Recherche appliquée

48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie menée sous anesthésie sans réveil. Le porteur décrit une chirurgie de trente minutes pour implanter des germes dentaires sous la capsule rénale de souris receveuses, les donneurs étant des souriceaux nouveau-nés d'une lignée qui ne survit que quelques heures. Il affirme que seul un modèle animal intégré permet la formation d'une dent, sans méthode de remplacement possible. Il indique par ailleurs qu'un test statistique justifierait douze souris, quand le projet en prévoit quarante-huit.

Objectifs

L'amélogenèse imparfaite constitue un groupe de maladies génétiques rares du développement affectant la structure de l'émail de toutes les dents (temporaires et permanentes). Ces troubles de structure ont un impact important sur l’esthétique et la fonction des dents du patient et affectent de manière importante sa qualité de vie. L’amélogenèse imparfaite peut s’exprimer de façon isolée ou syndromique. Les formes isolées sont principalement liées à des mutations dans les gènes qui codent pour les composants de la matrice extracellulaire de l'émail, ou des protéines impliquées dans la maturation de l'émail, ou encore dans l’attachement cellule-cellule et cellule-matrice. L'amélogenèse imparfaite est aussi fréquemment diagnostiquée chez les patients présentant des troubles génétiques associés aux reins, à la peau et à de nombreux autres organes/systèmes ; on parle alors de formes syndromiques. L’objectif de notre recherche est d’étudier les consquences dune mutation d'un gène codant une protéine clée des jonction intercellulaires, dans l'amélogenèse . Nous disposons au laboratoire de la lignée de souris invalidée pour ce gène. Ce modèle, déjà bien établi dans la littérature, permet la formation complète d’une dent. Ceci nous permettra d’étudier tous les stades de l’amélogenèse dans un environnement nourricier contrôlé et idéal.

Bénéfices attendus

La mort des souriceaux de la lignée de souris invalidée pour ce gène survenant quelques heures après la naissance empêche l’étude des différents stades de l’amélogenèse (formation de l’émail). Quand bien même la souris serait viable au-delà de quelques heures, elle présenterait, comme chez les patients avec le syndrome, une homéostasie minérale perturbée, ce qui impacterait indirectement la formation de l’émail. Pour évaluer le rôle direct de l’absence de cette protéine sur la formation de l’émail, nous allons implanter les germes dentaires issues des souris de cette lignée invalidée pour le gène dans la capsule rénale de souris sauvages afin d’étudier tous les stades de l’amélogenèse, les germes continuant à se développer après implantation dans le rein. La capsule rénale est en effet un modèle d’implantation bien établi, qui constitue un environnement nourricier contrôlé et idéal. La capsule rénale est un compartiment bien isolé, accessible, richement vascularisé qui permet donc un afflux de nutriments et de minéraux qui va donc favoriser le développement et la minéralisation des germes inclus. Cette étude pionnière apportera des données essentielles sur la compréhension du rôle de ce gène dans l’amélogenèse. Les retombées de cette étude seront à la fois scientifiques mais aussi de manière plus générale apporteront des données nouvelles sur l’amélogenèse et ses dysfonctionnements. Il est à savoir qu’un nombre considérable de patients avec des maladies rares mais aussi des maladies chroniques comme la carie dentaire présentent des perturbations au niveau de l’émail. Une meilleure compréhension des mécanismes qui sous-tendent l’amélogenèse devrait apporter un bénéfice réel à la fois pour la connaissance scientifique et pour la population car cela pourrait ouvrir des pistes vers de nouvelles thérapies à la fois préventives et interventionnelles pour ce type de pathologies.

Procédures

Chirurgie : durée d’environ 30 minutes par animal réalisée une seule fois.

Impact sur les animaux

Notre expérience avec les procédures mises en place pour ce projet a montré qu’il y a peu d’effets indésirables observés moyennant un traitement antidouleur systématique en pré et post chirurgie (Buprénorphine 0.05mg/kg 2X/jour pendant 48h). D’après la littérature, aucun changement de comportement ne devrait être observé et la perte de poids resterait inférieur à 5%.

Devenir

À l'issue de la procédure, les souris sont mises à mort pour collecter des germes formés dans la capsule rénale puis pour différentes types d'analyses.

Remplacement

La formation d’une dent est un processus physiologique complexe qui fait intervenir différents types cellulaires et de nombreux facteurs de croissance qui n’ont pas tous été identifiés. Par conséquent seul un modèle animal intégré permet à l’heure actuelle ce développement et il n’y a pas de méthode alternative de remplacement.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans cette étude mais de disposer d’un nombre minimal d’animaux pour obtenir la puissance statistique requise, nous utiliserons le test statistique d’analyse de variance Turkey suivi d’un test t de Student. Ces tests permettent de déterminer qu’un nombre de 12 souris sera nécessaire pour cette étude.

Raffinement

Afin de limiter au maximum la souffrance des animaux, les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Les analyses se feront sous anesthésie générale avec une médication antidouleur systématique en pré et également post-opératoire. Des tapis chauffants seront utilisés pendant la chirurgie et en phase de réveil. Les animaux seront surveillés quotidiennement et des points limites ont été définis au-delà desquels les animaux seront mis à mort. Les souris seront maintenues dans des cages bénéficiant d’un enrichissement composé d’un igloo rouge et de coton.

Choix des espèces

La souris est une espèce de laboratoire appropriée et classiquement utilisée pour l’étude de l’amélogenèse. Il permet une faisabilité technique et la biologie car l’émail murin est proche de celui de l’homme. Afin de limiter toute réaction immunitaire chez la souris receveuse, nous utiliserons la même souche. Pour les donneurs, seules les souriceaux nouveaux nés seront utilisés puisque les souris invalidées pour le gène ne vivent que quelques heures après la naissance. Pour les receveurs, des souris de 3 mois seront utilisées car à cet âge, leurs reins sont assez développés pour pouvoir réaliser les implantations de germe.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie de trente minutes sous anesthésie pour l'injection de cellules tumorales dans l'hypophyse, puis des prélèvements sanguins hebdomadaires et un prélèvement terminal. Le porteur indique que les tumeurs peuvent, comme chez l'humain, provoquer une compression intracrânienne, des maux de tête et une pression sur les nerfs optiques altérant la vision, mais estime que le suivi hormonal évitera ces stades avancés. Il affirme ne pas pouvoir remplacer le modèle murin par des approches in vitro et présente cette greffe intra-hypophysaire comme plus représentative que la greffe sous-cutanée.

Objectifs

Les tumeurs hypophysaires humaines ont une incidence élevée (1 personne/1500). Ces tumeurs bien que bénignes provoquent des maux de tête, des troubles visuels et peuvent être invasives dans certains cas. Elles répondent mal aux traitements thérapeutiques, il est donc indispensable de trouver de nouvelles molécules pouvant limiter leur développement. Malgré leur fréquence importante chez l’homme, il existe peu d’outils d’étude pour caractériser le comportement de ces tumeurs, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et tester de nouveaux traitements cliniques. Leur étude est donc tributaire de modèles précliniques qui soient représentatifs des tumeurs hypophysaires humaines. Bien que le nombre de lignées tumorales soit limité et la mise en culture de cellules dérivées de tumeur soit délicate, la greffe de ces différents modèles sous la peau des souris constitue actuellement la seule possibilité de modèle préclinique pour mettre au point et valider de nouveaux traitements thérapeutiques. Les greffes sous-cutanées sont toutefois peu représentatives du contexte intracrânien dans lequel se développent et évoluent ces lésions tumorales chez l’Homme. Notre projet vise donc à tester la faisabilité et à développer un modèle expérimental de greffe de cellules tumorales dans l’hypophyse de souris pour disposer de modèles précliniques relevant qui permettront : i) d’étudier le comportement et la biologie de différentes lignées et cellules tumorales hypophysaires dans leur environnement naturel de développement et ii) de valider de nouveaux modèles précliniques pour évaluer l’effet de drogues thérapeutiques qui sont actuellement uniquement testées in vitro. La mise en place et la validation de ces nouveaux modèles de greffes intra-hypophysaires seront réalisées par le biais d’une micro-injection automatisée dans l’hypophyse de souris sur des animaux profondément endormis. Nous avons identifié les coordonnées d’injection dans l’hypophyse sur une cohortes d’animaux de réforme déjà morts. Notre projet visera à confirmer que ces coordonnées sont adaptées et ne varient pas si elles sont utilisées pour des injections sur animaux anesthésiés. Nous testerons ensuite l’efficacité de prise de greffe des 5 lignées tumorales hypophysaires de rongeurs disponible mais également de 20 suspensions cellulaires issues de tumeurs humaines issues de 2 sous types tumoraux. Les tumeurs seront collectées pour étude et mises en culture pour établir de nouveaux outils cellulaires

Bénéfices attendus

Notre projet vise à développer de nouveaux modèles précliniques pour l’étude biologique et le développement d’outils thérapeutiques dédiés aux atteintes tumorales de la glande hypophysaire. Il devrait permettre de mieux comprendre la complexité de ces tumeurs particulièrement fréquentes dans la population (1 cas / 1500) et mieux saisir l’impact de leur niche environnementale naturelle (i.e. l’hypophyse antérieure) sur leur comportement et leur évolution. Notre projet devrait également permettre d’engendrer de nouvelles lignées tumorales humaines qui font actuellement défaut dans le champ de recherche et ainsi limiter à long terme l’usage de modèles animaux.

Procédures

Lors de l’injection des cellules tumorales dans leur hypophyse, les animaux subiront une chirurgie de 30 minutes maximum sous anesthésie générale et sous analgésie. Cette acte n’aura lieu qu’une fois. Un prélèvement de sang sera ensuite réalisé sur ces animaux chaque semaine afin d’identifier toute augmentation d’hormone qui pourrait suggérer un développement tumoral. Une variation trop importante (supérieur à 35% ) des concentrations circulantes d’hormones mesurées avant la greffe conduirait alors à un arrêt immédiat de l’expérimentation. Un prélèvement terminal de sang sera réalisé à la fin de chaque procédure, il sera cependant réalisé sous anesthésie profonde avant leur mise à mort finale.

Impact sur les animaux

Un acte chirurgical sera réalisé sous anesthésie pour injecter les cellules dans l’hypophyse. La greffe de cellules tumorales dans l’hypophyse entrainera le développement de lésions tumorales intracrânienne. Ces lésions pourront comme chez l’homme entrainer une compression intracrânienne, conduisant à des maux de têtes et une pression sur les nerfs optiques altérant la vision. Grâce au suivi des hormones produites par ces tumeurs, les souris ne devraient toutefois jamais atteindre ces stades tumoraux avancés qui sont fréquemment retrouvés chez l’homme et sont déclencheurs d’une chirurgie. Après injection, un prélèvement sanguin de 50 à 100uL sera également réalisé chaque semaine par une ponction à la veine caudale sous contention chez les animaux greffés afin d’assurer le suivi de la progression tumorale par un dosage hormonal. L’utilisation d’un ciment biologique pour colmater le site d’injection ne devrait pas entrainer de gêne.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procedures experiemntales réalisées. Nous procéderons à un prélèvement sanguin final qui servira à réaliser des dosages d’hormones et de molécules secrétées par les lésions cancéreuses. Nous procéderons également à de nombreuses analyses sur les tumeurs collectées post-mortem, Des analyses histologiques et moléculaires complémentaires permettront d’exploiter au mieux nos résultats. Les tumeurs collectées derivé de patients seront également mise en culture pour générer de nouveaux outils cellulaires qui nous permettront de travailler in vitro et limiter ainsi nos besoins d’expérimentation sur l’animal.

Remplacement

Les modèles de greffes tumorales dans les tissus où se développent naturellement les tumeurs greffées représentent actuellement les modèles précliniques les plus convaincants, car ils permettent d’étudier le comportement des cellules tumorales (pousse tumorale, remodelage du microenvironnement, réponse à certains traitements, …) dans leur environnement cellulaire natif. En raison de la nature complexe de la recherche proposée, qui vise à évaluer la prise de greffe et l’impact de l’environnement hypophysaire sain sur la progression tumorale de cellules injectées, nous ne pouvons malheureusement pas remplacer l’utilisation de modèles murins par des outils cellulaires ou des approches in vitro.

Réduction

Afin de nous conformer à la règle de réduction, le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre le taux de succès de nos greffes et l’obtention d’un nombre suffisant de tumeurs dont nous pourrions étudier les caractéristiques moléculaires. Afin de limiter l’utilisation d’animaux, nous avons au préalable mis au point toute notre procédure d’injections sur des animaux morts de réforme. Dans le cadre des travaux proposés, 9 souris par sexe devraient nous permettre d’aboutir à l’obtention de 7 tumeurs dont les traits moléculaires pourront être étudiés et comparés entre eux. Nous ne réaliserons pas de répétition expérimentale ni de test statistique, notre procédure se limitant à la mise au point d’un nouveau modèle préclinique. La greffe de 400 souris au maximum sur 5 ans nous permettra de confirmer la faisabilité et la reproductibilité de nos modèles de greffes de lignées cellulaires et étudier la prise éventuelle de plusieurs greffes humaines parmi les injections des cellules issues des 20 tumeurs humaines qui seront utilisées.

Raffinement

Nous mettrons en place une surveillance adaptée et individuelle des animaux afin d’assurer que les animaux expérimentaux ne subissent aucune souffrance inutile. Ce suivi individuel permettra d’identifier l’apparition de signes évocateurs de mal-être ou de souffrance (prostration, comportement erratique, altération des constantes hormonales, …). L’identification de ces signes entrainerait alors une fin d’expérimentation immédiate et une mise à mort des animaux concernés. Le suivi individuel des animaux permettra également de mieux saisir : i) la reproductibilité des greffes réalisées et ii) d’évaluer le nombre d’animaux statistiquement nécessaires qui devront être étudiés en cas de test de molécules thérapeutiques à venir. Les analyses post-mortem que nous réaliserons sur le matériel biologique collecté nous permettrons de valider l’intérêt de ce modèle en comparaison des greffes sous-cutanées et de dériver d’éventuels nouveaux modèles cellulaires de lignées tumorales humaines qui font actuellement défaut dans le champ de recherche.

Choix des espèces

Le modèle de souris Rag2KO, possède un système immunitaire appauvri. Il s’agit d’un modèle indispensable pour greffer du tissu humain ou des lignées rongeurs de fonds génétiques mixtes afin qu'il n'y ait pas de rejet du greffon. Le modèle Rag2KO est de plus un modèle réceptif aux lignées choisies et aux tumeurs humaines hypophysaires que nous avons déjà pu greffer avec succès en sous-cutané. Nous y avons mis au point les coordonnées stéréotaxiques pour cibler l’hypophyse. Il est donc idéal pour les greffes dans l’hypophyse que nous souhaitons faire et il nous permettra également l’étude du microenvironnement et de l’interaction entre la tumeur et son environnement. Les protocoles d’injection seront réalisés sur des souris âgées de 12 à 16 semaines. Ce sont à ces âges que nous avons validé nos 70% d’efficacité d’injection avec les coordonnées définies.