Recherche appliquée

50 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisées dans d'autres projets de l'établissement. Elles subissent l'implantation chirurgicale de boîtiers de stimulation et de télémétrie, une intervention pouvant durer quatre heures, avant induction d'une fibrillation auriculaire et injections quotidiennes d'une molécule pendant plusieurs semaines. Le porteur décrit des cicatrisations prolongées, des risques d'infection ou de rejet des implants, et un stress lié à l'isolement lors des injections. Il affirme que la complexité de la maladie empêche toute simulation in silico et présente la brebis comme un modèle de "référence" proche du cœur humain.

Objectifs

La fibrillation auriculaire (FA) est le trouble du rythme cardiaque le plus répandu. Cette maladie des oreillettes peut toucher 1 % de la population globale et jusqu'à 5 % des personnes âgées de plus de 65 ans et sa fréquence double à chaque décennie. La gravité de cette affection est principalement liée à ses conséquences : 30 % des accidents vasculaires cérébraux peuvent lui être imputés. Nos équipes de recherche ont identifié que la FA modifie spécifiquement le compartiment mitochondrial. Nos résultats sont en accord avec la littérature décrivant que les dommages cellulaires causés par le stress oxydant sont considérés comme un mécanisme participant à la stabilisation de la FA. Nous avons identifié une cible pharmacologique potentielle au niveau des mitochondries et nous possédons une molécule (l’ATT) spécifique de cette cible mitochondriale. Par conséquent, notre objectif est d’évaluer le potentiel antiarythmique de l’ATT dans notre modèle expérimental, et d’optimiser le traitement en adaptant la posologie.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet revêt une importance particulière dans la mesure où l’obtention de résultats positifs pourrait réellement avoir des répercussions sur le développement d’un nouveau traitement dans la FA chez l’homme. L’ATT possède une autorisation de mise sur le marché en Europe et aux États-Unis mais pas pour son potentiel effet antiarythmique. Ainsi, la démonstration que l’ATT possède un potentiel antiarythmique chez la brebis FA est une étape indispensable au développement d’un futur projet de recherche clinique. Les bénéfices attendus de notre projet sont donc (i) la démonstration du ciblage pharmacologique du compartiment mitochondrial comme stratégie thérapeutique efficace pour lutter contre le développement et la progression de la FA et (ii) l’utilisation des données collectées pour commencer le développement d’un essai clinique visant à évaluer le potentiel antiarythmique de l’ATT chez l’homme.

Procédures

Les animaux auront deux prises de sang (une lors de l’inclusion et une à la fin du projet, pour une prise de sang il faut compter 15 min) et également deux prélèvements urinaires (30 min). Les animaux auront une IRM et une cartographie endocavitaire par cathéter, les procédures seront réalisées sous anesthésie et analgésie, ces examnes ont une durée d'environ 90 min. Les animaux auront une implantation chirurgicale d’un boitier de stimulation cardiaque, d’un boitier de télémétrie et d’une chambre de perfusion. Procédures réalisées sous anesthésie et analgésie, cette intervention, de la prise en charge de l'animal jusqu'à sont réveil complet durera maximum 4 heures. Suite à la récupération post-chirurgicale, les brebis recevront une injection journalière d’ATT pendant 10 jours ou une injection journalière pendant 80 jours (la réalisation des injections nécessite l’isolement des brebis pour une durée de 20 à 30 minutes le temps de la réalisation par les personnes en charge des animaux). Les effets du traitement seront évalués à distance grâce à la surveillance télémétrique.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables éventuels peuvent être liés aux anesthésies (hypothermie) réalisées aux différentes phases du projet notamment lors du réveil (désorientation, apathie) ces effets disparaissent rapidement car les moyens nécessaires pour faciliter le réveil des animaux (lampe chauffante par exemple) sont mis en place. Les examens IRM et électrophysiologique sont indolores pour les animaux. Des effets indésirables attendus sont liés à l’implantation des équipements électroniques localisés en sous-musculaire dans la zone du cou pour induire et enregistrer la progression de la fibrillation auriculaire mais ils sont maîtrisés et correspondent à des phases de cicatrisation prolongées. L’induction de la fibrillation auriculaire chez la brebis peut provoquer une fréquence ventriculaire cardiaque irrégulière mais il est à noter que l’installation de la fibrillation auriculaire est asymptomatique chez la brebis. Ainsi les brebis saines et en fibrillation auriculaire sont indifférenciables au niveau du comportement et de l’aspect physique. Lors des tests des effets de la molécule antioxydante étudiée sur la progression de la maladie, les injections de cette molécule se feront à travers une chambre de perfusion, identique à celle utilisée chez les patients, localisée dans la zone du cou en sous-cutanée. Les effets indésirables peuvent être à ce stade : altération de la cicatrice du site d’implantation, infection dans la zone d’implantation ou rejet des équipements implantés. Pour minimiser l’inconfort de la brebis, les chambres de perfusion sont de petite taille (poids 4.7g, dimensions 30x22x11 mm). La réalisation des injections nécessite l’isolement des brebis pour une durée de 20 à 30 min, ce qui peut induire un stress. Une récompense alimentaire sera donnée par les animaliers expérimentés à chaque injection et à chaque animal afin de limiter l’angoisse liée à l’isolement mais également dans le but d’entrainer l’animal afin de faciliter la procédure et de diminuer le stress de la brebis. Concernant les effets éventuels de la molécule, les données de toxicité disponibles montrent que la dose journalière d’antioxydant utilisée de 60µg/Kg est 40 fois inférieure à la dose montrant un effet toxique chez le miniporc. Nous anticipons donc l’absence d’effet toxique chez la brebis.

Devenir

Dans ce projet, constitué d’une procédure expérimentale classée modérée, tous les animaux seront gardés en vie à l’issue de la procédure. Les animaux sont des animaux modèle d'une pathologie humiane, ils sont très précieux en terme d'obtention, de suivi et en terme scientifique, ils seront donc réutilisés au sein de l’institut soit dans des procédures classées légères, modérées ou terminales. La réorientation des animaux dans de nouveaux projets de l’institut ne pourra se faire que suite à la réalisation d’une demande d’autorisation de projet et suivant l'avis de la SBEA qui suit les projets de l'établissement.

Remplacement

Cette DAP s’inscrit dans le contexte du test de l’activité antiarythmique d’une molécule déjà utilisée pour soigner d’autres pathologies. En effet, l’ATT est un stimulant de la fonction biliaire et un substitut salivaire et lacrymal. L’évaluation de l’effet antiarythmique de l’ATT dans la FA nécessite l’utilisation du modèle expérimental de brebis en fibrillation auriculaire. Cette pathologie est trop complexe et nos connaissances insuffisantes pour que nous soyons actuellement en mesure de simuler in silico les effets de l’inhibition de la production de stress oxydatif en provenance du compartiment mitochondrial sur le développement et la progression de la FA. Bien que nos résultats collectés in vitro soient en faveur d’un effet inhibiteur de l’ATT sur la progression de la FA, la démonstration de l’effet thérapeutique passe nécessairement par l’utilisation de l’animal. Nous n’avons pas de stratégie de remplacement valable à ce jour nous permettant de répondre à la question scientifique posée dans ce projet.

Réduction

Pour favoriser la réduction du nombre d'animaux dans ce projet, chaque brebis est son propre contrôle au moins pour les paramètres de fonctions cardiaques et le profil électrophysiologique, cette approche permet de limiter le nombre d’animaux utilisé en s’affranchissant de la variabilité interindividuelle. Dans ce projet 50 brebis seront utilisées sur une durée de 5 années, soit 10 animaux par an, ce nombre a été défini de part la durée nécessaire pour la mise en œuvre du modèle et les contraintes logistiques de l'établissement. Le projet comporte un total de 5 sous-groupes de brebis pour lesquels 7 à 10 animaux seront nécessaires pour répondre aux questions scientifiques posées avec une puissance statistique suffisante. Notre stratégie de réduction repose également sur la redistribution des animaux étudiés dans cette DAP vers les autres projets de l’institut. Cette mutualisation des animaux permettra de réduire significativement le nombre de brebis en FA utilisées au sein de l'établissement tout en répondant aux demandes des différentes équipes de l'établissement Par exemple, le modèle de brebis FA est utilisé dans le développement de cathéters de diagnostic et de traitements de la FA, pour leur application chez l'Homme.

Raffinement

Toutes les mesures de raffinement sont mises en place durant les phases du projet. Lors des examens et expérimentations, une anesthésie avec analgésie adaptée est mise en place et les animaux sont étroitement surveillés lors des jours suivants l'opération. Lors du suivi longitudinal, l’utilisation de la télémétrie pour surveiller la température, l’activité et le rythme cardiaque des brebis 24 heures sur 24 est une mesure de raffinement. Par exemple, lors du réveil de l’animal nous pouvons agir si nous observons que le retour de la température corporelle est trop lent. Cette surveillance renforcée permet également de mieux gérer les traitements antibiotiques et/ou analgésiques suite à une augmentation de température significative sans modification du comportement de l’animal ce qui est souvent le cas chez la brebis. Cette méthode nous permet de récolter des données sans induire de stress chez la brebis. Plus spécifiquement dans le cadre de ce projet les animaliers entraineront les animaux à rentrer dans le box d’isolement pour la réalisation de l’injection de l’ATT. Les brebis sont habituées à voir les animaliers tous les jours et par conséquent l’implication des animaliers dans le projet est indispensable à sa bonne réalisation et à la minimisation du stress des animaux. Les personnes en charge des animaux sont formés et expérimentés dans la prise en compte du bien-être de cettte espèce. L’utilisation d’une récompense alimentaire sous forme de granulés fonctionne très bien chez la brebis. L’entrainement des brebis réduira l’angoisse et le stress lors des phases d’injections. Nous savons que des brebis entraînées ont un rythme cardiaque moins élevé lors de l’arrivée dans le box d’isolement que des brebis qui découvrent cet exercice pour la première fois. L’animal est placé dans les conditions d’hébergement initial avec les méthodes de raffinement adéquat à son espèce : groupe social, pierre à sel à disposition, foin et paille. Les animaux sont suivis quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Si une étape du protocole affecte l’état de santé au point d’atteindre un des points limites sans qu’aucune action ne puisse permettre un retour à l’état basal alors le protocole sera interrompu conformément au point 3.3.3.

Choix des espèces

Le cœur de la brebis a une anatomie, une électrophysiologie et une géométrie proche de celles du cœur humain. Ainsi, les méthodes cliniques d’imagerie et d’électrophysiologie peuvent être directement appliquées dans cette espèce et extrapoler à une application à l'Homme. Le modèle de FA persistante utilisé dans cette étude a été mis au point sur le mouton au sein d'autres équipes de recherche, le modèle est donc décrit et caractérisé dans cette espèce, constituant une référence dans la communauté scientifique. Les brebis utilisées seront adultes car les dimensions du myocarde permettent l’utilisation des outils cliniques notamment les cathéters, correspondant à ceux utilisés chez l'Homme lors de la prise en charge de la maladie. De plus, la FA étant une pathologie majoritairement représentée chez les personnes âgées nous utiliserons des brebis âgées de 8 à 11 ans minimum, ce qui correspond à un âge avancé chez l'Homme.

1890 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles de dystrophies musculaires, elles reçoivent des injections répétées et des gavages plusieurs fois par semaine, ainsi que des vecteurs de thérapie génique, avant une évaluation de la force musculaire sous anesthésie terminale. Le porteur soutient que les traitements, "tous de nature bénéfique", ne justifient pas de points limites, tout en décrivant des modèles sévères au phénotype avancé. Il affirme que l'effet ne peut être obtenu que dans un organisme "entier" et qualifie ces expériences d'"absolument indispensables".

Objectifs

L'objectif de ce projet s’inscrit dans l’évaluation d’approches de thérapie génique médiées par des vecteurs viraux pour les dystrophies musculaires, pour lesquelles il n’existe, à l’heure actuelle, aucun traitement. Ces maladies sont caractérisées par des cycles de dégénérescence/régénération du muscle entrainant une perte des fibres musculaires au profit de tissu fibrotique ou adipeux. Ce processus dégénératif provient de défauts génétiques et conduit à des conséquences délétères sur la fonction motrice, la qualité et la durée de vie des patients. Il peut impacter les capacités de réversion du phénotype myopathologique. En raison de la progressivité du processus dégénératif, le diagnostic et le traitement se réalisent alors que la dégénération est engagée déjà depuis des années chez les patients. Il semble que ceci soit à l’origine de la faible efficacité des approches de thérapie génique observée dans les essais cliniques dans les dystrophies musculaires où la restauration fonctionnelle dépasse rarement 15%. De plus, les essais cliniques soulignent la possibilité d’apparition d’effets adverses liés aux doses utilisées. Il apparait donc nécessaire d’adjoindre au transfert de gène des traitements agissant sur le mécanisme physiopathologique dystrophique afin d’obtenir un effet thérapeutique probant et une meilleure sécurité. Le but est d’évaluer l’effet de traitements thérapeutiques agissant sur les différentes composantes du processus dystrophique en combinaison avec un produit de thérapie génique pour évaluer leur synergie sur les modèles murins des pathologies incluses dans le projet à un stade précoce et avancé de la maladie. Les résultats obtenus devraient permettre une meilleure efficacité de la thérapie génique et une réduction des possibilités de toxicité par une diminution des doses à administrer chez les patients. Les animaux utilisés sont des souris modèles et leurs contrôles normaux. Le nombre nécessaire est de 1890 animaux. Les traitements associés peuvent être de petites molécules qui seront administrées soit par gavage, soit par administration intrapéritonéale, sur une durée variable. Ils peuvent également être réalisés par transfert de gène. Dans ce cas, ils seront co-administrés avec le traitement de thérapie génique. Un suivi de biomarqueurs sériques permettra de suivre l’effet au cours du temps. L’évaluation de l’effet thérapeutique sera réalisée par des études de la fonction du muscle, et après sacrifice par des études moléculaires.

Bénéfices attendus

Les bénéfices devant découler de ce projet concernent le domaine de la santé humaine. Ils visent à valider l’effet thérapeutique de combinaisons associant soit une petite molécule, soit une modulation génique, à un traitement de thérapie génique d’intérêt pour un groupe de maladie humaine sur un modèle murin de la maladie. L’observation d’un effet thérapeutique permettra d’envisager un essai clinique qui, s’il est probant, devrait permettre de stopper l’évolution de la pathologie chez les patients atteints de dystrophie et donc de valider une thérapie pour des maladies qui n’en n’ont pas à ce jour. La combinaison de traitement permettra d’augmenter la correction chez les patients et d’améliorer la sécurité de produits de thérapie génique par la réduction des doses requises.

Procédures

Toutes les molécules pharmacologiques seront injectées entre 2 et 5 fois par semaine en fonction de leur demi-vie. Elles seront administrées soit par voie orale, soit par injection intra péritonéale (durée injection moins de 1 minute), sur animaux vigiles. L’administration par voie orale se fait par gavage à l’aide d’une canule souple en plastique à bout arrondi afin de ne pas blesser l’animal (durée : entre 30 secondes et 1 minute). Les traitements adjoints administrés par AAV et le traitement de thérapie génique se font par injection intraveineuse en une seule fois, soit sur animaux vigile avec injection dans la veine caudale (durée : moins de 1 minute en injection rapide et entre 3 à 10 minutes pour les injections lentes), soit sur animaux anesthésiés au sinus (durée : moins de 1 minute). Dans ce cas l’anesthésie est une anesthésie gazeuse de courte durée. Les prélèvements de sang se font au maximum une fois par semaine sur animaux sous anesthésie gazeuse de courte durée. (Durée de l’intervention : moins de 10 minutes entre l’anesthésie et le réveil de l’animal. Les prélèvements de sang ne se font pas le même jour que les injections afin de ne pas induire de douleur supplémentaire. En fin de protocole, les animaux sont soumis à une évaluation fonctionnelle sur muscle semi-isolé sur animaux analgésiés et anesthésiés. L’analgésique est injecté 30 minutes avant l’anesthésie qui est une anesthésie par voie intra-péritonéale profonde sans réveil de l’animal. L’évaluation fonctionnelle dure en moyenne 30-45 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont liées en particulier à la nature des différents actes réalisés : - Piqûres intrapéritonéales d’un volume maximum de 100µl pour l’administration de molécules (5 fois par semaine sur animaux vigiles) ou d’anesthésique une seule fois en fin de protocole. Pour réduire les nuisances, les animaux seront traités 30 minutes avant la procédure avec un analgésique. - Gavage pour administration de molécules (maximum 200µl, 5 fois par semaine) - Intraveineuse caudale ou au sinus pour injection AAV (soit en bolus de 100µl/20g, soit en IV lente 500µl/20g, une fois au cours du protocole) * Possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies (utilisation de gel pour réduire cette nuisance). En ce qui concerne les modèles utilisés, même s’ils sont porteurs d’une anomalie génétique correspondant à une dystrophie musculaire progressive chez l’homme, ils présentent un phénotype moins important que les patients. Ils ne présentent donc pas de phénotype délétère à l’exception des modèles les plus sévères (SGCA et SGCG) au stade avancé de la pathologie. Cependant, même dans ce cas, les nuisances possibles n’ont pas d’impact sur la survie et ne sont pas de nature à nécessiter la mise en place de points limites. Il n’y a pas de nuisances attendues dans ce projet par rapport à l’effet des traitements qui sont tous de nature bénéfique et sont utilisés à des doses correspondant à la fenêtre thérapeutique.

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés par dislocation cervicale.

Remplacement

Afin de valider l’effet thérapeutique in vivo au préalable à une application chez l’homme, nous souhaitons utiliser un modèle animal (souris), car aucun modèle in vitro ou de culture cellulaire ne nous permet d’étudier les symptômes de perte de la locomotion typiques des dystrophies musculaires. De plus, afin d’estimer l’efficacité de nos approches expérimentales, il est nécessaire d’administrer les vecteurs dans un organisme entier capable de répondre physiologiquement aux traitements administrés. Ceci ne peut être obtenu in vitro et justifie notre recours à des animaux.

Réduction

Un effort de réduction a été réalisé en amont de ce projet. En effet, les molécules pharmacologiques utilisées dans ce projet ont toutes déjà démontré leur efficacité sur la souris mdx, modèle de la myopathie de Duchenne. Nous savons donc qu’elles ont un effet bénéfique, reste à savoir maintenant si, combinées à la thérapie génique, elles pourront augmenter la correction et permettre une réduction des doses de vecteurs. La dose administrée a déjà été validée chez la souris. Au cours des 5 années du projet, nous avons prévu d’utiliser un total de 1890 souris pour faire l'ensemble des expériences in vivo. Ce projet se limite aux expériences considérées comme absolument indispensables et prévoit l'exploitation maximale des données obtenues. Nous utiliserons les mêmes souris contrôles pour des expériences différentes. Tous les modèles sont sur le même fond génétique., nous pouvons donc utiliser les mêmes souris contrôles pour tous les modèles. De plus, un maximum d’analyses sera réalisé sur organes prélevés après la mort des animaux pour éviter des doublons de procédures expérimentales. Le nombre d’animaux utilisés par groupe est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les différentes conditions seront testées en premier lieu sur les modèles les plus sévères. Pour les conditions ne montrant pas d’effet positif, les traitements ne seront pas testés sur les modèles les moins sévères, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Le raffinement du projet inclus la sélection des modèles : la souris est un modèle déjà utilisé et bien étudié pour les maladies musculaires. Le souci de raffinement est une préoccupation permanente tout au long de la vie des animaux et pendant les différentes étapes des protocoles expérimentaux. Les souris étant des animaux sociaux, elles sont hébergées par groupes. Une phase d’adaptation de 7 jours est mise en place avant l’entrée en protocole. En cas d’observation de la moindre douleur, les souris reçoivent un traitement analgésique, et si cette douleur persiste, les animaux sont sacrifiés pour éviter toute souffrance. Les animaux sont élevés dans un environnement enrichi, ils sont observés quotidiennement pendant les jours ouvrés. Les souris sont anesthésiées lorsque les procédures expérimentales sont jugées potentiellement douloureuses ou stressantes. Dans ce cas, les animaux reçoivent au préalable un traitement analgésique. Les prélèvements de sang seront effectués sous anesthésie de courte durée (moins de 5 minutes). Nous appliquons les points limites établis préalablement et utilisons les procédures de sacrifice appropriées. Des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées, telles que l’utilisation d’une plaque thermostatée pour maintenir la température corporelle stable lors de la phase de réveil et l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus lors des anesthésies.

Choix des espèces

Les modèles murins utilisés dans ce projet sont des souris modèles de la pathologie étudiée. Dans cette étude, les animaux seront utilisés à partir de leur sevrage jusqu’à un stade tardif de la pathologie (variable selon les modèles mais entre 6 mois et 1 an) afin de refléter au mieux la maladie humaine puisqu’il s’agit de pathologies progressives. Les signes cliniques peuvent apparaitre dès l’enfance, mais également à l’âge adulte pour certaines dystrophies. Après le sevrage, les animaux présentent une taille de muscle et des conditions physiques suffisantes pour évaluer la fonction musculaire et présentent déjà des signes histologiques pour les modèles les plus sévères. Des animaux plus âgés (entre 6 mois et 12 mois) seront également utilisés, afin d’évaluer l’effet thérapeutique sur des animaux où le phénotype dystrophique est installé, ce qui permettra d’évaluer la réversion du phénotype au stade tardif. En effet, il est indispensable de savoir si le traitement est efficace lorsque la maladie est installée afin de pouvoir proposer un traitement à des patients qui sont à un stade avancé de la maladie.

900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de tumeurs rénales, elles reçoivent un traitement par gavage quotidien et sont suivies par échographie puis IRM sous anesthésie, avant mise à mort pour analyse des organes. Le porteur annonce des bénéfices en termes de compréhension des mécanismes du cancer et de pistes thérapeutiques, formulés au conditionnel. Il affirme que les expériences in vitro ou in silico ne conviennent pas car "trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu" et que la souris est le seul mammifère où les gènes visés ont été mutés.

Objectifs

Les cancers du rein représentent environ 2% des tumeurs malignes chez l’être humain. Au cours des dernières décennies, l’incidence de ce cancer a progressivement augmenté. Le cancer du rein touche davantage les hommes que les femmes, il est diagnostiqué principalement entre 60 et 70 ans mais peut survenir à tout âge. Les facteurs de risque principaux sont le tabagisme et l’obésité. Le potentiel métastatique de ces cancers est important. La survie médiane à ce stade n’est que de treize mois, le défi thérapeutique est donc immense. Au cours des dix dernières années, il a été clairement établi que ces cancers sont associés à des anomalies génétiques spécifiques tant dans les formes sporadiques que dans les formes héréditaires. Actuellement, il n'existe pas modèle préclinique pour analyser correctement le developpement d'un cancer du rein. Un modèle préclinique efficace permettrait de mieux comprendre les mécanismes de progression de la maladie et d'identifier de nouvelles pistes thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant au développement de cellules cancéreuses. Identification potentielle de nouveaux traitements. Identification potentielle de biomarqueurs.

Procédures

Un traitement sera administré par gavage quotidien pour faire diminuer le volume tumoral. Celui ci sera effectué́ par un technicien expérimenté́ et le plus petit volume possible sera administré aux souris. Le gavage sera réalisé chez des souris adultes. Les sondes de gavages sont les dernières arrivées sur le marché́, en silicone, ultra souple et non traumatisante pour l’animal. Les tumeurs rénales seront surveillées en imagerie à intervalles réguliers (echographie une fois par mois puis une seule IRM en fin de procédure).

Impact sur les animaux

Nous n'attendons aucun effet indésirable lié au gavage. Nous serons particulièrement attentif aux fausses routes (point limite établi). La réalisation des suivis en imagerie se fera sous anesthesie générale. Nous serons particulièrement attentifs au stress induit par l'anesthésie (point limite établi).

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Dans un contexte de recherche physiopathologique sur le cancer du rein, les expérimentations in vivo ne peuvent en aucun cas être remplacées par des expériences in vitro, où les cellules sont sorties de leur environnement. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas utilisables dans ce contexte car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu.

Réduction

La taille des groupes utilisés représente le minimum nécessaire et suffisant pour l’obtention de résultats significatifs, en utilisant des tests statistiques adaptés, qui satisfait à l’objectif de réduction du nombre d’animaux exposés aux procédures expérimentales.

Raffinement

Enfin, nous éviterons toute souffrance inutile des animaux en les surveillant régulièrement. Le gavage sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. Par ailleurs, des points-limites précis ont été établis (poids, comportement, aspect du poil), entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Nous espérons ainsi identifier de nouveaux traitements médicamenteux qui pourraient améliorer les conditions de vie des patients porteurs de ces mutations génétiques et pour lesquels aucun traitement satisfaisant n'existe.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction et elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques et que de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). La souris est le seul mammifère pour lequel les protéines PIK3CA, VHL et SDHA ont été mutéee. Souris âgées d'au moins 4 semaines car il est nécessaire que leur développement soit terminé.

1200 truites arc-en-ciel vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardées vivantes pour entretenir des lignées de l'élevage. Elles subissent un jeûne de trois semaines et des mesures de poids sous anesthésie, 30 d'entre elles faisant l'objet de prises de sang répétées par ponction de la veine caudale. Le projet vise à estimer l'efficacité alimentaire pour réduire les coûts et l'impact environnemental de l'aquaculture. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'alternative in vitro et qu'il est "nécessaire" de mesurer cette efficacité dans des conditions proches de l'élevage commercial.

Objectifs

Dans un contexte de développement durable de l’aquaculture, il existe aujourd’hui une volonté grandissante de sélectionner les poissons ayant la meilleure EA possible. L’EA peut être vue comme la capacité à produire plus à partir d’une même quantité d’aliment ingérée. En effet, d’une part, l’alimentation représente de 30 à 70% des coûts de production, et, d’autre part, l’utilisation de granulés entrainent de lourds impacts environnementaux à différents niveaux : de la production des ingrédients qui les composent aux rejets dissous des effluents d’élevage. Améliorer l’EA requiert de pouvoir quantifier précisément l’ingestion individuelle ce qui reste, encore aujourd’hui, difficile à entreprendre chez les poissons élevés en larges groupes. C’est pourquoi, des critères indirects pour l'estimation de l’EA ont été évalués ces dernières années chez les poissons. Chez la truite arc en ciel, il a été démontré que la perte de poids au jeûne combinée aux performances de croissance observée après le jeûne peut expliquer jusqu’à 60% de la variabilité de l’ingéré individuel un critère d’estimation de l’EA. Les poissons perdant le moins de poids durant le jeûne sont supposés être ceux avec une meilleure EA car ayant de moindres besoins d’entretien. Bien que potentiellement intéressante, une sélection sur un tel critère pose alors la question de la capacité des poissons à maintenir de bonnes performances pour d’autres caractères associés à la robustesse (santé, reproduction).

Bénéfices attendus

Ce projet se basera sur l’utilisation d’un modèle biologique tout à fait pertinent, deux lignées expérimentales divergentes pour la teneur en lipide du muscle : lignée grasse (LG) et lignée maigre (LM). Ces deux lignées expérimentales divergentes constituent un modèle biologique de choix dans ce projet, en effet elles ont montré une utilisation différente de l’énergie. Nous faisons l’hypothèse qu’elles réagissent différemment à l’effet du jeûne avec des réponses différentes en terme d’EA. Sur le plan scientifique, le projet REFER-Trout, permettra de tester l’intérêt de la perte de poids au jeûne comme paramètre indirect d’estimer de l’EA, difficile à mesurer chez la truite arc-en-ciel en conditions de production, tandis que les analyses de sang permettront de tester les relations entre EA et d’autres fonctions biologiques et notamment l’immunité. Ces connaissances seront utiles pour mieux appréhender l’allocation des ressources chez le poisson et affiner la notion de robustesse.

Procédures

Les animaux seront soumis à des mesures non-invasives de poids et d'adiposité (3 fois sur l'ensemble de l'expérience) qui concerne l'ensemble des individus (n = 1200) et nécessitent l'anesthésie et l'émersion des animaux. Des prises de sang, par ponction de la veine caudale, répétées sur un nombre limité d’individus (n = 30) seront réalisées également lors des périodes de mesures décrites précédemment (3 fois sur l'ensemble de l'expérience). L'ensemble des mesures biométriques et d'échantillonnage de sang sera réalisée dans un temps limitant l'émersion à une durée maximale de 1 minute.

Impact sur les animaux

La procédure est classée en modérée en raison du jeûne prolongé de trois semaines combiné à des prises de sang répétées sur un nombre limité d’individus, qui si, mal réalisés peuvent conduire à générer de la douleur et du stress et une sensibilité accrue aux pathogènes. Les prises de sang sont effectuées sur 30 poissons afin de réduire au maximum le nombre d’individus concernés tout en permettant des résultats exploitables. Les prises de sang auront lieu uniquement lors des phénotypages, ce faisant, les poissons concernés n’auront pas à subir des anesthésies et manipulations supplémentaires.

Devenir

A la fin de la procédure, l’ensemble des individus (1200 poissons) seront gardés en vie pour compléter les effectifs destinés à l’entretien des lignées grasse et maigre au sein de l'établissement utilisateur (UE PEIMA, INRAE).

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé qu’in vivo. Il n’y a pas d’alternative in vitro pour caractériser l’EA des truites arc en ciel et, plus largement, des animaux d’élevage. De plus, l’objectif étant, in fine, de promouvoir une aquaculture durable par la réduction des intrants alimentaires, il est nécessaire de mesurer l’EAs des poissons dans des conditions proches de l’élevage commercial.

Réduction

Nous avons recours à un matériel biologique original, les lignées expérimentales divergentes pour la teneur en lipide du muscle. Les individus utilisés pour l’expérimentation envisagée seront issus de l’entretien annuel de ces lignées. Nous avons réduit le nombre d'animaux au minimum nécessaire pour avoir une puissance statistique suffisante. Le nombre d'animaux impliqués correspond au strict minimum requis pour déterminer avec le plus de précision possible la loi de distribution des caractères ciblés et ainsi d'être mieux en mesure de différencier statistiquement les caractéristiques de chaque lignée. Ces chiffres permettent de s'assurer de la robustesse de nos analyses statistiques et nous semblent être un minimum pour mettre en œuvre une analyse de variance fiable.

Raffinement

Avant et pendant les procédures, une surveillance du comportement des animaux est effectuée pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse subies. Tout au long de l’expérimentation et tout particulièrement durant la phase de jeûne prolongée, les poissons seront observés au moins 2 fois par jour et les poissons au comportement anormal (léthargie, perte d’équilibre) seront péchés et mis à mort. Par ailleurs, aucune manipulation ne sera réalisée durant la phase de jeûne, la plus critique de l’expérimentation, afin de minimiser autant que possible le stress généré.

Choix des espèces

La truite arc en ciel est l’espèce principalement étudiée au laboratoire. Il s’agit de l’espèce prépondérante de la pisciculture en France et l’une d’une des espèces les plus élevées en Europe. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement diffusée dans la communauté scientifique (environ 50 000 références). De plus, les lignées expérimentales divergentes pour la teneur en lipides du muscle, LG et LM, permettent de réaliser le projet sur un matériel biologique original. Les truites arc-en-ciel sont utilisées au stade juvénile (animaux non matures). Ce stade est plus sensible aux stress que les poissons maturants.

468 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée. Ces souris génétiquement modifiées deviennent progressivement aveugles, et reçoivent dans l'œil une injection de vecteurs viraux sous anesthésie, suivie de tests visuels répétés. Le porteur reconnaît que l'injection, geste délicat, peut provoquer des lésions irréversibles, tout en espérant restaurer en partie la vision pour tester une thérapie génique contre le syndrome de Bardet-Biedl. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ou informatique ne peut reproduire un organe aussi complexe chez un animal aussi jeune.

Objectifs

Le principal objectif de ce projet est de déterminer si, dans le cadre d'une maladie rare telle que le syndrome de Bardet Biedl (BBS), il est possible de développer un traitement basé sur de la thérapie génique pour ralentir l'atteinte de la rétine qui est observée chez les animaux modèles de cette maladie.

Bénéfices attendus

Nous espérons restaurer au moins partiellement l'atteinte de la rétine qui est habituellement observé chez les 3 modèles murins Bbs étudiés. Le projet que nous proposons devrait servir à valider le schéma experimental proposé. Nous pourrons alors envisager de l'appliquer à d'autres modèles murins. Ce projet pourrait être considéré comme une étude préclinique pour la mise en oeuvre d'un traitement de la dégenerescence rétinienne des patients BBS par thérapie génique.

Procédures

L'injection dans l'oeil des souris se déroule sous anesthésie générale et dure au maximum 1 minute par animaux et sera réalisé une seule fois à 14 jours sur toutes les souris, tous génotypes confondus. Pour mise en évidence un potentiel effet bénefique de cette injection, nous comptons soumettre toutes les souris à 3 tests fonctionnels différents. L'ERG (Electrorétinogramme) permet d'enregistrer le signal électrique généré par les cellules de la rétine suite à un stimulation lumineuse. Il sera réalisé sur des animaux sous anesthésie générale et dure au maximum 20 minutes. L'OCT (tomographie en cohérence optique) est basé sur le principe de l'échographie et permet de visualiser et mesurer l'épaisseur des différentes couches de la rétine. Il est également réalisé sur des animaux sous anesthésie générale et l'acquisition des photos ne dépasse pas 10 minutes. L'optomoteur permet de tester si les souris voient correctement en déterminant si elles sont capables de suivre le décor tournant qui les entoure. Il est réalisé sur des animaux vigiles et dure entre 30 minutes et 1 heure. Ce trio de tests sera répété 2, 3 ou 4 fois afin de suivre d'évolution de l'effet en fonction du temps.

Impact sur les animaux

Les 3 lignées de modèles murins Bbs que nous allons étudier deviennent progressivement aveugles dès 10 semaines. Il s'agit d'animaux génétiquement modifiés qui naissent en étant plus petits que des souris génétiquement modifiées. L'injection dans l'oeil que nous allons réaliser est un geste délicat qui s'il est mal executé peut mener à des lesions irréversibles et ainsi rendre les animaux aveugles. De la même manière, l'ERG et l'OCT sont des tests nécessitant une anesthésie durant lesquels les yeux des animaux doivent être hydratés fréquemment pour limiter les risques de cataracte résiduelle. Par contre, l'effet attendu suite à l'injection devrait être bénéfique pour les animaux car nous nous attendons à ce que les souris Bbs traitées aient une vision restaurée par rapport à leurs congénères non traités et nous espérons que cette restauration soit maintenue dans le temps.

Devenir

Dans un premier temps, les animaux utilisés dans les croisements pour la génération des cohortes d'animaux explorées seront gardés en vie. A la fin du projet, tous les animaux seront euthanasiées.

Remplacement

Le recours à n’importe quel autre modèle alternatif (cellulaire, informatique…) ne permettrait pas l’étude d'un organe aussi précocément (14 jours de vie) avec une telle diversité et complexité cellulaire comme chez la souris. Dans notre cas, l’utilisation d’un modèle murin permet d’avoir un modèle proche de la maladie humaine et de pouvoir effectuer les tests in vivo tels que l'électrorétinogramme (ERG), la tomographie par cohérence optique (OCT) et l'optomoteur qui mesurent les capacités visuelles des souris et aident à déceler une potentielle atteinte rétinienne.

Réduction

Les effectifs pour chaque analyse ont été déterminés d’après la littérature en prenant en compte la variabilité interindividuelle, la vulnérabilité des modèles murins étudiés. Ils correspondent aux nombres minimaux de souris à inclure pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et exploitables entre les différents groupes étudiés. Nous nous sommes également basés sur d’autres études publiées sur d'autres modèles murins Bbs (Bbs1, Bbs4 …) pour confirmer ces effectifs.

Raffinement

Les souris seront maintenues en groupes sociaux pour éviter l'appartition de comportements anormaux ou de stéréotypie. Un milieu enrichi en coton de nidification, tubes cartonnés et morceaux de bois sera mis à leur disposition pour les occuper et réduire leur stress, ils pourront ainsi occuper l'espace de leur cage, ronger et les femelles pourront contruire le nid qui accueillera et réchauffera leurs nouveaux-nés. Ils auront accès à l’eau et la nourriture « ad libitum ». Nous nous assurerons du bien-être des animaux en contrôlant le pelage, l’aspect général des souris, leurs comportements individuels et vis-à-vis de leurs congénères. Une observation quotidienne et une pesée hebdomadaire permettront de détecter les souris présentant des signes de souffrance, douleur, détresse. Nous avons établi, en annexe, des points limites à rechercher afin de soutraire les animaux à la souffrance

Choix des espèces

L’utilisation d’un modèle murin de syndrome de Bardet-Biedl (BBS) permet d’avoir un modèle proche de la maladie humaine et de pouvoir effectuer les tests fonctionnels nécessaires à l’étude tels que tomographie par cohérence optique (OCT) et l’électrorétinogramme (ERG) qui mesurent les capacités visuelles des souris et permet de déceler la dégénérescence rétinienne. Ces tests sont des tests applicables à l’homme ce qui les rendent pertinents dans le cadre de ce projet qui étudient des modèles murins de maladies génétiques rares humaines. On ne peut pas substituer notre étude "in vivo" par des études "in vitro" puisqu'il est impossible d'obtenir un système intégré et une diversité cellulaire similaire à la rétine, à un stade aussi précoce. Pour ce projet, nous effectuerons l'injection dans les yeux des souris à 14 jours : âge à partir duquel elles ouvrent les yeux puis nous poursuivrons nos expériences jusqu'à l'âge de 8 mois.

840 poulets de chair vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée. Chaque animal est isolé en cage individuelle pendant neuf jours et soumis à deux mises à jeun de dix-sept heures, puis abattu par électronarcose et saignée pour prélever le contenu digestif. Le porteur évalue de nouvelles matières premières pour l'alimentation des volailles, dans un objectif de valorisation par la filière avicole. Il affirme qu'en l'absence de méthode in vitro, le recours à l'espèce cible est indispensable.

Objectifs

La viande de volaille représente une source de protéine animale importante et en augmentation dans l'alimentation humaine. La production française se fait avec du tourteau de soja importé (3.5 millions de tonnes, majoritairement OGM) et des céréales. L'alimentation animale représente 75% du coût de production et doit faire face à des enjeux sociétaux majeurs : réduction des gaspillages, bien être animal, valorisation de nouvelles ressources, OGM, autonomie protéique, sécurité du consommateur. Dans ce contexte, le projet vise à caractériser 1) De nouvelles ressources alimentaires pour l'alimentation animale, en diversifiant les sources de matières premières tout en limitant la concurrence avec l'alimentation humaine 2) De nouveaux programmes alimentaires réduisant les pertes et les rejets, dont l'objectif est d'optimiser l'efficience des rations et de réduire à la source les rejets d'azote en mettant l'accent sur les stratégies nutritionnelles. Pour cela, des "bilans digestif" seront réalisés, en mesurant de façon précise, les nutriments digérés et/ou métabolisés par le poulet de chair et ceux rejetés dans les fientes. Un bilan permet donc de quantifier le pourcentage de chaque nutriment réellement disponible pour le maintien, la croissance ou la production de l’animal. Le bilan est réalisé selon une méthode de référence standardisée (Bourdillon et al., 1990), afin de fournir à la filière des tables d'alimentation précises et complètes, sur la valeur nutritionnelle des matières premières.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet concernent : 1) Les éleveurs et fabricants d’aliments : le projet permettra de leur fournir des données sur de nouvelles matières premières ou des matières premières issus de nouveaux process afin de limiter le gaspillage et les rejets, de choisir des matières premières non importés ou non utilisable directement par l’homme, l’ensemble contribuant à préserver l’environnement. 2 )L'alimentation de l'homme : trouver des alternatives aux solvants issus du pétrole (hexane par exemple) utilisés dans la fabrication d’aliments pour volailles (tourteaux par exemple), améliorer la qualité des produits animaux. 3) L'alimentation et le bien-être des animaux d'élevage : gagner 5 à 15 points de digestibilité apparente de la protéine avec les procédés ou produits testés ; contribuer au développement d’alternatives aux bilans en cage en alimentant des bases de données qui serviront à la modélisation ou à l’évaluation de la valeur d’un aliment par Spectrométrie Proche InfraRouge, méthodes non opérationnelles aujourd’hui ; accompagner l'élevage vers l'alimentation de précision, développer les connaissances sur le microbiote.

Procédures

Tous les animaux sont soumis à une procédure de bilan digestif en cage individuelle, de 17 à 25 jours d’âge (digestibilités fécale + iléale). Le bilan consiste à mesurer l’ingéré et l'excrété pour chaque animal individuellement, ce qui nécessite l'isolement en cage individuelle (pendant 9 jours), et deux mises à jeun (sans restriction hydrique) de 17h chacune afin de vider le tube digestif.

Impact sur les animaux

Les aliments distribués permettent de couvrir les besoins des animaux sans carence ni excès (apports équilibrés en vitamines et minéraux). Les effets négatifs sur les animaux sont liés, d'une part à l'isolement en cage individuelle, avec un enrichissement limité pour ne pas interférer avec l'aliment et d'autre part à la mise à jeun (sans restriction hydrique) pendant 17h (la nuit), afin de permettre la vidange du tube digesti

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés par électronarcose suivie d'une saignée, pour prélèvement des contenus digestifs à la fin de la procédure.

Remplacement

En l'absence de méthodes in vitro, il n'est pas possible de se passer de l'animal, d’autant plus pour des recherches appliquées de l'espèce cible. Les processus de digestion sont propres à chaque espèce. S’agissant de nouvelles matières premières pour l’alimentation animale, des mesures sur espèce cible sont indispensables. Les prélèvements de contenus digestifs à la fin de la procédure contribueront à la compréhension plus fine de la digestion chez le poulet. Aussi, l 'étude du microbiote nécessite le recours à des animaux.

Réduction

La réduction du nombre d'animaux est basée sur deux principes : 1) Grouper les régimes pour n'avoir qu'un seul régime témoin (régime standard). L'objectif est d'avoir 10 régimes (dont 1 témoin) de 12 animaux par régime. 2) Disposer de 12 animaux par régime est nécessaire et suffisant pour conduire une analyse de variance sur les résultats individuels, avec comparaison de moyennes. Le coefficient de variation des paramètres mesurés sur animaux étant inférieur à 5% (sur la base de 30 ans de mesures), les produits seront considérés comme différents si les valeurs de digestibilité diffèrent au seuil de 5%. Sur la base de la bibliographie disponible, la digestibilité apparente des nutriments se situe entre 40 et 95 %, avec un coefficient de variation de l'ordre de 10 %.

Raffinement

Les animaux sont mis en cage à 17 jours d'âge, ce qui correspond à l'âge à partir duquel le tube digestif et son microbiote sont pleinement fonctionnels. La durée du séjour en cage individuelle est réduite au maximum ; les animaux seront en cage uniquement pour les 9 jours de procédure (dont 4 jours consacrés à l’accoutumance à la cage et au régime). Les cages sont disposées de manière à procurer aux poulets une perception visuelle, auditive et olfactive entre congénères. Afin d’éviter d’induire un biais expérimental, il n'est pas possible d'enrichir le milieu avec des matériaux consommables ; les cages sont donc enrichies de chaînettes. Les aliments distribués aux animaux permettent de couvrir les besoins physiologiques sans carence ou excès. L'eau est maintenue à volonté. La température de la salle est augmentée de 2 degrés par rapport à un programme classique d'élevage pour améliorer le confort thermique des animaux. Une grille d’évaluation du bien-être des animaux, basée sur leur comportement et leur état de santé, est complétée quotidiennement par le personnel animalier afin de détecter toute altération de leur état de bien-être. Pour chaque paramètre d’atteinte au bien-être, nous avons défini plusieurs niveaux d’action. De plus, la surveillance des animaux portera particulièrement sur les éléments suivants : - l'alimentation : si un animal ne mange plus, nous vérifierons qu'il ne présente pas d'atteinte à son bien-être (boiterie, blessure...), nous vérifierons l'accès à l'eau de boisson et une distribution manuelle d'aliment lui sera proposée. - l'état des déjections : si nous constatons des fientes très molles (diarrhée), nous vérifierons les paramètres d'ambiance et nous ferons une recherche de parasites dans les fientes (coproscopie) dans le but d'apporter des soins appropriés. - le comportement : si un animal est prostré, des visites supplémentaires permettent de vérifier dans le temps et si l'animal reste prostré il est sorti de la cage pour un diagnostic et des soins appropriés. - les blessures : en cas de présence de sang, l'animal est attrapé, la blessure observée et soignée (bombe cicatrisante) Dans le cas où les symptômes persistent au-delà de 3 jours, l'animal est déclaré « hors expérimentation ». Selon son état, il est remis au sol, en groupe. Si son état ne le permet pas, il sera euthanasié selon une méthode conforme à la règlementation. Dans tous les cas, la décision de mise à mort sera prise par le responsable du projet.

Choix des espèces

Les objectifs du projet portent sur la nutrition des volailles et l'étude du microbiote, avec un objectif de valorisation par les filières avicoles. Le poulet de chair représente l'espèce majeure concernant la production de viande de volailles. Les bilans digestifs (procédure de digestibilité fécale + iléale) sont réalisés entre 17 et 25 jours d'âge, ce qui correspond à l'âge à partir duquel le tube digestif et son microbiote sont pleinement fonctionnels. Aussi, à ce stade, les animaux sont suffisamment développés pour tolérer de légers déséquilibres nutritionnels, s'adapter à une période d'une semaine en cage, et sont en pleine croissance, ce qui permet une réponse physiologique maximale.