Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Etudes de tolérance à de nouvelles molécules avant études d’efficacité.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
1 200 souris saines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des composés par injection ou gavage, jusqu'à dix-huit administrations sur six semaines, afin de déterminer la dose maximale tolérée avant de futures études d'efficacité. Le porteur précise que les dommages attendus tiennent à une toxicité que les tests in vitro n'auraient pas détectée et que les animaux atteignant un point limite seront tués. Il affirme qu'il n'est pas possible d'étudier la tolérance d'un composé sans animaux, les approches in vitro et in silico ne tenant pas compte de l'"organisme entier".
Objectifs
Notre laboratoire travaille avec des laboratoires qui développent des composés à visée thérapeutique. Ces laboratoires nous sollicitent ensuite afin de réaliser par imagerie In Vivo des études d’efficacité sur des modèles animaux de pathologie ; classiquement il s’agit de modèles de cancer. Avant de pouvoir réaliser ces études d’efficacité, il est nécessaire d'évaluer la dose maximale tolérée qui pourra être utilisée. Les expériences menées dans ce projet sont donc des études préliminaires de tolérance menées chez l'animal sain. L’objectif est également de cibler au mieux les doses à utiliser afin de limiter le nombre de lots expérimentaux dans les projets futurs d'efficacité menés sur l'animal porteur d'une pathologie. Avant de recevoir les composés et d’envisager l’administration à des souris, le client aura réalisé une analyse de la littérature afin de vérifier si des études ont déjà été faites sur des composés de même classe et qu’ils ne possèdent pas de toxicité avérée. Le client aura également réalisé des tests in vitro pour déterminer la dose efficace 50% du composé. A partir de cette dose, la dose efficace équivalente chez la souris est déterminée par des calculs prenant en compte différents facteurs tel que le volume sanguin. C’est à partir de cette dose théorique que les doses à tester sont déterminées. Notre laboratoire n’a pas la capacité de tester des marqueurs biochimiques ou des marqueurs de tolérabilité et/ou l’obtenir des données de pharmacocinétiques. Ces analyses nécessiteraient en outre l’utilisation d’un grand nombre de souris supplémentaires. De plus, ce projet ne s’inscrit pas dans le cadre des études réglementaires de toxicité. Le déroulement des études prévues permettra de limiter au maximum du nombre de souris. Si la dose administrée est tolérée, une dose supérieure pourra être administrée au lot de souris suivant et ainsi de suite jusqu'à l'observation d'effets indésirables. (perte de poids, diarrhée, urine foncée, altération du comportement…). Dans ce cas, la dose supérieure ne sera pas administrée et si l'un des points limites est atteint, l'animal sera mis à mort. La dose sélectionnée sera la dose précédant celle qui a induit des effets indésirables.
Bénéfices attendus
Les expériences menées dans cette saisine ne s'inscrivent pas dans les études réglementaires de toxicité mais en tant qu'études préliminaires menées chez l'animal sain, avant des essais menés sur l'animal porteur d'une pathologie. Ce projet permet de cibler les doses qui seront utilisées pour de futures études d'efficacités évalué par imagerie. Lors de ces études, le nombre de lots utilisés sera donc réduit.
Procédures
- Pour le projet" Détermination de la dose maximale tolérée pour une injection unique": Pour chaque souris, administration du composé par voie IP (100µL/10g souris) ou par voie iv (sous 100-150µL) ou par gavage (200µL) en fonction du poids de l'animal. Les administrations seront réalisées sur animal vigile par du personnel qualifié. Nous pourrons être amenés à prélever du sang sur animal vigile au niveau sous mandibulaire: Sur chaque souris, au maximum 3 prélèvements de 100µl avec au minimum 1 semaine d'intervalle entre chaque prélèvement. - Pour le projet" Détermination de la dose maximale tolérée pour des injections répétées": Pour chaque souris,administration du composé par voie IP (100µL/10g souris) ou par voie iv (sous 100-150µL) ou par gavage (200µL) en fonction du poids de l'animal. Les administrations seront réalisées sur animal vigile par du personnel qualifié. La dose sera administrée à plusieurs occasions, avec un maximum de 18 administrations sur 6 semaines maximum et au maximum 1 administration 1 fois/jour. Nous pourrons être amenés à prélever du sang sur animal vigile au niveau sous mandibulaire. Sur chaque souris,au maximum 7 prélèvements de 100µL avec au minimum 1 semaine d'intervalle entre chaque prélèvement.
Impact sur les animaux
Les dommages attendus sont liés à une toxicité in vivo qui n'aurait pas pu être détectée in vitro. Une observation méticuleuse de l'état général des animaux tout au long des expériences ainsi que la définition de points limites pertinents permettra d'anticiper toute douleur ou souffrance chez les animaux.
Devenir
Toutes les souris seront mise à mort à l'issue de chaque procédure car elles ne peuvent pas être réutilisées pour la procédure suivante ou une autre étude.
Remplacement
Dans le cadre du développement de futurs médicaments, il est nécessaire d'évaluer leur toxicité potentielle en fonction de la dose administrée. Pour ce type de développements, les études sont classiquement réalisées in vitro, in silico ou avec des modèles animaux. Les études in vitro et in silico ne tiennent pas compte de la complexité d'un organisme entier (variété des tissus, communications inter organes etc...) et il n'est pas possible à l'heure actuelle d'étudier la tolérance d'un composé sans utiliser d'animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux sera réduit au minimum permettant d'obtenir des résultats pertinents soit 2 souris par doses. Il n’y a pas de test statistiques prévu. Les doses testées seront administrées de la dose la plus faible à la dose la plus forte, en décalé dans le temps sur des souris différentes (24h minimum ou plus entre 2 doses, en fonction de la cinétique d'élimination du composé, estimée par le client) ainsi si des effets indésirables sont observés sur 1 des 2 souris d’une dose, la dose inférieure sera retenue comme étant la dose maximale tolérée et les autres souris ne seront pas injectées avec les doses supérieures.
Raffinement
Les souris sont hébergées dans des cages en portoir ventilé avec un accès à l’eau et la nourriture ad libitum, un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation et des objets d'enrichissement du milieu (celluron). Les animaux sont observés scrupuleusement quotidiennement afin de respecter leur bien-être et de déceler tout signes d’apparition d’effets indésirables (perte de poids, diarrhée, urine foncée, altération du comportement, douleurs…). Nous avons mis en place une grille de scoring et des points limites.
Choix des espèces
Ces études sont menées chez la souris saine car elles se situent en amont d'essais qui seront ensuite réalisés sur des animaux modèles de pathologie expérimentale.(modèles animaux de cancer par implantation orthotopique ou sous-cutanée de cellules tumorales par exemple) La taille de l'animal est compatible avec l'administration de composés parfois difficiles à produire par les chimistes en grande quantité et la petite taille de la souris (nécessitant donc peu de composés) en fait un animal souvent utilisé pour les premières études réalisées in vivo. C'est chez la souris qu'il existe le plus grand nombre de modèles de pathologies. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, entre 6 et 12 semaines en fonction de la demande du chercheur. En effet, par la suite, les études d’efficacité se feront sur des modèles pathologiques de souris. Les modèles cancéreux sont induits sur des souris de 6 semaines minimum. Les traitements peuvent commencer immédiatement et jusqu’à 6 semaines après l’induction d'où le choix de l'utilisation d'animaux agés de 6 à 12 semaines.
Evaluation ex vivo des effets pharmacologiques de molécules sur un modèle de stress induit par une contention forcée sur souris.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections jusqu'à deux fois par jour pendant un à trois mois, puis subissent une fois une contention forcée d'une à trois heures destinée à provoquer le stress que le projet cherche à étudier, avant d'être décapitées ou perfusées sous anesthésie. Le porteur indique que les souris génétiquement modifiées ne peuvent pas échapper à leur phénotype dommageable et que la mise à mort peut entraîner un stress pré-mortem important. Le projet répond à des demandes de laboratoires clients pour évaluer, avant les essais réglementaires, des molécules liées au stress.
Objectifs
Les grands groupes pharmaceutiques et les sociétés biotechnologiques souhaitent avoir de plus en plus tôt (phases de Recherche et Développement) des informations pharmacologiques fonctionnelles sur leurs molécules en développement pour traiter des maladies du système nerveux central ou pour identifier des molécules anti-stress. Pour une meilleure appréhension (ou prédictibilité) d’éventuels effets secondaires, les agences réglementaires exigent une connaissance complète des cibles et des mécanismes d’action associés à ces nouvelles molécules qui sont soumises à une demande d’autorisation de mise sur le marché. En phase de Recherche et Développement (avant les phases précliniques réglementaires), il n’est pas possible de tester les effets des molécules sur de grande quantité d’animaux, à la fois pour des questions de quantité disponible des molécules (quelques milligrammes le plus souvent) et pour des questions éthiques (aucune idée sur les effets éventuels qui pourraient être observés). A l’importance de mise au point de nouvelle molécule, il faut ajouter le développement de modèle rongeur génétiquement modifié (GM). Ces modèles permettent de mimer des pathologies humaines, leur utilisation est alors un avantage certain pour l’évaluation de l’efficacité de molécule d’intérêt. Il faut pour cela que ceux-ci soit électrophysiologiquement caractérisés. L'utilisation de tranches et/ou de cellules isolées de système nerveux central (SNC) de rongeurs permet une étude sur l'activité du composé dans le SNC et une information sur ses mécanismes d’action dans le modèle rongeur GM. Pour se faire, nos laboratoires utilisent deux types de technique le Multi-Electrode Array (MEA) = enregistrements extracellulaires multipoints avec « array » d’électrodes (circuit imprimé) et le Patch-clamp = un enregistrement à l'échelle du neurone. Le projet vise à déterminer, ex vivo, les effets pharmacologiques et/ou toxiques de nouvelles entités chimiques en développement préclinique afin de permettre à nos clients d’évaluer les propriétés de leur(s) molécule(s) - et/ou les propriétés d’une famille de molécule dans les mécanismes de stress induit par une contention forcée. Le cas échéant, ils pourront ainsi déterminer si une molécule à des propriétés suffisamment pertinentes pour entrer ou non en développement préclinique réglementaire.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de mieux caractériser, évaluer et comprendre les effets de futurs candidats médicaments pour traiter les pathologies du système nerveux central liées au stress. Nos techniques mises en œuvre dans ce projet, pour l’évaluation ex vivo des effets pharmacologiques fonctionnels et/ou toxiques sur des explants de tissus vivants, exposés de façon chronique ou de façon aiguë, constitue la meilleure approche car elle permet: - de limiter le nombre d’animaux à tester par l’utilisation de tissus (mesures multipoints sur le même tissu séparé en petits échantillons), - de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de disponibilité dans le système nerveux central et dans la circulation sanguine. Ce projet permet ainsi d’affiner la sélection et l’orientation du développement de futurs médicaments avant de lancer les premières étapes précliniques coûteuses de leur mise sur le marché.
Procédures
Les animaux vigiles seront injectés deux fois par jour, au maximum, pour assurer une exposition in vivo de la molécule à tester. Le protocole est en moyenne d’un mois mais peut durer jusqu’à trois mois. Les contentions répétées nécessaires à ces injections répétées génèrent du stress. Ces animaux traités au préalable peuvent subir ces injections soit par voie orale, soit cutanée, soit intrapéritonéale ou soit intramusculaire. Si les animaux sont génétiquement modifiés, ils ne peuvent pas par définition échapper à leur phénotype dommageable. Nous travaillerons uniquement sur des animaux asymptomatiques. Nos critères de surveillance seront ceux associés aux animaux symptomatiques. Ils seront, pour les groupes subissant le stress, exposés, une seule fois entre une et trois heures maximum, à une contention qui a pour but de générer du stress que nous cherchons à étudier. Tous les animaux seront mis à mort par deux techniques, en fonction de leur âge, par décapitation rapide ou par perfusion intracardiaque sous anesthésie gazeuse juste après l’induction de ce stress.
Impact sur les animaux
Notre procédure amène des effets indésirables: *-la manipulation régulière d’un animal, générer du stress. *-l’injection régulière, provoquer des effets indésirables au site d’injection. ; *-la nature des animaux génétiquement modifiés, créer des douleurs auxquelles les animaux ne peuvent s’échapper ; *-*- Ce projet a pour but de déclencher du stress par une contention forcée de une à trois heures, nous permettant l’étude des mécanismes du stress ; *- La mise à mort par perfusion intracardiaque sous anesthésie gazeuse et la décapitation rapide peuvent amener un stress pre-mortem important.
Devenir
A l’issue de la procédure, tous les animaux seront mis à mort car nous utiliserons les organes pour nos mesures.
Remplacement
Nos évaluations ou caractérisations nécessitent de pouvoir réaliser des observations sur des réseaux neuronaux natifs et connectés, « donc les plus physiologiques possibles ». Il n’est pas envisageable de réaliser sur l’Homme les tests que nous proposons. Nous devrons, en effet, tester des molécules avec des effets potentiellement inconnus, en les administrant à un organisme vivant. De plus, nous utilisons des tissus fraichement prélevés, car il n’est pas possible, in silico, de reproduire la complexité de ces connexions et/ou la particularité d’un neurone spécialisé.
Réduction
Notre capacité à utiliser un même animal pour plusieurs mesures et plusieurs conditions d’exposition diminue le besoin en nombre d’animaux et nous permet de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et des problèmes de pharmacocinétique. Grâce à notre expérience sur les projets antérieurs, nous avons déterminé que 6 animaux contrôles et 6 animaux d’intérêt nous permettent de valider 24-30 neurones ou 18-30 tranches. Compte tenu des variations inter-individus de réponses à l’inflammation dans ce projet, nous devons augmenter à 10 animaux maximum par groupe. Après la première étape, nous pourrons évaluer la significativité statistique. Si celle-ci est présente, l’étape suivante pourra donc être menée en poursuivant l’étape par quatre conditions différentes maximum. Si elle est absente, l’étude sera suspendue
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe sociaux (4 souris adultes/cage). Ils bénéficieront d’enrichissement adapté, deux types différents par cage (système permettant la création de nid soit tunnel ou soit pièce de bois à ronger par exemple). Cet enrichissement est validé par le fournisseur ou le partenaire. Les animaux utilisés seront habitués aux différentes contentions utiles pour les voies d’administration des composés à tester. Nous diminuerons les futurs stress dus à ces manipulations. Ces administrations seront réalisées par du personnel compétent et formé en respectant les recommandations vétérinaires. Les solutions injectées seront contrôlées pour s’assurer de leur innocuité. Les animaux seront surveillés deux fois par jour et pesés. Les animaux génétiquement modifiés auront une semaine d’acclimatation et un mois d’hébergement maximum avant d’entrer dans le projet. Il se fera en groupes sociaux de 4 animaux en mélangeant les génotypes pour assurer la meilleure expression de phénotypes normaux. Chaque lignée modifiée aura une documentation de suivi spécifique répertoriant les symptômes possibles. Les animaux seront asymptomatiques. Les points limites seront tout de même adaptés aux symptômes possibles et nous adapterons notre surveillance. Toute perte de poids en deçà de la limite préétablie entrainera une sortie du test et des soins en accord avec le responsable de projet et le vétérinaire. Grâce à notre expérience et nos connaissances scientifiques sur des tests que nous maitrisons, nous avons pu établir un nombre d’animaux par condition d’étude soit 10 animaux contrôles et 10 animaux d’intérêt, nous permettant d’obtenir une bonne significativité, réduisant considérablement le besoin en animaux.
Choix des espèces
La grande quantité d’informations scientifiques disponible sur le fonctionnement du système nerveux central des rongeurs, ajoutée à la maîtrise de leur élevage, de leur génétique, de leur relative petite taille et au développement de technique d’enregistrements électrophysiologiques sur explants vivants font de cette espèce un modèle de choix pour l’évaluation pharmacologique de molécules. Ponctuellement, nous utilisons d’autres lignées de cette espèce, après discussion de la pertinence du modèle espèce-lignée-lignée génétiquement modifiée-protocole avec notre client. Toute demande de caractérisation de lignée modifiée fera l’objet d’une analyse bibliographique et circonstanciée en amont. L’impact du phénotype devra être décrit. Nous ne travaillerons qu’avec des animaux asymptomatiques. Toutefois, les symptômes ayant des impacts possibles sur le bien-être de l’animal, cela entrainera la mise en place de conditions d’hébergement spécifiques et une validation des points limites modifiés pour pallier des symptômes qui ne devraient pas apparaitre dans ce projet. L’âge des animaux testés est déterminé en fonction du type de test et d’une analyse bibliographique. Nous travaillerons avec des animaux adultes ou âgés en fonction des cibles fonctionnelles à observer et de l’évolution de la pathologie considérée liée au stress. Les choix de l’espèce, de la lignée et de l’âge sont validés en collaboration avec le client. En effet, l’expression phénotypique de la pathologie et/ou d’un déficit et/ou d’une lésion est souvent déterminante pour le choix de l’âge d’utilisation des animaux.
Tests de polyculture en circuit fermé pour valider une méthode in silico de combinaisons d’espèces piscicoles
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Tests réglementaires
795 poissons de six espèces vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, sédatés à répétition pour le suivi de croissance et anesthésiés pour des prélèvements sanguins. Le porteur indique que 186 d'entre eux seront tués pour évaluer leur stress et leur statut immunitaire, les 609 restants devant être réhabilités dans la mesure du possible. L'objectif affiché est de valider un modèle informatique de combinaisons d'espèces pour la pisciculture, présenté comme un outil visant à réduire le recours aux animaux. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'autre alternative que des données expérimentales pour valider ce modèle.
Objectifs
Ce projet est dans la continuité d'un précédent travail expérimental. L'objectif est de valider une méthode in silico en vue d'établir des combinaisons d'espèces de poissons pouvant être élevés ensemble.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à valider expérimentalement une méthode in silico, c’est-à-dire un modèle définissant des combinaisons d’espèces piscicoles compatibles (voire complémentaires) dans l'exploitation de ressources en système d'élevage. Le travail de modélisation vise clairement à diminuer le recours à des animaux avec des approches de type essai-erreur. Toutefois, pour valider le modèle, il n’existe pas d’autre alternative que le recours à des données expérimentales. A terme, ce modèle doit être un outil d’aide à la décision pour les pisciculteurs voulant développer la polyculture de poissons, que ce soit en circuit fermé hors sol ou en étang. Le projet prévoit par ailleurs l'analyse de différents paramètres qui permettront de développer plusieurs descripteurs de bien-être animal, spécifiques aux poissons et si possible, moins invasifs. L’agrégation de ces descripteurs permettrait ensuite de construire un indicateur du bien-être du poisson en élevage, intégrateur, incluant les dimensions à la fois zootechniques, physiologiques et comportementales.
Procédures
Les animaux seront soumis à des manipulations pour le suivi de croissance et seront à ce titre sédatés. Cela concerne tous les poissons (N = 795). Ce suivi sera réalisé à J0 et tous les 20 jours jusqu'à J60. Pour les prélèvements de sang, les poissons seront anesthésiés (à J60). Cela concerne 93 poissons pour la série 1 (30 carpes, 30 tanches et 33 black-bass) et 93 autres poissons pour la série 2 (33 perches, 30 tilapias et 30 clarias). Les poissons seront anesthésiés pour réaliser ces prélèvements.
Impact sur les animaux
Le projet est construit de façon à minimiser les nuisances et les effets indésirables sur les poissons, quelle que soit l'espèce. Toutefois le projet prévoit l'application de sédation et d'anesthésie des poissons, impliquant par là-même une manipulation et une émersion temporaire des poissons. Précisons cependant que nous plaçons les poissons dans des conditions expérimentales proches de celles en élevage, mis à part la densité, qui est relativement faible dans nos unités expérimentales comparativement à ce qui peut être pratiqué en élevage. Les conditions expérimentales sont établies de façon à satisfaire au mieux les exigences comportementales et physiologiques des différentes espèces de poissons.
Devenir
Procédure 1 : Evaluation de l'état de stress et du statut immunitaire : 186 poissons concernés par cette procédure, avec dans le détail 30 carpes, 30 tanches et 33 black-bass pour la série 1 et à 33 perches, 30 tilapias et 30 clarias pour la série 2. Ils seront mis à mort. Procédure 2 : Suivi de croissance et enregistrement du comportement. Cela concerne 795 poissons, à savoir dans le détail, 130 carpes, 65 tanches et 265 black-bass, soit un total de 460 poissons pour la série 1 ainsi que 140 perches, 130 tilapias et 65 clarias, soit un total de 335 poissons pour la série 2. Sur ces 795 poissons, 186 seront mis à mort (cf. procédure 1). Les poissons restants, soit 609 en l'absence de mortalité durant les deux séries de tests, seront dans la mesure du possible réhabilités (placement dans des structures d'hébergement ou d'élevage).
Remplacement
Le remplacement n'est pas envisageable dans le cadre du présent projet. En effet, rappelons que notre objectif est de produire un outil (modèle prédictif) visant à réduire (ou dans le meilleur des cas, à s'affranchir) de l'expérimentation animale. Pour développer cet outil, nous utilisons des données de la littérature scientifique pour construire le modèle, mais nous avons aussi besoin d'un jeu de données externes pour valider celui-ci. Aussi est-ce la nécessité de disposer de données externes qui nous amènent à envisager ce projet expérimental.
Réduction
Le projet prévoit d'utiliser un nombre suffisant mais réduit de poissons : de 10 à 35 poissons / aquarium selon les modatlités avec prélèvement de 3 individus par espèce et par aquarium pour les prélèvements sanguins, de cerveaux et d’écailles. Les mêmes individus seront utilisés pour les prélèvements de ces trois matrices. Le nombre total de poissons (795) nous permet d’avoir une robustesse suffisante d’un point de vue statistique. Les espèces sont grégaires au stade de vie juvénile (comme c'est le cas ici) et c'est la raison pour laquelle il est prévu une biomasse initiale de 1 kg/aquarium. Cette valeur intègre la volonté de réduction du nombre de poissons, les exigences biologiques des espèces utilisées dans le projet et la capacité de traitement de l'eau des aquariums durant les deux mois d’expérimentations de chaque série.
Raffinement
Le stress des poissons est limité autant que possible durant toutes les étapes du projet en les plaçant toujours dans une eau de bonne qualité (suivi régulier des paramètres et corrections si nécessaire), en évitant le bruit et les gestes brusques et en appliquant de façon progressive tout changement lumineux (application d'une aube et d'un crépuscule). Pour les suivis de croissance, les poissons doivent être sortis de l'eau ; aussi pour cette étape, nous prenons soin de leur appliquer une légère sédation, avec respect d'un jeûn la veille du contrôle de croissance, sur la base d'un protocole visé par le vétérinaire référent.
Choix des espèces
Black-bass (Micropterus salmoides), tanche (Tinca tinca) et carpe commune (Cyprinus carpio) sont les trois espèces à mobiliser pour la première expérimentation. Perce commune (Perca fluviatilis), Tilapia (Oreochromis mossambicus) et Clarias (Clarias gariepinus) sont les autres espèces pour la seconde expérimentaion. Ces deux groupes d'espèces ont été choisis pour produire des données permettant de valider expérimentalement la méthode prospective in silico (prédiction d'indices de compatibilité et de complémentarité d'espèces de poissons en polyculture). Ces 2 x3 espèces ont été retenues en particulier car elles ont les mêmes exigences quant aux caractéristiques du milieu d'élevage (paramètres physico-chimiques) mais des réponses physiologiques (vitesse de croissance) et comportementales (occupation de la colonne d'eau, prise alimentaire) différentes. Ces expérimentations doivent produire un set de réponses utile pour valider la méthode in silico. Tous les poissons utilisés dans ce projet seront au stade juvénile.
TL EVOTEC IMMUNO Mise au point de solutions thérapeutiques modulant le système immunitaire dans les domaines de l’inflammation de l’immuno-oncologie et de la vaccination
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Rats : 700
Lapins : 500
55 000 animaux non-humains vont être utilisés, en majorité des souris avec 700 rats et 500 lapins, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent des composés-tests, des prélèvements sanguins répétés et des immunisations, certaines souris étant irradiées puis greffées de cellules immunitaires humaines, pour sélectionner des candidats médicaments destinés aux dossiers réglementaires. Le porteur indique que les hébergements longs, les doses mal tolérées et l'injection de cellules humaines peuvent provoquer perte de poids et difficultés de déplacement. Il affirme qu'aucun modèle in silico ou in vitro ne reproduit la complexité du système immunitaire.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux composés modulant le développement et la fonction du système immunitaire dans différents modèles de pathologies sur le rongeur. Les informations générées seront indispensables pour permettre la progression du médicament au travers des futures étapes de développement et inclus l’identification des doses minimales produisant une efficacité, détermination de la pharmacocinétique et pharmacodynamie essentielle pour mettre en place les schémas de traitement appropriés et enfin les études d’efficacités. Ces données pré-cliniques sont un préalable aux essais cliniques et à l’enregistrement de molécules candidates et figureront dans les différents dossiers réglementaires.
Bénéfices attendus
Sélectionner de nouvelles entités thérapeutiques innovantes pour des pathologies dont les besoins médicaux et la prise en charge de patients sont non satisfaits aujourd'hui.
Procédures
Administration unique ou répétée (plusieurs fois par jour sans dépasser 3 fois) de composés-tests à des doses pharmacologiquement actives. Prélèvements de sang sériés sur un même animal sans dépasser 7.5% du volume total du sang sur une semaine. Administration d'un antigène afin d'immuniser un animal sous anesthésie. Irradiation non létale de souris hautement immunodéfiscientes afin d'éliminer les cellules immunitaires murines avant de greffer des cellules immunitaires humaines.
Impact sur les animaux
Ces modèles sont de longue durée (1 à 40 semaines) pour se mettre en place. Cela signifie un impact négatif relatif à un hébergement de longues durées en groupe sociaux sur le bien-être des animaux bien que tous les moyens disponibles sont utilisés pour minimiser cet aspect. Les effets indésirables peuvent provenir de niveaux de doses administrées mal tolérées pour obtenir un effet pharmacologique ou d’un effet adverse de l’injection de cellules humaines dans un environnement murin. Les signes en seraient alors une perte de poids, des difficultés à se déplacer. Des administrations de composés à des doses sub-toxiques durant plusieurs jours, des prélèvements de sang sériés pour évaluer l'exposition à un composé peuvent nuire au confort des animaux, peut générer du stress.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour réaliser des prélèvements de sang terminaux ou des collectes d'organes pour mesurer certains paramètres ou la concentration des composés-test adminsitrés. Les animaux dits "contrôle" sont mis à mort également pour des prélèvements de sangs ou d'organes afin de disposer d'échantillons contrôles au niveau des analyses faites ultérieurement.
Remplacement
A notre connaissance il n’existe pas de modèles in silico ou in vitro qui reproduisent l’extrême complexité du rôle du système immunitaire dans le développement des réponses immunitaires anti-tumorales et l’activation du système immunitaire à des fins vaccinales. Les actions du système immunitaire impliquent de nombreux tissus et organes avec des mécanismes sous-jacent encore largement inexpliqués. Le modèle animal est également nécessaire pour recueillir des données pertinentes sur les mécanismes d’action du système immunitaire suite à l’administration d’un composé afin de développer des solutions thérapeutiques innovantes.
Réduction
Les composés passeront des filtres pour réduire le nombre des études in vivo et la quantité d’animaux utilisés dans ce projet. Ces filtres comprennent des tests in vitro et des études pharmacocinétiques chez le rongeur. Seuls les produits à forts potentiels seront testés dans les études d’efficacité in vivo. Les modèles animaux utilisés suivront les protocoles décrits dans la littérature. Nous confirmerons la taille des groupes qui permettrait de détecter un effet statistiquement significatif pour une différence entre les gropes controles et traités de 40% en considérant une puissance de 80% et un risque alpha de 5%.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des locaux conformes aux standards règlementaires. Les procédures générant douleur, inconfort ou stress se feront sous anesthésie. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Des consignes spécifiques seront mises en place pour définir les procédures à suivre en cas de complications. Les animaux affectés recevront des soins adaptés, par ou sous autorité du vétérinaire ou seront euthanasiés
Choix des espèces
Le modèle animal utilisé est sélectionné en fonction des antigènes évalués, du type de réponse immune analysé et des données de la littérature ou des connaissances scientifiques. Plusieurs critères entrent en ligne de compte pour le choix de l’espèce, voire de la souche : • Espèce développant une maladie identique à celle touchant l’homme (par exemple, la rage) (Souris) • Espèce sensible à l’infection (par exemple l’Herpès Simplex) (Souris, lapin) • Espèce développant une réponse immunitaire similaire à l’homme (par exemple CMV) (Souris, Rat) • Type d’antigènes (protéines, polysaccharides, germes atténués…) ou d’adjuvants D’autres aspects techniques sont aussi à prendre en compte : taille des animaux (voie ou volume des administrations, volume de prélèvement), disponibilité des outils immunologiques adaptés à l’espèce (cytokines, marqueurs cellulaires…). Les souris mutantes ou transgéniques constituent une opportunité unique pour étudier les mécanismes d’actions et les voies associées à la réponse immunitaire. Dans la plupart des procédures, les rongeurs et les lapins sont tous utilisés après sevrage au stade adulte pour que leur système immunitaire soit mature. Pour des demandes particulières, des animaux âgés peuvent être utilisés pour étudier les phénomènes d’immunosénescence et l’évaluation de candidats vaccins pour les personnes âgées. De même, pour l’évaluation de candidats vaccins pédiatriques des modèles d’animaux juvéniles peuvent être utilisés (souriceaux, ratons ; etc…).
Etude des paramètres biologiques en fonction des stratégies nutritionnelles chez la vache laitière
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
150 vaches laitières vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis gardées vivantes pour poursuivre leur lactation. Elles font l'objet de prélèvements sanguins, urinaires et fécaux, réalisés en majorité par méthode naturelle et avec peu de contention, pour évaluer des stratégies nutritionnelles. Le porteur mentionne des risques de bagarres, de glissades et de boiteries lors des déplacements, et un recours au sondage urinaire ou à l'exploration rectale en cas d'échec de la méthode naturelle. Il justifie la démarche par des enjeux financiers, écologiques et de bien-être des animaux non-humains, et affirme qu'aucune méthode in vitro ne remplace ces prélèvements.
Objectifs
L’intérêt scientifique de ce projet est d’évaluer les besoins nutritionnels des vaches laitières, ainsi que d’étudier l’intérêt de nouveaux additifs ou matières premières dans leur alimentation. Avant de généraliser un programme alimentaire à un grand nombre d’élevages, il est nécessaire d’évaluer précisément ses impacts sur le bien-être et les performances des animaux. Les enjeux sont non seulement financiers (coût de formulation, performances des vaches laitières), mais aussi écologiques (émissions de gaz à effet de serre), et indirectement sociétaux puisque l’alimentation participe au bien-être des animaux. Au cours de ce projet, les mesures sont principalement d’ordre zootechnique : consommation d’aliments, production laitière, évolution du poids et suivi sanitaire. Cependant afin de mieux comprendre les besoins des vaches laitières, des prélèvements sanguins, urinaires et fécaux peuvent être réalisés pour évaluer l’impact de la nutrition sur plusieurs métabolismes (reproduction, santé, immunité, efficacité du métabolisme protéique,…). L’objectif de ce projet est d’évaluer les besoins nutritionnels des vaches laitières, ainsi que d’étudier l’intérêt de nouveaux additifs ou matières premières dans leur alimentation. Ce projet est mis au point par des scientifiques et validé par la direction du site.
Bénéfices attendus
Ces essais s’inscrivent dans la cadre de la recherche agricole, car les effets recherchés ciblent des problématiques d’élevage : amélioration de la valorisation ailmentaire des animaux, solutions nutritionnelles pour amléiorer et préserver le bien-être des animaux, solutions nutritionnelles visant à réduire l'impact environnementales des élevages bonvins lait. Afin d’apprécier l’effet des aliments testés, il est nécessaire d’élever les vaches laitières dans des conditions représentatives des conditions d’élevage.
Procédures
Pour ce projet trois procédures classe légère peuvent être réalisées : •Prélèvements sanguins: le volume prélevé est très faible pour les vaches (
Impact sur les animaux
Les effets indésirables ou nuisances attendues sont décrits dans les points limites. On peut mentionner les nuisances suivantes : bagarres/glissades lors des déplacements pouvant provoquer des boiteries, perte de sang/hémorragie au moment du prélèvement de sang (n'est jamais arrivé). Les prélèvements sanguins sont réalisés au niveau de la veine caudale. Les prélèvements urinaires et fécaux pourront être majoritairement réalisés par méthode naturelle non invasive. Si cette dernière échoue, les prélèvements urinaires sont réalisés par sondage urinaire et les prélèvements fécaux par exploration rectale, par contrôle d’une personne qualifiée. Les prélèvements sont réalisés par le personnel de l’établissement ayant reçu la formation expérimentale de niveau 2 : applicateur de procédures expérimentales. Par ailleurs, en plus de cette formation, le personnel maîtrise ces actes d’élevages grâce à leur formation initiale et à leur formation continue apportée par notre vétérinaire-conseil. Pour les 3 procédures, il n’y a pas ou très peu de contention des animaux, et seules 3 tentatives peuvent être réalisées. Durant les prélèvements, en présence de signes cliniques notables, les prélèvements sont arrêtés, le protocole de soins est appliqué et l’animal peut être sorti de l’essai et placé en zone de repos. Le bâtiment des vaches laitières est découpée en 4 zones de vies pouvant accueillir maximum 30 vaches. Chacune de ces zones de vie est dotée d’une zone de repos permettant d’y loger les vaches malades ou affaiblies, ou celles ayant besoin d’un suivi de reproduction particulier par exemple (surveillance après vêlage, IA, etc.). Les vaches connaissent bien cette zone et y sont habituées. Chaque zone de repos est équipée d’une zone de couchage libre (pas de logettes) confortable (matelas + sciure)..
Devenir
Tous les animaux utilisés dans ces procédures sont gardés en vie et poursuivent leur lactation comme en élevage classique.
Remplacement
Les méthodes in-vitro actuelles ne sont aujourd'hui pas suffisantes pour caractériser les interactions complexes entre les métabolismes, les variabilités individuelles ou encore l’environnement. C’est pourquoi il n’existent pas de méthodes alternatives aux trois procédures décrites dans ce projet (prélèvements sanguins, urinaire et fécaux).
Réduction
A la fin de chaque essai, les vaches laitières continuent leur cycle d’élevage et de production classique. Ainsi les animaux peuvent participer à plusieurs essais nutritionnels faisant parti de ce projet de recherche. Aussi, le nombre de vache par essai est étudié pour limiter le nombre d’animaux tout en permettant une puissance statistique suffisante.
Raffinement
Les conditions de contention sont identiques à celles utilisées pour l’élevage, voir meilleures. Les animaux sont élevés en groupe dans des aires dotées de zones de couchages adaptées avec matelas souples, présence de brosse automatique, aucune compétition pour l’accès à l’eau et à l’alimentation. Les prises de sang sont des actes reconnus d’élevage et sont réalisées par un personnel qualifié et préalablement formé à la contention et manipulation des animaux, ainsi qu’aux prélèvements selon une procédure interne. Les animaux sont déplacées en groupe de 12 au moins dans des zones de contention jouxtant leur zone de vie, donc dans leur environnement familier dans le but de limiter leur stress. Cette zone de contention est inspirée d’une salle de traite par l’arrière, c’est-à-dire que les animaux sont alignés et contenues par l'avant, ce qui permet une sortie plus rapide. Les opérateurs se situent derrière les animaux. Cette zone de contention est également utilisée pour d’autre manipulation d’élevage (parage, suivi reproduction), les animaux ne l’associent pas seulement aux mesures expérimentales. Si au bout de trois tentatives, le prélèvement de sang échoue, le prélèvement est abandonné sans remplacement de l’animal. Cependant, 100% des prélèvements réussissent à minima dès la seconde tentative et la grande majorité dès la première. Cas de plusieurs prélèvements (bouses + sang + urine) à réaliser sur un même animal : Les prélèvements sont réalisés «en une seule fois » afin de ne pas déplacer plusieurs fois les animaux limitant ainsi le stress lié au déplacement. On profite aussi de la mise en zone de contention des animaux pour récolter les bouses faites pendant le déplacement des animaux. On débute par la prise de sang, en même temps un opérateur se charge de récolter les bouses faites naturellement ainsi que l’urine. On termine lorsqu’il y a besoin par les prélèvements par exploration rectale et sondage urinaire. Des points limites sont également définis à la fois pendant la réalisation du prélèvements mais aussi dans les jours qui suivent le prélèvement afin de s'assurer du bon état de santé des animaux prélevés.
Choix des espèces
Il s’agit de l’espèce cible. Les vaches étudiées seront en phase de lactation, afin de produire du lait, donc adulte, puisqu’il s’agit de la phase cible.
Etude de la fonction lièe au microtubule de WDR47 dans le développement cortical
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 60 femelles gestantes subissent une laparotomie et l'électroporation de chaque embryon in utero par un capillaire de verre, et leurs souriceaux reçoivent des injections cérébrales et sous-cutanées avant d'être tués, certains par décapitation, pour étudier le rôle d'un gène dans le développement du cortex. Le porteur indique que la plaie abdominale peut s'infecter, entraînant l'euthanasie de la mère. Il affirme que la complexité de l'environnement cortical rend l'étude impossible in vitro.
Objectifs
Notre recherche est orientée vers l’étude de la physiopathologie des maladies neuro-développementales d’origine génétique. Un grand nombre de gènes y ont été reliés. Notre objectif est de comprendre les rôles de ces gènes dans les cellules du système nerveux central et les mécanismes physiopathologiques impliqués dans ces maladies. Nous avons identifié des mutations chez plusieurs patients (7 familles) avec des troubles du neurodéveloppement. Tous ont des anomalies de développement du corps calleux, jonction entre hémisphères droit et gauche, formée par les axones des neurones corticaux callosaux. Nous avons fait une étude fonctionnelle chez une souris qui porte une mutation qui nous permet d'invalider le gène étudié. Lorsque les neurones de cette souris n'ont pas ce gène (ni la protéine), leur développement n'est pas modifié, mais ils ont des difficulté à former des jonctions avec les neurones de l'autre hémisphère du cerveau. La partie du cerveau touchée s'appelle le corps calleux. La protéine que nous étudions étant impliquée dans la régulation de la dynamique du réseau de microtubules, nous voulons tester si son rôle sur les microtubules est déterminant pour la survie des neurones callosaux. Nous proposons ici de réaliser des expériences de sauvetage qui consistent à injecter un agent stabilisateur des microtubules, Epothilone B, disponible sur le marché. Les étapes majeures de la formation du corps calleux étant l’initiation (P2) et la phase terminale (P4) et l’invasion (P8) par les axones du cortex contralatéral et le branchement des axones à P21, nous prévoyons 4 stades d’étude.
Bénéfices attendus
Notre étude permettra de comprendre la fonction d’une protéine impliquée dans le neurodéveloppement et les mécanismes par lesquelles la déplétion de cette protéine conduit à des troubles du neurodéveloppement. Ce projet aura des retombées directes pour le patient. En effet, si les résultats sont ceux atendus, c’est-à-dire le sauvetage du phénotpe de neurodégénérescence par l’Epothilone B, ceci va ouvrir des perpectives de traitement pour les patients portant une mutation dans le gène étudié mais aussi toutes autres maladies lièes à des perturbations du réseau de microtubules.
Procédures
Les 60 femelles gestantes vont subir une chirurgie abdominale (laparotomie) et leur utérus va être exposé et transpercé par un capillaire en verre très fin à plusieurs reprises (une fois pour chaque embryon, durée 1 à 10 sec). Cette chirugie dure moins de 45 min. Elles seront par la suite placées dans des cages isolées avec leur portée jusquà la mise à mort des souriceaux. Les souriceaux vont subir une injection de 1 à 10 sec dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin au stade embryonnaire (E15.5). A leur naissance ils seront injectés en sous cutané avec une solution saline contenant ou non la molécule à tester une fois à P0 pour ceux étudiés à P2 et P4, une fois à P0 et une fois à P7 ceux étudiés à P8, une fois à P0, une fois à P7 et enfin une à P14 ceux étudiés à P21 . Chaque injection sous cutanée dure 1 à 5 sec. Les souriceaux étudiés à P2, P4 et P8 seront mis à mort par décapitation, ceux étudiés à P21 recevront une injetion intra-péritonéale d’anesthésique (5 sec) puis seront perfusés au PBS puis PFA sous anesthésie profonde
Impact sur les animaux
Les femelles gestantes vont subir une chirurgie abdominale (laparotomie) et leur utérus va être exposé et transpercé par un capillaire en verre très fin à plusieurs reprises (une fois pour chaque embryon, durée 1 à 10 sec).Elles seront par la suite placées dans des cages isolées. La plaie abdominale est susceptible de s'infecter, elle sera surveillée et la souris euthanasiée en cas d'infection. Les souriceaux vont subir une injectionde 1 à 10 sec dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin au stade embryonnaire (E15.5). A leur naissance ils seront injectés en sous cutané avec une solution saline contenant ou non la molécule à tester une fois à P0 pour ceux étudiés à P2 et P4, une fois à P0 et une fois à P7 ceux étudiés à P8, une fois à P0, une fois à P7 et enfin une à P14 ceux étudiés à P21 .Chaque injection sous cutanée dure 1 à 5 sec. Le site d'injection sera surveillé pour détecter tout signe d'infection. Les souriceaux étudiés à P2, P4 et P8 seront mis à mort par décapitation, ceux étudiés à P21 recevront une injetion intra-péritonéale d’anesthésique ( 5sec)puis seront perfusés au PBS puis PFA sous anesthésie profonde.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet. Après la PE1, les femelles gestantes sont herbergées jusqu’au sacrifice des nouveau-nés. Après la PE2, les nouveaux-nés sont herbergés entre 2 et 8 jours en ce qui concerne les stades P2, P4 et P8, puis sacrifiés par decapitation. Pour le stade P21, une perfusion intracardiaque, procédure classée sans réveil, est prévue.
Remplacement
L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement cortical qui ne peut pas être recréé par des approches in vitro. Le développement du cerveau est très bien caractérisé chez la souris, ce qui nous permet de déterminer efficacement les effets de l’altération du gène étudié sur le développement embryonnaire cortical. Il s’agit ici de réaliser des expériences de sauvetage du phénotype de neurodégénérescence que nous avons caractérisé précédemment dans le cadre d'un projet antérieur . Par ailleurs, de telles expériences ont été réalisées par un autre groupe français, justifiant la pertinence de notre approche et la faisabilité dans le modèle souris.
Réduction
La bonne maitrise de cette chirurgie acquise par l’équipe tout au long de ces dernière années permet d’avoir un temps de chirurgie de moins de 30 minutes et un bon taux de survie des embryons (70-80%) ce qui limite fortement le nombre de femelles gestantes manipulées. Nous garderons à l’esprit notre responsabilité de diminuer au maximum le nombre d’animaux expérimentés tout en atteignant la significativité statistique. Pour minimiser le nombre d’animaux utilisés, aucune nouvelle expérience ne sera effectuée avant qu’une analyse complète des précédentes ne soit réalisée. Nous envisageons d’utiliser le test statistique de Student afin d’évaluer la survie cellulaire et la santé des neurones invalidés pour le gène étudié entre condition contrôle et traitées Epothilone B en analysant la croissance axonale (36 animaux P2) le corps calleux (36 animaux P4) ; les branchements ipsilatéraux (36 animaux P8) et les branchements controlatéraux (36 animaux P21). Afin de réduire le nombre total d’animaux utilisés et d’éviter le cannibalisme des souris de fond bl6, nous avons adapté nos croisements et croisons des mâles hétérozygotes bl6 avec des souris F1 hétérozygotes 129Sv/Fas (50% 129Sv/Pas – 50% C57bl6). Ce type de croisement est utilisé en routine pour ces expériences sur le corps calleux et a montré une baisse notable du cannibalisme.
Raffinement
Nous prendrons en compte avec la plus grande attention le bien être de nos animaux. L’élevage et la reproduction de nos animaux se font dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress pour l’animal. Durant l’expérimentation les femelles gestantes sont anesthésiées par voie gazeuse et leurs yeux sont protégés de la deshydrartation par de l’ocrygel. Nous limitons le temps de manipulation à 45 minutes sur l’animal anesthésié. Le réveil est immédiat une fois l’arrêt de l’isoflurane. Un anti-inflammatoire non-stéroïdien, la metacam, est injecté avant l’opération par voie sous-cutanée. La metacam est également ajoutée au biberon jusqu’à la mise bas (6mg/L dans l’eau de boisson). L’animal se réveille dans une cage chauffée à 37°C et est surveillé régulièrement. Nous vérifions que les animaux mangent et s’abreuvent normalement. Les jours suivants, les animaux sont surveillés deux fois par jour pour voir notamment si la plaie a besoin de soins et pour détecter d’éventuelles infections postchirurgicales ou autres complications. L’objectif est de prévenir toute douleur ou détresse. En cas d’infections importantes ou de douleur manifeste, les animaux sont euthanasiés immédiatement par dislocation cervicale et les embryons sortis de leur sac et décapités.
Choix des espèces
La technique d’électroporation dans le cerveau a été mise au point chez la souris. Cet animal de petite taille avec environ 8 embryons par animal rend cette méthode efficace. Les étapes du développement du cerveau sont très bien caractérisées chez la souris ce qui nous permet de voir les effets des mutations dans des gènes impliqués dans les maladies neuro-développementales chez l’homme. Femelles adultes gestantes de 15,5 jours, stade auquel les neurones d’intérêt (neurones callosaux) sont générés. L’electroporation des embryons à ce stade permettra d’invalider WDR47 uniquement dans ces neurones et de suivre leur développement grâce à un marqueur fluorescent. Etant donné que les étapes majeures de la formation du corps calleux sont la croissance des axones, le passage dans l’autre hémisphère et la phase terminale de l’invasion par les axones du cortex contralatéral à P2, P4 et à P8 respectivement et le branchement des axones à P21, nous prévoyons 4 stades afin d’évaluer comment le traitement EpothiloneB protège les neurones contre la perte de la fonction de WDR47
Etude de l’efficacité de nouvelles thérapies combinatoires utilisant des anticorps bloquants anti-PD-1 chez la souris PD-1 humanisée.
- Recherche appliquée
- Cancers
1 380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des souris génétiquement humanisées pour le récepteur PD-1 reçoivent une inoculation de tumeur par voie sous-cutanée, intraveineuse ou chirurgicale, puis des injections répétées de traitement, pour évaluer de nouvelles combinaisons d'anticorps anti-PD-1 contre le cancer. Le porteur indique que les modèles orthotopiques, notamment pulmonaire, sont sévères et peuvent provoquer douleur, perte de poids et mobilité réduite. Il affirme que ces modèles permettent de valider l'effet des traitements à l'échelle de l'organisme avant un essai clinique.
Objectifs
Dans le but d’échapper au système immunitaire, les cellules tumorales créent un microenvironnement suppresseur pour inhiber la réponse des lymphocytes T via la voie PD-1/PD-L1. La molécule PD-L1 exprimée à la surface des cellules tumorales interagit avec son récepteur PD-1 exprimé à la surface des lymphocytes T et bloque leur capacité anti-tumorale. Pour réactiver la réponse immunitaire antitumorale, des anticorps thérapeutiques bloquants PD-1 (Pembrolizumab, Nivolumab) ou PD-L1 (Avelumab) ont été développés. Ces anticorps ont démontré une efficacité clinique impressionnante chez les patients atteints de mélanome ou de cancer du poumon et sont aujourd’hui utilisés comme première ligne de traitement. Malgré le succès de cette thérapie, seulement des sous-groupes de patients sont répondeurs. Il est donc nécessaire de tester de nouvelles cibles thérapeutiques et de les combiner avec des anti-PD-1/PD-L1 pour induire une réponse immunitaire anti-tumorale efficace. Au laboratoire, nous avons identifié des cibles capables d’améliorer l’effet des anticorps anti-PD1 sur la réponse immunitaire anti-tumorale. Pour simultanément cibler le récepteur PD-1 et les cibles que nous avons identifiées, nous avons généré de nouveaux formats d’anticorps dit « bispécifiques » en fusionnant un anticorps anti-PD-1 à ces cibles. L’objectif du projet est d’étudier l’effet thérapeutique de ces anticorps bispécifiques dans des modèles tumoraux murins : leucémie, cancer du pancréas, cancer du poumon et mélanome.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet en complément du projet pourrait permettre de développer et valider des traitements innovants efficaces contre le cancer humain afin de répondre à des besoins cliniques importants. Durant toute ces évaluations pré-cliniques, de nouvelles découvertes pourront être faites, notamment durant l’étude de la mécanistique du produit sur le système immunitaire en mettant en lumière des populations cellulaires antitumorales.
Procédures
Les animaux seront soumis à une inoculation de tumeur murine via injection en sous-cutanée, intraveineuse ou via intervention chirurgicale sous anesthésie (un modèle par animal). Pour le suivi de chaque modèle, les animaux seront également soumis à des injections en intrapéritonéale pour les traitements (environ 3 fois par semaine) sur animaux vigiles et, si besoin, pour l’injection de luciférine lors du suivi de la croissance tumorale en bioluminescence (1 à 2 fois par semaine). Dans le cadre de l’étape #3 du projet, un prélèvement de sang en intracardiaque des animaux pourra être effectuée sous anesthésie (intervention sans réveil).
Impact sur les animaux
L’induction des modèles tumoraux décrits dans cette saisine ont plusieurs effets indésirables en fonction du modèle. Pour les modèles orthotopiques : -cancer du poumon : altération de la respiration (point-limite). Tous ces modèles (or les modèles sous-cutanées) peuvent induire de la douleur, une perte de poids chez la souris, une diminution de la mobilité, un stress notamment dû à la chirurgie associée et un comportement altéré provoqué par ses différents effets indésirables. Tous ces modèles sont considérés comme sévères et une attention particulière sera apportée régulièrement aux souris (quotidiennement aux points les plus critiques). Les modèles tumoraux sous-cutanées peuvent provoquer de la douleur si l'état de la tumeur se détériorent (points-limites). La tumeur ne devant pas provoquer de gêne pour la mobilité de l’animal, celui-ci sera mis à mort si la tumeur atteint 1500mm3 (soit moins de 10% de la masse corporelle). Aucun autre effet indésirable n’a été remarqué sur ce type de modèle au laboratoire. Les modèles tumoraux sous-cutanées sont considérés comme des procédures modérés. La durée de ces effets est dépendant du type d’expérimentation : - évaluation de l’effet thérapeutique du traitement (étape #2) : étude de la survie de la souris. Les effets indésirables seront présents jusqu’à la mise à mort de l’animal. Celle-ci intervient lors de l’accumulation de ses effets ou l’apparition d’un effet considéré grave (points-limites). - évaluation mécanistique des traitements (étape #3) : mis à mort de l’animal avant l’apparition de points limites (à la fin de la séquence thérapeutique) afin d’étudier l’impact des traitements sur le système immunitaire.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des organes d’intérêts pourront être récupérés pour compléter les analyses.
Remplacement
Les traitements évalués lors de ce projet ont déjà démontré des résultats prometteurs in vitro chez l’homme sur de nombreux tests comme des évaluations à partir de lignées cellulaires, PBMC humains frais ou de tumeurs isolées de patients. Les modèles tumoraux chez la souris humanisée pour le récepteur PD-1 nous permettent de valider l’effet thérapeutique de nos traitements à l’échelle d’un organisme ainsi que d’évaluer leur potentiel effet toxique avant d’envisager un essai clinique chez l’homme.
Réduction
Ce projet nécessitera 1380 animaux au maximum. Ceci est une estimation haute qui sera surement réduite en fonction des résultats. Ce nombre d’animaux comprend la mise en place de six modèles au sein de notre laboratoire, ce qui est essentiel pour la suite des études et permet de générer à long terme un savoir-faire pour tous nos projets présents et futurs en cancérologie. Pas de tests statistiques seront nécessaires durant l’étape #0 et #1 du projet, le nombre d’animaux est donc réduit à 4 par condition. Idéalement, l’entrainement à la chirurgie du modèle du cancer du Pancréas (étape #0) sera effectué sur des souris recyclées de l’animalerie issue d’élevage (animaux surnuméraires ou issu du tri génétique ; pas de réutilisation d’animaux) afin de maitriser le geste. Autrement, les entrainements seront effectués sur des souris C57BL6 issues d’un élevage commercial. Au total, 156 animaux maximum sont estimés pour ces étapes de mise au point. Pour l’étape #2, le nombre total d’animaux pour cette étape a été estimé à 960 animaux en considérant que six modèles tumoraux seront utilisés pour étudier les 4 types d’anticorps bispécifiques. En réalité, nous pensons avoir besoin que de 1 à 4 modèles. Pour l’étape #3, le nombre total d’animaux pour cette étape a été estimé à 264 animaux, en considérant que maximum quatre modèles tumoraux seront utilisés pour étudier les 4 types d’anticorps bispécifiques. Cette étude sera menée si et seulement si un effet thérapeutique a été observé à l’étape #2. Les étapes #2 et #3, un nombre de 5 souris sera utilisé pour le groupe contrôle et 7 souris seront utilisées pour les traitements. Ces étapes nécessitent des résultats statistiques pour démontrer l’efficacité du produit thérapeutique. Ce nombre d’animaux a été estimé par des tests statistiques d’échantillonnage. Dû à la variabilité de la prise tumorale et de l’effet de thérapeutique interindividuelle, ce nombre est nécessaire pour avoir une bonne reproductibilité et obtenir des résultats statistiquement fiables. L’étude statistique choisie est le test de Mann-Whitney (ou Wilcoxon si le nombre de groupes à comparer est de 2) qui repose sur l’analyse de données non paramétriques déterminée quand le nombre de sujet est inférieur à 30. Ce test nous permet d’analyser nos données en combinant un test statistique fiable et un nombre d’animaux réduit.
Raffinement
Une étape d’acclimatation de 3 jours minimum pour les souris issues de l’élevage sur site et de 5 jours minimum pour les souris commerciales sera respectée avant inclusion dans des protocoles expérimentaux. Pour limiter le stress et l’inconfort, les animaux sont maintenus dans des cages ventilées dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté ainsi qu’un nombre maximum de 5 animaux/cage et un enrichissement frisottis pour s’enfouir et se cacher. Un enrichissement supplémentaire sera ajouté chez les mâles (dôme ou tunnel) afin de prévenir de potentielles agressions. Si un mâle se retrouve dominant et attaque ses congénères, il sera isolé dans une cage individuelle avec deux enrichissements (frisottis + dôme/tunnel). Nous avons aussi mis en place une procédure non invasive pour visualiser par imagerie de bioluminescence la croissance de la tumeur. Cette technique nous permet d’exploiter au mieux les résultats et ce, sans souffrance pour l’animal. Le suivi des animaux sera quotidien une fois que le protocole est considéré comme sévère et la gestion de la douleur maîtrisée le plus adéquatement possible afin d’apporter les soins nécessaires le plus rapidement aux animaux. Comme décrit dans les paragraphes des procédures expérimentales ci-dessous, des analgésiques seront utilisés avant et après chirurgie. Pour limiter l’inconfort de l’anesthésie, les animaux seront anesthésiés dans une boîte à induction placée sur tapis chauffant. Enfin des points limites ont été mis en place afin de réagir rapidement en cas d’inefficacité des traitements ou de souffrance animale.
Choix des espèces
Nous travaillerons avec la lignée de souris PD-1 humain Knock In (hPD-1KI) dont le fond génétique C57BL/6 est une référence pour la recherche fondamentale/préclinique et pour lequel plusieurs modèles tumoraux ont été établi au sein du laboratoire (APAFIS15700) ou par la communauté scientifique. Ces souris hPD1KI exprimant la version humaine du gène PD-1 se développent normalement et présentent les mêmes fonctions immunitaires que les souris sauvages C57BL/6. Ce modèle est donc très relevant d’un point de vue clinique car nous pouvons tester directement les effets thérapeutiques et biologiques de nos traitements anti-PD-1 bispécifique humain dans des modèles de tumeurs sans passer par un anticorps substitutif ciblant la molécule PD-1 de souris. Des souris C57BL/6 pourront être utilisées pour mettre en place certains modèles tumoraux et maitriser la chirurgie associée. Des adultes de 6 à 10 semaines seront utilisés, car la prise tumorale est homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse anti-tumorale, et donc un stade tumoral différent.
Evaluation de l’efficacité de la Fraction vasculaire stromale du tissu adipeux sur la fibrose pulmonaire et cutanée induite par l’acide hypochloreux chez le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
87 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une sclérodermie est induite par des injections intra-dermiques d'acide hypochloreux cinq jours sur sept pendant six semaines, avec imageries et injection d'une fraction du tissu adipeux, pour évaluer une nouvelle approche thérapeutique. Le porteur indique que les injections répétées causent stress et douleur et peuvent provoquer des ulcérations cutanées susceptibles de s'infecter. Il affirme que cette recherche est réglementairement impossible chez l'humain sans modèle animal préalable.
Objectifs
Il est urgent de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour les formes cutanées diffuses et l’atteinte pulmonaire fibrosante de la sclérodermie systémique (ScS). Compte-tenu de la complexité de la ScS, le choix du modèle préclinique de la maladie est crucial, devant refléter les différentes facettes de la maladie. Nous avons ainsi choisi le modèle induit par des injections d'acide hypochlroreux (HOCl) à la fois pour son caractère inductible sur une courte période, une atteinte cutanée diffuse, des lésions de fibrose pulmonaire et la production d’anticorps spécifiques. Il est donc très proche des conditions physiopathologiques observées chez les malades et apparaît pertinent pour l’évaluation d’une nouvelle approche thérapeutique, visant à cibler la fibrose pulmonaire et cutanée. L’équipe travaille sur la Fraction vasculaire stromale (FVS) du tissu adipeux. Nos travaux ont démontré l’effet anti-fibrosant et pro-angiogénique de la FVS. Le modèle chez la souris rendant difficile le recueil d’une quantité suffisante de FVS pour une utilisation en autologue, il a été décidé de transposer le modèle chez le rat. Le recours à la voie intra-veineuse s’impose également dans l’optique d’une thérapeutique systémique visant l’amélioration à la fois de la fibrose pulmonaire et cutanée. Nous avons choisi pour cette étude de « preuve de concept » de transposer le modèle de ScS induite par l’HOCl décrit chez la souris chez le rat pour y évaluer l’effet thérapeutique d’une injection intra-veineuse de FVS. Objectifs et moyens : 1/ Mettre en place le modèle ScS-HOCl chez le rat au laboratoire, 2/ Caractériser la fibrogénèse cutanée et pulmonaire induite par l’injection répétée d’HOCl chez le rat, 3/ Comparer les caractéristiques de la FVS des rats sclérodermiques et sains, 4/ Tester la faisabilité et la sécurité de l’injection IV de la FVS, 5/ Etudier les effets d’une injection IV de FVS hétérologue (rats sains) et autologue sur les lésions induites de fibrose pulmonaire et cutanée, 6/ Comparer les différentes doses de FVS utilisées à la recherche d’un effet dose et évaluer l’effet de la FVS déplétée de la fraction leucocytaire CD45+
Bénéfices attendus
Développement d'un modèle de sclérodermie systémique présentant les différents aspects systémiques de la maladie, complémentaire du modèle de sclérodermie cutanée induite par la bléomycine déjà utlisé antérieurement par l'équipe. Evaluation de l'effet systémique de la FVS injectée par voie IV. La faisabilité de l'injection IV de FVS chez le rat a déjà été démontrée dans la littérature dans des modèles de pathologies ischémiques cardiaques. Perspectives : pouvoir évaluer l'effet d'autres thérapies cellulaires ou d'autres traitements sur une espèce animale différente de la souris.
Procédures
Procédure 1 / 15 rats induction du modèle (+/- 12 animaux supplémentaires pour recherche dose optimale), + 6 animaux pour valider la reproductibilité de l'induction une fois la dose optimale trouvée). L’induction se fait par injection intra-dermique d’HOCl à 2 endroits de part et d’autre de la colonne avec une aiguille de 27G. Ces injections seront répétées 5 jours/7 pendant 6 semaines. Les injections se feront 30 minutes après application de crème anesthésiante et sous anesthésie à l’isoflurane (induction 5%, maintien 1,5%,durée 5min). Les animaux feront l’objet de 3 imageries (J0, J21 et 41). Les animaux sont endormis une première fois (isoflurane induction à 5% puis maintien à 1.5% sous mélange air/oxygène 30% à raison d'1L/min) afin de cathétériser une veine caudale pour injecter le radiotraceur en solution isotonique stérile (volume maximum 500µl). Une heure après l'injection du radiotraceur, les animaux sont de nouveau anesthésiés pour le passage sous les caméras (durée 30min). Procédure 2 / Induction de la fibrose (cf procédure 1) chez 27 rats. La FVS obtenue à partir de la graisse de rats sains (hors saisine) (lots 2,3 et 4) ou une solution de Ringer Lactate (lot 1) sera injectée aux rats par voie IV au niveau d’une des veines caudales sous courte anesthésie (5minutes) (isoflurane induction à 5% et maintien à 1.5% sous mélange air/oxygène 30% à raison d'1L/min). Les rats feront l’objet de 4 imageries sur la période (J0, J21 et 41 et J63) protocole identique procédure 1. Les animaux sont ensuite remis dans leur cage et gardés jusqu’à la fin du protocole où ils seront mis à mort. Procédure 3 / Induction de la fibrose (cf procédure 1) et imageries (cf procédure 2) chez 27 rats. Prélèvement de la graisse : 30 minutes avant le début de l’anesthésie les rats reçoivent une injection s.c de Buprénorphine. Les rats sont ensuite pré-anesthésiés dans une chambre spécialisée par administration de Isoflurane à 5% sous mélange air/oxygène 30% à raison d'1L/min, puis maintenus sous anesthésie générale en ventilation spontanée au masque par administration de Isoflurane 2% environ sous mélange air/oxygène 30% à raison d'1L/min. L’abord chirurgical sera fermé sur 2 plans. Injection de ropivacaine au niveau de la cicatrice. Réveil des animaux. Prévention des douleurs par injection s.c de buprénorphine pendant 48-72h. La FVS ou le ringer lactate sont ensuite réinjectés (cf procédure 2). Les animaux sont gardés jusqu’à la fin du protocole où ils seront mis à mort.
Impact sur les animaux
Fort de l'expérience sur les expérimentations antérieures, la répétition des injections génère un stress pour les animaux du fait de leur contention nécessaire et est source de douleurs. Afin de limiter ses souffrances, nous avons décidé après évaluation de la bonne tolérance lors des expérimentations antérieures, de réaliser les injections sous courte anesthésie gazeuse et d'administrer systématiquement aux rats dans les suites des injections du paracétamol. Des ulcérations cutanées peuvent apparaitre suite aux injections répétées d'HOCl. Malgré les mesures d'aseptie prises, il y a un risque de surinfection de ces lésions possible qu'il faudra surveiller et traiter si cela arrive. De part l'objectif visé, le développement de la fibrose cutanée pourrait entraver les mouvements du rat et limiter sa mobilité. L'apparition de cette fibrose est par contre indolore. Il faudra veiller à adapter la localisation de la nourriture et de l'eau si les rats venaient à presenter des difficultés à se mobiliser afin qu'il ne perde pas de poids ni se déshydrate. Avec le développement d'une fibrose pulmonaire, nous pouvons envisager l'apparition de difficultés respiratoires qui pourraient retentir sur l'activité du rat (difficultés respiratoires à l'effort tout d'abord) voir sur son état général ensuite (difficultés respiratoires au repos, fatigue, difficultés à manger). En ce qui concerne les rats de la procédure 3 qui auront un prélèvement de leur graisse péri-épididymaire, il est attendu des douleurs post-opératoires au niveau sus-pubien et testiculaire éventuellement qui seront prises en compte et traitées. Il y a un risque d'infectieux potentiel et possiblement un risque d'iléus réflexe avec rétention d'urines et constipation à surveiller.
Devenir
A l'issue de l'ensemble des procédures 1, 2 et 3, les animaux seront mis à mort. Procédure 1 : Au bout des 6 semaines, tous les rats seront mis à mort pour caractériser la fibrogénèse en récupérant les poumons et de la peau pour analyses histologiques, immunohistochimiques et moléculaires. Procédure 2 : A J63 les 27 rats induits puis traités seront mis à mort pour évaluer l'efficacité de l'injection de FVS saine. Procédure 3 : A J63, les 27 rats induits puis traités seront mis à mort pour évaluer l'efficacité de l'injection de FVS autologue.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale se justifie par l’impossibilité réglementaire de conduire ce type de recherche chez l’homme sans un modèle animal avant pour évaluer l’efficacité et les risques. Le modèle de fibrose induite par l’acide hypochloreux chez la souris est bien connu pour l’étude des mécanismes impliqués dans le développement de la ScS et pour tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le modèle HOCl reproduit des caractéristiques proches d’une forme diffuse de ScS avec une fibrose cutanée et pulmonaire et la production d’anticorps spécifiques. Il est ainsi très proche des conditions physiologiques observées chez l’homme. Bien qu’il ne soit pas parfait surtout pour une maladie aussi complexe que la ScS, le modèle HOCl chez le rongeur apparait pertinent pour l’évaluation d’une nouvelle approche thérapeutique visant la fibrose pulmonaire et cutanée. Vue la complexité de la pathologie, il n'est pas possible non plus de la modéliser in vitro ni in silico.
Réduction
Un maximum de 87 rats wistar est envisagé pour ce projet en espérant pouvoir se limiter à 75 rats. Le nombre de rats prévus est minimum mais suffisant pour chaque étape pour espérer obtenir des résultats significatifs. Pour la mise au point du modèle, suite aux résultats préliminaires, nous avons décidé de tester 3 concentrations d’acide hypochloreux d’emblée afin de limiter le nombre de rats témoins nécessaires et nous espérons ne pas avoir à tester 4 autres doses avec 12 rats supplémentaires. N=3 est suffisant à cette étape car l’induction de la fibrose ne doit pas induire de décès, que les animaux sont suivis longitudinalement par imagerie et que le résultat attendu est présence ou non de fibrose. Nous avons prévu 6 rats pour s'assurer de la reproductibilité d'induction du modèle avec la dose optimale trouvée. Pour l’étude de l’efficacité de la FVS, nous avons aussi prévu l’évaluation de 2 doses différentes de FVS + d'une dose de FVS déleucocytée dans le même temps afin de limiter le nombre de rats témoins également. Le nombre d’animaux (n=6 ou 7 / lot) a été déterminé en fonction des études sur l’injection IV de cellules souches mésenchymateuses sur le modèle murin de fibrose induite par l’acide hypochloreux et en tenant compte du risque de décès des animaux à la hauteur de 5-10%. L’évaluation de la FVS autologue permettra si les résultats avec la FVS hétérologue issue de rats sains sont comparables de ne plus avoir à utiliser des rats uniquement pour le recueil de la FVS à l’avenir et chez les patients seule la FVS autologue est envisageable. Le suivi de l’apparition et de la régression de la fibrose par imagerie permet également de limiter le nombre de rats puisque tous les rats seront mis à mort uniquement à la fin de l'expérimentaton et non à chaque point d'évaluation. Les paramètres quantitatifs seront comparés à l’aide du test t ou du test non paramétrique de Mann-Whitney. Une ANOVA sera utilisée lorsque l’analyse inclura plus que 2 groupes. Le seuil de significativité est fixé à 5%.
Raffinement
Les rats seront hébergés par 2 en armoire ventilée durant la période d’acclimatation puis d’expérimentation pour diminuer leur stress. Nous habituerons les animaux durant la période d'acclimation à être manipuler afin de limiter leur stress par la suite. Chaque cage sera agrémentée de tunnel rouge afin d'amener un enrichissement aux rats et les stimuler dans la réalisation de leur propre nid au sein de la cage. Ils auront à disposition nourriture et eau, le cycle jour nuit sera respecté et la température ambiante sera de 22°C. Une petite balle en plastique sera mise dans la cage afin qu’ils puissent se divertir le temps où nous ne sommes pas présents. Toutes les manipulations seront réalisées par du personnel formé afin d’optimiser le bien-être des rats et l’obtention de résultats positifs. Les injections id pour l'induction de la maladie seront réalisées après l’application d’une crème anesthésiante et avec l’administration orale en systématique de paracétamol dans les suites. Des soins locaux cutanés seront réalisés en cas de lésions cutanées induites par les injections id. Afin de limiter le stress important des animaux lié à la contention nécessaire aux injections, les injections seront réalisées sous une courte sédation gazeuse. Cela a été réalisé lors des expérimentations préalables avec succès et une très bonne tolérance. En cas de difficultés des rats à se mobiliser du fait du développement de la fibrose cutanée et/ou pulmonaire avec gêne respiratoire, nous leur mettrons à disposition dans la cage eau et nourriture afin d'éviter toute perte de poids. En cas de difficultés respiratoires, nous adopterons la concentration d'isoflurane et pourront ajouter de l'oxygène. Le recueil du tissu adipeux se fera sous anesthésie générale avec une analgésie péri-opératoire. Nous serons vigilants si difficultés respiratoires au réveil de l'anesthésie et à la tolérance des injections de buprémorphine. Une injection de ropivacaine au niveau de la cicatrice permettra de limiter le recours à la buprémorphine en post-opératoire immédiat. L'injection de la FVS et les imageries prévues seront réalisées sous anesthésie également. La même attention sera portée aux anesthésies pour ces gestes. De plus, la douleur et le bien-être des rats seront évalués quotidiennement tout au long de l’expérimentation afin d’adapter leur prise en charge en fonction. Si une souffrance sévère irréversible était objectivée, une mise à mort du rongeur sera réalisée sans délai.
Choix des espèces
Nous avons choisi de mener notre expérimentation chez le rat pour différentes raisons : -La faisabilité du prélèvement de tissu adipeux pour pouvoir obtenir une quantité suffisante de FVS et pouvoir travailler en autologue. Nous nous sommes notamment inspirés des études dans l’infarctus du myocarde. -La caractérisation de la FVS chez le rat déjà publiée validant un recueil uniquement de la graisse péri-épididymaire pour obtenir une quantité de FVS suffisante pour les objectifs cellulaires souhaités. -La faisabilité de l’injection intra-veineuse de FVS Nous utiliserons des rats wistar de 200-225 grammes afin d'avoir un poids des rats au bout des 8 semaines d'expérimentation (Acclimation + induction) suffisant pour obtenir une quantité de graisse péri-épidydimaire permettant l'obtention de FVS (3ml de graisse nécessaire). Le recueil de la graisse péri-épidydimaire a été choisi compte tenu des données de la littérature et cela permet de se limiter à une incision sus-pubienne et d'être moins invasif que si de la graisse abdominale doit être prélevée. Les suites opératoires en seront facilitées avec notamment moins de douleurs et un risque infectieux diminués.
Evaluation in vivo d’un nouvel agent immunothérapeutique dans les cancers de la vessie
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
610 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent chaque semaine, jusqu'à six semaines, une injection intra-uréthrale sous anesthésie et des prélèvements d'urine, pour tester un agent immunothérapeutique contre le cancer de la vessie. Le porteur indique que le développement tumoral peut provoquer une inflammation urinaire et un affaiblissement de l'état général. Il affirme que le recours à l'animal est "irremplaçable", aucun autre modèle n'évaluant les effets à l'échelle de l'organisme.
Objectifs
Le cancer de la vessie se classe au 10e rang des cancers les plus courants selon le Centre international de recherche sur le cancer. Les malades sont traités via une approche multidisciplinaire (chirurgie avec radiothérapie, chimiothérapie ou immunothérapie). En particulier, l’immunothérapie par instillation intravésicale du Bacillus Calmette-Guerin (BCG), initiallement utilisée pour la vaccination contre la tuberculose, est fréquente. Elle a des effets prouvés sur la réduction des récurrences et de progression de la tumeur. Ces effets du BCG résultent d'une interaction entre les effets directs sur les cellules tumorales du BCG et de la réponse immunitaire de l'hôte conduisant à la production de cytokines et à la destruction des cellules tumorales. Néanmoins, ce traitement a encore des effets cliniques insatisfaisants, justifiant le développement de nouvelles thérapies. Ainsi, ce projet de recherche vise à établir une preuve de concept pour une stratégie immunothérapeutique anticancéreuse à partir de vésicules de membranes externes (ou VME en abrégé) naturellement produites par des souches d’E. coli. Des expériences ont été menées dans des lignées cellulaires modèles humaines de cancer de la vessie et dans une lignée cellulaire contrôle de vessie peu transformée afin de mesurer l'impact du traitement par les VME sur la prolifération et la survie cellulaire. Il est maintenant indispensable de vérifier l'innocuité et l'efficacité des VME par des expériences in vivo dans un modèle murin car les expériences sur cultures cellulaires ne prennent pas en compte toute la complexité d’un organisme intégré. Nous évaluerons l’innocuité du traitement en instillant des VME dans la vessie de souris saines (même protocole que pour le BCG, cette technique est maitrisée par notre équipe). Si ce traitement s’avérait toxique (ce qui est peu probable au vu des résultats obtenus avec le BCG et étant donné que le traitement est purement local), nous pourrions alors utiliser une souche bactérienne beaucoup moins toxique et disponible au laboratoire. Cette dernière souche est à réserver en dernier recours, car étant moins toxique, elle est aussi bien moins immunostimulante et est donc moins susceptible d'être efficace contre les tumeurs. Puis, en utilisant deux modèles de cancer de la vessie (induits soit par l'ingestion d'un agent carcinogène soit par une infection par un agent uropathogène), nous évaluerons l'impact d'un traitement par les VME sur les cancers de la vessie.
Bénéfices attendus
Ces résultats devraient permettre d'établir une preuve de concept concernant l’efficacité d’un traitement par des VME sur les cancers de la vessie en évaluant d'une part leur inocuité sur l'animal sain et d'autre part leur(s) effet(s) sur le développement de lésions cancéreuses peu évoluées et sur la régression de tumeurs établies.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés une fois par semaine par anesthésie injectable (Ketamine-100mg/kg/Xylazine- 10mg/kg, i.p., 10ml/kg) ou anesthésie gazeuse (4% isoflurane), pendant au maximum 6 semaines, afin de réaliser l'injection de VME ou de produits contrôles (liquide physiologique, etc...) par voie intra-uréthrale via un catheter adapté. Chaque injection durera 1 à 2 minutes. Des prélèvements d’urine par miction spontanée (quelques gouttes recueillies dans un tube eppendorf) seront réalisés une fois par semaine pendant au maximum 6 semaines.
Impact sur les animaux
Certaines procédures expérimentales prévues génèrent chez la souris un développement tumoral pouvant entraîner une souffrance chez l'animal avec des effets locaux (inflammation au niveau de l'appareil urinaire par exemple) et des effets systémiques (affaiblissement de l'état général par exemple).
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure afin de réaliser des prélèvements de tissus pour évaluer les lésions éventuelles, notamment au niveau de la vessie (réalisation de scores macro- et microscopiques)
Remplacement
Nous avons déjà réalisé de nombreuses validations in vitro et in cellulo de manière à garantir la qualité des VME utilisées à des fins de stratégie anti-cancéreuses. Nous allons continuer à étudier leur effet sur des lignées cellulaires modèles. Le recours à l’animal est cependant irremplaçable car aucun autre modèle ne permet d’évaluer les répercussions d’un tel traitement à l’échelle d’un organisme (évaluation de l’éventuelle toxicité systémique – non attendue-, et de l’efficacité sur la régression tumorale). Une veille scientifique sera mise en oeuvre pour identifier toute méthode scientifique alternative à l’expérimentation animale dans le domaine.
Réduction
Des expériences préalablement réalisées avec ce modèle permettent d'estimer de manière optimale le nombre d'animaux requis. Ce projet nécessite l’utilisation de 610 souris âgées de 6 semaines car il est indispensable de réiterer les expériences 3 fois de manière indépendante pour garantir la robustesse des résultats. Plusieurs paramètres seront analysés chez chaque animal (poids, prélèvements d’urine, de tissus et de sang lors du sacrifice) et une méthode non invasive d'échographie sera appliquée pour suivre la progression tumorale au cours du temps et ainsi réduire le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
L’environnement des animaux assurera des conditions d’hygrométrie et de température constantes. Les cages possèdent des cabanes dans lesquelles les animaux peuvent se cacher et exprimer un comportement propre à leur espèce. Les cages sont teintées de manière à apaiser les animaux. Le change de la litière sera effectué toutes les semaines. La surveillance quotidienne permettra de s'assurer que les animaux ne présentent pas des douleurs ou détresses dépassant les points limites ou nécessitant le recours à un traitement antalgique. L'hydratation et l'alimentation seront disponibles ad libitum. Le protocole d’expérimentation sera adapté afin de minimiser la morbidité et la douleur.
Choix des espèces
La souris est le mammifère le plus facilement manipulable et le modèle plus décrit pour l’étude du cancer de la vessie. En particulier, les lésions néoplasiques liées aux cancers de la vessis développées dans cette espèce animale sont très similaires à celles développées chez l'homme, ce qui rend ce modèle particulièrement intéressant pour l'étude de cette maladie. Nous utilierons des souris de 7 à 8 semaines. Dans la littérature, les souris soumises au carcinogène (BNN) sont classiquement âgées de 5 à 6 semaines, âge auquel elles sont considérées adultes. Nous prenons une marge de deux semaines pour permettre l’acclimatation.
Rôle d’une protéine de réponse au stress oxydatif de Pseudomonas aeruginosa dans l’infection pulmonaire aiguë chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
102 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par la bactérie Pseudomonas aeruginosa par instillation intra-nasale sous anesthésie, puis mises à mort 24 heures après pour analyser leurs poumons, afin d'étudier une protéine bactérienne comme cible thérapeutique. Le porteur indique des signes d'infection respiratoire, dyspnée et poil hérissé, et une surmortalité possible de 20 % lors de l'instillation. Il affirme qu'un modèle in vitro d'épithélium humain reste "très limité" et ne rend pas compte de la réponse immunitaire globale.
Objectifs
Pseudomonas aeruginosa est une bactérie de l’environnement induisant des infections respiratoires chez les sujets fragilisés comme ceux se trouvant en réanimation, ceux atteints de broncho-pneumopathie chronique obstructive ou encore ceux atteints de mucoviscidose. L’émergence de souches de P. aeruginosa de plus en plus résistantes aux antibiotiques est observée partout dans le monde. La resistance aux antibiotiques est un problème car cela risque d’entrainer des impasses thérapeutiques pour les patients. L’objectif est d’étudier si une proteine protégeant P. aeruginosa contre la défense de l’hôte peut servir de cible thérapeutique alternative ou adjuvante aux antibiotiques pour traiter les infections à P. aeruginosa résistant aux antibiotiques : ce projet scientifique a pour objectif (i) de déterminant les charges bactériennes dans les poumons infectés par les bactéries hyperexprimant ou non la proteine, (ii) d’étudier l’impact de l’infection sur la destruction de l’architecture du poumon et sur la réaction inflammatoire et immunitaire.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet nous permettra de caractériser plus précisement la virulence accrue au niveau pulmonaire induite par la proteine d’intérêt chez la bactérie P. aeruginosa résistante aux antibiotiques utilisés couramment en médecine humaine. Cette caractérisation histologique et bactérienne est indispensable pour affirmer l’implication de cette protéine dans la différence de survie observée chez les souris dans nos travaux précédents et elle est nécessaire pour expliquer le mécanisme global de la virulence augmentée de ces souches. Cette protéine participe à la virulence à la bactérie. Elle constitue donc une cible potentielle pour le développement à plus long terme de nouvelles stratégies thérapeutiques dans les infections pulmonaires à P. aeruginosa résistants à de nombreux antibiotiques. Le développement d’inhibiteurs de cette proteine peut être envisagé pour constituer une thérapeutique alternative et adjuvante aux antibiotiques en médecine humaine. Son inhibition pendant l’infection respiratoire permettrait de limiter la prolifération de P. aeruginosa en le rendant sensible à la réponse de l’hôte.
Procédures
Pour chaque animal, il sera réalisé : - Une infection respiratoire par instillation intra-nasale : geste réalisé sous anesthésie générale. - Une administration d’un antalgique de palier III par injection intrapéritonéale à 6h post infection. - L’euthanasie à 24h post infection pour prélévement et analyse des poumons (études bactérienne, histologique et cytologique)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sont ceux résultants de l’infection pulmonaire bactérienne. Il pourra être observé des signes d’infections respiratoires : dyspnée, mobilité réduite, dos vouté et poil hirissé. Une sur-mortalité possible de 20% lors de l’instillation intranasale est également attendue.
Devenir
Les animaux de la procédure seront mis à mort 24h après l’infection afin de réaliser le dénombrement de la charge bactérienne pulmonaire, les analyses d’histologie/immunomarquage sur poumons et les analyses cytologiques sur LBA
Remplacement
Ce projet requérant un modèle murin a été considéré après une étude in vitro préalable. En effet, la première partie de notre projet, qui a permis la mise en évidence de la virulence augmentée de la souche résistante aux antibiotique et le rôle d’une protéine d’intérêt, a été réalisée sur un modèle in vitro d’épithélium respiratoire humain. Cependant, malgré son utilité, ce modèle reste très limité car il ne permet pas d’étudier la virulence bactérienne à l’échelle du poumon dans son ensemble et il ne prend pas en compte la réponse immunitaire globale de l’hôte vis-à-vis de P. aeruginosa. Seule une partie de la réponse immunitaire innée est assurée mais la réponse immunitaire innée médiée par les phagocytes (polynucléaires, macrophages, …) ainsi que la réponse immunitaire adaptative (humorale et cellulaire) est absente dans ce modèle. Au contraire, dans le modèle murin de pneumonie aiguë, la réponse globale de l’hôte au niveau pulmonaire est assurée et cette étape in vivo est essentielle à la validation du rôle la protéine d’intérêt dans l’infection à P. aeruginosa résistant aux antibiotiques
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été déterminé pour répondre à l’objectif scientifique selon le nombre d’expériences prévues, les besoins en données selon les analyses statistiques envisagées et les données de la litterature. Pour comparer les résultats de charges bactériennes, des tests non paramétriques de Mann-Whitney seront appliqués, ces tests non paramétriques étant adaptés à notre étude comprenant un faible nombre d’individu. Une réflexion biostastistique (utilisant le logiciel G-Power) a été réalisée afin d’éviter qu’une réduction trop drastique ne nuise à la fiabilité des résultats du projet. Nous avons également pris en compte le risque de surmortalités, c’est-à-dire la sortie précoce d’animaux avant la fin de la procédure (mortalité lors de l’instillation nasale, atteinte des points limites avant 24h, …), selon les données de la littérature et notre expérience acquise lors de précédentes manipulations. Les groupes ont donc été réduits à la taille minimum nécessaire à l’interprétation des résultats. Pour essayer de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous allons exploiter le plus possible les organes prélèvés, en essayant par exemple de mettre au point l’immunomarquage de P. aeruginosa sur les coupes en paraffine utilisées pour l’étude histologique classique. Si le marquage fonctionne, l’expérimentation (infection 4) prévue pour la cryoconservation/immunomarquage ne sera finalement pas utilisée, permettant de diminuer le nombre d’animaux (16 animaux en moins).
Raffinement
Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien être de l’animal, plusieurs mesures seront réalisées : - l’anesthésie par injection intrapéritonéale de Kétamine (50 mg/Kg) / Xylazine (5 mg/Kg) lors de l’instillation intra-nasale de l’inoculum bacterien, avec l’utilisation d’un dispositif chauffant lors de l’anesthésie des souris pour éviter l’hypothermie. - une surveillance rapprochée pendant la procédure (toutes les 2 à 4 heures en journée (8h à 18h) et une visite nocturne). Cette surveillance permet le suivi des animaux et la vérification des points limites, requérant l’euthanasie. - l’administration d’un antalgique de palier III (Buprénorphine, 50µg/kg) en intra péritonéal à 6h post-infection pour limiter la douleur et la dyspnée chez l’animal. - un enrichissement des cages et le regroupement des souris dans les cages pour préserver les interactions sociales
Choix des espèces
La souris est une espèce pour laquelle de nombreux protocoles de pneumonie aiguë d’étiologie bactérienne ont été optimisés et validés. Le modèle murin utilise des souris âgées de 6 à 8 semaines et permet d’étudier la pathogénicité bactérienne lors de l’infection pulmonaire aiguë (i) en établissant les courbes de survie (se basant sur l’atteinte des points limites), (ii) en réalisant des coupes histologiques pulmonaires et (iii) en déterminant la charge bactérienne infectante dans les poumons.
Etude des mécanismes d’invasivité des adénomes hypophysaires chez le rat et évaluation de l’efficacité thérapeutique d’un médicament candidat
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
32 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection de cellules tumorales dans l'hypophyse, puis trois séances d'IRM sous anesthésie et des prélèvements sanguins, pour étudier la propagation d'un adénome hypophysaire et tester un médicament candidat. Le porteur indique que la croissance tumorale peut entraîner une perte de poids et une altération de l'état général. Il affirme que le recours au modèle animal est "indispensable", des cultures cellulaires ayant servi en amont sans pouvoir le remplacer.
Objectifs
L’objectif de notre projet est double. Il d’agit d’une part de suivre l’évolution de ces tumeurs afin de les caractériser et de comprendre les mécanismes de propagations dans les tissus cérébraux. D’autre part, nous évaluerons également l’efficacité thérapeutique d’un médicament candidat (la Sitagliptine) sur la base de la taille de la tumeur mesurée de façon non invasive par IRM. En effet, parmi toutes les modalités d'imagerie permettant d'étudier de manière non invasive les tissus, l'IRM (Imagerie par Résonance Magnétique) est l'une des plus prometteuses : elle est capable de fournir des images à haute résolution du cerveau, qui permettent ainsi une mesure précise des altérations des structures cérébrales et des tumeurs en elles-mêmes. Dans ce projet, un suivi longitudinal sera effectué par IRM, ce qui permettra de caractériser la vitesse de propagation des cellules tumorales à travers les tissus environnants et d’évaluer la sensibilité des différentes structures péri-hypophysaires. Afin d’étudier les mécanismes moléculaires à l’origine de la tumorigenèse hypophysaire et ceux à l’origine de l’invasion des structures cérébrales adjacentes par des cellules hypophysaires, nous souhaitons étudier le comportement de cellules hypophysaires sur-exprimant les gènes d’intérêt in vivo. L’utilisation de modèles animaux dans l’étude des mécanismes de dissémination tumorale est nécessaire pour reproduire au mieux le microenvironnement tumoral humain.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes à l’origine de la survenue d’une tumeur hypophysaire et ceux à l’origine de sa propagation vers les structures cérébrales adjacentes. En plus des connaissances fondamentales sur la croissance tumorale de ce type de tumeurs, un des bénéfices majeurs du projet est l’évaluation de l’effet thérapeutique d’un médicament candidat. La substance active du médicament évalué ici est la Sitagliptine qui est déjà connue et commercialisée : elle est administrée à l'homme depuis longtemps sans effet secondaire significatif ainsi qu’à l’animal. A court terme, les résultats pourront être valorisés sous forme de publication scientifique qui bénéficieront à l’ensemble de la communauté scientifique travaillant sur ce type de tumeurs cérébrales. A plus long terme, les connaissances acquises, en particulier sur le candidat médicament, permettront d’envisager son utilisation dans des études cliniques.
Procédures
Injection intra-hypophysaire de cellules tumorales (durée) Ce geste sera réalisé dans le laboratoire de l’équipe partenaire pour lequel une saisine a déjà été validée. Tous les animaux impliqués dans cette procédure ne subiront qu’une seule chirurgie au cours de leur vie. Caractérisation par IRM 14 jours après l’injection des cellules tumorales, les animaux seront imagés par IRM. Les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane (3%) dans une boite à induction afin d’être positionnés dans le cadre stéréotaxique compatible avec l’IRM. Une fois positionné dans le cadre stéréotaxique, l’animal sera positionné dans l’aimant pour réaliser l’acquisition des images. 3 sessions d’IRM seront réalisées à J+14, J+28 et J+49 après injection des cellules tumorales. La durée totale de l’examen IRM est de 30min. Prélèvements à la veine saphène Les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane pour effectuer le prélèvement de sang (durée) à la veine saphène. 3 sessions de prélèvements seront réalisées à J+10, J+35 et J+56 après injection des cellules tumorales. Traitement médicamenteux La moitié des animaux sera traitée par un médicament candidat luttant contre la propagation tumorale. Ce traitement sera administré quotidiennement par ajout dans l’eau de boisson et ce durant toute la durée de l’hébergement. Perfusion intracardiaque L’euthanasie interviendra à J+56 après injection des cellules tumorales ou du PBS (durée). Juste après le dernier examen IRM, et avant leur réveil, les animaux seront euthanasiés par administration de pentobarbital (Exagon 1ml/kg, soit 400mg/kg de pentobarbital) afin de préparer les tissus en vue d’utilisation pour des analyses post-mortem.
Impact sur les animaux
La nuisance principale attendue dans ce projet est liée à la croissance tumorale. En effet, la croissance des tumeurs hypophysaires est susceptible d’entrainer une perte de poids des animaux et une altération de l’état général. Pour prendre cela en compte, l’état des animaux sera surveillé quotidiennement et l’ensemble des signes associés au développement tumoral attendu chez les animaux sera surveillé de manière hebdomadaire. Concernant l’administration du médicament, nous n’attendons pas d’effet secondaire particulier car la substance active est déjà bien connue et a déjà été administrée à l’homme comme à l’animal sans effet secondaire notoire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure
Remplacement
L’utilisation de modèles animaux pour l’étude du développement tumoral et pour l’étude d’un inhibiteur pharmacologique est indispensable. - Des cultures cellulaires ont également déjà été utilisées en parallèle pour étudier la migration et l’invasion des cellules traitées ou non par les inhibiteurs pharmacologiques ce qui permet de limiter le nombre d’animaux. Seules les cibles ayant déjà prouvées leur efficacité sur des cultures cellulaires sont étudiées in vivo. - Seule l’utilisation de modèles animaux in vivo mimant le plus fidèlement le microenvironnement tumoral permettra d’étudier de manière spécifique le rôle des voix de signalisation étudiées dans la croissance tumorale et dans la migration des cellules tumorales vers les structures cérébrales adjacentes. - Seule l’utilisation de modèles animaux vivant permettra de confirmer le rôle inhibiteur des molécules sur la croissance tumorale et de mimer la maladie tumorale humaine.
Réduction
Dans une première étude, nous avons utilisé des groupes de 6 animaux par condition expérimentale. Nous avions estimé que c’était un nombre raisonnable au vue de la reproductibilité du modèle tumoral mis en place. Le nombre d’animaux par groupe avait été déterminé en utilisant un calcul de puissance statistique. Pour comparer les 2 groupes de rats (traités vs non-traités), nous avons utilisé un test non-paramétrique de Mann-Whitney. Dans le cas des mesures répétées (comparaison de la croissance tumorale ou du poids corporel dans le temps), des ANOVA à mesures répétées suivies des tests post-hoc adéquats ont été utilisés. Rétrospectivement, nous pouvons utiliser la différence observée lors de la première étude (N=6) pour améliorer le calcul de puissance statistique (logiciel G-Power et la formule de Cohen d = (M2 - M1) ⁄ SD, avec M1 et M2 les moyennes des volumes tumoraux des deux groupes et SD la déviation standard). Les études précédentes ont déterminé une moyenne de volume tumoraux, 0.1213 +/- 0.077 cm3 et 0.031 +/- 0.03 cm3 respectivement. Nous obtenons donc une valeur de d=1.52 selon la formule de Cohen. Avec un risque alpha de 5% et une puissance de 95%, nous obtenons N = 11 par groupe, soit 5 animaux supplémentaires par groupe. Afin de s’affranchir d’éventuelles pertes lors de la chirurgie, il est préférable d’ajouter 2 animaux par groupe soit N=13 par groupe.
Raffinement
Une acclimatation de 7 jours sera respectée à l’arrivée dans notre animalerie. Les animaux seront hébergés dans des cages adaptées à leur taille (2 par cage, portoirs ventilés, environnement à température contrôlée, cycle diurne-nocturne de 12h, eau et nourriture fournies ad libitum). Un examen quotidien sera effectué par les zootechniciens, sous la supervision permanente du vétérinaire. Un environnement enrichi par un système de nidification périssable et renouvelé à chaque changement de cage sera fourni, selon nos procédures standards. - Les examens IRM et les prélèvements de sang à la veine saphène seront réalisés sous anesthésie isoflurane avec soutien thermique et suivi de la fréquence respiratoires et de la température de l’animal. - Nous utilisons un scoring quotidien pour surveiller le,bien être animal. 5 composantes seront évaluées : apparence (qualité du poil, propreté des yeux et du nez), posture, mobilité, comportement et signes cliniques. Si necessaire nous demanderons conseil auprès de notre vétérinaire pour envisager la mise en place ou la poursuite d’un traitement analgésique Si un point limite est atteint l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Pour des raisons immunologiques, des rats seront utilisés pour l’injection des cellules hypophysaires de rats (GH3). L’apparition d’un phénotype tumoral chez les rates après injection de cellules GH3 a déjà été observée par le passé . Ce choix d’utiliser une injection dans l’hypophyse repose sur la création d’un modèle fidèle de tumeur hypophysaire mimant le microenvironnement tumoral et permettant d’étudier de manière plus spécifique l’envahissement des structures cérébrales adjacentes. Par ailleurs, les rats sont adaptés pour étudier le cerveau car leur petite taille permet de les examiner dans des scanners IRM performants. De plus, nous disposons d’une antenne IRM spécifique pour cerveau de rat, ce qui permet de diminuer le temps d’acquisition et donc les durées d’anesthésie des animaux. Tous les rats arriveront dans notre animalerie à l’âge de 9 semaines. La procédure expérimentale débutera après 1 semaine d’acclimatation. L'utilisation de rats au stade de 9 semaines correspond à la maturité sexuelle des animaux afin d'obtenir un environnement oestrogenique favorable au développement de la tumeur.
Evaluation de l’efficacité et de la sécurité de deux dispositifs innovants pour la thrombectomie chez un modèle porcin d’ischémie cérébrale.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
12 cochons vont être utilisés dans une procédure unique d'environ quatre heures menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Un modèle d'ischémie cérébrale est provoqué pour évaluer deux dispositifs de thrombectomie destinés à retirer un caillot dans une artère du cerveau, deux dispositifs testés sur le même animal. Le porteur indique qu'aucune nuisance supplémentaire n'est prévue au-delà du stress de la prémédication, puisque la procédure est sans réveil. Il affirme que la sécurité de ces dispositifs ne peut pas être évaluée in vitro et que seul l'essai in vivo permet de la confirmer.
Objectifs
L'accident vasculaire cérébral ischémique (AVC) est la première cause de handicap et la troisième de décès dans le monde occidental. L’AVC résulte de l'occlusion d'une artère cérébrale par un caillot sanguin appelé thrombus. Le traitement de l'AVC consiste à retirer mécaniquement le thrombus par voie endovasculaire, c'est à dire en passant par les veines et les artères. C'est ce qu'on appelle la thrombectomie mécanique. Pour cette intervention l'opérateur utilise différents outils endovasculaires, et des techniques pour extraire le thrombus de l'artère bouchée. Ce traitement est efficace dans 80 à 90% des cas. Cependant, le temps nécessaire au rétablissement de la circulation sanguine dans l’artère est parfois excessivement long, ce qui influence négativement l'évolution clinique des patients. Notre étude consiste en l'évaluation in vivo de la sécurité et de l'efficacité de deux nouveaux dispositifs endovasculaires conçus pour améliorer les procédures de thrombectomie cérébrale. Ils sont conçus pour être utilisés en conjonction avec les outils habituels et permettront d’améliorer la procédure en renseignant l’opérateur sur la localisation du thrombus et en optimisant le retrait de celui-ci. Ces deux dispositifs, qui se trouvent encore dans une phase de développement, ont déjà fait l'objet de multiples évaluations in-vitro, à l'aide de modèles d'artères cérébrales en silicone qui ont démontré leur efficacité mais n’ont pas permis d'évaluer leur sécurité d’utilisation. En effet, ils pourraient engendrer des dommages au niveau de la paroi d’une artère réelle (dissection ou rupture). Par conséquent, l'objectif de notre projet est d’étudier l’impact de l’utilisation de ces dispositifs à visée clinique sur les parois artérielles réelles, étape indispensable pour leur développement futur. Nous envisageons de reproduire des procédures de thrombectomies chez l'animal (sous anesthésie générale) en utilisant les dispositifs en cours d'évaluation et de prélever les vaisseaux pour réaliser une analyse histopathologique des différentes couches de la paroi en accord avec d'autres études animales similaires de références.
Bénéfices attendus
L'expérience proposée est essentielle pour prouver l'efficacité et la sécurité de deux nouveaux dispositifs d’aide à la thrombectomie (action de déboucher une artère) pour le traitement des accidents vasculaires cérébraux (AVC). En effet, les deux dispositifs que nous avons mis au point, associés avec les outils endovasculaires utilisés pour réaliser des thrombectomies standards, ont montré une bonne efficacité et même une amélioration de la procédure. Néanmoins la sécurité de ces dispositifs ne peut pas être évaluée in vitro et l’efficacité reste à confirmer in vivo. Notre étude comparera directement une procédure nouvelle d’un côté et la procédure standard de l’autre côté sur le même animal. Le gain de connaissances attendu par cette expérience permettra d’envisager une application future chez l’homme. L’apport de ce développement est significatif car le traitement des AVC aigüs représente un nombre important d’interventions dont les résultats cliniques à moyen terme sont directement liés aux aspects techniques de la procédure. Toute amélioration bénéficiera donc à ce domaine de recherche qui est très important en termes de santé publique. L’optimisation de ces dispositifs permettra in-fine d’améliorer le traitement des accidents vasculaires cérébraux (AVC) et par conséquent les résultats cliniques pour les patients.
Procédures
Les animaux ne seront soumis qu'à une seule procédure expérimentale d'environ 4h00 et classée sans réveil. L’animal restera sous anesthésie générale et tous les prélèvements tissulaires seront réalisés post-mortem.
Impact sur les animaux
En dehors des contraintes liées à la préparation de l'animal (stress au moment de la prémédication), aucune nuisance supplémentaire n'est prévue puisqu'il s'agit d'une procédure sans réveil, au cours de laquelle la gestion de la douleur et de l'anesthésie seront rigoureusement surveillées.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure alors qu'ils sont sous anesthésie générale.
Remplacement
Notre étude consiste en l'évaluation in vivo de la sécurité et de l'efficacité de deux nouveaux dispositifs endovasculaires conçus pour améliorer les procédures de thrombectomie cérébrale. Ces dispositifs sont conçus pour être utilisés en conjonction avec les outils couramment utilisés pour la thrombectomie, en particulier les fils guides, les cathéters et les stentrievers. Ces deux dispositifs permettront d’améliorer la procédure de thrombectomie en renseignant l’opérateur sur la localisation du thrombus et en permettant d’optimiser le retrait de celui-ci. Ces deux dispositifs qui se trouvent encore dans une phase de développement, ont déjà fait l'objet de multiples évaluations in-vitro à l'aide de modèles d'artères cérébrales en silicone. Bien que tous les tests appropriés aient été réalisés pour évaluer l’efficacité des dispositifs, il est impossible d’estimer, dans un environnement in vitro ou in silico, si les dispositifs provoqueront une lésion de la paroi de l’artère traitée (dissection, rupture de la couche musculaire). Ainsi, la seule alternative restante pour évaluer l’impact sur la paroi artérielle est d’utiliser les dispositifs dans un organisme vivant et d'évaluer ses conséquences.
Réduction
Nous évaluerons sur les animaux l’efficacité des deux dispositifs dans les conditions les plus défavorables (caillots durs) car nous avons déjà évalué in vitro l’efficacité des deux dispositifs dans les cas favorables (caillots mous). Ceci permet de réduire le nombre de tests in vivo. Le nombre d'animaux sélectionné est aussi faible que possible pour évaluer la sécurité des dispositifs comme reporté dans des études similaires. Par conséquent, nous prévoyons 24 gestes de thrombectomie par dispositifs testés ce qui représente un total de 12 cochons répartis en 6 sessions de test. Le fait d’évaluer deux dispositifs sur le même animal réduit le nombre nécessaire.
Raffinement
Toutes les mesures nécessaires seront prises pour éviter les nuisances pour les animaux. Concernant l'hébergement de ces animaux, les mesures de raffinement seront mise place en amont : période d'acclimatation d'une semaine, hébergement en groupe afin de limiter leur stress. L'enrichissement est réalisé en créant une zone de repos couverte de litière, leur permettant de s'allonger tous ensemble et de répondre à leur comportement de fouissement. Ils disposent également de jouets suspendus à mordiller. Au cours de la procédure, les animaux seront anesthésiés profondément, avec l’utilisation de médicaments analgésiques et anesthésiques adaptés pour toute la durée des expériences. L’animal sera placé sous anesthésie générale avant de procéder à l’accès artériel fémoral et durant toute la durée de l’intervention jusqu’à sa mise à mort. Par conséquent, aucune expérience douloureuse ne sera ressentie par l’animal pendant les expériences.
Choix des espèces
Le porc convient à ce type d'étude car sa taille, son anatomie vasculaire et le diamètre de ses artères sont proches de celle de l’homme et permettent d’utiliser les mêmes cathéters et dispositifs interventionnels, dans les mêmes conditions de diagnostic et de surveillance (radiologie). Les animaux sont choisis au terme du post-sevrage à l'âge de 3 mois. A ce stade de développement les diamètres de vaisseaux correspondent à ceux de l’humain et permettent donc de réaliser l'étude dans de bonnes conditions.