n’affecte pas leur qualité de vie de manière significative aux âges analysés. Les animaux interagissent, se déplacent et s’alimentent normalement (poids normal). A notre connaissance il n’y a pas de douleurs associées au phénotype myopathique. La pose des électrodes sous-cutanée et l’injection intra-musculaire peux causer une inflammation dans le muscle tibial antérieur.

Devenir

Les animaux sont mis à mort sous anesthésie à la fin des deux procédures expérimentales pour plusieurs raisons : Notre projet nécessite la collection d’organes pour compléter l’analyse au niveau histologique et moléculaire. La myopathie étudiée est progressive et deviendrait potentiellement sévère si les souris étaient maintenues en vie.

Remplacement

Ces analyses ne peuvent pas être effectuées sur des cellules en culture car celles-ci ne reproduisent pas la fonction d’un organe et encore moins d’un organisme entier. En effet seul le modèle animal permet d’étudier d’une part la maladie dans sa globalité et d’autre part l’évolution des symptômes, ce qui est essentiel dans le cadre d’une mise au point de thérapie.

Réduction

Le nombre d’animaux a été basé sur les résultats de précédentes études sur ces mêmes animaux. Il nous permet d’assurer la robustesse statistique des différences entre animaux sains et malades et ainsi d’évaluer correctement l’effet de notre traitement. Afin de limiter le nombre d’animaux de la cohorte d’injections intra-musculaires nous injecterons les deux pattes (muscle tibial antérieur) de chaque animal, l’une avec la solution contrôle et l’autre avec un des traitements. L’utilisation d’un contrôle interne à chaque souris plutôt qu’un groupe de souris contrôles permet de renforcer la puissance statistique en s’affranchissant de la variation inter-groupes et de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Toutes les souris passeront des tests phénotypiques et leurs tissus seront collectés pour compléter l’analyse histologique et moléculaire, nous permettant ainsi de nous affranchir de la création d’une deuxième cohorte pour la collection de tissus. La mesure de la force musculaire in vivo par la procédure non-invasive hebdomadaire nous permet de faire le suivi de chaque animal, ce qui renforce la puissance statistique et nous affranchit de créer une cohorte d’animaux pour chaque semaine d’âge analysée.

Raffinement

Si des difficultés de locomotion apparaissent lors de l’hébergement, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Lors de la procédure de mesure de la force musculaire hebdomadaire, les souris seront anesthésiées afin d’immobiliser l’animal et de prémunir tout stress causé par la procédure. Un gel protecteur oculaire sera appliqué pour prévenir tout inconfort d’assèchement oculaire lors du réveil. Les souris seront observées jusqu’à leur réveil (~5min) pour s’assurer qu’elles sont capables de se déplacer après le test. Lors de la procédure de mesure de la force musculaire sous anesthésie générale , les souris seront anesthésiées afin d’immobiliser l’animal et de prémunir toute douleur lors de l’opération chirurgicale. Durant la procédure les souris seront placées sur une plaque chauffante pour maintenir leur homéostasie thermique et elles seront monitorées en permanence.

Choix des espèces

Pour tester l'éventuelle amélioration thérapeutique, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo sur modèle animal. Nous disposons déjà de plusieurs modèles murins de myopathies avec lesquelles nous avons publié plusieurs études sur les myopathies centronucléaires. Conserver la même espèce animale pour ce projet s’inscrit dans un effort de continuité et de reproductibilité de nos études. Nous prévoyons ainsi de réaliser cette étude sur des lignées de souris déjà disponibles dans nos laboratoires, ces modèles présentent des phénotypes comparables aux symptômes observés chez les patients humains. Enfin, le modèle murin présente l’unique avantage d’être génétiquement très proche de l’homme et facile d’élevage en raison de sa taille et de ses capacités de reproduction. Nous utiliserons ces animaux à des stades très précoces pour étudier l’effet de notre traitement avant l’apparition des symptômes mais également des animaux adultes pour étudier cet effet après l’apparition des symptômes.

40 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces rats porteurs de la dystrophie musculaire de Duchenne reçoivent 26 injections sur douze semaines et deux prélèvements de sang au sinus de l'œil sous anesthésie, et passent des mesures de force et de fonction cardiaque, pour tester un composé censé renforcer la membrane des fibres musculaires. Le porteur indique que la maladie provoque spontanément une perte de masse et un comportement de "freezing", une immobilité inhabituelle, et que tous les rats sont tués pour les analyses. Il affirme que cette question ne peut être tranchée que chez l'animal vivant, le rat reproduisant la maladie "beaucoup plus fidèlement" que la souris.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie génétique rare qui touche un garçon sur 3500 à la naissance. Le pronostic de la DMD est très sombre et les jeunes patients meurent prématurément d'insuffisance cardiorespiratoire, en raison de l'absence de la protéine dystrophine dans les muscles striés. La dystrophine connecte l’intérieur de la fibre musculaire à la matrice moléculaire à l’extérieur de la fibre. En l'absence de dystrophine, les fibres musculaires sont affaiblies et fragiles, au point de rompre lors d’une contraction musculaire qui agit comme un stress mécanique. Cela conduit à des cycles répétitifs de régénération et de dégénérescence des fibres, accompagnés d'une inflammation chronique douloureuse, d’une fibrose et d’une perte permanente des fibres musculaires par épuisement de la capacité régénérative des cellules souches. Dans les muscles squelettiques et cardiaque, la liaison à la matrice se fait essentiellement via une protéine appelée intégrine. En condition DMD, les intégrines sont surexprimées par un mécanisme compensatoire. La présence massive d'intégrines à la surface de la fibre musculaire favorise le relarguage de molécule de l’inflammation, à l’origine d’une boucle vicieuse favorisant la fibrose. La stratégie pharmacologique proposée ici consiste à exploiter la présence des nombreuses molécules d'intégrines à la surface des fibres musculaires DMD. L'objectif du projet est d'activer les molécules d'intégrines par une modification de leur forme induite par la fixation spécifique du composé testé. On sait que l'activation des intégrines promeut leur fixation aux molécules de la matrice extracellulaire. Nous posons l'hypothèse que sur notre modèle de DMD, la fragilité de la membrane cellulaire des fibres musculaires initialement induite par la déficience en dystrophine sera compensée par une stabilité renforcée de la membrane, résultant de sa connexion avec la matrice qui agit comme une gaine externe protectrice, avec pour conséquence de réduire la mort des fibres musculaires et pour conséquence fonctionnelle d'accroître le nombre de fibres musculaires actives et ainsi, la force du muscle.

Bénéfices attendus

Notre laboratoire vise à mieux caractériser les mécanismes de la DMD pour les contrer via des thérapies innovantes que nous testons sur un modèle de rat qui mime fidèlement la sévérité de la maladie de l'enfant. Nous proposons ici de traiter des rats malades avec un composé mimant l'activation d’un mécanisme protecteur de la membrane des fibres musculaires, dont nous espérons qu'il améliorera le fonctionnement de l'ensemble des muscles du rat. Ce composé agit en facilitant la résistance de la membrane protectrice qui entoure les fibres musculaires, réduisant ainsi leur mort qui est toujours accompagnée d’une inflammation douloureuse. Le composé réduit aussi la fibrose du muscle, accélérant la récupération motrice. Nous projetons ainsi d'identifier une piste innovante qui pourrait devenir un traitement utilisable chez l’enfant en complément des outils de thérapie génique en cours de développement.

Procédures

Les animaux vigiles sont injectés deux fois par voie sous-cutanée pour induire l'anesthésie/analgésie préalable au prélèvement sanguin (au démarrage de la procédure puis en fin de procédure). Ils sont injectés par voie sous-cutanée pour recevoir le traitement ou le contrôle 2 fois par semaine pendant 12 semaines. Au total, chaque rat recevra 26 injections, chacune d'une durée maximale de 2 minutes, réalisée par une personne très expérimentée et soucieuse de réduire l'impact négatif pour l'animal. L'injection sera réalisée plutôt au début ou en fin de journée pour éviter de réveiller l'animal. Les animaux seront également prélevés deux fois au sinus rétro-orbitaire pour obtenir du sang permettant d'évaluer le bénéfice espéré de la thérapie (biomarqueurs), sous anesthésie générale et locale. La séquence de prélèvement dure au total 1 heure (jusqu'au réveil). Le prélèvement lui-même dure moins de 30 secondes. La durée d'un enregistrement ECG est de 15 minutes. La durée d'un enregistrement pléthysmographie est de 30 minutes. La durée d'une séquence de grip test est de 20 minutes. La durée d'un enregistrement de force est de 90 minutes, anesthésie comprise. Il n'y a pas de chirurgie prévue.

Impact sur les animaux

Il a été montré que le produit administré à une dose 3 fois supérieure à celle que nous administrerons n’est pas toxique chez le rat. Les rats DMD développent spontanément une dystrophie musculaire caractérisée par une perte significative et progressive de masse corporelle. On assiste par ailleurs à un comportement de "freezing" chez les animaux, caractérisé par une absence de mouvements chez les animaux qui semblent se reposer plus que leurs congénères non atteints. Ce "freezing" survient par exemple lorsqu'on prend un animal dans les mains et qu'on le remet dans sa cage. Nous connaissons bien cette évolution de la maladie et ces comportements parfois atypiques, ce qui nous permet de les repérer immédiatement quand ils surviennent. Cela garantit une surveillance très rigoureuse et rapprochée des animaux. Une zootechnicienne est dédiée à cette surveillance. Par expérience des derniers mois, nous n'avons pas à intervenir sur des animaux avant l'âge de 6 mois. La procédure de ce projet inclut des animaux chez lesquels les nuisances de l'évolution spontanée de la maladie sont très limitées et ne semblent pas, en milieu confiné, poser de problèmes particuliers, facilement gérables.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques, cellulaires et moléculaires nécessaires. Tous les animaux, même morts précocement au cours de la procédure, pourront être inclus pour les analyses prévues.

Remplacement

L'efficacité du composé testé sur l’activation des intégrines a déjà été confirmée in vitro et sur des modèles de souris. Sur ces bases robustes, nous souhaitons avec ce projet répondre à la question qui ne peut être obtenue que chez l'animal vivant avec l'ensemble de ses organes en interrelation constante : l’action du composé permet-elle de protéger suffisamment la membrane de la fibre musculaire pour que la masse des muscles des rats DMD traités augmente, que cela confère un bénéfice fonctionnel quantifiable à l’échelle du cœur et des muscles squelettiques, associée à une diminution également quantifiable du remodelage délétère à l’échelle histologique ?

Réduction

Nous avons accumulé beaucoup d'expérience sur les lots de rats DMD traités avec des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Pour certaines de ces études, nous sommes en train de rédiger les conclusions et avons déjà réalisé les analyses statistiques. Il apparaît que pour chacun des groupes, traiter 6 rats permet d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution fatale de la maladie. Par ailleurs, en raison de ce nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sauvages (wildtype, WT) et DMD traités avec un placebo, nous avons accumulé des données nombreuses qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères sauvages. Il est donc possible de réduire les cohortes de ces animaux. Au bilan, chacun des groupes a pu être réduit à 6 animaux.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la réglementation. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à 7 ou 8 ratons par cage à l'âge d'un mois. Puis nous réduisons ce nombre progressivement jusqu'à atteindre 3 rats par cage pour les animaux de plus de 600g. L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice et en cas d'absence de bénéfice (maladie irréversible), nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l'humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les récents outils d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Notre nouveau modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle historique de la souris, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle du chien dystrophique. En médecine translationnelle, il s'insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d'environnement, format). Les muscles des animaux âgés d’un à 6 mois sont affectés par la maladie. Il est donc attendu que les différences entre animaux WT et DMD seront marquées et instructives, et que l'évaluation de l'efficacité du composé testé sera pertinente puisqu'intervenant à un moment où la déviation de la trajectoire fibrotique permettra une moindre myonécrose, facilement quantifiable.

2 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur implante des électrodes dans le cerveau, puis des stimulations électriques répétées de l'amygdale provoquent des crises d'épilepsie, pour tester des molécules antiépileptiques développées par des industriels du médicament. Le porteur indique que ces stimulations quotidiennes peuvent induire un stress accru et une absence de prise de poids, et que l'hébergement en cage individuelle peut aggraver ce stress. Il affirme qu'aucun modèle alternatif ne reproduit les circuits neuronaux impliqués et que les tests sur l'animal vivant sont "indispensables" avant toute mise sur le marché.

Objectifs

Les désordres épileptiques représentent l’une des atteintes cérébrales les plus importantes avec une incidence de 0.6 % de la population mondiale. Malgré le développement de plusieurs antiépileptiques ces 30 dernières années, plus de 30% des patients épileptiques n’ont pas leur épilepsie contrôlée par ces traitements qui provoquent de plus de nombreux effets secondaires. Il est donc critique de développer de nouvelles molécules antiépileptiques afin de traiter les patients résistants aux traitements déjà existants et d’améliorer le contrôle de la maladie et la qualité de vie des patients. Ce projet a pour but de tester, sélectionner et valider de nouvelles molécules développées par les professionnels du médicament dans un modèle de rat mimant une épilepsie chronique focale secondairement généralisée. Cette approche repose sur la stimulation électrique répétée afin de reproduire les principales caractéristiques électrophysiologiques d’une forme d’épilepsie humaine : l’épilepsie du lobe temporal. Des études pharmacologiques ont montré l’utilité de ce modèle reposant sur la méthode de l’embrasement, pour le criblage de molécules grâce à la bonne stabilité du modèle une fois établi . Il apparait donc comme un modèle pertinent pour la sélection et la validation de nouvelles molécules antiépileptiques. Ce projet facilitera le développement de nouvelles molécules antiépileptiques plus efficaces et ayant moins d’effets secondaires pour des patients souffrant d’épilepsies non contrôlées efficacement par les traitements actuels.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à aider les industriels du médicament à identifier, sélectionner et valider de nouvelles molécules antiépileptiques afin de palier au manque d’alternatives thérapeutiques disponibles. L’utilisation du modèle de rat embrasé pourrait également permettre d’identifier des cibles potentiellement impliquées dans la génération et/ou la propagation des crises d’épilepsie. Ce projet ajoute une analyse électrophysiologique (en sus de l’évaluation comportementale classiquement décrite) de l’effet sur ce modèle d’épilepsie des molécules testées en caractérisant notamment : les durées, latences d’apparition et amplitudes des crises, et les variations potentielles de seuil d’excitabilité des réseaux observés. Une attention particulière sera portée sur l’effet sur la généralisation ou non des crises induites par la stimulation. L’utilisation de ce modèle dans ce projet pourrait donc permettre d’identifier le potentiel thérapeutique de nouveaux traitements antiépileptiques ou bien leur capacité à ralentir voire arrêter la phase d’épileptogénèse.

Procédures

L’ensemble des animaux de ce projet vont subir une chirurgie d’implantation d’électrodes corticales et sous-corticales, procédure réalisée sous anesthésie générale. Puis des stimulations électriques amygdaliennes de faible intensité et de courte durée (1s) seront réalisées sur l’animal vigile. Une stimulation quotidienne (5 jours sur 7) sera appliquée pendant la phase d’établissement du modèle (2 à 4 semaines). Lors des tests pharmacologiques en aïgu, une administration sur animal vigile maintenu en contention précèdera la stimulation. Ces administrations seront espacées de 72h minimum et ne pourront pas excéder le nombre de 20. Lors des tests pharmacologiques en administration chronique, les injections peuvent être réalisées jusqu’à trois fois par jour, sur une durée maximum de 28 jours. Quatre lots de 25 animaux pourront être implantés avec une pompe osmotique sous anesthésie générale, permettant une administration continue des molécules testées. Lors des protocoles de tests pharmacologiques, 4 stimulations électriques maximum auront lieu dans la même journée, deux fois par semaine maximum. En fin d’étude, selon la demande des clients, les animaux subiront une perfusion intracardiaque sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Ce modèle animal implique l’utilisation de stimulations électriques répétées permettant d’abaisser progressivement le seuil d’excitabilité cérébrale. L’intensité de stimulation est progressivement augmentée jusqu’à générer les premières crises épileptiques détectées sur le signal électroencéphalographique. Une fois cette intensité fixée par animal, elle est maintenue pour l’ensemble des stimulations appliquées par la suite. L’animal va présenter à chaque stimulation un ou plusieurs des signes décrits par l’échelle d’évaluation comportementale (échelle de Racine) : ces effets sont observés sur un cours laps de temps uniquement dans les minutes post-stimulation (maximum 2 minutes). En dehors de cette courte période, les animaux ne présentent pas de crises ni de comportements anormaux observables. L’amygdale basolatérale est impliquée dans les mécanismes de défense et les comportements de fuite chez les rongeurs, il est donc envisageable que la stimulation de cette zone aie un impact émotionnel sur l’animal, même si ce potentiel effet n’est pas décrit dans la littérature sur ce modèle. Au cours de la phase de génération du modèle (~15 jours), ces stimulations quotidiennes peuvent induire un stress accru et une absence de prise de poids. De plus, la nécessité d’hébergement en cage individuelle des animaux (afin de préserver l’intégrité des systèmes d’enregistrement) peut potentiellement exacerber ce stress. Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tout test de composé sur nos animaux, certains effets indésirables non attendus peuvent survenir, notamment une myorelaxation, une sommnolence ou à l’inverse des myoclonies du fait des mécanismes d’action des molécules testées.

Devenir

Ce projet implique l’implantation de dispositifs de stimulation et d’enregistrement de signaux électroenécephalographiques et la mise en place d’un modèle pathologique. De plus, dans certains cas, une vérification d’exposition aux molécules testées et une caractérisation histologique des tissus cérébraux seront nécessaires. Les animaux seront donc tous mis à mort à la fin du projet.

Remplacement

Ce projet a pour but de démontrer l’efficacité de molécules à la fois sur l’épileptogénèse et sur la génération de crises épileptiques. Actuellement, il n’existe aucune alternative in vitro ou modèle computationnel reproduisant les circuits neuronaux impliqués dans leur globalité et pouvant se substituer à ce modèle. De plus, toute demande de mise sur le marché nécessite de prouver l’innocuité et l’efficacité de la molécule testée, les tests in vivo préalables aux essais cliniques sont dans ce contexte indispensables. L’utilisation d’un organisme vivant est donc nécessaire.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en préservant la validité scientifique des expériences menées. Les protocoles d’études sont basés sur des procédures d’études cliniques en utilisant un plan d’étude croisé permettant de réduire le nombre d’animaux et d’augmenter la puissance statistique puisque chaque animal est son propre contrôle. Un nombre minimum final de 16 animaux pour les protocoles pharmacologiques est nécessaire pour obtenir des résultats fiables.

Raffinement

Le projet implique la mise en place d’un état pathologique chez le rongeur avec une stimulation électrique répétée de classe modérée. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et l’état général de l’animal. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soins sont optimisées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux. Le poids des animaux est également contrôlé de manière continue et hebdomadaire. Les animaux sont hébergés dans des cages individuelles contenant un enrichissement composé de briquettes en bois, de nichoirs en papier kraft et de bâtonets en nylon dédiés spécifiquement aux rongeurs. Afin de minimiser la détresse sociale liée à l’isolement, les animaux sont régulièrement regroupés dans une grande enceinte avec différents éléments (tunnels, briquettes en bois, objets divers). Cette étape d’enrichissement social est réalisée au moins une fois par semaine sous la supervision d’un membre du laboratoire afin d’éviter tout endomagement des dispositifs d’enregistrement.

Choix des espèces

Les modèles animaux sont indispensables pour avancer la compréhension des épilepsies. De précédentes études ont montré la très bonne sensibilité des rats vis-à-vis des protocoles d’embrasement afin de modéliser l’épilepsie humaine. Les activités neurologiques visibles sur les signaux électroencéphalographiques ont des profils similaires à ceux observés chez les patients souffrant d’épilepsie- : début et fin abruptes, oscillations rapides et régulières. Les tests pharmacologiques montrent les sensibilités aux mêmes drogues : suppression ou réduction des crises avec le valproate, le diazepam et l’éthosuximide. Des rats adultes de 5 à 7 semaines seront utilisés dans ce projet. Les procédures seront réalisées au minimum une semaine après l’arrivée des animaux dans notre établissement. L’implantation des électrodes corticales et profondes impose l’utilisation d’un cerveau mature afin que le positionnement des électrodes soit correct, que les connections neuronales soient bien établies et que les animaux puissent récupérer facilement de la chirurgie.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans le cerveau, par chirurgie stéréotaxique, une forme agrégée d'alpha-synucléine qui déclenche une maladie proche de la maladie de Parkinson. Le porteur indique que cette inoculation conduirait de toute façon à la mort par paralysie progressive, et que les souris sont tuées dès l'apparition d'une démarche saccadée et de troubles de l'équilibre, avant la paralysie du train arrière. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet aujourd'hui de remplacer l'expérimentation animale pour décrire l'extension de ces lésions.

Objectifs

Le projet vise à caractériser la maladie chez la souris génétiquement modifiée M83 après injection dans le cerveau d’une forme particulière d’alpha-synucléine agrégée, non détéctable par les méthodes de laboratoire jusqu'à présent utilisées. L’alpha-synucléine est la protéine majoritaire dans les lésions des maladies humaines assocciées (maladie de Parkinson et démence à corps de Lewy , atrophie multisystématisée), au sein desquelles elle se présente sous une forme agrégée.

Bénéfices attendus

Le projet vise à mieux connaître les relations entre les structures moléculaires de l’alpha-synucléine agrégée et les maladies associées à cette agrégation, par la description approfondie des lésions et des caractéristiques moléculaires observées chez les souris.

Procédures

Les souris font l’objet d’une inoculation par stéréotaxie dans le cerveau de jeunes souris M83 (6-8 semaines) réalisée sous anesthésie générale et locale chez les 40 animaux prévus dans l’étude. L’intervention chirugicale dure 30 à 45 minutes.

Impact sur les animaux

L’inoculation d’alpha-synucléine agrégée est réalisée afin de mesurer le délai d’apparition des premiers signes cliniques moteurs, premier élément de caractérisation dans ce type d’étude. Ceux-ci se manifestent par une démarche saccadée de l’animal et une perte d’équilibre. La confirmation de ces anomalies de locomotion détermine la décision de mise à mort des animaux, avant la survenue d’une paralysie du train postérieur.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin du protocole d’expérimentation. En effet, l’inoculation d’alpha-synucléine altérée chez les souris modifiées génétiquement M83 utilisées dans ce projet conduirait irrémédiablement à leur mort suite à la progression d’une paralysie, et leur mise à mort dès l’apparition des premiers symptômes permet de leur éviter des souffrances ultérieures.

Remplacement

Le projet ne peut être réalisé qu’in vivo, visant à évaluer le délai d’apparition des symptomes moteurs et à décrire l’extension des lésions et les altérations de l’alpha-synucléine. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative permettant de remplacer l’expérimentation animale.

Réduction

Les lots expérimentaux conduits jusqu’au stade clinique sont constitués chacun de 14 souris adultes, mâles et femelles, homozygotes et hémizygotes. Cet effectif permet de disposer du nombre d’animaux nécessaire et suffisant aux travaux de caractérisation fondés sur l’examen de la durée d'incubation de la maladie, de la distribution des lésions dans les différentes régions du cerveau et de la caractérisation biochimique de l’alpha-synucléine pathologique. Un lot de 14 souris permet de disposer d’au moins 6 souris, pour les analyses biochimiques et d’au moins 6 souris pour les analyses des lésions du cerveau, prélevés lorsque la maladie apparaît chez la souris. Les autres prélèvements (yeux, intestin, pancréas, sang) contribuent aux travaux menés au laboratoire sur les marqueurs périphériques de la maladie dans ce modèle transgénique.

Raffinement

Pour les inoculations par voie stéréotaxique, l’anesthésie de la peau est réalisée afin de limiter la douleur du scalp. Ceci est réalisé dans le contexte d’un animal par ailleurs soumis à une anesthésie générale par la xylazine/kétamine dont le temps d’action est estimé à 4-5 h, permettant aussi de limiter la douleur post-opératoire. Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi pendant toute la durée de l’expérimentation. Les souris sont suivies quotidiennement et de façon individuelle lorsque la maladie apparaît dans le lot expérimental. La maladie se manifeste d'abord par des signes de démarche saccadée et des troubles de l’équilibre dont la manifestation constitue le stade auquel les animaux sont mis à mort. La connaissance des zootechniciens concernant la symptomatologie et son évolution permet ainsi d’éviter que ces troubles évoluent vers une paralysie du train postérieur qui entraînerait des difficultés d’alimentation et un mal-être chez la souris. Une fiche individuelle de suivi pour chaque souris est renseignée, consignant les signes cliniques observés et justifiant la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Le projet prévoit des inoculations dans le cerveau chez des souris adultes, âgées de 6 à 8 semaines, permettant l’inoculation stéréotaxique des fibrilles dans le striatum, qui sont ensuite entretenues et surveillées cliniquement jusqu’à l’apparition de la maladie avant son délai d’apparition normale lors du vieillissement spontané de cette lignée, lors de laquelle les souris sont mises à mort sous anesthésie générale par ponction ou perfusion intra-cardiaque sans réveil.