Recherche appliquée

500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur mammaire ou une injection de cellules tumorales dans la veine caudale, une chimiothérapie et jusqu'à six cycles de thérapies dites innovantes, avant une exsanguination terminale par ponction intracardiaque, pour étudier la réponse immunitaire au cancer du sein après traitement. Le porteur décrit une tumeur à croissance rapide pouvant provoquer nécrose, ulcérations cutanées et hémorragies douloureuses. Il juge une étape in vivo "nécessaire" pour se rapprocher de la clinique humaine.

Objectifs

L’objectif du projet est d'évaluer l'impact de la chimiothérapie conventionnelle sur la réponse antitumorale, particulièrement la réponse du système immunitaire sur des tumeurs mammaires murines implantées chez des souris, au niveau du site primaire et des métastases, afin de caractériser des acteurs moléculaires pertinents pouvant être cibler par une thérapie innovante. Le projet global consiste à étudier la réponse du carcinome mammaire et de son environnement immunitaire après chimiothérapie dans un modèle syngénique murin immunocompétent comparé un modèle immunodéficient afin de définir : 1. L’efficacité de la chimiothérapie sur la tumeur initiale et le développement autonome des métastases incluant la caractérisation du programme de mort déclenchée dans les cellules tumorales sensibles et notamment la voie cGAS/STING 2. le remaniement du microenvironnement tumoral qu’il induit, particulièrement au niveau immunitaire (immunité innée et adaptative) locale (tumeur primaire) et systémique (métastases, ganglion de drainage, sang) 3. la nature des clones tumoraux qui résisteront au traitement 4. la réponse immunosuppressive locale qui a permis l’établissement des métastases 5. les stratégies thérapeutiques ciblant les acteurs de mort cellulaire et de réponse anti-tumorale immunitaire pouvant amplifier les effets de la chimiothérapie en diminuant les cellules lui échappant

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est de participer au rétablissement d’une réponse immunitaire antitumorale locale et/ou systémique efficace grâce à la caractérisation et au ciblage des voies de signalisation participant à l’échappement tumoral entre la tumeur et son microenvironnement immunitaire. L’évasion immunitaire dont bénéficie la tumeur repose sur des processus intrinsèques à la tumeur ou sur sa capacité à corrompre l’environnement tissulaire dans lequel elle évolue et l’effet cytotoxique direct d’une chimiothérapie efficace modifie l’équilibre initial. A court et moyen terme, il va donc être important de déterminer le type de mort que les cellules tumorales vont déclencher sous l’effet de la chimiothérapie, et la nature des signaux d’alarme libérés dans l’espace tumoral ainsi que leur cinétique de sécrétion. Ces signaux de nature variée (incluant métabolites, cytokines, acides nucléiques, vésicules, organites...) influent sur les autres cellules tumorales ou immunitaires au niveau local ou systémique, contribuant à l’adaptation de la tumeur, du système immunitaire et finalement à la récidive de la maladie. Ceci va permettre de générer des données biologiques intégrant le caractère inflammatoire et/ou immunomodulateur de la mort cellulaire induite par le traitement anticancéreux au niveau de la tumeur primitive (ou sa maladie résiduelle quand une exérèse a été pratiquée) ou des métastases associées. A moyen et long terme, ceci permettra d’identifier les processus cytotoxiques qui seront capables de favoriser une réaction immunitaire antitumorale locale et systémique, en l’associant éventuellement avec les approches d’immunothérapie actuellement en cours de développement.

Procédures

Chaque animal de l’étude recevra : • une allogreffe tumorale au niveau 4e coussinet mammaire après incision cutanée et sous anesthésie générale (durée : 20 minutes) avec exérèse tumorale chirurgicale sous anesthésie générale 1é jours plus tard (durée : 20 minutes) o u une injection intraveineuse de cellules tumorale dans la veine caudale sans allogreffe associée (durée : 5 minutes) • 3 injections de chimiothérapie par voie intra-péritonéale sur animal vigile (durée : 2 minutes) • Administration d’une ou de plusieurs thérapies innovantes (jusqu’à 6 cycles par animal) par voie intra-péritonéale ou per os/gavage sur animal vigile ou sous anesthésie générale (durée : 2-5 minutes) • 5 séances de bioluminescence après anesthésie générale et injection intra-péritonéale de Luciférine (durée : 30 minutes) • Une exsanguination terminale par ponction intra-cardiaque sous anesthésie générale injectable juste avant la mise à mort (durée : 15 minutes)

Impact sur les animaux

Le modèle 4T1 est un modèle de cancer mammaire montrant une croissance tumorale rapide et une extension métastatique précoce notamment au niveau du poumon dans les premiers stades puis au niveau de divers organes ensuite (foie, os, rate, cerveau). La croissance de la tumeur et des ses métastases peut provoquer des effets indésirables sur les animaux recevant cette lignée. Tout d’abord au niveau local d’implantion de la tumeur primaire (dans le coussinet mammaire de la 4e mamelle), l’animal peut subir une nuisance mécanique de la tumeur par son volume pouvant compliquer sa mobilité et son activité. La tumeur primaire, par sa croissance rapide, peut montrer une nécrose centrale par hypoxie, associée à des remaniements cutanés ulcératifs et hémorragiques entraînant une douleur pour l’animal. Ces nuisances au niveau du site local seront réduites par l’exérèse précoce (J12) de la tumeur et seront absentes dans le modèle métastatique par injection de cellules tumorales dans veine cave caudale. Au niveau des différents sites métastatiques, on peut observer des difficultés fonctionnelles de(s) différent(s) appareil(s). Notamment au niveau du poumon, une dyspnée peut être observée, due à la présence mécanique des métastases et/ou à la présence d’un hydrothorax ainsi qu’au niveau de la moelle osseuse avec des fractures spontanées par présence mécanique de la masse dans le fût osseux. De manière plus générale, l’animal peut être touché par des signes plus généraux de mauvais état général comme la perte de poids et d’appétit ainsi qu’une hypothermie persistente. Des observations et examens cliniques seront réalisés très régulièrement afin de mettre en lumière les animaux montrant des signes cliniques atteignant des points limites pour leur administrer un analgésique en cas de signes de douleur (opioïdes) ou procéder à une mise à mort anticipée.

Devenir

Dans le cas d’une allogreffe tumorale (Procédure 1), la tumeur sera analysée par une séance de Bioluminescence puis sera traitée par une séance de chimiothérapie -avec ou sans traitement innovant- avant l’exérèse de sa tumeur. Dans le cas d’une injection intraveineuse de cellules tumorales (Procédure 2), l’animal subira seulement une injection dans la veine caudale des cellules 4T1 sans chimiothérapie néo-adjuvante ni exérèse tumorale. Ensuite, dans tous les cas (Procédures 1 et 2), les animaux recevront 4 séances d’analyse par bioluminescence et 3 séances de chimiothérapie -avec ou sans traitement innovant-. A la suite de la dernière séance d’analyse par bioluminescence, l’animal sera laissé endormi pour une exsanguination précédent la mise à mort.

Remplacement

Le projet s’intéresse à la caractérisation des mécanismes d’échappement tumoral au système immunitaire, notamment dans la niche métastatique. Il est très compliqué de mimer in vitro une implantation métastatique ectopique complexe dans un terrain pulmonaire riche en divers éléments micro-environnementaux comme notamment les acteurs locaux de l’immunité innée et acquise. Une étape in vivo est donc nécessaire afin de se rapprocher au plus près des conditions de clinique humaine, afin d’observer finement les mécanismes d’action des cellules tumorales et immunitaires dans la niche tumorale. Toutefois, avant implantation in vivo dans la souris, la lignée 4T1-Luc2 sera étudiée in vitro dans sa réponse aux traitements et dans les caractéristiques de résistance à ce dernier. Les prélèvements obtenus par l’expérience in vivo seront analysés ex vivo afin d’en tirer des acteurs moléculaires pertinents qui seront validés, in vitro, sur cultures cellulaires ou organoïdes, puis ciblés par des molécules afin de retourner au modèle in vivo murin dans un dernier temps.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombres d’animaux utilisés, le personnel est formé aux outils statistiques appliqués à l'expérimentation animale (planification, randomisation et analyse) par l’utilisation de traitements statistiques des données (ANOVA, Bartlett,…). Les protocoles d’injection et d’exérèse du modèle 4T1, issus de la bibliographie, sont validés et robustes permettant une prise tumorale optimale sur l’ensemble des individus de la cohorte, limitant l’utilisation d’animaux dont les prélèvements se révèlent non analysables. L’ensemble du protocole expérimental sera précisément défini en amont afin de limiter les biais de non homogénéité entre lots de souris. L’expression par la lignée 4T1 de la luciférase facilite une quantification précise de la croissance tumorale et de l’extension métastatique, réduisant donc le nombre d’animaux pour atteindre des résultats statistiquement significatifs. Elle permet aussi un suivi cinétique non invasif des masses et donc sans sacrifice à différents temps de lots d’animaux. Le personnel collaborera avec d’autres équipes, notamment dans le partage des animaux (les animaux disponibles devenus trop âgés pour la greffe ou de sexe masculin) et dans le partage des données notamment par la mise en commun des données et des expertises analytiques.

Raffinement

Le bien-être des animaux de l’étude sera particulièrement porté à l’attention du personnel qui veillera aux meilleures conditions d’hébergement possible, notamment via un maintien des groupes sociaux (3-4 animaux par cage) et l’enrichissement de l'habitat (frisottis de papier ajoutés aux cages). La gestion du stress des animaux sera maximisée, par une contention la plus rapide et la moins fréquente possibles. Différents lieux accueilleront les animaux pour un distanciation maximale entre les lieux d’hébergement, de soins et de sacrifice. Enfin, la douleur des animaux utilisés sera fréquemment monitorée par un examen clinique des animaux tous les 2-3 jours (et tous les jours en fin d’expérimentation) afin de déterminer le plus précocément possible les points critiques chez un animal et d’adapter le protocole d’analgésie (c.f. Annexe 5).

Choix des espèces

La souris est l’espèce de choix pour ces essais : - modèle 4T1 de cancer du sein décrit précisément dans la bibliographie pour les souris immunocompétentes Balb/c - concordance du modèle 4T1 murin avec les observations cliniques chez les patientes femmes atteints d'un carcinome mammaire et sur son évolution métastatique - Similitudes de la physiologie et de la taille du génome entre la souris et l'homme - l'organisme murin évolue rapidement (courte durée de vie) et permet des analyses compatibles avec les impératifs de progrès thérapeutiques à apporter en clinique humaine -certaines souches sont génétiquement modifiées, permettant la création de modèles tumoraux particuliers (absence du système immunitaire pour mettre en lumière le rôle de ce dernier dans l’échappement au traitement des cellules tumorales). Les animaux utilisés ont un âge qui varie entre 6-8 semaines à leur inclusion dans le protocole. En effet, la prise tumorale est dépendante de l'imprégnation hormonale : plus elle est précoce et prolongée, plus le taux de prise de greffe est important. Dans le cas des modèles 4T1, elle est estimée à proche de 100% dans ses conditions chez les souris immunocompétentes d'après la bibliographie existante. De plus, le temps de latence estimé avant prise tumorale est de 2-3 semaines et les métastases sont détectables à partir de 4-5 semaines : les souris auront atteint l'âge adulte, un âge où elles pourront supporter le développement de la tumeur.

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à une course de deux heures sur tapis roulant en pente descendante, destinée à provoquer des microtraumatismes musculaires, avec prélèvements de sang et de fèces, puis tuées pour recueil de matériel biologique, afin de tester un extrait de microalgue censé accélérer la récupération. Le porteur situe l'objectif du côté des stratégies nutritionnelles pour sportifs, tandis que les lésions musculaires sont provoquées volontairement. Il affirme que l'étude des relations entre alimentation et activité physique ne peut s'envisager que chez l'animal.

Objectifs

La principale conséquence de lésions musculaires induites par l'exercice pour l'athlète est la perte de la fonction musculaire squelettique et la douleur. C'est pourquoi de nombreux nutriments et aliments fonctionnels ont été étudiés pour leur capacité à atténuer les effets de ces lésions et à accélérer la récupération, ce qui est l'objectif de nombreuses stratégies nutritionnelles pour les athlètes. Dans cette étude, nous cherchons à évaluer l'effet d'un extrait de microalgue sur la récupération musculaire suite à un test de blessure provoquée par un exercice physique.

Bénéfices attendus

Dans cette étude, nous évaluerons la capacité d'un extrait de microalgue à atténuer les effets de lésions musculaires et à accélérer la récupération suite à un exercice physique. Des modifications métaboliques seront identifiées par des dosages des marqueurs des voies du métabolisme énergétique et musculaire. Des marqueurs inflammatoires et du stress oxydant seront également recherchés.

Procédures

Un prélèvement de sang sur animal vigile sera réalisé au début de l'étude. Deux recueils de fèces seront effectués à 4 semaines d'intervalle (isolement en cage individuelle pendant 1h au maximum). Une course de 2h (+20 min d'habituation/échauffement) sur tapis roulant aura lieu en fin de protocole.

Impact sur les animaux

La course sur tapis roulant peut engendrer un stress chez l'animal. Au lieu d'une période d'acclimatation typique qui dure de quelques jours à plusieurs semaines, une brève période d'acclimatation au début de la séance d'exercice sera réalisée. Les souris seront placées sur un tapis roulant stationnaire pendant quelques minutes pour leur permettre de se familiariser avec l'environnement de course avant une augmentation progressive de la vitesse et de la pente pendant 20 minutes. Cette période a pour but de réduire le stress provoqué par un environnement nouveau tout en prévenant toute adaptation au protocole de course qui est connu pour atténuer de manière significative les effets nocifs sur les muscles . Les blessures causées par ce type de course en pente descendante sont de l'ordre de microtraumatismes musculaires et courbatures.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront mis à mort pour recueil du materiel biologique nécessaire aux analyses.

Remplacement

L'étude des relations entre alimentation et activité physique ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Aucun modèle in vitro n’a pour l'instant la capacité d’intégrer cette complexité multifactorielle.

Réduction

Le nombre d'animaux est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre les groupes. Des études du même type portent sur 8 à 10 animaux, du fait de la forte variabilité entre animaux au niveau de la performance sportive. Nous travaillerons avec 9 animaux par groupe afin que le nombre d'animaux par cage soit homogène (3 souris par cage). Nous chercherons à mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre 3 groupes ou plus à l'aide de tests statistiques non paramétriques de Kruskall-Wallis. Dans le cadre de comparaisons entre 2 groupes, un test statistique de Mann-Whitney sera appliqué.

Raffinement

Les animaux sont hébergés par groupe de 3 animaux par cage. L'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique et de matériel de nidification (bandelettes de papier kraft). Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Les animaux seront observés hebdomadairement afin de détecter des comportements agressifs de certains animaux, si tel est le cas l'animal agressif sera isolé de ses congénères dans une cage individuelle. Si un animal est blessé, il sera soigné par badigeonnage de bétadine sur la zone lésée, il sera également isolé le temps de la cicatrisation de ses blessures. Dans tous les cas, les animaux isolés resteront en contact visuel, olfactifs et auditifs avec leurs congénères. La course sur tapis roulant pouvant engendrer un stress chez l'animal, afin de limiter ce stress, chaque souris sera placée sur le tapis roulant fixe pendant quelques minutes afin de se familiariser avec l'environnement. Pendant les 20 premières minutes d'exercice, les animaux seront familiarisés avec le tapis roulant à une vitesse lente et régulière, qui sera progressivement augmentée. Au cours des phases d’exercice sur tapis, les animaux bénéficieront d’une surveillance constante. Si un animal venait à se blesser pendant la course (contusion), ils seraient alors immédiatement pris en charge selon les recommandations du vétérinaire référant. Pour chaque procédure, des points limites spécifiques et des points d'arrêt ont été définis.

Choix des espèces

La souris est un modèle classiquement utilisé dans les études concernant la mobilisation des ressources énergétiques, notamment au cours d’un exercice imposé. Le modèle C57Bl/6J est une souche reconnue pour ce type d'expérimentation. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondant tels que le vieillissement.

864 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une transplantation chirurgicale d'îlots pancréatiques sous la capsule rénale ou par voie intraportale et des injections répétées, après induction d'un diabète, pour tester une molécule censée améliorer la survie des greffons. Le porteur renvoie l'application clinique au conditionnel, les résultats devant "facilement" être transposés, tandis que les souris sont rendues diabétiques puis opérées. Il indique avoir mené des essais in vitro préliminaires mais affirme qu'"aucune méthode alternative" ne permet d'aller plus loin.

Objectifs

Notre projet porte sur l'application préclinique de nouveaux composés ciblant une voie innovante que nous avons identifiée chez les mammifères, et dont les inhibiteurs peuvent prévenir les lésions tissulaires induites par l'ischémie associées au processus de transplantation. Après avoir démontré leur efficacité dans un modèle préclinique de transplantation rénale et d'accident vasculaire cérébral, notre objectif est d'évaluer leur utilité dans la transplantation d'îlots pancréatiques, connue pour être une thérapie curative du diabète de type 1. Les applications cliniques ont clairement montré que cette procédure améliore le contrôle glycémique chez les patients mais elle présente certaines limites liées à la survie des Îlots.

Bénéfices attendus

L'objectif de cette étude est de déterminer l'efficacité de notre traitement pour améliorer le rendement, la survie et la fonctionnalité des îlots avant et après transplantation. Les résultats pourront ainsi être facilement transposés à la clinique.

Procédures

Les animaux receveurs seront soumis à une procédure chirurgicale de transplantation soit sous la capsule rénale (procédures 1 et, 2) soit par voie intraportale (procédure 3). Les actes chirurgicaux seront effectués une seul fois par animal et dureront le moins longtemps possible (20-30 minutes max). Les animaux bénéficieront d'un suivi journalier dans les premiers jours post-opération. Les animaux seront soumis à des injections IP (avec aiguille G25), selon la procédure, avec des produits (médicaux ou pharmacologiques) qui n’entrainent aucune souffrance physique.

Impact sur les animaux

Les souris diabétiques développeront l'hyperglycémie typique de cette pathologie qui sera monitorée par bandelettes. Le traitement pharmacologique préconisé dans les procédures utilise un produit déjà breveté qui ne cause aucune toxicité pour l'animal. Les animaux receveurs qui subiront une procédure chirurgicale seront attentivement suivis afin d'éviter toute complication post-opératoire (infection, inflammation et douleur).

Devenir

Les animaux seront tous euthanasie à la fin de chaque procedure ou lors qu'ils attaignent le point limite identifié.

Remplacement

Des études préliminaires sur lignée cellulaire (INS-1E) et îlots primaires isolés de souris nous ont permis 1) d'établir la concentration optimale du produit pour obtenir la meilleure survie et fonctionnalité des îlots pancréatiques et 2) de démontrer la capacité de notre composé à protéger les îlots en culture des phénomènes d’anoxie. Toutes ces étapes d'optimisation ont été effectuées in vitro avec un nombre très limité d'îlots par rapport aux expériences de transplantation. Néanmoins, aucune méthode alternative au modèle in vivo n’est disponible pour aller plus loin dans notre étude.

Réduction

Les études d'optimisation in vitro nous ont permis de réduire le nombre de souris nécessaire pour les procédures chirurgicales. En plus, selon les résultats obtenus dans les procédures 1 et 2, nous pourrons éventuellement choisir un seul type de préparation d'îlots avant transplantation (pré- ou per-conditionnement), en réduisant le nombre des souris nécessaires dans la procédure 3. Le nombre de souris utilisé dans l'étude est strictement calculé pour obtenir des résultats statistiquement concluants.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe et en milieu enrichi. Ils seront surveillés quotidiennement (comportement, apparence, signes cliniques) par le personnel animalier d'une part, et par les personnes en charge de l'expérimentation d'autre part. Toute apparition de signes de douleur tels que prostration, dos vouté, isolement et poil hérissé entrainera l’ouverture d’une fiche de score avec des points limites bien définis qui entraineront l'euthanasie de l‘animal par dislocation cervicale. Une attention particulière sera portée au point d’injection abdominal (rougeur) et à la zone de chirurgie pour les animaux transplantés.

Choix des espèces

Aucune méthode alternative ou modèle in vitro n’est disponible pour aller plus loin dans notre étude. En effet, la complexité des organes ne peut être récapitulée in vitro, ni le modèle d’ischémie et reperfusion. Les alternatives d’anoxie et d’hypoxie in vitro sont limitées dans leur mise œuvre et dans la pertinence des résultats obtenus. Les animaux seront utilisés entre 8 et 10 semaines post-natales qui est par expérience l’âge optimal pour la chirurgie.

9 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un traitement laser oculaire sous anesthésie puis des séances d'imagerie sur trois semaines, pour qu'une entreprise vérifie que son laser de traitement de la rétine ne provoque pas de cataracte avant un passage chez l'humain. Le porteur indique qu'une cataracte est possible, voire systématique dans le groupe le plus exposé, avec perte définitive de la vision de l'œil traité et stress pouvant entraîner une perte de poids. Il affirme que l'essai doit "obligatoirement" être mené in vivo et présente le lapin comme le seul animal à l'anatomie oculaire proche de l'humain.

Objectifs

Une société Suisse a développé un traitement laser (proche infrarouge) des maladies chroniques de la rétine (DMLA, glaucome, Rétinopathie diabétique) qui a pour but d’interagir avec le métabolisme cellulaire rétinien. Dans ce cadre, elle souhaite réaliser une expérimentation animale préliminaire pour vérifier que la technologie laser utilisée n’est pas cataractogène. L’apparition de cataracte est liée soit à un effet photothermal du laser (échauffement de tissus absorbant l’énergie laser comme l’iris) et/ou à un effet photo-chimique. Le traitement laser étudié n’étant pas ciblé sur l’iris et le cristallin étant optiquement transparent (absorption de l’énergie faible à nulle), il est supposé que l’effet photothermal du laser utilisé sera négligeable et non associé à un risque de cataractogenèse. Néanmoins, un effet photochimique (réaction chimique catalysée par la lumière) ne peut être exclu et est variable en fonction de l’intensité d’énergie utilisée. La présente étude propose ainsi d’évaluer l’absence de cataractogenèse liée au traitement laser étudié 1/à une énergie de travail qui serait utilisée chez l’Homme, 2/à une énergie seuil de référence (énergie maximale autorisée par législation par exemple), 3/ainsi qu’une énergie très supérieure à la dose maximale utilisée. Sera étudiée à court terme l’apparition d’une cataracte dans le cristallin de lapins après les tirs lasers.

Bénéfices attendus

Ce projet permetterait de connaître la sécurité pour le cristallin de l'utilisation d'un laser innovant ayant pour but de traiter des rétinopathies chroniques jusqu'ici très difficile à traiter voir impossible. Avec les résultats de ce projet, l'entreprise developpant ce dispositif pourra alors se tourner vers une étude clinique.

Procédures

Les 9 animaux recevront à j0 un traitement laser sans contact, sans docking et sous anesthésie générale qui a une durée théorique de 1 minute. Puis à J0 (postlaser immédiat), J1, J7, J14 et J21, la rétine et le cristallin des 2 yeux de l'animal seront observés par des techniques d'imageries sans contact (Lampe à fente, tomographie à cohrence optique et rétinographe) et sous anesthésie générale. Les observations ont une durée théorique de 30 minutes.

Impact sur les animaux

Une cataracte (opacification du cristallin) de l'oeil traité par le laser est possible pour les groupes 1 et 2 voir systématique pour le groupe 3. Cette atteinte du cristallin n'est pas douloureuse, mais est accompagné d'une perte de la capacité visuel définitive de l'oeil cataracté et par conséquent cela peut entrainer un stress pouvant se traduire par une perte de poids (supérieure ou égale à 10% en 3 jours) ; des perturbations comportementales graves et persistantes comme la piloérection, dos voûté, prostration, isolement, agressivité à l'ouverture de la cage et des perturbations graves et persistantes liées au système digestif (marqueur de stress chez le lapin) comme la constipation (absence de fèces), selles liquides. Les atteintes rétiniennes par un laser n'entraine aucune douleur et hémorragies. Le côté thermique du laser aura pour effet de cautériser les saignements. Le seul impact délétère pouvant être une atteinte de la capacité visuel de l'oeil traité. Si cela était le cas, le stress induit sera alors surveillé selon les mêmes critères que pour les atteintes du cristallin.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par surdose d'anesthésiant sous anesthésie générale.

Remplacement

Ce nombre doit OBLIGATOIREMENT ÊTRE MIS EN ŒUVRE IN VIVO avant de pouvoir utiliser pour la première fois le laser chez l’Humain. Aucun dispositif ex vivo ou in silico ne peut remplacer la complexité de l'organisation de l'oeil et de l'histologie du cristallin.

Réduction

Il a été jugé que le nombre minimum, mais suffisant d’animaux était de 3 lapins par groupe pour l’expérimentation pour prendre en compte les différences interindividuelles pour ce type de traitement laser indolore.

Raffinement

Les animaux arriveront au moins une semaine (7 jours) avant tout manipulation. Tout est mis en œuvre pour LIMITER AU MAXIMUM LE STRESS ET LA DOULEUR DE L’ANIMAL (anesthésie générale pendant le traitement laser et les observations). Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérer grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant/anesthésie). Par ailleurs, les lapins sont hébergés en cage règlementaire pouvant communiquer entre elles ; dans un environnement enrichi (jouet kong et autres jeux). Enfin, l'eau et la nourriture (granules et foin) sont mises à disposition "ad libitum" et de la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et atténuer les bruits environnementaux. Toutes les techniques d'imagerie et la technique laser se font sans contact avec l'oeil et sans docking. Le traitement est indolore. La mise à mort de l'animal est faite sous anesthésie générale

Choix des espèces

D'un point de vue éthique et pratique, les lapins sont les seuls animaux communément utilisés en expérimentation animale et présentant une anatomie oculaire proche de l'homme. Pour que le traitement soit représentatif de ce qu’il puisse être chez l’homme dans le futur, la chambre antérieure de l’œil de l’animal ne doit pas être trop petite. C’est pour cela que nous optons pour des lapins âgés d’environ 3 mois (12 semaines).

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent un régime enrichi en graisses pendant cinq semaines, reçoivent des injections quotidiennes pendant onze jours, un antibiotique dans l'eau puis un gavage de bactéries isolées de patients atteints de la maladie de Crohn, avant d'être tuées par dislocation cervicale pour prélèvement du tube digestif. Le porteur indique attendre une perte de poids et une inflammation intestinale légère à modérée, suivies au moyen d'une grille de souffrance notée sur quinze points. Il juge le recours à la souris "nécessaire" pour étudier l'infection dans un "organisme entier", à partir de résultats obtenus jusque-là in vitro.

Objectifs

La maladie de Crohn est une maladie inflammatoire chronique de l’intestin qui touche plus de 2,5 millions de personnes en Europe. Cette maladie digestive, pour laquelle aucun traitement curatif n’existe à ce jour, altère considérablement la qualité de vie des malades. Des facteurs génétiques, environnementaux et bactériens sont impliqués dans le développement de cette maladie. Notamment, des bactéries particulières sont anormalement retrouvées dans le tube digestif des patients. Les mécanismes menant à l’implantation des bactéries dans l’intestin des patients sont encore méconnus. Cependant, il semblerait que d’autres facteurs soient impliqués dans le développement de cette maladie tels que des facteurs épigénétiques. Aux vues de dérégulations épigénétiques observées chez les patients, nous avons émis l’hypothèse que certains acteurs épigénétiques (HDAC), dérégulées par un régime alimentaire enrichi en graisses, joueraient un rôle dans cette susceptibilité accrue des patients à être colonisés par les bactéries. Ainsi, ce projet a pour but de valider des résultats obtenus dans des modèles de cellules en culture dans un modèle in vivo de souris. Dans ce projet, des souris seront nourries avec un régime enrichi en graisses et infectées avec des bactéries provenant de patients afin de déterminer si ce type de régime dérégule les HDAC et de valider le rôle des HDAC lors de l’infection intestinale par les bactéries. Cette étude permettra également de tester des molécules potentiellement d’intérêt thérapeutique pour traiter les patients atteints de maladie de Crohn.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de confirmer les résultats obtenus in vitro dans des modèles de cellules en culture où il a été observé que les HDAC régulaient l’entrée des bactéries dans les cellules de l’hôte. Il est attendu que les résultats confirment le rôle majeur joué par ces HDAC au cours de l’infection et qu’ils permettent de déterminer si un facteur environnemental tel qu’un régime alimentaire enrichi en graisses peut déréguler ces HDAC. Ce protocole expérimental permettrait également de démontrer un potentiel bénéfice des molécules testées. À plus long terme, l’analyse des différents échantillons recueillis au cours du protocole permettrait de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu lors de l’infection dans un contexte de régime alimentaire enrichi en graisses ce qui pourrait mener à la découverte des nouvelles cibles d’intérêt thérapeutique pour les patients.

Procédures

Les animaux suivront un régime alimentaire enrichi en graisses tout au long du protocole soit 5 semaines. Ils seront également traités par injection intra-péritonéale avec les molécules à tester tous les jours durant 11 jours. Les souris recevront un antibiotique à faible dose via l’eau de boisson durant 2 jours et l ’infection des animaux avec les bactéries isolées de patients se fera par voie orale, via un unique gavage intragastrique (durée contention + gavage estimée < 1 min). Un prélèvement de sang au niveau du sinus rétro-orbital sera également réalisé, une seule fois, sur animaux anesthésiés (durée contention + prélèvement estimée < 2 min).

Impact sur les animaux

À partir des travaux antérieurs menés sur souris infectées par ces bactéries les effets indésirables attendus sont une perte de poids légère dans les jours suivant l’infection (environ 5%) et le développement d’une inflammation intestinale légère à modérée. Les symptômes liés à l’inflammation intestinale sont relativement légers mais une surveillance quotidienne (y compris dimanches et jours fériés) des animaux par un personnel formé sera réalisée dans le but de détecter tout comportement douloureux. La souffrance des animaux sera évaluée à partir d’une grille tenant compte de plusieurs critères comme l’apparence générale, l’expression faciale, le poids, les signes d’inflammation digestive et le comportement (score sur 15 points). En fonction du score individuel et de son évolution, un arbre décisionnel permettra d’adapter la surveillance ou le traitement de l’animal par des antalgiques. Si un animal dépasse le score limite, il sera immédiatement sorti du protocole et euthanasié.

Devenir

À l’issue de la procédure, tous les animaux seront anesthésiés par inhalation à l’isoflurane puis euthanasiés par dislocation cervicale car différentes sections du tube digestif seront prélevées et les bactéries associées aux muqueuses seront dénombrées. De cette manière, les bactéries adhérentes aux muqueuses seront quantifiées précisément et spécifiquement.

Remplacement

Les modèles de cellules en culture in vitro ne permettent de travailler que sur une ou deux lignées cellulaires à la fois. À l’inverse, un modèle de souris in vivo va permettre d’étudier l’interaction entre les bactéries et l’intestin dans un organisme entier, complexe composé du microbiote intestinal et du système immunitaire de l’hôte. Le recours à un modèle murin est donc nécessaire pour notre projet pour étudier l’impact d’un régime alimentaire enrichi en graisses associé à différentes molécules sur la colonisation intestinale par les bactéries et sur l’inflammation intestinale afin de pouvoir conclure pleinement sur le bénéfice des molécules testées pour une potentielle utilisation chez les patients atteints de maladie de Crohn.

Réduction

Le nombre de 7 animaux par lot a été déterminé lors de précédentes études d’infection avec les bactéries. Ce nombre d’animaux devrait permettre d’obtenir des résultats fiables, reproductibles et statistiquement significatifs. Les expériences ont été conçues de manière à ne pas démultiplier les lots témoins. Le nombre d’animaux pour ce projet a été réduit au minimum (140 animaux) sans compromettre les objectifs du projet. Le nombre de bactéries présentes dans les fèces des souris reflètent le nombre de bactéries associées à la paroi intestinale. Ainsi, la quantification des bactéries au cours du temps dans les fèces des animaux réduit le nombre d’animaux à euthanasier à différents temps post-infection pour comptabiliser les bactéries présentes dans l’intestin. Aussi, un maximum de prélèvement sera réalisé sur les animaux lors de l’euthanasie ce qui permet de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Afin d’éviter le surpeuplement qui est une source de stress, les souris de chaque lot seront séparées dans des cages de 530 cm² (3-4 animaux/cage), soit > 80 cm² pour des souris de 25-30 g. Elles auront un accès libre à la nourriture et à l’eau. Les conditions d’hébergement seront : température 20-24°C, hygrométrie 50 ± 10%, cycle 12h/12h, éclairage 350/450 lux. Un enrichissement leur sera proposé sous la forme de maison et tube en polycarbonate teinté rouge afin de diminuer le stress en stimulant l‘activité et en procurant un sentiment de sécurité à l‘animal. Les injections par voie intra-péritonéale, l’infection par voie orale ainsi que le prélèvement de sang seront réalisés par des personnels témoignant de la qualification nécessaire. Lors du prélèvement sanguin via le sinus rétro-orbital, les souris seront anesthésiées afin de réduire stress et douleur potentiellement générés par cet ace. Les animaux peuvent développer une inflammation intestinale légère à modérée lors de ce projet. Les animaux seront donc surveillés quotidiennement (y compris dimanches et jours fériés) par un personnel formé pour évaluer leur souffrance à partir d’une grille tenant compte de plusieurs critères comme l’apparence générale, l’expression faciale, le poids, les signes d’inflammation intestinale ou le comportement (sur 15 points). En fonction du score individuel et de son évolution, un arbre décisionnel permettra d’adapter la surveillance ou le traitement de l’animal par des antalgiques. Si un animal dépasse le score limite, il sera immédiatement sorti du protocole et euthanasié.

Choix des espèces

Le modèle d’étude choisi est la souris. Il s’agit d’un des modèles le plus utilisé et les expériences antérieures pour étudier l’infection intestinale par les AIEC ont été réalisées sur des modèles murins également. Cela permettra ainsi de comparer les résultats obtenus avec de précédentes études. L’étude sera réalisée sur des animaux de 8 à 10 semaines, âge auquel les études antérieures de colonisation par les AIEC sur modèle murin ont été réalisées.

1 350 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau ou dans la glande mammaire, par chirurgie sous anesthésie, puis des injections dans la tumeur, avec une croissance tumorale pouvant durer jusqu'à 75 jours, pour tester une thérapie reprogrammant les cellules cancéreuses. Le porteur décrit une possible perte de poids, une gêne au déplacement et une inflammation cutanée de la tumeur. Les animaux sont tués à l'atteinte des points limites ou pour analyse, les bénéfices pour les patients restant annoncés à moyen terme.

Objectifs

Ce projet vise à étudier l'efficacité antitumorale d'une thérapie innovante, combinée à des anticorps thérapeutiques, chez la souris. La thérapie d'intérêt reprogramme les cellules tumorales afin de les transformer en cellules immunitaires qui vont ainsi réveiller et armer le système immunitaire afin qu'il détruise les cellules tumorales non reprogrammées. Le projet proposé comportera 3 procédures qui serviront à tester l'efficacité antitumorale de la thérapie de reprogrammation en combinaison avec des anticorps thérapeutiques, sur des modèles tumoraux représentatifs d'indication oncologiques avec de forts besoins d'innovation thérapeutique. L’efficacité antitumorale sera étudiée sur le cancer colorectal, le mélanome, le fibrosarcome, le cancer de la vessie, cancer du sein. Les modèles tumoraux de cancer du sein seront implantés dans la glande mammaire des souris, les autres modèles seront implantés en sous-cutané au niveau du flanc des souris.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à moyen terme. Ce projet permettra de développer et de caractériser en phase préclinique une approche thérapeutique anticancéreuse très innovante, sur un large panel d’indications oncologiques. Cette approche thérapeutique permettra au mieux de guérir les patients atteints de ces cancers, au pire de ralentir la progression tumorale. La thérapie étudiée devra encore passer par une phase préclinique règlementaire avant une première administration chez l’homme.

Procédures

- Injection sous cutanée et orthotopique mammaire de cellules tumorales : quelques minutes -implantation par chirurgie et sous anesthésie de tumeurs sous cutanées, une 10aine de minute, administration d’antalgiques au préalable ; traitement si douleur post opératoire 20 minutes maximum - croissance de tumeurs sous cutanée sur le flanc, durée maximale 75 jours, durée moyenne 3 semaines -injection intrapéritonéale de composés thérapeutiques non toxiques, pour un maximum de 4 injections espacées de 7 jours ; quelques minutes - injection intratumorale de composés thérapeutiques à une dose tolérée pour un maximum de 2 injections espacées de 7 jours ; quelques minutes

Impact sur les animaux

1/Nuisances attendues : -Injection sous-cutanée de cellules : douleur à la piqure et l'injection; durée quelques secondes -Suite d’une chirurgie sous-cutanée sous anesthésie et anti-douleurs : douleur au réveil 20 minutes maximum ; gène cutanée à la cicatrisation 48h maximum -croissance d’une tumeur sur le flanc ou dans la glande mammaire : gène cutanée, gène au déplacement ; durée maximum 50 et 75 jours respectivement. -injections intrapéritonéales ou intratumorales : douleur de la piqure ; 5 secondes. 2/Nuisances potentielles : -perte de poids de moins de 20% du poids maximal : 4 jours maximum -inflammation de surface de la tumeur : douleur cutanée, démangeaisons ; maximum 48h

Devenir

Les animaux seront mis à mort soit pour prélèvement et analyse post mortem, soit parce qu'ils ont atteint un point limite tels que définis pour chaque procédure

Remplacement

Les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes lymphoïdes (la rate, les ganglions etc), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). Certaines caractéristiques individuelles seront étudiées in vitro/ex vivo dans le cadre du projet européen (modèles organoïdes, modèles bio-imprimés), l’impact et l’efficacité de la thérapie étudiée en combinaison avec des traitements immuno-stimulants approuvés ne peut être pleinement évaluées que dans un système complet.

Réduction

Les procédures seront faites sur le nombre minimal de souris nécessaires permettant de conclure de façon fiable statistiquement avec le test statistique approprié (comparaison de moyennes et analyse de courbes d’espérance de vie), à savoir 10 souris par groupe thérapeutique, pour un total 8 groupes. Ces 8 groupes thérapeutiques seront testés sur 12 modèles tumoraux représentatifs de cancers à fort besoin thérapeutique. Les tests statistiques utilisés seront un t test non paramétrique de Mann-Whitney, non apparié, bilatéral, pour la comparaison des volumes tumoraux. Et un test de Mantel-Cox pour la courbe d’espérance de vie. Dans notre expérience, les effectifs de 10 souris par groupe permettent de caractériser avec les tests cités des différences significatives supérieures à 25% de gain d’inhibition de croissance tumorale ou de 20% d’espérance de vie. Ces gains sont au minimum de l’intérêt thérapeutique. Tous les modèles tumoraux utilisés auront été préalablement testés in vitro pour leur bonne réponse à la thérapie étudiée. Pour chaque groupe thérapeutique, les tumeurs et les organes lymphoïdes (rate et ganglions) seront analysées post-mortem sur 5 souris indépendantes. Les paramètres étudiés seront les cellules immunitaires présentes dans ces organes, l’analyse statistique se fera par comparaison de moyennes (t test non paramétrique de Mann-Whitney, non apparié, bilatéral). Notre expérience de l’immunophénotypage a montré que ce test permet de mettre en évidence une différence biologiquement significative des populations immunitaires.

Raffinement

Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Toutes les précautions seront prises pour détecter et minimiser la souffrance, la douleur et le stress des animaux (observation quotidienne, pesée des animaux, traitement antalgique si besoin). Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas de perte de poids légère. Pour les modèles implantés dans la glande mammaire, connus pour développer des inflammations cutanées superficielles au niveau de la tumeur, les animaux seront stabulés sur une litière en cellulose moins agressive que la litière en copeaux. Des prélèvements en point final (tumeurs et organes) seront réalisés pour pouvoir obtenir le maximum d’informations des animaux utilisés. Pour les modèles implantés sous la peau par chirurgie, les animaux seront traités avec un antalgique avant la chirurgie qui se fera sous anesthésie.

Choix des espèces

Nous avons besoin d’animaux présentant un système immunitaire compétent, et de modèles tumoraux murins. La souris immunocompétente est un modèle de choix pour ce type d’étude car il existe un large panel de tumeurs murines représentatives de différentes indications oncologiques, ce qui n’est pas le cas chez les autres espèces de rongeurs de laboratoire. Par rapport aux rats, la souris permet également d’utiliser moins de composés pour obtenir une dose/poids. Nous avons choisi des souris âgées de 5 semaines, car la prise tumorale est meilleure sur les individus jeunes, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux à utiliser. Les modèles tumoraux prévus dans ce projet sont utilisés fréquemment sur des souris de cet âge, avec un taux de prise supérieur à 99%.

2 000 rongeurs, 1 000 souris et 1 000 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie gazeuse, ils subissent un prélèvement de sang au sinus rétro-orbital ou à la veine temporale, puis sont mis à mort, pour valider des kits de dosage de marqueurs sanguins jugés peu fiables. Le porteur précise employer des animaux issus de l'élevage des lignées et non utilisés par ailleurs. Il présente ainsi la mise à mort comme un usage d'animaux déjà destinés à être tués.

Objectifs

De très nombreux marqueurs sanguins circulants permettent d'évaluer chez l'homme l'existence de certaines pathologies et d'en suivre leur évolution. On peut citer par exemple la troponine qui est un marqueur d'infarctus du myocarde et permet son diagnostic et son suivi en clinique humaine. De même il existe des protéines ou marqueurs spécifiques de pathologie, rénales, musculaires, d'inflammation, de cancer,....... Certains modèles de rongeurs génétiquement modifiées, dont les lignées sont présentes dans l'animalerie de notre institut, reproduisent ces pathologies humaines et pourraient nous être utiles à la mise en place et la validation de ces marqueurs chez la Souris et/ou le Rat afin de pouvoir les suivre et les identifier lors d'études scientifiques à venir. Des kits de dosage spécifiques de ces espèces sont commercialisés mais nous avons constaté que beaucoup ne sont pas fiables ou pas spécifiques, c'est pourquoi nous voulons les valider avant de proposer les dosages de ces marqueurs. Pour cela nous envisageons de prélever du sang sur des animaux générés durant l'élevage des lignées, juste avant la mise à mort de ces animaux qui ne sont pas utilisés dans des protocoles expérimentaux. La présence de ces marqueurs dans le sang étant souvent labile, il est nécessaire que les animaux soient encore vivants au moment du prélèvement sanguin. Les lignées seront sélectionnées d'après des critères scientifiques afin d'être sûr que les modèles prélevés représentent des animaux susceptibles d'avoir une perturbation de l'un ou l'autre des marqueurs d'intérêt.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de nous permettre de valider des réactifs utilisés dans l'analyse de certains marqueurs sanguins. Ces réactifs sont censés cibler de manière spécifique des marqueurs d'intérêt, comme cela peut être fait lors d'une analyse sanguine humaine. Néanmoins, il apparait que la sensibilité, fiabilitié ou spécificité de ces kits n'est pas toujours garantie, rendant certaines analyses peu fiables. Nous souhaitons ainsi mettre en place une étape de validation afin de garantir que lors de leur utilisation dans un projet d'analyse scientifique, nous pourrons obtenir des informations valides et porteuses d'informations fiables sur lequel pourront s'appuyer les conclusions des chercheurs.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse à l'aide d'une boite à induction puis d'un masque. Ils s'endormiront et nous effectuerons le prélevement sanguin sur les animaux endormis. Pour cela, selon la préférence de l'expérimentateur, nous préleverons le sang à la veine temporale superficielle ou au sinus retro-orbital. Les animaux seront ensuite mis à mort à la fin de la procédure, dans la même anesthésie. La durée de l'anesthésie et du prélèvement sanguin est d'environ 3-4 minutes par animal

Impact sur les animaux

Les animaux subiront le stress de l'endormissement durant l'anesthésie générale. Par la suite, ils resteront endormis durant le prélevement sanguin puis leur mise à mort.

Devenir

Les animaux employés dans cette procédure sont des animaux générés durant l'élevage et le maintien des lignées. Ils ne seront pas employés dans des procédure expérimentales additionnelles et seront mis à mort.

Remplacement

Cette étude a pour but de mettre en place le dosage de marqueurs sanguins chez la Souris ou le Rat en vue d'etudes scientifiques futures et à venir visant à reproduire et étudier des pathologies humaines Etant donné que nous avons à disposition de nombreux modèles génétiquement modifés reproduisant des pathologies humaines ce modèle ne peut être substitué.

Réduction

Les lignées de Souris ou de Rat étant déjà existantes dans l'institut cette étude ne génèrera pas un supplément d'animaux utilisés. Nous utiliserons en effet des animaux générés durant les élevages de ces lignées mais non utilisés pour des procédures expérimentales. Si les fonds génétiques sont similaires, nous essaierons au mieux de rapprocher les prélevements et analyses pour mutualiser les groupes controles et réduire le nombre d'animaux utilisés. Etant donné la variabilité des analyses biochimiques, nous utilisons 10 animaux par condition expérimental soit 40 animaux par marqueur étudié (10 males controles, 10 males mutants, 10 femelles controles, 10 femelles mutantes). A raison de 5 lignées étudiées par années, durant 5 ans, cela représente 1000 animaux au maximum par espèce étudiée, soit un total de 2000 animaux (Souris et Rat). Nous utiliserons des analyses paramétriques de type analyse de variance à deux facteurs suivies d'analyses post-hoc pour pouvoir conclure sur la significativité des résultats obtenus.

Raffinement

Les animaux seront stabulés en groupes avec un enrichissement, accès à la nourriture et à l'eau sans restriction. Ils seront surveillés quotidiennement pour s'assurer de leur bon état général. Une anesthésie générale gazeuse sera effectuée avant le prélèvement sanguin des animaux afin d'empêcher toute souffrance. Les animaux seront ensuite mis à mort sans réveil.

Choix des espèces

Notre institut possède une animalerie de rongeur (Souris et Rat) et nos études portent sur l'étude de ces animaux génétiquement modifiées, c'est pourquoi nous avons choisi ces espèces Par ailleurs la souris représente un modèle de choix pour l'étude de pathologies humaines S'agissant de lignées en élevage dont la mise à mort est décidée par le chercheur en charge des animaux, l’âge va dépendre des projets Certains marqueurs évoluant avec l’âge il peut être intéressant de prélever des animaux d'âges différents. Des marqueurs de vieillissement pourront être évalués sur des animaux âgés dans le cas où cela se présenterait