Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Effet d’inhibiteurs de nécrose programmée sur l’intoxication au paracétamol chez la souris_avenant2
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1 088 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un surdosage de paracétamol par injection pour provoquer une atteinte du foie, puis sont tuées par dislocation cervicale afin de prélever foie, rate et reins. Le porteur affirme que le surdosage entraîne un inconfort mais aucune douleur dans les vingt-quatre heures. Sur le remplacement, il affirme que l'intoxication au paracétamol est un processus complexe non modélisable in vitro et une étape préclinique "indispensable".
Objectifs
Ce projet a pour objectif de trouver de nouveaux traitements de l'insuffisance hépatique induite par le paracétamol.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait aboutir à la mise en place de nouveaux traitements de l'intoxication au paracétamol basés sur l'utilisation de la N-Acétyl Cystéine et d'inhibiteurs de nécrose régulée.
Procédures
Deux injections intrapéritonéales pour procédure 1 "Traitement par le paracétamol et les inhibiteurs", une injection intrapéritonéale et une injection intraveineuse par voie rétro-orbitale sous anesthésie isoflurane pour procédure 2 "Traitement par le paracétamol par voie intrapéritonéale et par l’inhibiteur par voie intraveineuse", et un prélèvement de sang par voie rétro-orbitale avant sacrifice par dislocation cervicale.
Impact sur les animaux
Le traitement par un surdosage contrôlé de paracétamol entraine certes un inconfort des animaux mais il n’est pas accompagné de douleurs dans les 24h qui suivent son injection (actions antalgique et antipyrétique du paracétamol).
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie après la procédure n° 1 "Traitement par le paracétamol et les inhibiteurs" (soit 960 souris) ou la procédure n° 2 "Traitement par le paracétamol par voie intrapéritonéale et par l’inhibiteur par voie intraveineuse" (soit 128 souris). Tous les animaux (1088 souris) sont mis à mort après la procédure n°3 "Prélèvement du sang par voie rétro-orbitale" afin de prélever les différents organes (rate foie et reins) pour les analyses.
Remplacement
S’il est vrai que certaines questions peuvent être abordées grâce à la culture d’hépatocytes, celle posée dans notre projet cherche à identifier le rôle protecteur d’une molécule vis-à-vis d’une pathologie, l’intoxication au paracétamol qui implique un grand nombre d’évènements moléculaires et cellulaires. Cette pathologie est un processus complexe non modélisable in vitro. Enfin, cette étude préclinique est une étape pré-requise indispensable avant de futures études cliniques chez l’homme.
Réduction
Le nombre de souris engagées (1088) dans ces expériences a été réduit au minimum pour permettre une validation des résultats statistiques par des tests non paramétriques Kruskal-Wallis, Mann et Whitney et Spearman.
Raffinement
L’étude a été raffinée au mieux en privilégiant un traitement de courte durée permettant à la fois la mesure des paramètres d'évaluation de l'hépatite et limitant le développement de douleurs et malaise induits par le traitement. Enfin nous avons anticipé l’étude de tous les organes pertinents (3) qui permettront une étude complète de la pathologie et des molécules pour un maximum d’informations.
Choix des espèces
Cette espèce permet de modéliser ce qui se passe dans une pathologie sur des temps raccourcis à l’échelle de vie de cette espèce. Elle permet d’étudier les phénomènes en cinétique de la physiopathologie et de tester l’effet de petites molécules chimiques pour la prévention et/ou thérapie de la pathologie. Adulte de 9 semaines pour avoir des animaux avec une fonction hépatique normale et pour étudier une pathologie qui affecte surtout des adultes.
Etudes cliniques, pathologiques et virologiques de l’infection de SRAS-CoV-2 chez deux modèles de rongeurs. Evaluation de traitements thérapeutiques et vaccinaux.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Hamsters dorés : 1000
2 000 souris et hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par le SRAS-CoV-2 par voie nasale sous anesthésie puis reçoivent des traitements ou des vaccins, l'infection étant létale chez la souris transgénique hACE2 avec atteinte du système nerveux central. Le porteur indique que la mise à mort est imposée par la gestion du risque lié à l'agent pathogène. Il présente cette recherche sur modèles animaux comme "essentielle" à la gestion de la crise sanitaire.
Objectifs
Depuis fin 2020, la COVID-19 évolue par vagues épidémiques et l’émergence de variants préoccupants de SRAS- CoV-2 requiert dans l’urgence de nouvelles données scientifiques. Dans ce contexte, l’apport de la recherche utilisant des espèces animales modèles est essentiel à la gestion de la crise sanitaire. De nouveaux besoins urgents de recherche sont apparus en lien avec l’apparition de formes symptomatiques longues de la maladie et l’émergence des variants préoccupants du SRAS-CoV-2. Le présent projet a pour objectifs (i) l’étude de la physiopathologie des infections à SRAS-CoV-2 et ses variants et ce, principalement, au niveau de l’épithélium respiratoire des rongeurs modèles de la COVID-19, (ii) une meilleure compréhension de la diffusion et de la multiplication du SRAS-CoV-2 et ses variants dans les tissus (immunité croisée, transmissibilité, réinfection) et (iii) l’évaluation de vaccins, en particulier muqueux, et d’approches thérapeutiques adaptés à l’évolution épidémiologique des infections à SRAS-CoV-2.
Bénéfices attendus
L’étude chez le rongeur des infections à SRAS-CoV-2 et des stratégies de prévention et/ou de contrôle est déterminante pour l’élaboration de stratégie de lutte contre la pandémie de COVID-19. Ce projet s’inscrit dans une démarche de sciences appliquées au domaine médical en lien avec les déclarations d’intérêt, d’urgence ou de priorité nationale du gouvernement et des organismes publics de recherche.
Procédures
L’inoculation de la souche virale est réalisée en 8 minutes, par voie nasale sous anesthésie à l’isoflurane, en prise unique. Les traitements (thérapeutiques ou vaccinaux) sont administrés en 2 minutes, par voie sous-cutanée, intrapéritonéale, intramusculaire à l’animal vigile. Le traitement par voie nasale est administré en 8 minutes sous anesthésie à l’isoflurane. Des analyses sérologiques seront réalisées au cours des essais vaccinaux. Tous les animaux seront prélevés au plus 3 fois lors de la phase d’immunisation : avant chaque vaccination (au maximum 2) et avant l’administration de la souche virale d’épreuve. Les prélèvements seront réalisés en 10 minutes, au sinus rétro-orbital sur animal anesthésié. Le volume de sang prélevé est de 100 à 300 μl selon l’espèce.
Impact sur les animaux
Dans les conditions expérimentales les plus défavorables, l’infection du hamster doré par le SRAS-CoV-2 se traduit par une perte de poids transitoire d’environ 10%. L’animal infecté contrôle l’expression pulmonaire de la maladie au bout du septième jour de l’infection. En revanche, dans les mêmes conditions, l’infection est létale chez la souris transgénique hACE2 à 7 jours post-infection avec une perte de poids et une infection du système nerveux central conduisant à une chute de l’activité motrice et des capacités respiratoires. Cette lignée de souris est la seule à ce jour qui présente une létalité. L’impact physiopathologique de l’infection des autres lignées de souris utilisées dans ce projet sera systématiquement évalué. Il a été observé que l’infection de souris non transgéniques pour hACE2 par la souche murinisée MACo3 entraîne des symptômes légers ou modérés.
Devenir
La mise à mort des animaux est requise au regard de la gestion du risque d’exposition de l’agent pathogène de groupe III utilisé dans cette procédure.
Remplacement
L’étude de la physiopathologie de l’infection ne peut être menée sans avoir recours à l’administration de l’agent pathogène à l’animal vivant. En revanche, les stratégies vaccinales et thérapeutiques sont validées préalablement sur des modèles d’infection utilisant des lignées cellulaires appropriées (cellules VeroE6 ou Calu3). L’effet du traitement antiviral sur la multiplication du SRAS-CoV-2 ainsi que le choix de l’antigène vaccinal sont ainsi entérinés par des analyses in vitro. Les essais vaccinaux et thérapeutiques sont ensuite réalisés chez l’animal dans les meilleures conditions possibles afin d’évaluer l'innocuité et l’efficacité du traitement.
Réduction
Les modèles d’infection à SRAS-CoV-2 chez les rongeurs sont validés et totalement maîtrisés. L’utilisation de la souche historique française dénommée D614G définit les conditions standard des protocoles expérimentaux auxquelles se réfèrent l’étude des variants préoccupants ou VoC. Nous disposons d’un protocole d’administration de souches virales présentant des conditions de Répétabilité et Reproductibilité satisfaisantes. La comparaison des traitements s’établit à l’aide de tests non paramétriques (Mann-Whitney).
Raffinement
Nous nous sommes employés à définir les conditions optimales d’hébergement des hamsters dorés. L’observation du comportement du hamster, d’une part, et l’adaptation des méthodes d’anesthésie, de contention et des gestes techniques à l’animal, d’autre part, garantissent une bonne prise en compte du principe de raffinement. Notre expérience du modèle souris a été également mise à profit pour aborder la question du raffinement : enrichissement et habituation de l’animal à la manipulation. La bonne connaissance du modèle infectieux sur lequel repose ce projet permet de limiter les souffrances ressenties par les animaux au cours des procédures expérimentales. Les hamsters sont hébergés individuellement et les souris par 5 dans des portoirs ventilés, avec à leur disposition du matériel de nidification (coton), des tunnels et des maisonnettes en carton ainsi que des bûchettes de bois à ronger.
Choix des espèces
Le hamster doré est naturellement sensible aux infections à SRAS-CoV-2 et représente un modèle de choix pour étudier la COVID-19. Ce modèle restitue naturellement la physiopathologie humaine de la COVID-19. Les signes cliniques sont transitoires, l’animal contrôlant naturellement l’infection. La souris transgénique K18 ou KI exprime le récepteur humain ACE2 au SRAS-CoV-2 et permet le développement clinique et virologique des infections à SRAS-CoV-2. La souris non transgénique pour hACE2 est sensible à l’infection par la souche murinisée MACo3 et présente l’avantage de pouvoir envisager l’emploi de souris génétiquement modifiée pour un gène d’intérêt (surexpression ou suppression) nécessaire à l’exploration des mécanismes biologiques impliqués dans la susceptibilité ou la défense de l’hôte vis-à-vis de l’infection virale. Les animaux utilisés dans ce projet seront des hamsters ou des souris de 6 à 8 semaines d’âge. Mais des hamsters plus âgés (> 6 mois) pourraient être enrôlés dans des études spécifiques selon l’évolution des connaissances.
Criblage chez le rat (Rattus norvegicus) d’un nouveau groupe de molécules (inhibiteurs présynaptiques) dans le traitement des maladies de la contraction musculaire.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
1 062 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent une injection dans le muscle puis sont soumis au test du digit abduction score pour mesurer l'effet myorelaxant de nouvelles molécules, avant d'être tués pour prélever les muscles. Le porteur qualifie ce test de bref, indolore et peu stressant, tout en signalant une douleur liée à l'injection. Sur le remplacement, il affirme que les modèles de co-culture cellulaire restent d'une pertinence débattue et ne reproduisent pas la diffusion dans le muscle.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de caractériser une nouvelle génération de produits potentiellement d’intérêt identifiés récemment Cette étude a pour objectif de caractériser le pouvoir myorelaxant de nouvelles molécules ; ces molécules ont été décrites dans la littérature scientifique, notamment en termes d’efficacité in vitro sur les cellules cibles (IC50). Dans cette étude, le produit sera injecté localement aux rats, dans les membres postérieurs pour un suivi de de la tolérance sur un petit nombre d’animaux dans un premier temps. Puis dans un second temps, nous réaliserons un suivi du « digit abduction score » (DAS). Cette procédure (injection et test DAS) est brève, indolore, et peu stressante pour les animaux. Nos produits seront comparés au traitement actuel de référence afin de s’assurer de leur bénéfice.
Bénéfices attendus
Les troubles du mouvement sont des maladies neuromusculaires, qui handicapent durablement les patients et ont donc un impact sociétal important. La dystonie, par exemple, est un trouble qui se caractérise par des contractions musculaires involontaires, pouvant entrainer des mouvements répétitifs ou des postures figées. La spasticité musculaire, quant à elle, est considérée comme une sur-contraction inhabituelle et involontaire du ou des muscles. Ce trouble du système nerveux central résulte en une crispation et une rigidité accrue du muscle touché. Le traitement de ces maladies implique généralement la prescription de traitements administrés oralement : le baclofène, les benzodiazépines, le dantrolène… Ces traitements systémiques comportent cependant tous des effets secondaires conséquents. Alternativement, l’injection intramusculaire de certains produits directement dans le muscle affecté peut soulager ces malades : le phénol ou la toxine botulique. Cette approche présente des avantages devant celles présentées précédemment, notamment concernant les effets secondaires. Cette approche doit encore être optimisée : les patients et soignants attendent des myorelaxants offrant encore moins d’effets secondaires, capables d’être efficaces rapidement après l’injection, et dont les effets seraient durables. L’objectif de notre projet global est de mettre en évidence les effets bénéfiques de l’utilisation locale de différents produits myorelaxants novateurs à effet rapide et durable, sur la contraction musculaire pour les patients souffrant de troubles du mouvement comme la dystonie et la spasticité. Au cours d’une étude princeps, nous avons pu identifier au moins 5 produits présentant une activité myorelaxante d’intérêt ; ensuite, grâce aux différents projets déposés, nous avons avancé notre premier Lead (FTP-501) quasiment au terme de son développement préclinique. Chacun des produits identifiés au cours de l’étude princeps semble avoir des caractéristiques pharmacologiques différentes : certains induisent une myorelaxation très rapide (FTP-101), et d’autres offrent un effet durable par exemple (FTP-501). Or, selon la maladie neuromusculaire, le besoin clinique est différent, et donc chaque caractéristique est plus ou moins critique. Nous visons ainsi le développement de plusieurs produits, car nous envisageons la possibilité de positionner chacun des produits finaux pour le traitement de différentes maladies neuromusculaires.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - Injection intramusculaire = 1 injection , durée 30 secondes / animal - Pesée des animaux = maximum 8 pesée / animal => 30 secondes / pesée => 4 minutes / animal - Test du DAS ( uniquement pour les animaux suivant la procédure 2) = 30 sec / test DAS (environ 28 stimulation sur la durée de l'étude / animal ) => 14 minutes / animal
Impact sur les animaux
Bien que certaines des 20 molécules de ce projet n’aient jamais été injectées chez l’animal, elles font partie de la même famille. Or, certains membres de cette famille ont été injectés, sans aucun signe clinique rapporté. Nous n’attendons ainsi pas de signe clinique particulier après injection des FTP-8xx ; toutefois, afin de se prémunir de tout imprévu, nous suivrons avec attention tout signe, et avons mis en œuvre les mesures décrites dans le tableau fourni en annexe. De plus, dans cadre de nos procédures, les nuisances attendues sont : le stress des animaux dû à la contention pour l’injection et le test du DAS ; une douleur liée à l’injection i.m.
Devenir
Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés car les muscles injectés seront prelevées pour des analyse histo-pathologiques.
Remplacement
Le remplacement ne peut pas être assuré dans cette étape du programme de travail, car la pertinence des modèles cellulaires de coculture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion (qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés). Le test DAS nous permet au contraire de mesurer l’activité myorelaxante tout en prenant en compte ce paramètre.
Réduction
Pour la réduction, les études précédemment réalisées nous ont donné un certain recul sur la taille des groupes nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs (test de Kruskal Wallis pour les sections B & C); Nous utiliserons donc le nombre minimal d’animaux par groupe permettant d’arriver à une conclusion. Soit 6 animaux par groupe.
Raffinement
Concernant le raffinement, les animaux seront hébergés en groupe de 2 avec enrichissement du milieu, et surveillés quotidiennement permettant un suivi clinique de chaque animal. Ainsi, des points limites sont mis en place durant tout ce projet permettant de définir des critères d’arrêt si nécessaire Nos études précédentes nous ont permis un raffinement du modèle DAS chez le rat : l’injection intramusculaire dans le membre inférieur est réalisée sous contention par un expérimentateur entraîné, et les mesures de DAS sont brèves, indolores et peu stressantes pour les animaux. Au cours de cette étude, nous souhaitons continuer à limiter au maximum le stress des animaux.
Choix des espèces
La comparaison de la rapidité d’action entre notre molécule et les traitements sur le marché ne pourra se faire que sur un modèle : i) exprimant les cibles moléculaires d’intérêt à la jonction neuromusculaire, et ii) dans lequel il existe une limite de diffusion dans les tissus. En effet, la cinétique des molécules après injection intra-musculaire est fortement dépendante de la capacité à diffuser dans le muscle, un tissu très compartimenté comportant plusieurs membranes internes. Or, bien qu’il existe des modèles in vitro qui permettent d’étudier la jonction neuromusculaire, la pertinence de ces modèles pour mimer la fonctionnalité de la jonction est débattue, et ils ne récapitulent pas les problématiques de diffusion qui se jouent in vivo. Le test DAS chez le rongeur, déjà éprouvé lors de notre étude princeps, est au contraire un test reconnu pour sa pertinence pour étudier les myorelaxants. Rats femelles Sprague Dawley femelles âgées de 6 semaines en début d’expérimentation (200g) et 10-12 semaines maximum en fin d’expérimentation (300g). Des animaux juvéniles seront choisis pour leur capacité à exhiber un réflexe lors des tests DAS. Les animaux âgés peuvent effectivement répondre de manière moins spontanée aux stimulations. Ils sont également plus légers, donc plus facile à stimuler.
Une thérapie pharmacologique pour une maladie rénale génétique chez l’embryon de souris
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
35 souris femelles gestantes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue avec leurs embryons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque femelle reçoit quatre gavages en contention vigile pour tester des médicaments sur une maladie rénale génétique, puis est tuée pour prélever les embryons, eux-mêmes tués pour en prélever les reins. Le porteur affirme qu'aucune souffrance n'est attendue et que les composés ont déjà été testés sur cultures cellulaires. Il conclut qu'il est "indispensable" de tester l'effet des composés à la période de développement rénal de l'embryon.
Objectifs
Chez l’homme, la déficience génétique dans un gène qui code pour un facteur de transcription mène à une insuffisance rénale. A l’heure actuelle, pour cette maladie rare il n’y a pas de thérapie en dehors de la transplantation et la dialyse. Les patients qui souffrent de cette maladie génétique ont sont caractérisés par une activité insuffisante de la protéine codé par ce gène. Suite à nos études, nous avons identifié plusieurs médicaments (normalement utilisés pour d’autres pathologies) qui ont la capacité d’augmenter l’activité de ce gène dans des lignées cellulaires in vitro. L’objectif de notre projet de recherche est de vérifier l’efficacité de nos 3 meilleurs composés qui se sont caractérisés par une importante stimulation de l’activité de ce gène pour vérifier si ces médicaments améliorent les défauts rénaux liés à sa déficience dans un modèle murin de la maladie.
Bénéfices attendus
Nous nous attendons de pouvoir mesurer l’effet du traitement de ces médicaments sur le degré d’avancement du développement rénal sure des tissus prélevés. Ces mesures seront effectuées par 1) analyse d’image 2) Quantification du niveau d’expression des ARN messagers codants pour les gènes cibles principales de qui sont normalement réprimés 10 fois dans le rein entier en développement d’un embryons par rapport à un embryon contrôle.
Procédures
Nous allons traiter 35 femelles mères porteuse. Chaque souris sera soumise à 4 procédures de gavage (en état vigile en contention) d'un médicament (ou du placebo). Chaque procedure de gavage va durer moins de 3 minutes.
Impact sur les animaux
En dépit du retard développemental observé avant la naissance, la grande partie des souris muntants dans leurs vies post natale arrivent à développer une fonction rénale normale et par conséquence ne développent pas de souffrances. D’autre part, pour ce qui concerne les médicaments qu'on doit tester, des études récentes ont montré que ces composés, administrés par gavage à ces doses, ne provoquent pas de conséquences visible sur le bienêtre des animaux.
Devenir
Tous les animaux utilisé dans ce protocol seront mis à mort a la fin des procédures. En effet, le prelevement des embryons pendant leur développpemnt nécessite la mise à mort des mères porteuses. Le prelevement des reins embryonnaires pendant leur développpemnt nécessite la mise à mort des embryons.
Remplacement
Remplacement : La complexité du rein et de la maladie rénale nécessite l’utilisation d’un modèle animal. Mais les molécules à l'étude de ce protiocole ont préalablement été testées sur des cultures cellulaires ce qui nous permet d’envisager une gamme d’efficacité sans toxicité pour les animaux.
Réduction
Réduction : nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet.
Raffinement
Comme chez l’homme, les maladies rénales restent longtemps silencieuses et le modèle murin qu'on va adopter ne comporte pas de souffrance spécifiquement liée à la déficience rénale. En tout cas, les animaux seront mis à mort avant l’apparition de symptômes douloureux. Une surveillance quotidienne sera effectuée auprès des animaux afin de s’assurer de leur bien-être constant en se référant à une grille de points limites. Pour compléter cette surveillance les souris seront pesée chaque jour pendant le traitement. Si les souris depassent un niveau de score 1 pour l'évaluation de leur apparence physique ou de leur comportement (comme indiqué dans la description de la procédure expérimentale de l'état du bien-être des souris), on mettra en place l’administration d’un antalgique. En cas de dépassement du point limite, on choisira la mise à mort de l’animal. Les animaux bénéficieront d’un programme d’enrichissement, comme des carrés de cellulose, des bâtonnets de bois ou une maisonnette, défini par la cellule de l’établissement chargée de leur bien-être. Les animaux bénéficieront d’un programme d’enrichissement, comme des carrés de cellulose, des bâtonnets de bois ou une maisonnette, défini par la cellule de l’établissement chargée de leur bien-être.
Choix des espèces
Le developpement rénal chez la souris est un excellent modèle experimentale qui se rapproche à celui de l'homme. Le modèle murin étudié developpe spécifiquement un retard de developpement rénal à 14 jours après conception. Il est donc indispensable tester l'effet de nos composés à cette période.
Evaluation des conséquences de la surexpression de CYP46A1 dans le métabolisme striatal et sanguin dans un modèle murin de la maladie de Huntington
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
146 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Issues d'une lignée transgénique qui reproduit la maladie de Huntington, elles présentent perte de poids, déficits moteurs et cognitifs et peuvent mourir spontanément vers trois mois, avant de recevoir une injection dans le cerveau par chirurgie stéréotaxique puis d'être tuées pour prélèvement. Le porteur indique que la craniotomie peut provoquer douleur, saignement et inflammation. Il affirme qu'aucune culture cellulaire ne reproduit la complexité du cerveau et présente la lignée comme bien caractérisée.
Objectifs
Les maladies neurodégénératives comme la maladie de Huntington (MH) sont une préoccupation croissante en santé publique. Malgré d’importants efforts de recherche, il n’existe encore aujourd’hui aucun traitement capable de combattre de façon efficace la progression de ce type de maladies. Des nouvelles approches thérapeutiques sont essentielles pour améliorer la qualité de vie des patients. Parmi ces nouvelles approches prometteuses se trouve la thérapie génique. Elle utilise l’ADN pour soigner ou prévenir de la maladie. Selon la pathologie, cet objectif peut être atteint en délivrant aux cellules un gène sain qui prendra le relai du gène déficient. Un virus modifié (AAV) non pathogène nous permettra de délivrer cet ADN au cœur même des cellules. Nous avons déjà la preuve de concept de notre stratégie dans des modèles murins pour la maladie de Huntington : l’enzyme déficiente à l’origine de la pathologie est remplacée par cet ADN permettant la synthèse d’une enzyme assurant la fonction normale permettant de corriger les anomalies neuropathologiques et comportementales chez la souris malade. Le but principal de cette étude est d’investiguer quelles sont les conséquences générales de la surexpression de ce gène et donc de la quantité d’enzyme sur la restauration des paramètres biologiques attendus des souris du modèle murin pour la MH. Pour répondre à cette question différents biomarqueurs présents dans les tissus et dans le sang seront analysés.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra d’identifier un marqueur métabolique dont le profil pourrait être modifié après l'injection d’un AAV exprimant le gène thérapeutique CYP46A1 chez un model murin de la maladie d’huntington. Ce métabolite pourra être utilisé comme marqueur d’efficacité de ce traitement dans le cadre du futur essai clinique.
Procédures
A partir de 6 semaines d’âge, les animaux transgéniques issus des couples reproducteurs développeront un phénotype dommageable. Les souris utilisées recapitulent les atteintes patholgiques de la maladie d'Huntington, c'est a dire qu'ils présentent une perte de poids, des defauts moteurs et cognitifs et décedent spontanément apres 3 mois de vie. A 4 semaines d’âge, les animaux seront soumis à une injection stéréotaxique sous anesthésie générale (Durée 70 minutes), avec prise en charge analgésique avant et apres la chirurgie. A 10 semaines d’age, les animaux seront mis à jeun pendant 6 heures puis euthanasié avec prise en charge préalable d’analgésique avant l’intervention (euthanasie). Les animaux sont euthanasiés afin de pouvoir analyser les prélèvements de sang et de tissus.
Impact sur les animaux
Les souris utilisées récapitulent les atteintes patholgiques de la maladie d'Huntington, la perte de poids, les défauts moteurs et cognitifs impactant la capacité de l'animal a s'alimenter et ils peuvent décédés spontanement apres 3 mois de vie. Une douleur peut survenir lors la mise en barre d’oreille des animaux, un risque de saignement peut avoir lieu au moment de la craniotomie. Un risque d’inflammation relativement faible peut être également être observe suite l’injection de l’aiguille dans le striatum des souris. Une perte de poids dû a l’injection de AAV pourrait être observé (5 à 7% ) du poids total de l’animal, (selon nos précédentes études), bien que les concentrations des AAVs utilisées ont déjà été evaluées in vitro et dans nos précédentes études afin d’éviter toute toxicité chez la souris.
Devenir
Lors de la procédure n°1 qui correspond à l’élevage d’une lignée dommageable les animaux d’intérêt produits seront maintenus en vie et inclut dans la procédure n°2 qui est la procédure expérimentale à proprement parler. Pour la procédure n°2 et donc l’euthanasie des animaux, les animaux seront euthanasiés en fin procédure pour les prélèvements et leur analyse afin de pouvoir répondre à la question scientifique de ce projet.
Remplacement
Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. De plus, les souris Huntington sont bien caractérisées. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont nés et élevés en captivité dans des élevages agrées
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques. Leur nombre (146) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives. En effet, des travaux précédents ont permis d’établir les doses de vecteur à injecter et les temps d'analyses. Afin de limiter le nombre total d’animaux essentiels au projet, les tests des analyses biochimiques post-mortem seront dans la mesure des possibles réalisés sur les mêmes animaux. Le design expérimental a pour but d’obtenir un maximum d’information en utilisant un minimum d’animaux. Les distincts paramètres (biochimiques) seront analysés grâce à des essais appropriés en fonction des revendications expérimentales. De plus, un plan statistique complet a été rédigé et validé.
Raffinement
Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. L’application de critères d’arrêts standards en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe certifient le bien-être des animaux. En cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique, et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance. 6h après l’acte chirurgical, une injection d'analgésique est réalisée pour éviter tout inconfort de l’animal. 24h après une deuxième injection d'analgésique est réalisée. 4h/5h après cette injection les animaux seront observés par l’expérimentateur et il sera vérifié qu’aucun signe de douleur est détecté. Si besoin, une injection d'analgésique est réalisée pour éviter tout inconfort de l’animal. Le protocole d’analgésie post opératoire a été décidé avec l’accord du vétérinaire clinicien.
Choix des espèces
Le but principal de cette étude est d’investiguer quelles sont les conséquences générales, de la surexpression du CYP46A1 (le gène thérapeutique) et la restauration de la voie de synthèse du cholestérol dans la région cible du cerveau (striatum), sur le métabolisme cellulaire des souris du modèle murin pour la MH. Pour répondre à cette question différents biomarqueurs du métabolisme présents dans les tissus et dans le sang seront analysés. Nous commencerons par valider nos vecteurs dans des souris saines avant son utilisation future chez la souris modèle. Les souris qui seront utilisées sont des souris adultes (4-8 semaines), dans lesquelles nous avons déjà optimisé les coordonnés d’injection dans le cerveau. Ce protocole a déjà été validé dans notre laboratoire.
Evaluation physique et in vivo d’un nouveau modèle de scanner microTEP/CT chez le primate
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
2 macaques à longue queue vont être utilisés, gardés en vie et réutilisés à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent jusqu'à six anesthésies générales de deux à trois heures, avec pose de cathéter et injection de radiotraceurs, pour évaluer les performances d'un nouveau scanner d'imagerie médicale. Le porteur indique que les doses de radiotraceurs restent trop faibles pour un effet pharmacologique. Il affirme que le recours à un organisme vivant est essentiel pour tester la caméra sur un animal de taille moyenne.
Objectifs
La tomographie par émission de positons (TEP), dénommée PET ou PET scan pour « positron emission tomography » en anglais, est une méthode d'imagerie médicale utilisée en médecine nucléaire qui permet de mesurer en trois dimensions une activité métabolique ou moléculaire d'un organe grâce aux émissions produites par les positons (positrons en anglais) issus d'un produit radioactif injecté au préalable (traceur). Initialement dévelopée chez l’homme, cette technique est de plus en plus utilisée chez l’animal de laboratoire et permet d’étudier des mécanismes complexes in-vivo tout en étant très peu invasif pour le sujet. Cependant, le passage de l’homme à l’animal implique d’améliorer la sensibilité et la résolution de ces appareils dans le but d’obtenir une image la plus informative possible. A ce jour, de nombreux systèmes permettant l’imagerie de rongeurs à haute résolution existent. Cependant, les systèmes permettant l’imagerie de sujets intermédiaires (animaux de taille moyenne) sont très rares. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer les performances physiques et la qualité d’image in-vivo,d’un nouveau modèle de caméra microTEP/CT sur deux primates et deux lapins. La campagne d’expérimentation donnant lieu à la demande APAFIS aura deux objectifs : - Des mesures physiques sur fantômes pour effectuer une évaluation des performances du scanner (résolution spatiale, sensibilité du système, etc...) selon les normes NEMA internationales des fabricants de scanners (étude hors du périmètre de l’expérimentation animale) - Des mesures in vivo avec l’acquisition d’images sur différents modèles animaux : le PNH et le lapin. Des traceurs radiopharmaceutiques produits au laboratoire seront utilisés pour avoir des images isotopiques fonctionnelles sur corps entier et/ou sur cerveau dans le but d’évaluer la qualité d’image de ce nouveau système.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu pour ce projet est d'obtenir des données contribuant à l'améliorer les performances (sensibilité et résolution) d'une méthode d'imagerie utilisant une nouvelle caméra microTEP/CT, utilisée dans le cadre d'évaluation par imagerie de sujets de tailles moyennes (a contrario, les systèmes d'imageries hautes résolutions sur petits sujets (rongeurs) et sur sujet humain existent et sont déjà bien développés. Cette validation permettra : - la réalisation de projets scientifiques futurs sur l’exploration du cerveau de primate à travers l’utilisation de nouveaux traceurs (biodistribution, pharmacocinétique, capacité à passer la barrière hémato-encéphalique) - d’imager des modèles de pathologies neurologiques (ischémie, Sclérose En Plaques...etc).
Procédures
Les animaux auront au maximum 6 anesthésies et 6 poses de cathéter veineux permettant de faire des examens d'imagerie. Chaque examen sera espacé d'un minimum de 15 jours. Les données TEP/CT seront acquises pendant 90 min, après injection du radiotraeur. La durée totale d’anesthésie est donc estimée à 2h30-3h.
Impact sur les animaux
Pour ce projet, les animaux subiront des anesthésie générale durant les acquisitions et l'injection du radiotraceur en intra veineux. Les animaux seront monitorés tout au long de l'anesthésie (SpO2 et rythme cardiaque) et leur température sera maintenue à l'aide d'un tapis chauffant. Pour les acquisitions, il est nécessaire d'administrer des radiotraceurs (à dose dites "traceuses", impliquant que les quantiés administrées sont suffisement faibles pour ne pas entrainer d'effet pharmacologique chez les sujets) et sont tous autorisés pour des administrations chez l'homme.
Devenir
Tous les animaux seront gardés en vie après examen et accord vétérinaires. La décision de réutiliser les animaux dépendra du vétérinaire de l’installation et en consultation avec la SBEA.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer une caméra microTEP/CT dédiée à l’animal moyen (< 6kg) et en particulier au primate. Le recours à un organisme vivant est donc essentiel. Nous avons donc choisi le macaque fascicularis comme espèce pour l’imagerie.
Réduction
Dans ce contexte de validation instrumentale, il est préconisé d’avoir un nombre large de radiopharmaceutiques, au détriment du nombre d’acquisition par molécules radioactives. Nous prévoyons donc un maximum de 6 radiotraceurs différents administré sur un même animal. Chaque animal subira un maximum d'une acquisition par quinzaine. Cette stratégie nous permet d'atteindre notre objectif en incluant un total de deux macaques fascicularis dans ce projet, ce qui est un minimum pour tester un panel de radiotraceurs sur la période de disponibilité de la caméra.
Raffinement
Les primates seront hébergés par groupes sociaux (mâles et femelles hébergés séparément) sur de la litière pour leur permettre de fourrager et dans des volières conformes aux recommandations et bénéficieront du programme d’enrichissement défini par la structure du bien-être animal, avec rotation du matériel pour renouveler l’intérêt des animaux. Des friandises seront distribuées quotidiennement aux animaux. Le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. L’imagerie TEP/CT sera effectuée de manière consécutive, au cours d’une même anesthésie. Les animaux seront suivis quotidiennement pendant la durée de la procédure afin de détecter tout signe clinique anormal (douleur, détresse ou stress). Les manipulations et le suivi des animaux seront réalisés exclusivement par du personnel formé et compétent.
Choix des espèces
La caméra a été développée pour imager le cerveau et/ou le corps entier de singe. La géométrie de la détection (couronnes de détecteurs TEP) est adaptée aux dimensions du corps et au cerveau du singe ayant un poids maximum de 6 kg. C’est un modèle de microTEP/CT intermédiaire entre un microTEP/CT « rongeurs » et un scanner TEP/CT clinique. Le singe cynomolgus est choisi pour sa la taille et pour la structure de son encéphale qui se rapproche de l’homme. De jeunes primates adultes seront utilisés (36 à 48 mois environ), stade de développement choisi car le poids des animaux est compatible avec la taille de la machine. De plus, certaines acquisitions concernent le cerveau et il est préférable de les réaliser sur un cerveau adulte pour pouvoir évaluer le système le mieux possible. L’aspect translationnel est un point important pour l’utilisation de traceurs TEP.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
16 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de vecteurs viraux puis des injections quotidiennes d'immunosuppresseurs pouvant s'étaler sur seize semaines, avec des prélèvements de sang répétés, l'immunosuppression pouvant provoquer des infections opportunistes et une perte de poids. Ce criblage sert à préparer une thérapie génique destinée à des enfants atteints d'une maladie osseuse rare. Le porteur décrit la souris comme une "espèce inférieure" servant à trier vecteurs et traitements avant des essais sur primates, qu'il présente comme le "modèle de prédilection".
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un programme plus large qui inclut un projet déjà en cours dans le même établissement utilisateur. L’objectif du programme est de développer des traitements pour différents types de dysplasies du squelette, notamment la dysplasie spondyloépiphysaire congénitale (SEDc), la collagénopathie de type 2 la plus fréquente. La SEDc est une dysplasie osseuse génétique qui cause une forme rare de nanisme chez l'être humain (1 naissance sur 100 000). Elle est caractérisée phénotypiquement par une petite taille avec un raccourcissement du tronc et du cou, induisant un risque important d'instabilité au niveau des vertèbres cervicales pouvant provoquer une paralysie. Les patients souffrent également d'anomalies au niveau de la rétine et d’une perte d'audition. Cette pathologie est due à des mutations perte de fonction dans le gène du collagène de type 2. L’objectif de ce projet est d’identifier un traitement immunosuppresseur pouvant être utilisé en combinaison avec un traitement de thérapie génique pour différents types de dysplasies squelettiques. Les traitements de thérapie génique basés sur l’utilisation de vecteurs viraux peuvent induire des réponses immunitaires pouvant réduire l’efficacité du traitement (diminution du niveau d’expression du gène d’intérêt ou élimination des cellules transduites) et empêcher la ré-administration efficace de ce dernier (réponse mémoire dirigée contre le vecteur viral). Il est donc nécessaire d’inhiber de façon transitoire les mécanismes impliqués dans les réponses immunitaires.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à la fois d’identifier la ou les constructions de vecteurs viraux les moins immunogènes, et la stratégie d’immunosuppression la plus efficace entrainant le moins de complications. Ces résultats, combinés à ceux d’un autre projet en cours permettront d’identifier, chez la souris, la combinaison vecteur viral / immunosuppression la plus efficace et la moins toxique. Ces étapes de pré-sélection chez la souris permettront de diminuer le nombre de sujets dans les futures études sur animaux supérieurs (type primates) aux caractéristiques plus proches de celles de l’Homme. Le bénéfice final du projet est de développer des traitements (combinaison thérapie génique / Immunosuppression) pour différents types de dysplasies du squelette, notamment la dysplasie spondyloépiphysaire congénitale (SEDc), la collagénopathie de type 2 la plus fréquente.
Procédures
Les animaux seront soumis à une ou deux injections de vecteurs viraux par voie intraveineuse ou intrapéritonéale, et de multiples injections d’immunosuppresseurs par voie intrapéritonéale. Ces dernières se feront sur une durée maximum de 16 semaines (injections IP quotidiennes sur un maximum de 21 jours consécutifs ou injections hebdomadaires sur un maximum de 16 semaines). Les animaux seront également soumis à des prélèvements répétés de sang (toutes les semaines, ou toutes les deux semaines sur une durée maximale de 16 semaines) dans la mesure du possible (effectués sur des animaux d’un mois minimum). Ces prélèvements s’effectueront sous anesthésie au niveau de la veine mandibullaire en alternant chaque côté. Des prélèvements de sang terminaux seront également effectués sous anesthésie sur tous les animaux par la voie rétro-orbitale.
Impact sur les animaux
Aucun effet indésirable n’est attendu suite à l’injection de vecteurs viraux (résultats obtenus dans le cadre d’un précédent projet). Les souris sous immunosuppresseurs présenteront un système immunitaire éteint. Elles seront ainsi plus sujettes à des infections opportunistes et aux complications qui pourraient en découler. En cas d’infection, les souris pourraient être sujettes à des pertes de poids ou des signes d’inactivité.
Devenir
Toutes les souris utilisées au sein de ce projet seront mises à mort par dislocation cervicale, asphyxie au CO2 ou injection intrapéritonéale d’une dose létale de pentobarbital sodique (de type Euthasol 140 mg/kg ou Euthoxin 500 mg/kg). La mise à mort est nécessaire afin de récupérer un ensemble d’organes (rate, foie, moelle osseuse, plaques de croissance…) pour évaluer à la fois la biodistribution des vecteurs viraux testés, mais aussi l’effet du traitement (vecteur viral et immunosuppresseur) sur la réponse immunitaire cellulaire.
Remplacement
Globalement, la construction des vecteurs viraux et l’optimisation de ces derniers se sont faites et continuent à se faire en se basant sur des publications scientifiques, et sur un certain nombre de tests in vitro réalisés. Les différents vecteurs viraux produits sont précédemment testés in vitro afin de valider leur capacité à transduire efficacement des cellules modèle (HEK293). Si la transduction n’est pas efficace, le vecteur ne sera pas sélectionné pour les études in vivo. Une importante recherche bibliographique a été effectuée afin d’identifier des traitements immunosuppresseurs d’intérêt, d’autant plus sachant que la patientèle sera constituée en totalité d’enfants. Il est très difficile de valider une stratégie d’immunosuppression par des tests in vitro sachant que cela nécessite la présence d’un système immunitaire complet et fonctionnel. Certains immunosuppresseurs seront tout de même évalués à l’aide des tests in vitro mentionnés précédemment afin de confirmer qu’ils n’impactent pas la capacité des vecteurs à transduire efficacement les cellules modèles.
Réduction
Le juste nombre d’animaux a été calculé de manière à réduire le nombre minimum d’animaux par lot, tout en produisant des résultats statistiquement significatifs et robustes. De manière à répondre aux exigences de réduction, nous allons utiliser des groupes contrôles en commun chaque fois que cela est possible. Globalement, un ensemble de 8 animaux par groupe sera suffisant pour comparer de manière significative les niveaux d’anticorps et les réponses cellulaire induites. En effet, l’utilisation d’outils statistiques (calcul de puissance de test et de taille d’échantillons, https://biostatgv.sentiweb.fr/?module=etudes/sujets#) permet de définir un nombre minimal d’animaux de 8 par groupe, en considérant un seuil de significativité (p
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe à maximum 5 par cage et par sexe dans une pièce à température et hygrométrie contrôlées avec un cycle jour/nuit de 12h. Chaque cage sera soumise à un enrichissement du milieu de type tige en papier, un igloo et une buchette de peuplier afin de satisfaire l’instinct naturel des souris à ronger et éviter les malocclusions des incisives. Les souris sous immunosuppresseurs présenteront un système immunitaire éteint. Elles seront ainsi plus sujettes à des infections opportunistes et aux complications qui pourraient en découler. L’hébergement des animaux en zone SPF (Specific Pathogen Free) dans des cages ventilées, l’utilisation de hottes de change, ou de hotte à flux laminaire pour les expérimentations, et l’apport d’aliments irradiés, permettront de réduire ces risques au minimum. Le suivi quotidien (weekends et jours fériés inclus) des animaux par le personnel de l’établissement utilisateur et les visites régulières des expérimentateurs (à minima deux fois par semaine) nous permettront de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. En cas d'altération de l'état de l'animal, la surveillance sera rapprochée (observation et pesée quotidienne) et les animaux seront soignés en fonction de la sévérité de la douleur observée. Les procédures mises en place dans ce projet ne nécessitent aucune analgésie particulière. En cas d'apparition d'une souffrance ou toxicité inattendue, les animaux seront exclus de l'étude et mis à mort dans les 24 heures avec l’accord du directeur d’étude et/ou d’un vétérinaire
Choix des espèces
Afin d’identifier une combinaison vecteur / immunosuppression applicable en clinique chez l’homme, il est important de la valider au préalable au sein d’un modèle animal. En effet le système immunitaire fonctionne au travers de mécanismes complexes qu’il est impossible de reproduire fidèlement en dehors d’un organisme vivant. Les primates non humains représentent le modèle de prédilection de par son anatomie proche de celle de l’Homme. Il est cependant impossible de cribler autant de paramètres différents (vecteur, dose, immunosuppresseur, dose, fréquence) chez cette espèce. Nous allons avoir besoin d’une espèce inférieure, i.e. la souris, pour cribler les vecteurs mais aussi les traitements immunosuppresseurs pertinents. Étant donné que les destinataires finaux du traitement seront des enfants, l’efficacité du traitement combinatoire thérapie génique + Immunosuppresseur devra être confirmé chez un modèle de souris d’âge similaire, soit des souris juvéniles (1 à 22 jours). Les études qui consistent à évaluer la cinétique de la réponse immunitaire (Procédure n°1), cribler les différents traitements immunosuppresseurs (Procédure n°2) et évaluer l’efficacité d’une seconde injection de vecteur viral (Procédure 3) seront réalisées sur des animaux adultes âgés de 5 à 8 semaines. Étant donné que les destinataires finaux du traitement seront des enfants, l’efficacité du traitement combinatoire thérapie génique + Immunosuppresseur devra être confirmé chez un modèle de souris d’âge similaire, soit des souris juvéniles avec des traitements allant de la naissance jusqu’à un âge de 4 mois maximum (procédures n°4 et 5).
Dermatologie
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
Rats : 1000
Cochons : 100
2 600 cochons, souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère, une partie des rongeurs (800) étant réutilisée et le reste tué. Ils subissent l'induction de maladies de peau comme le psoriasis, des biopsies cutanées et des évaluations de grattage sous anesthésies répétées, l'isolement prolongé classant certaines procédures en sévères. Le porteur indique que l'ingestion d'imiquimod par toilettage peut provoquer chez la souris une perte de poids, une déshydratation et une hypothermie. Sur le remplacement, il affirme que les tests in silico ou in vitro ne peuvent pas suppléer le modèle animal faute d'un environnement biologique intact.
Objectifs
Les origines des pathologies de la peau sont souvent multifactorielles. Le psoriasis, par exemple, est une maladie inflammatoire chronique de la peau qui touche 1 à 3% de la population mondiale et pour laquelle il existe souvent une prédisposition familiale héréditaire (30 % des cas). Un dérèglement du système immunitaire est aussi incriminé. De plus, des facteurs extérieurs, comme le stress, la fatigue, les infections, certains médicaments par exemple, peuvent favoriser la survenue de poussées de psoriasis. Le psoriasis ou l’hypersensibilité de contact, tout comme un grand nombre de pathologies de la peau sont souvent associés à des démangeaisons qui entrainent un besoin incontrôlable de se gratter. Le prurit peut aussi survenir sur une peau saine, sans raison apparente. Les causes des démangeaisons sont très variées : éruptions cutanées, peau sèche, piqûres, réactions allergiques, maladies affectant le système nerveux ou d’autres organes. Quel que soit la ou les causes, le fait de se gratter n’améliore pas la situation, au contraire, il contribue à son aggravation. Le projet concerne des tests d'évaluation de réactions ou d'affections cutanées chez le rongeur et le porc, de comportements de grattage chez le rongeur et de cicatrisation chez le rongeur. Les tests décrits dans ce projet ciblent l'évaluation des effets de substances dans le cadre de développement préclinique de produits pharmaceutiques. Ces modèles sont mis en place et utilisés afin de tester l'efficacité de médicaments à lutter contre certaines affections cutanées (psoriasis, allergie, dermatite atopique, démangeaisons) ou à améliorer la cicatrisation.
Bénéfices attendus
Ces différents modèles sont nécessaires à la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments sûrs et efficaces pour traiter contre certaines affections cutanées (psoriasis, allergie, dermatite atopique, démangeaisons) ou à améliorer la cicatrisation. Par exemple, même si les corticoïdes, appliqués par voie topique ou orale, sont fréquemment utilisés pour traiter de nombreuses affections cutanées, ces derniers ne restaurent pas la barrière que constitue l’épiderme. Leur utilisation est de plus fréquemment accompagnée d’une immunosuppression, ce qui a pour conséquence de prolonger leur utilisation à des doses fortes entrainant ainsi de nombreux effets secondaires (atrophie de la peau, augmentation du risque d’infection). Pour ces raisons, de nouveaux traitements, sans effets secondaires majeurs, sont en développement.
Procédures
Dans la procédure d'évaluation de grattage, les rats et les souris sont rasés (sous anesthésie gazeuse). A la fin de la procédure (évaluation du grattage), des prélèvements de sang (sous anesthésie) et structures/organes après euthanasie (peau…) peuvent être nécessaires. Dans la procédure d’évaluation de la cicatrisation chez la souris, les souris sont rasées (sous anesthésie gazeuse) et une exérèse de la peau est réalisée (sous anesthésie gazeuse et sous traitement analgésique) à l’aide d’un punch à biopsie (2 biopsies d’un diamètre de 5 mm). Pour évaluer l’évolution de la cicatrisation (et appliquer les traitements topiques le cas échéant) les souris sont légèrement anesthésiées (anesthésie gazeuse) de façon régulière pendant 3 semaines maximum (généralement 1 fois maximum par jour). A la fin de la procédure, des prélèvements de sang (sous anesthésie) et structures/organes après euthanasie (peau…) peuvent être nécessaires. Dans les autres procédures chez le rongeur (rat et souris), les animaux sont anesthésiés (anesthésie gazeuse) et rasés/épilée (zones à traiter). Pour évaluer l’évolution des lésions cutanées et appliquer les traitements topiques, les animaux souris sont légèrement anesthésiées (anesthésie gazeuse) de façon régulière sur une période pouvant aller d’une à trois semaines maximum selon la procédure (généralement 1 fois maximum par jour, sauf 2 fois par jour pour le modèle de sécheresse de la peau). A la fin de la procédure, des prélèvements de sang (sous anesthésie) et structures/organes après euthanasie (peau…) peuvent être nécessaires. Dans la procédure chez le porc, les animaux sont placés sous sédation légère (injection de tranquillisants) pour la phase dite de sensibilisation, la phase dite de challenge, pour l’application des traitements topiques et pour les prélèvements sanguins (le cas échéant). Cette tranquillisation est réalisé en plusieurs occasions sur une période généralement de 9 jours maximum (généralement 1 fois maximum par jour). A la fin de la procédure, des prélèvements de sang (sous anesthésie) et structures/organes après euthanasie (peau…) peuvent être nécessaires.
Impact sur les animaux
Pour les procédures chez le rongeur, les animaux peuvent être isolés pendant plusieurs jours. Cet isolement est nécessaire pour éviter les morsures/griffures occasionnées par les congénères qui pourraient introduire un biais dans l'évolution et donc l'évaluation des lésions (aggravation des symptômes). De plus, l’isolement permet aussi d’éviter l’ingestion inter-individuelle des traitements appliqués de façon topique (traitements sous forme de pommade, de crème,…). Dans la procédure d'induction de psoriasis chez le rongeur, l’ingestion possible de l’imiquimode (par le toilettage) peut induire une toxicité (observée plus particulièrement chez la souris) dont la conséquence est une perte de poids (et éventuellement une déshydratation et une hypothermie). Pour les procédures chez le rongeur (sauf modèle de grattage et modèle de sécheresse de la peau), même si cela demeure extrêmement rare, une attention particulière sera apportée à l’apparition de lésions ulcératives et/ou infectées, ainsi qu'à l’infection/surinfection de la plaie induite par la biopsie (modèle de cicatrisation uniquement). Pour la procédure chez le porc, une contention est nécesaire pour appliquer les traitements. Pour minimiser le stress de cette contention, les aniamux sont placés sous sédatif
Devenir
A l'issue la procédure d'évaluation de grattage, les rats et les souris peuvent être réutilisés s'ils n'ont pas été soumis à un prélèvement terminal et s'ils n'ont pas reçu de substances dont les effets à long terme ne sont pas connus. Les autres procédures chez le rats et la souris sont classées sévères (du fait de la durée d'isolement des animaux). Ils sont euthanasiés à l'issue de la procédure. De plus, des prélèvements terminaux (ex: peau et/ou sang) sont souvent réalisés pour analyse à la fin de la procédure. Ils sont euthanasiés à l'issue de la procédure. De plus l'évolution corporelle importante du porc ne permet pas sa réutilisation dans une nouvelle procédure.
Remplacement
En amont des tests in vivo, des tests in silico ou in vitro peuvent être envisagés. Cependant, même si ces tests peuvent apporter des données préliminaires ou complémentaires (permettant ainsi un tri des substances à étudier, et donc réduisant de fait le nombre d'animaux utilisés), ils ne peuvent entièrement suppléer les modèles animaux car ils ne permettent pas d’évaluer les pathologies dans un environnement biologique et immunologique intact comme cela est possible chez l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement positif. Nos analyses statistiques (Student'st test) indiquent qu’un effectif de 8-10 animaux par groupe (nombre de groupes variable en fonction du nombre de doses et de produits à testés) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Lorsque celà est possible, des prélèvements sanguins intermédiaires (autre que terminal) peuvent être envisagés sur un même animal, permettant ainsi de générer de données sur la cinétiques d'action de la molécule testés sans utiliser un plus grand nombre d'animaux..
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs et suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure), jouets (porcs). Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur les paramètres physiologiques des espèces choisies est prédictif de leurs effets chez l’Homme. De plus, le choix des espèces est basé sur la bibliographie scientifique, les modèles expérimentaux étant largement décrits chez le rat et la souris. L’utilisation du porc voit également son intérêt de par les caractéristiques de sa peau qui sont proches de celle de l’Homme. Principalement rongeurs sevrés, âge variant entre 3 semaines et 6 mois, conformément aux données historiques, à la bibliographie scientifique (Avci et al., 2013, Expert Opin Drug Discov. 8(3): 331-355). Principalement porcs sevrés, âge minimum de 4 semaines, conformément aux données historiques (manipulation encore aisée à cet age) et à la bibliographie scientifique (Mollison et al., 1998, Current Pharmaceutical Design. 4: 367-379).
Système hépatique
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 2400
4 800 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils servent à provoquer des atteintes du foie pour tester des médicaments, l'un des modèles imposant chez le rat une chirurgie de ligature du canal biliaire suivie d'une jaunisse, d'une ascite et d'une perte d'appétit. Le porteur indique que le stade de coma hépatique n'est pas atteint car les animaux sont tués avant, et que le prélèvement du foie ne permet pas leur maintien en vie. Sur le remplacement, il affirme que les cultures d'hépatocytes ne peuvent pas suppléer le modèle animal, faute de reproduire un environnement biologique et immunologique intact.
Objectifs
La stéatose hépatique non alcoolique (NASH) représente la première cause d’hépatopathie chronique dans les pays occidentaux. Elle est caractérisée par un dépôt excessif de lipides dans le foie (stéatose), d’une inflammation et d’une nécrose hépato-cellulaire pouvant évoluer vers la cirrhose. L’hépato-toxicité liée aux médicaments, aux plantes médicinales ou aux agents chimiques est un problème de santé publique. Le foie joue un rôle essentiel dans la transformation et l'élimination des médicaments. Mais lorsque la quantité ou la puissance du toxique dépassent les capacités métaboliques du foie, il peut se produire une destruction de cellules hépatiques: c'est l'hépatite toxique. La toxicité hépatique des médicaments est l’une des principales causes d’arrêt dans le développement de substances ou de retrait de médicaments. Par exemple, le paracétamol (antalgique et antipyrétique de référence) est l'un des médicaments les plus utilisés et est considéré comme une substance d'utilisation sûre, du moins à doses thérapeutiques. Toutefois, le potentiel hépatotoxique du paracétamol en cas de surdosage, accidentel ou plus souvent à visée suicidaire, est néanmoins connu de longue date. L’exposition à des produits chimiques est également un problème croissant dans les sociétés industrielles. Le risque est plus difficile à apprécier que pour les médicaments car il n’existe pas de réseaux spécifiques centralisant les effets secondaires rapportés par des cliniciens. De plus, les effets à long terme à des expositions intermittentes à doses variables, susceptibles de produire des maladies chroniques du foie et des cancers, restent peu connus. Parmi les agents chimiques identifiés, on retrouve le tétrachlorure de carbone (CCl4). L’hépatite auto-immune est une maladie d’étiologie inconnue, qui progresse spontanément vers la cirrhose et l’insuffisance hépatique. Certains modèles murins d’hépatite auto-immune sont induits par des produits chimiques tels que la concanavaline A. Enfin, l'obstruction des voie biliaires (cholestase), dont l'origine peut être diverse, entraine également des nombreuses complications. Les tests décrits dans ce projet ciblent l'évaluation des effets de substances dans le cadre de développement préclinique de produits pharmaceutiques. Ces modèles sont mis en place et utilisés afin de tester l'efficacité de médicaments (par la réduction de l'hépatite, du NASH) ou de s'assurer qu'ils n'induisent pas eux-mêmes une hépatotoxicité.
Bénéfices attendus
Ces différents modèles sont nécessaires à la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments sûrs et efficaces pour traiter l'hépatotoxicité chronique (NASH) ou aigüe (intoxication, cholestase). Par exemple, il n’existe pas, pour l’instant, de traitements médicamenteux établis pour traiter le NASH et le risque associé de développer d’autres affections du syndrome métabolique (par exemple augmentation du risque de développer un diabète) Jusqu’à présent, le traitement reste basé sur le contrôle de chacun des facteurs de risque métabolique (limiter le surpoids par le régime et l'exercice physique et/ou combattre l'insulino-résistance par la prescription de médicaments qui améliorent la sensibilité des tissus périphériques à l'insuline).
Procédures
Dans les procédures chez la souris (modèles d'hépatotoxicité aigüe et NASH), un prélèvement sanguin terminal (euthanasie sans réveil) sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane est réalisé. Dans les procédures chez le rat (modèles d'hépatotoxicité aigüe, NASH et cholestase), un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane est réalisé (juste avant l'euthanasie). Selon les besoins de l'étude (et plus particulièrement pour les procédures NASH et cholestates, des prélèvements sanguins supplémentaires (fréquence à adapter en fonction des besoins de l'étude) peuvent être réalisés (sous anesthésie avec retour à l'état conscient). Dans le cas des prélèvements intérmédiaires, le volume prélevé sur chaque animal sera inférieur ou égal à 15% de sa volémie et ne pourra être répété que toutes les 2 semaines au minimum. Dans la procédure cholestase, une phase de chirurgie est nécesaire. Les rats sont anesthésiés (anesthésie gazeuse isoflurane) et reçoivent une administration d'un anti-inflammatoire non stéroïdien. Une laparotomie médiane est pratiquée en condition d'asepsie. Le canal biliaire est répéré, liguaré puis sectionné (entre 2 ligatures). Les plans musculaires et cutanés sont suturés et l'animal est placé près d'un dispositif chauffant jusqu'au réveil. Pendant la phase de récuprération post-chirurgicale, les animaux recoivent un traitement antibiotique et de nouvelles administrations de l'anti-inflammatoire non stéroïdien. NB: un groupe d'animaux subit la même procédure (anesthésie, laparotomie...) à l'exception de la ligature/section du canal biliaire. Les animaux de ce groupe (groupe Sham) servent de contrôle.
Impact sur les animaux
A ce stade du développement du médicament, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Il n’est donc pas attendu de sévérité forte liée au médicament. Dans ce type de procédures, il est attendu une hépatotoxicité aigüe (intoxication, cholestase) ou chronique (NASH). Dans les modèles aigüs d'intoxication, une perte d'appétit et de poids peut être observées sur la durée de l'évaluation (généralement dans les premières 24 heures). Dans le modèle de cholestase (ligature du canal biliaire), les animaux doivent être hébergés en cage individuelle (avec enrichissement) pendant la période de récupération post-chirurgicale (quelques jours). Après la ligature du canal biliaire, une jaunisse apparait progressivement. Elle peut être accompagnée par de l'ascite (à un stade plus tardif, environ 4 semaines) et une diminution de d'appétit. Le stade d'encéphalopathie hépatique (et de coma), observé chez l'homme à un stade terminal, n'est pas atteint dans ce modèle (les animaux étant euthanasiés avant ce stade). Dans le modèle du NASH, il n'est pas attendu de nuisances ou d'effets indésirables sur les animaux.
Devenir
Chez la souris (procédures 1 à 4), le volume du prélèvement sanguin terminal et le prélèvement du foie (pour analyses, procédure 4) ne permettent pas le réveil et le maintien en vie. Chez le rat (procédures 4 et 5), le prélèvement du foie (pour analyses) ne permettent pas le réveil et le maintien en vie. Chez le rat (procédures 1 et 2), l'éventuelle toxicité long terme de la substance d'induction et l'eventuel prélèvement du foie (pour analyses) ne permettent pas le réveil et le maintien en vie.
Remplacement
En amont des tests in vivo sur les modèles d’hépatotoxicité aigue (acétaminophène, CCl4 ou concanavaline A), des tests in vitro (culture d'hépatocytes) peuvent être envisagés. Cependant, même si ces tests peuvent apporter des données préliminaires ou complémentaires (comme par exemple les tests de viabilité cellulaire), les hétatocytes en culture ne peuvent entièrement suppléer les modèles animaux car ils ne permettent pas d’évaluer les pathologies dans un environnement biologique et immunologique intact comme cela est possible chez l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif. Nos analyses statistiques (Student'st test) indiquent qu’un effectif de 10 animaux par groupe (nombre de groupes variable en fonction du nombre de doses et de produits à testés) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Lorsque celà est possible, et chez le rat uniquement, des prélèvements sanguins intermédiaires (autre que terminal) peuvent être envisagés sur un même animal, permettant ainsi de générer des données sur la cinétique d'action de la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs, et sont suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur le système hépatique du rat et de la souris dans les modèles décrits, sont prédictifs de leur efficacité en clinique. Principalement rongeurs sevrés, âge variant entre 3 semaines et 6 mois, conformément aux données historiques.
Etude d’immunogénicité, protection et suivi en stabilité d’un vaccin universel contre la grippe chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent deux injections dans la patte sans anesthésie, et 30 % d'entre elles sont infectées par la grippe par voie nasale sous anesthésie, l'infection pouvant provoquer une perte de poids, les souris atteignant -20 % de leur poids étant alors mises à mort. Le projet vise à tester un candidat-vaccin ciblant la nucléoprotéine du virus et à contrôler des lots destinés au marché humain. Le porteur affirme qu'aucun test in vitro ne peut reproduire la réponse immunitaire et que le modèle souris est imposé par les tests précliniques des compagnies pharmaceutiques.
Objectifs
La grippe est une maladie virale aiguëe, fréquente et très contagieuse causée par des virus grippaux qui circulent dans toutes les régions du monde. On estime à un milliard le nombre de cas, à 3-5 millions le nombre de cas graves et entre 290 000-650 000 le nombre de décès liés à la grippe dans le monde. Des pandémies de grippe surviennent occasionnellement en plus de la grippe saisonnière annuelle, avec un impact sanitaire et économique considérable. La vaccination est la stratégie la plus efficace pour protéger les populations. Elle fonctionne en induisant des anticorps spécifiques à la souche de grippe circulante, visant à cibler les protéines de surface du virus. Cependant ces vaccins sont partiellement efficaces : 32% pour les personne âgées et 43% sur les adultes en raison du fait que les souches virales en circulation mutent tous les ans. Pour pallier la mutation des protéines de surface, les vaccins sont reformulés chaque année. Cependant, le virus de la grippe possède également une protéine contenue à l’intérieur de l’enveloppe virale, la nucléoprotéine (NP), qui diffère peu d’une souche à l’autre, ce qui fait d’elle une cible pertinente pour l’efficacité des vaccins sur le long terme. Ainsi un vaccin qui induit une réponse protectrice contre une protéine peu sujette aux mutations pourrait donc conférer une protection plus durable non seulement contre la grippe saisonnière humaine, mais aussi contre une nouvelle pandémie et pourrait donc avoir améliorer l'efficacité du vaccin. Un candidat-vaccin, contenant la nucléoprotéine de la souche A de la grippe est capable d’induire une réponse immunitaire de type cellulaire permettant une protection contre différentes souches du virus de la grippe chez la souris. Ce projet a donc pour objectif d’améliorer les vaccins actuels contre la grippe, en ouvrant la voie vers le développement clinique d'un candidat-vaccin qui pourra être utilisé seul, avec un adjuvant ou en association avec les vaccins saisonniers actuellement sur le marché. Les lots de vaccins destinés aux études cliniques chez l’homme doivent subir des tests concernant leur efficacité et leur activité biologique chez la souris. Enfin il est nécessaire de procéder à des études de stabilité, afin de vérifier que le médicament expérimental sera stable pendant la période de stockage prévue de sa libération à son administration aux patients
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont d’améliorer l’efficacité des vaccins antigrippaux saisonniers et pandémiques actuels. Ce candidat-vaccin produira, en plus de la réponse humorale habituellement observée à la suite d’une vaccination contre la grippe saisonnière ordinaire, une forte réponse des cellules T ainsi qu’une protection de longue durée contre l’antigène le plus conservé de la grippe : la nucléoprotéine NP. Afin d’obtenir une autorisation d’essai clinique chez l’homme (Phase IIA, III), il est nécessaire de réunir suffisamment de données concernant l’efficacité et l’innocuité de ce candidat-vaccin in vivo. Une preuve de concept de l’efficacité et de l’innocuité du candidat-vaccin seul ou coadministré avec un vaccin saisonnier ou avec un adjuvant sera effectuée dans un modèle physiopathologique infectieux, c'est-à-dire après inoculation de la grippe. La production et le contrôle qualité des vaccins répondent à des normes très strictes (réglementation européenne et bonnes pratiques de fabrication) qui doivent être respectées pour la libération des lots de vaccin, la surveillance de sa sécurité et son contrôle pour une utilisation chez l’homme. Un test chez la souris, comme contrôle de l’activité biologique est imposé à la libération des lots, et également dans les études de stabilité réalisées suivant les ICH pour contrôler une potentielle évolution des vaccins au cours du temps, et dans les conditions de stockage définies (température, humidité de l'air, lumière). Le suivi en stabilité permet de définir la date limite d’utilisation du vaccin.
Procédures
Tous les animaux du projet vont recevoir 2 injections dans le muscle de la patte sans anesthésie préalable. Ces injections sont espacées de 21. Pour 70% des animaux, seul un prélèvement de sang sera réalisé au jour de la mise à mort de l'animal. Avant chaque prélèvement de sang, une goutte d'un collyre anesthésique local (Tétracaïne). 30% des animaux seront infectés par voie intra-nasales sous anesthésie profonde (70 mg/kg de Kétamine et 9 mg/kg de Xylazine, par injection intra-péritonéale)
Impact sur les animaux
Pour les procédures (Comparaison de l’efficacité d’un candidat vaccin contre la Grippe, Etude de la co-admnistration avec un vaccin saisonnier grippe et le dernier etude d’activité biologique et stabilité de un candidat vaccin contre la Grippe) du projet aucune souffrance des animaux n'est attendue. Le geste de l'immunisation intramusculaire est très peu invasif pour l'animal. Également, les volumes injectés ne dépassent pas 50μl évitant au maximum tout type de douleur musculaire et aucune souffrance n'est attendue en réponse aux formulations vaccinales injectées. La procédure Etude de protection contre une infection virale pour évaluer l’efficacité des candidat-vaccins, l'infection virale peut entraîner une perte de poids chez les animaux.
Devenir
L'ensemble des animaux du projet sont mise à mort lors de chaque procédure.
Remplacement
L'efficacité d'un vaccin dépend de sa capacité à induire une réponse immunitaire, avec un mécanisme d’action spécifique, un phénomène biologique complexe faisant intervenir différents types de cellules immunitaires et une organisation particulière qui rend impossible son étude dans des tests in vitro. De plus, les tests de protection contre une infection virale ne peuvent être menés que par des études in vivo. Pour la procédure: Etude de protection contre une infection virale pour évaluer l’efficacité des candidat-vaccins, nous étudions et essayons de mettre en place un test in vitro qui puisse répondre aux exigences de la réglementation pour remplacer les études sur les animaux, mais cette étude est toujours en recherche.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit à minima sans compromettre les objectifs du projet. Pour obtenir des résultats statistiquement interprétables, des groupes de 6 souris sont nécessaires dans les procédures (Comparaison de l’efficacité d’un candidat vaccin contre la Grippe, Etude de la co-admnistration avec un vaccin saisonnier grippe ). Des groupes de 10 souris sont nécessaires dans les procédures ( Etude de protection contre une infection virale pour évaluer l’efficacité des candidat-vaccins ou pour l'etude d’activité biologique et stabilité de un candidat vaccin contre la Grippe) pour l’utilisation d’un test plus performant et une analyse statistique plus stricte pour la libération de lots vaccins. L’analyse et l’estimation du nombre d'animaux à utiliser se font en amont de l’expérimentation.
Raffinement
Les souris seront acclimatées durant une semaine au PBES. L’immunisation est réalisée par voie intra musculaire. C’est une voie permettant l’obtention d’une bonne réponse immunitaire et qui est peu invasive pour l’animal. Les animaux en expérimentation sont observés au moins une fois tous les 2 jours et ce pendant 7 jours après les immunisations. Enfin, avant chaque prélèvement de sang, un collyre anesthésique local sera appliqué. Pour la procédure Etude de protection contre une infection virale pour évaluer l’efficacité des candidat-vaccins, les infections virales intra-nasales sont réalisées sous anesthésie profonde. De jour 43 à jour 56 après infection les souris feront l’objet d’une surveillance régulière et seront pesées quotidiennement pendant 2 semaines, un point limite est fixé à une perte de 20% de poids du poids initial.
Choix des espèces
Une partie des réponses immunes médiées par les lymphocytes T sont initiées dans les ganglions lymphatiques, qui drainent le site de l’immunisation, et qui vont pouvoir circuler dans les divers organes lymphoïdes et certains tissus comme le parenchyme pulmonaire. Cependant, aucun modèle in vitro n’est actuellement capable de reproduire une telle dynamique de circulation. Egalement, de nombreuses études déjà réalisées sur le modèle souris avec ce pathogène permettent d'optimiser les essais en limitant au maximum le nombre d'animaux, ainsi que la souffrance de l'animal. Le choix du modèle souris est donc adapté, et également imposé par son utilisation dans les tests précliniques des compagnies pharmaceutiques. Nous allons utiliser des animaux sevrés de 6 semaines à 12 semaines. Le système immunitaire est décrit comme mature à partir de cet âge là et non vieillissant.
Développement d’une biothérapie pour une maladie rare : Syndrome d’ostéolyse carpotarsienne multicentrique (MCTO) (2022-I-002)
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
16 270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent un modèle d'une maladie osseuse rare avec atteinte rénale, reçoivent des injections de vecteurs lentiviraux, des prélèvements de sang et d'urine et une biopsie d'oreille, puis sont toutes tuées pour analyse des organes, pour une preuve de concept thérapeutique. Le porteur annonce un bénéfice "certain à long terme" pour les patients, formulé au conditionnel, face à ce nombre très élevé d'animaux mobilisés d'emblée. Il affirme le recours au modèle animal "inévitable" malgré des tests menés in vitro et une recherche bibliographique.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de développer une nouvelle approche thérapeutique pour une maladie osseuse avec troubles renaux associés. En effet, il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement curatif pour cette maladie. Les seules approches thérapeutiques actuellement utilisées sont des approches palliatives et seulement pour certains symptômes de la maladie notamment les problèmes rénaux associés.
Bénéfices attendus
Ce projet va nous permettre de faire la preuve de concept chez l’animal d’une approche thérapeutique pour cette maladie. Il s’agit d’une maladie rare sévère pour laquelle à l’heure actuelle il n’existe aucune approche thérapeutique. Dans le cas où cette approche fonctionnerait cela nous permettrait de continuer le développement dans le but d’apporter un jour un traitement efficace pour les patients. Il s’agit donc d’un bénéfice certains à long terme pour ces patients.
Procédures
Les animaux sont soumis à des injections de vecteurs lentiviraux (30 secondes), ainsi que des prélevements de sangs (5 minutes) et d'urine (30 minutes). Les prélèvements de sang sont sur animal anesthésié et un animal aura maximum de 3 prélèvements dans sa vie. Les prélèvements d'urine se font sur animal non anesthésié et un maximum de 6 prélèvements sera fait Les animaux auront également une biopsie d'oreille pour savoir s'ils sont porteur de la maladie (20 secondes).
Impact sur les animaux
Le modèle de souris utilisé dans ce projet présente les signes cliniques caractéristiques de la maladie. En effet, ces animaux sont de plus petite taille et présentent un poids inférieur par rapport aux souris non malades de même âge. Cependant les chercheurs ayant générés ce modèle ne rapportent aucun problème pour ces animaux à se mouvoir ou à s’alimenter. Les souris ont également une altération de la fonction rénale et une ostéoporose associée à une destruction partielle des os des pattes chez la souris malade. Toutes ces altérations sont caractéristiques de la pathologie.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés. En effet, le projet nécessite d'étudier la structure des organes afin de vérifier l'efficacité du traitement testé et cela ne peut se faire que sur animal euthanasiés.
Remplacement
Globalement, la production du traitement et l’optimisation se fait et continue à se faire en se basant sur des publications scientifiques, et sur un certain nombre de tests in vitro réalisés sur cellules. Une importante recherche bibliographique a été effectuée afin d’identifier les cellules atteintes lors de la pathologie et ainsi développer un traitement le plus ciblé possible. Cependant l’utilisation du modèle animal de la maladie est inévitable afin de déterminer le bénéfice thérapeutique ainsi que d’évaluer les potentiels effets toxiques du traitement.
Réduction
Le juste nombre d’animaux a été calculé de manière à réduire le nombre minimum d’animaux par lot, tout en produisant des résultats statistiquement significatifs et robustes. De manière à répondre aux exigences de réduction, nous allons utiliser des groupes contrôles en commun chaque fois que cela est possible. Globalement, un ensemble de 10-12 animaux par groupe sera suffisant pour valider l’efficacité d’un traitement. Ce modèle étant un nouveau modèle de souris, il est possible que ce nombre soit amené à changer au cours des études et des différents résultats obtenus. Ce nombre est basé sur nos expériences passées avec différents modèles animaux de maladies osseuses.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe à maximum 5 par cage. Chaque cage contient une tige en papier, un igloo et une buchette de peuplier afin de satisfaire l’instinct naturel des souris à ronger et éviter les malocclusions des incisives. Le suivi quotidien (weekends et jours fériés inclus) des animaux par le personnel de l’établissement utilisateur et les visites régulières des expérimentateurs (à minima trois fois par semaine) nous permettront de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. En cas d'altération de l'état de l'animal, la surveillance sera rapprochée et les animaux seront soignés en fonction de la sévérité de la douleur observée. Les procédures mises en place dans ce projet ne nécessitent aucune analgésie particulière. En cas d'apparition d'une souffrance ou toxicité inattendue, les animaux seront exclus de l'étude et euthanasiés dans les 24 heures.
Choix des espèces
Ce projet ne peut pas se faire sans modèle animal car avant de pouvoir envisager un traitement, et de commencer une étude clinique sur les patients souffrant de la maladie, il est nécessaire de démontrer que les molécules choisies ont l'effet attendu au niveau du modèle animal de la maladie, et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs. Ce modèle de souris est pertinent car il a été construit pour mimer la pathologie et en effet, les auteurs du papier original démontrent bien que les principales caractéristiques de la pathologie sont retrouvées. Les animaux seront utilisés de la naissance jusqu’à environ 52 semaines maximum afin de pouvoir caractériser chacune des étapes du développement de la pathologie.
Système nerveux autonome
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
300 rats vont être utilisés, dont 250 opérés sous anesthésie et tués sans réveil et 50 réutilisés après avis vétérinaire, dans des procédures impliquant selon les cas un niveau de souffrance modéré. On leur pose un cathéter dans la carotide ou un implant de télémétrie dans l'aorte, puis on provoque à plusieurs reprises une chute de tension par basculement brutal de leur position, pour tester des médicaments contre l'hypotension orthostatique. Le porteur affirme ces modèles "nécessaires" à la mise sur le marché de nouveaux médicaments et juge qu'ils "ne peuvent pas être remplacés" par des méthodes alternatives. L'impact du produit lui-même est déclaré faible, l'atteinte venant surtout de la chirurgie et des manipulations.
Objectifs
L’hypotension orthostatique est définie comme une chute brutale de la pression artérielle qui survient lors du passage de la position couchée à la position debout. Par gravité, le passage en position debout résulte en une accumulation sanguine dans le pool veineux (jambes) qui en retour induit une diminution transitoire du retour veineux, du débit cardiaque et de la pression artérielle. Chez le patient sain, la pression artérielle revient rapidement à des valeurs normales grâce au mécanisme réflexe sympathique. Toutefois, certains médicaments, tels que les antagonistes des récepteurs adrénergiques ou les vasodilatateurs (les antagonistes des récepteurs à l’angiotensine II par exemple), diminuent ce réflexe sympathique, aggravant l’hypotension orthostatique et pouvant ainsi conduire à l’étourdissement et la perte de connaissance. Ces effets secondaires peuvent réduire considérablement le champ d’application thérapeutique de ces médicaments et limiter leur utilisation clinique. Les tests décrits dans ce projet ciblent l'évaluation des effets de substances dans le cadre de développement préclinique de produits pharmaceutiques. Ces modèles sont mis en place et utilisés afin de tester l'efficacité de médicaments (par la réduction de cette hypotension) ou de s'assurer qu'ils n'induisent pas eux-mêmes une hypotension orthostatique pouvant conduire à une syncope.
Bénéfices attendus
Les modèles décrits dans ce projet sont nécessaires à la découverte et à la mise sur le marché de nouveaux médicaments efficaces pour traiter les problèmes d'hypotension orthostatiques, ou à la recherche de tels effets secondaires de certains traitements (pour les caractériser voire pour aider à affier leur champ d'application).
Procédures
Dans le modèle anesthésié, les animaux sont anesthésiés jusqu'à la fin de la procédure (sans réveil). Un cathéter est positionné dans une artère carotide pour la mesure en continue de la pression artérielle et de la fréquence cardiaque. L'hypotension orthostatique est provoquée (en plusieurs occasions) par un changement abrupte de position de l'animal qui passe d'une position horizontale à une position inclinée. Pour les besoins de l'étude, des prélèvement de sang peuvent être réalisés (sous anesthésie) pendant le test et/ou en fin de test (immédiatement avant la mise à mort). La procedure (sous anesthésie) n'excède pas 2 heures et les animaux sont immédiatement mis à mort (sans reveil préalable). Dans le modèle éveillé, les animaux sont dans une première phase équipé (sous anesthésie) d'un implant de télémétrie qui permet l'enregistrement en continue de la pression artérielle (par cathétérisme de l'aorte abdominale) et de la fréquence cardiaque. Après réveil et une période de récupération (généralement une semaine au minimum), l'hypotension orthostatique est provoquée (sous anesthésie gazeuse légère et transitoire) par un changement abrupte de position de l'animal (appelé procédure de Tilt) qui passe d'une position horizontale à une position inclinée. Cette procédure de Tilt peut-être répétée en plusieurs occasions et à des jours différents. Pour les besoins de l'étude, des prélèvements de sang peuvent être réalisés (sur animal vigile ou anesthésié au gaz isoflurane) pendant le test et/ou en fin de test.
Impact sur les animaux
Des effets toxiques majeurs ne sont pas attendus. A ce stade du développement du médicament, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Il n’est donc pas attendu de sévérité forte liée au médicament. Dans le modèle chez le rat éveillé, certaines périodes d'hébergement en cage individuelle (avec enrichissement) sont cependant nécessaires: 1) pendant la phase de récupération post-chirurgicale, afin d'éviter que les animaux ne retirent les agrafes/sutures de leurs congénères (généralement pour un période d'une semaine maximum); 2) pendant les mesures (généralement un peu plus de 24h), car le système de télémétrie ne fonctionne qu'avec une fréquence d'émission des signaux. Un hébergement groupé ne permet donc pas d'identifier la source d'émission d'un signal (interférence entre les implants).
Devenir
Pour les procédures modérées, les animaux peuvent être réutilisés après l’approbation du vétérinaire. Pour les procédures sans réveil, les animaux ne sont pas réutilisable.
Remplacement
Les tests/modèles que nous souhaitons développer et valider dans ce projet ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur la capacité de régulation du système nerveux autonome. Les techniques, décrites et validées dans ce projet, sont utilisées dans divers modèles animaux qui ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur la capacité de régulation du système nerveux autonome, l'intégrité du système nerveux autonome ne pouvant être respecté que chez l'animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif. Dans la procédure mise en place chez l'animal anesthésié et dans la mesure du possible (dépend de la durée d'action de la substance testée), plusieurs doses d'une même substance peuvent être testées chez le même animal, réduisant aisni le nombre d'animaux utilisés. Dans la procédure mise en place chez l'animal éveillé et dans la mesure du possible (dépend de la durée d'action de la substance testée), plusieurs doses d'une même substance peuvent être testées chez le même animal à des jours différents, réduisant aisni le nombre d'animaux utilisés. Nos analyses statistiques (basées sur des analyses de variances et test de Dunnett) indiquent qu’un effectif de 8 animaux par groupe (nombre de groupes variables, 2 en standard) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Dans le but de réduire le nombre d’animaux (dans l’application de la règle des 3R), certains animaux issus du modèle chez le rat éveillé (étude par télémétrie) peuvent également être réutilisés aux strictes conditions qu’ils n’aient pas subi de procédures sévères et après accord du vétérinaire.
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs et suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur le système nerveux autonome du rongeur est prédictif de leur efficacité en clinique. Principalement rats sevrés, âge variant entre 3 semaines et 6 mois, conformément aux données historiques, à la bibliographie scientifique.