Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Evaluation de l’autotransfusion par le système i-SEP dans un modèle de saignements massifs répétés d’origine cardiaque chez le cochon : comparaison avec un appareil de référence et effet sur le comptage plaquettaire
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
16 cochons vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque animal subit une thoracotomie avec pose d'une canule dans l'oreillette droite du cœur, puis trois cycles de saignement massif et d'autotransfusion sous une anesthésie de dix heures, pour tester un dispositif d'autotransfusion avant une étude clinique. Le porteur décrit un choc hémorragique prolongé qu'il juge incompatible avec le réveil de l'animal. Sur le remplacement, il affirme qu'un modèle grand format proche de l'humain est "indispensable" et "sans méthode alternative".
Objectifs
L’autotransfusion consiste à collecter le sang du patient épanché lors de la chirurgie associé à un anticoagulant, à le traiter pour pouvoir réinfuser une grande partie de la portion cellulaire du sang (globules rouges en premier). Le sang collecté est transféré dans le module de traitement, concentré et épuré des molécules contaminantes (héparine, hémoglobine libre), pour obtenir un concentré de globules rouges et de plaquettes avant transfusion peropératoire. Le projet présenté développe un nouveau dispositif d’autotransfusion basé sur la filtration, autour d’un modèle chirurgical d’hémorragie massive chez le miniporc pour évaluer la sécurité et la performance du dispositif lors de nombreux cycles consécutifs. En particulier, il est indispensable d’étudier les paramètres suivants avant une nouvelle étude clinique : performances de l’aspiration (intégrée dans le dispositif) afin de libérer le champ opératoire du sang écoulé, les vitesses de traitement du sang après de nombreux cycles permettant de rendre rapidement le sang au patient limitant la transfusion homologue, l’effet sur la physiologie du patient de la transfusion de grands volumes de sang traité. Il est particulièrement indispensable d’éprouver cette nouvelle technologie par filtration lors de nombreux cycle en conditions chirurgicales pour vérifier la durabilité de la performance de filtration.
Bénéfices attendus
Le bénéfice principal de ce projet est de s’assurer d’une utilisation optimale du dispositif d’autotransfusion chez l’humain. En effet, il s’agit de garantir les performances et la sécurité du dispositif dans les cas de multiples cycles consécutifs, et de les comparer avec un dispositif de référence déjà sur le marché. Les hémorrhagies massives sont des cas rares mais particulièrement exigeants. En effet, la perte d’un important volume sanguin peut très rapidement dégrader l’état d’un patient et engager sa vie. Dans ces cas, il est indispensable que les performances du dispositif d’autotransfusion soient maintenues afin de rapidement rendre le sang au patient. De plus, la comparaison avec un dispositif de référence actuellement déjà sur le marché permettra de s’assurer de performances au moins égales ou supérieures du dispositif testé. Il a été montré que le dispositif testé permet de récupérer les globules rouges mais aussi les plaquettes. La récupération des plaquettes est significativement supérieure pour le dispositif testé par rapport au dispositif référence. Les échantillons sanguins prévus au cours des cycles de saignement et pendant le suivi post-opératoire permettront de tester la supériorité du dispositif testé sur la numération plaquettaire de l’animal lors du saignement de 80% du volume sanguin de l’animal.
Procédures
Une injection intra-musuclaire initiale sur animal vigile Sous anesthésie générale, procédure chirurgicale (thoracotomie avec pose d'une canule de prélèvement dans l'oreillette droite du coeur), cycle de saignement massif et d'autotranfusion: Une anesthésie de 10 heures, 4 heures d'instrumentation et procédures chirurgicales incluant les saignements répétés (3 cycles saignement/autotransfusion) Prélèvements sanguins dans un cathéter en place pendant toute la procédure sur animal anesthésié Euthanasie sur animal anesthésié
Impact sur les animaux
L’objectif du modèle étant d’étudier la performance de la machine et la qualité diu sang retransfusé sur un saignement massif et prolongé dans des conditions extrêmes. Pour se faire, il est nécessaire de mettre en place une réanimation minimale évitant le développement d’une coagulopathie dilutionnelle et sans transfusion de plasma ni de concentré plaquettaire pour ne pas modifier les caractéristiques du sang auto-transfusé. Pour ces raisons, les animaux seront gardés sous anesthésie générale pendant la procédure puis sédation profonde/anesthésie légère pendant l’observation des effets post-transfusionnels avant d’être euthanasié. Ainsi la douleur sera prise en charge et le potentiel état de choc hémorragique sera pris en charge alors que l’animal restera inconscient.
Devenir
Euthanasie En raison de l’induction d’un choc hémorragique prolongé et de la nécessité d’une réanimation minimale (sans transfusion d’alloproduits sanguins de type plaquettes et plasma), il est jugé que ce modèle mis au point pour tester l’appareil dans des conditions extrêmes n’est pas compatible avec le réveil de l’animal.
Remplacement
La stratégie d’évaluation du dispositif développé doit conduire à la démonstration de sa sécurité et de ses performances en vue de l’obtention des autorisations réglementaires pour sa mise sur le marché. Cette stratégie a été discutée avec les autorités réglementaires et notamment l’ANSM. Les évaluations prévues ici consistent à reproduire des situations cliniques extrêmes grâce à un modèle d’hémorrhagie. L’utilisation d’un modèle animal grand format, proche de la situation chirurgicale et conditions d’analyses rencontrées chez l’Homme est indispensable, sans méthode alternative. En effet, l’anticoagulant contenu dans les poches de sang de donneurs utilisé pour les tests in vitro (citrate) est différent de celui utilisé en clinique lors des interventions chirurgicales (héparine). De plus, le sang épanché aspiré lors d’une chirurgie rentre brièvement en contact avec le milieu extravasculaire, ce qui est suffisant pour déclencher la cascade de coagulation ainsi que des méchanismes d’inflammation, dont l’origine est impossible à reproduire in vitro avec du sang anticoagulé au citrate.
Réduction
D’importantes étapes de mise au point in vitro et ex vivo d’échantillons sanguins fournis par EFS et Oniris respectivement ont permis de lever d’importants verrous technologiques et de limiter le nombre d’animaux au strict nécessaire. Le nombre d’animaux est fixé au minimum, tout en assurant l’analyse statistique des résultats obtenus et la pertinence clinique du projet. Un calcul statistique de l’effectif nécessaire a été effectué en prévision de l’étude : L’effectif necessaire pour démontrer la supériorité du dispositif test par rapport au dispositif référence pour la numération plaquettaire de l’animal est calculé d’après la formule suivante : n = f(α/2, β) × 2 × σ² / (μ1 − μ2)² où μ1 et μ2 sont les moyennes attendues pour le dispositif testé et le dispositif référence, σ est l’écart-type et f(α, β) = [Φ-1(α) + Φ-1(β)]², avec Φ-1 est la fonction de distribution cumulative d’un écart normal standardisé. Considérant un niveau de signification (alpha) à 5% et une puissance (1- β) de 90%, l’effectif total nécessaire est de 16, c’est-à-dire 8 pour le groupe du dispositif testé et 8 pour le groupe du dispositif référence. Références : Pocock SJ. Clinical Trials: A Practical Approach. Wiley; 1983. Julious SA. Sample sizes for clinical trials with Normal data. Statist. Med. 2004; 23:1921-1986. Sealed Envelope Ltd. 2012. Power calculator for continuous outcome superiority trial. [Online] Available from: https://www.sealedenvelope.com/power/continuous-superiority/
Raffinement
En plus du raffinement des conditions d’hébergement, les procédures de préparation, d’induction de l’anesthésie, de mise en place de l’analgésie répondent aux exigences de l’analgésie multimodale pré-emptive et sont confiées à des anesthésistes/réanimateurs spécialistes. Une attention identique est portée au suivi des animaux pendant les interventions chirurgicales et le suivi postopératoire grâce à l’ensemble des moyens de monitorage du plateau technique. Les données de monitorage sont enregistrées fréquemment afin de relever à posteriori d’éventuelles réponses physiologiques chez les différents animaux. Des échantillons sanguins sont prélevés avant la chirurgie (après anesthésie), pendant la chirurgie et après la chirurgie (pendant le suivi post-opératoire) afin de collecter le maximum de données sur la numération plaquettaire, l’évaluation de l’hémostase et la biochimie de l’animal. Les besoins en données sont anticipés et ouverts aux analyses exploratoires afin de pouvoir effectuer des analyses sur des paramètres qui n’auraient pas été anticipés. De plus, les études préliminaires in vitro ainsi que la première étude comparative ont permis de raffiner les procédures réalisées et le protocole d’échantillonnage et d’analyse.
Choix des espèces
Le choix du mini-porc est fondé sur plusieurs critères : - Animaux de grande taille, aspect anatomique proche de l’homme ; paramètres hémato- biochimiques comparables et dont les variations sont accessibles par des techniques de dosages similaires à celle utilisées en médecine humaine, afin d’assurer la prédictivité des résultats. - La taille des animaux permet une gestion aisée de l’anesthésie et de l’analgésie, ainsi que l’utilisation d’instruments et de matériels identiques à ceux utilisés chez l’Homme. - Le mini-porc à l’âge adulte atteint un poids minimum de 40 kg et reste maitrisé par le rationnement (environ 50 kg) ce qui représente un avantage lors des manipulations comparativement au porc charcutier qui peut doubler de poids sur la même période et à âge égal. Animaux adultes
Évaluation de la biodistribution de bactéries thérapeutiques (LBP : Live Biotherapeutic Products) après leur administration dans les voies respiratoires du macaques cynomolgus
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
150 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque macaque, maintenu vigile sur une chaise à contention, reçoit une administration de bactéries dans les voies respiratoires, puis subit jusqu'à cinq lavages bronchiques et dix prises de sang sous anesthésie, avant d'être tué pour prélever ses organes. Le porteur reconnaît que la contention représente la principale contrainte pour l'animal. Il justifie le recours au macaque par la proximité de son système respiratoire avec celui de l'humain, un passage préalable par des rongeurs étant prévu.
Objectifs
Les maladies inflammatoires respiratoires représentent un ensemble de syndrome dont le développement est croissant avec l'augmentation de la pollution athosméphique et d'autres facteurs d'environnement. Ces maladies invalidantes sont souvent bien contrôles chez les malades, mais les traitements peuvent être lourds ou présentent des effets indésirables. Actuellement, les traitements des maladies inflammatoires du système respiratoire font appel à des thérapeutiques anti-inflammatoires chimiothérapeutiques ou à des immunothérapies classiquees administrées par voie générale. Ce projet a pour but d'étudier l'innocuité, la biodistribution et la biodisponibilité de produits de type Live Biotherapeutics Product administré par voie pulmonaire. Ces produits sont en cours de développement, leur effet aura été prouvé au préalable in vitro et doit être testé in vivo chez le singe macaque cynomolgus.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de mieux caractériser produits immunostimulants innovants, et de mieux les connaître avant de les utiliser pour le traitement des maladies inflammatoires pulmonaires. Les informations obtenues chez les singes, dont la physiologie et l'immunologie des voies respiratoires sont très proches de l'homme.
Procédures
L'administration des produits se fait avec un animal vigile, maintenu sur une chaise à contention. Les prélèvements prévus sont des lavages broncho-alvéolaires, et des prélèvements de sang, d'urine ou de fécès. La fréquence et le durée des prélèvements sont fonction des caractéristiques estimées du produit, avec un maximum de 4 semaines. Au total, on peut envisager 5 lavages bronchiques et 10 prises de sang au maximum.
Impact sur les animaux
L'adminstration du produit représentante un stress pour les animaux, mais elle n'est pas douloureuse. La principale contrainte est que l'animal est immobilisé dans une chaise à contention. Les prélèvements réprésentante une contrainte, mais ils sont réalisés sous anesthésie générale. Il est prévu de pouvoir réaliser dees prélèvements sanguins ou des lavages bronchiques principalement.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés sous anesthésie à la fin des protocoles pour pouvoir prélever les organes.
Remplacement
L'administration de LBP dans les voies pulmonaires pour lutter contre des maladies inflammatoires chroniques nécessite des développements précliniques spécifiques, permettant de mesurer la quantité de bactéries nébulisées dans les voies respiratoires, il est nécessaire de disposer d’un modèle animal pertinent. En effet, la nécessite de pouvoir observer des interactions complexes et fines entre organes n’est aujourd’hui possible que sur modèle animal, dans ce cadre d’étude. Même si des modèles in vitro de poumons existent, ils ne permettent pas de prédire la distribution et la viabilité d'un produit biologique aussi spécifique qu'un LBP, ni la réponse de l'organisme a l'influx soudain d'une large quantité de bactéries, même non pathogènes. Une approche sur des modèles de rongeurs est préalable aux essais sur Singes.
Réduction
Le nombre d'animaux est limité au minimum nécessaire. Pour tester un LBP, un groupe de 3 à 5 animaux au maximum est suffisant. Nos études sont exploratoires, très en amont dans le développement des produits. L'évaluation de l'effet se fait sur la base de l'analyse hostologique microscopique et de l'évaluation des populations cellulaires détectées après administration du produit. Avec un groupe de 3 à 5 animaux, seules des statistiques descriptives sont possibles, sachant que nous n'utilisons pas d'animaux témoins non traités. Nous comparons les résultats obtenus avec nos données de base, en comparant les données et parfois les moyennes pour évaluer une tendance. Le nombre d'animaux présenté dans ce projet est une estimation qui tient compte du nombre de produits qui pourraient être confiés à notre société pour en évaluer la biodistribution et l'innocuité. Si la demande est faible, il est évident que seuls les animaux nécessaires (3 à 5 par produit) seront utilisés.
Raffinement
Chacun des actes techniques mis en oeuvre pour ce projet ont été mis au point, étudiés et raffinés pour limiter le stress ou la douleur des animaux. La plupart des prélèvements sont réalisés sous anesthésie générale. L'administration se fait avec un système de contention auquel les animaux sont habitués au préalable pendant plusieurs jours, sans administration. Les techniques analytiques auxquelles nous faisont appel sont suffisamment sensibles pour réduire la quantité de prélèvement nécessaire. Ainsi, les volumes des prises de sang ou des lavages alvéolaires sont très faibles.
Choix des espèces
La macaque cynomolgus possède une proximité physiologique et immunitaire avec l’homme ainsi qu’une anatomie des grandes fonctions extrêmement proche de l’homme. En effet, l’anatomie de son système respiratoire (en partie liée à sa posture verticale (semi-bipède- par opposition aux modèles rongeurs ou porcins) est très proche de celle de l’homme, ou encore un système digestif ou urinaire sensiblement similaire également. Ces similitudes permettent de tester la distribution et la viabilité d’un produit biologiques pour une transposition future chez l’Homme (thérapie par nébulisation, administration par voie orale). Selon le type de LBP choisi et sa cible thérapeutique, des animaux jeunes (2 ans) ou plus âgés (à partir de 3 ans) pourront être utilisés pour des raisons de maturité du système immunitaire et de poids. Cependant, le stade de développement pourra être affiné avec le donneur d’ordre selon le type d’individus visé par la thérapie.
Rôle d’Enterococcus faecalis dans la genèse de l’inflammation pancréatique : susceptibilité individuelle et gravité des atteintes pancréatiques
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pour provoquer une pancréatite, chaque souris reçoit jusqu'à dix-huit injections de céruléine, des gavages et des injections d'antibiotique ou de bactéries, la céruléine pouvant causer des douleurs modérées répétées. Les animaux sont tués pour des analyses post-mortem. Le porteur affirme que les interactions entre bactéries, tube digestif et pancréas ne peuvent être reproduites in vitro et que le modèle animal est le seul auquel il peut recourir.
Objectifs
Le microbiote intestinal influence le développement des maladies digestives. En effet, les patients avec une pancréatite alcoolique présentent des modifications de leur microbiote intestinal en comparaison des patients avec une consommation alcoolique similaire mais sans pancréatite ou développant une atteinte hépatique. On trouve notamment une augmentation des entérocoques, en particulier d’Enterococcus faecalis. Il a été́ démontré que, chez les patients ayant une hépatite alcoolique aigue, les souches d’E. faecalis produisant la toxine cytolysine sont augmentées, cela est corrélé à la sévérité de la maladie. Il est montré que les patients avec une consommation alcoolique excessive développant une pancréatite alcoolique hébergent plus souvent des souches exprimant la cytolysine que les patients ayant une hépatite alcoolique. De plus, l’abondance relative d’E. faecalis productrice de cytolysine est de 10 à 100 plus importante chez les patients développant une pancréatite par rapport à ceux développant une hépatite. Cependant, le rôle de cette souche dans l’apparition et la gravité de la pancréatite n’est pas connu. Notre objectif est de démontrer que cette bactérie est un facteur prédisposant à la pancréatite en particulier lorsque la souche est productrice de la toxine cytolysine. Nous avons isolé des souches de E. faecalis de patients ayant une pancréatite. Notre projet vise à évaluer sur des modèles murins de pancréatite chronique ou aigue induites par la céruléine, l’implication de E. faecalis (avec ou sans production de cytolysine) sur le développement des lésions de pancréatite.
Bénéfices attendus
La pancréatite et ses complications, notamment le risque de cancer du pancréas, sont associées à une mortalité élevée et il existe peu de traitements actuellement. Notre approche vise à évaluer le rôle du microbiote intestinal chez les patients alcooliques, et en particulier d’Enterococcus faecalis, dans la survenue des dommages du pancréas. Si notre hypothèse se confirme, des stratégies de modification du microbiote intestinal, avec éradication de E. faecalis, pourraient améliorer la prise en charge des patients atteints de pancréatite chronique, soit environ 15 000 patients en France, et potentiellement prévenir les complications de la pancréatite sur le long terme, comme le cancer du pancréas.
Procédures
- Induction d’une pancréatite chronique : de 3 à 6 injections maximum intrapéritonéales de céruléine espacées d’une heure, une fois par semaine, pendant 3 semaines soit 18 injections /souris, ce qui concerne 180 souris au total. - Induction d’une pancréatite aiguë : 6 injections intrapéritonéale de céruléine espacées d’une heure,suivi du sacrifice la même journée soit 6 injections intrapéritonéale /souris/ ce qui concerne 120 souris au total. - Gavage PBS ou E. Faecalis : 1 gavage par semaine pendant 2 semaines soit 2 gavages/souris ce qui concerne 168 souris au total. - antibiothérapie préalable au gavage : 1 injection sous cutanée de clindamycine pendant 3 jours, pendant 2 semaines soit 4 injections /souris ce qui concerne 168 souris au total. - injection intraveineuse d’E. Faecalis : 1 injection intraveineuse de souches d’enterococcus faecalis par semaine pendant 2 semaines soit 2 injections intraveineuse/souris ce qui concerne 36 souris au total.
Impact sur les animaux
Le traitement à la céruléine par injections intra péritonéales peut engendrer des douleurs modérées, mais répétées lors des injections et dans les heures qui suivent. Les injections sous cutanées d’antibiotiques peuvent entrainer des douleurs légères au moment de l’injection. Le gavage peut entrainer un stress de la souris, et des douleurs modérées lors du gavage.
Devenir
Mise à mort pour analyses post-mortem.
Remplacement
Les complications qui vont être observées au cours de la pancréatite mettent en jeu des interactions entre les différents organes qu’il est encore actuellement impossible de reproduire in vitro. Notre projet correspond à un travail qui permettra de comprendre le lien entre microbiote intestinal, la barrière intestinale et le développement d’une pancréatite. Le modèle animal est le seul auquel nous pouvons avoir recours et qui permet d’intégrer les interactions entre bactéries, tube digestif et pancréas.
Réduction
Nous nous sommes basés pour calculer la taille des groupes sur le dosage d’un marqueur sérique de pancréatite qui est augmentée dans le modèle avec céruléine. Nous avons ainsi déterminé la taille des groupes de souris afin à la fois d’obtenir des résultats robustes d’un point de vue statistique et permettant de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, 12 souris par groupe de comparaison seront utilisées dans les procédures.
Raffinement
Les souris seront hébergées par 4. L’enrichissement classique en cellulose, ayant un impact sur le microbiote intestinal, sera remplacé par un enrichissement plastique. Le jour de la mise à mort, les souris seront manipulées dans un local différent de celui où seront hébergées les autres souris en attente d’être manipulées. Le temps de manipulation des souris vigiles sera minimisé au maximum afin de limiter le stress et l’angoisse des souris. C’est une des raisons pour laquelle nous demandons à ne pas avoir à pré-traiter les souris par une pommade à la lidocaïne. Nous utilisons pour les injections intra-péritonéales des petites aiguilles et un volume réduit afin de minimiser la douleur de la piqure. Pour les injections en intra-veineuse au niveau du sinus retro-orbital, les souris seront anesthésiées et les 2 injections à une semaine d’intervalle seront réalisées sur le sinus gauche puis à droite la semaine suivante. Les gavages réalisés sur souris vigile pour éviter les fausses routes seront également réalisées 2 fois à 1 semaine d’intervalle avec un volume réduit à l’aide de canules de gavage fine et courte bien adaptées au modèle murin et à la taille de l’animal. Les injections sous cutanées permettant l’administration des antibiotiques au niveau interscapulaire seront réalisées. Dans tous les cas les souris hébergées par 4 seront remises dans la cage avec leurs congénères avec une quantité de sciure augmentée favorisant leur enfouissement, en particulier après les manipulations.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car les mécanismes cellulaires développés dans la physiopathologie de la pancréatite sont proches de ceux observés chez l’Homme.
Étude de l’activité anti-Pseudomonas aeruginosa d’une souche clinique de Porphyromonas instillée en prophylaxie
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque souris reçoit deux instillations nasales de suspensions bactériennes à dix-huit heures d'intervalle, puis est tuée vingt-quatre heures plus tard pour récupérer ses poumons ou réaliser des lavages, les groupes recevant Pseudomonas aeruginosa pouvant perdre du poids et devenir inactifs. Le porteur affirme ne pas pouvoir répondre à sa question avec des outils de culture cellulaire et choisit donc de conserver le modèle animal. Il retient la souris pour sa sensibilité permettant de provoquer une pneumonie sans mortalité trop importante.
Objectifs
Pseudomonas aeruginosa (PA) est une bactérie responsable d’infection pulmonaire grave chez les patients atteints de mucoviscidose et chez les patients en réanimation. Cette bactérie, au gré de successives antibiothérapies, devient résistante à tous les antibiotiques habituellement utilisés. Aussi il est capital de rechercher des alternatives thérapeutiques aux antibiotiques comme les probiotiques. Les probiotiques sont des microorganismes qui, administrés en quantités adéquates, confèrent un bénéfice à la santé de l’hôte. Lors d’une étude précédente, l’analyse du microbiote respiratoire de patients atteints de mucoviscidose a permis de mettre en évidence un genre bactérien particulier : Porphyromonas. Ce genre bactérien et plus particulièrement Porphyromonas cationae (PC) semble être prédictif de l’infection à PA. Il a été montré chez ces patients, que ceux qui avaient moins de Porphyromonas dans les poumons, avaient plus de risque de se coloniser à PA. Par la suite, il a également été montré que la quantité de PC pulmonaire venait à diminuer, voire disparaître, préalablement à la colonisation à PA alors que PC restait stable chez les patients non colonisés. Précédemment, nous avons testé une souche clinique de Porphyromonas catoniae isolée de patients atteints de mucoviscidose qui semblerait plus efficaces in vivo. Nous avons réalisés 2 expérimentations indépendantes qui ont permis de valider l’effet bénéfique observée ; (réduction significative de la quantité de Pseudomonas aeruginosa à 24h post infection) avec la souche clinique de Porphyromonas catoniae. Nous souhaitons donc poursuivre ces expérimentations afin d’évaluer le mécanisme d’action de cette souche potentiellement bénéfique avec un modèle murin d’infection pulmonaire à PA avec ou sans prophylaxie à PC.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de recueillir des données sur l’intérêt de l’utilisation de souches cliniques de Porphyromonas comme potentiels bactéries bénéfiques (probiotiques) à visée anti-Pseudomonas aeruginosa, pathogène clé de plusieurs pathologies respiratoires humaines dont la mucoviscidose.
Procédures
Les animaux recevront deux suspensions bactériennes par instillation nasale à 18h d’écart. 24h plus tard, les animaux sont mis à mort avant récupération des poumons ou réalisation de lavages broncho alvéolaires.
Impact sur les animaux
Ce projet a été conçu pour minimiser les effets indésirables. Ce projet peut induire un stress chez les animaux. Un geste maitrisé par l’expérimentateur, une surveillance accrue (deux fois par jour minimum) des animaux avec une table de suivi de soins permettent également une diminution de ses effets. Les groupes recevant seulement Pseudomonas aeruginosa souche PAO1 ou Pseudomonas aeruginosa résitant à plusieurs antibiotiques (PA MDR) peuvent être sujets à une perte de poids, des douleurs, une mobilité réduite voire, une inactivité. Ces derniers seront gérés en accord avec la table de soins. Pour les groupes recevant du Porphyromonas, aucun effet indésirable n’est attendu au vu des expérimentations précédentes.
Devenir
Les 90 souris C57BL/6 mâles survivantes sont mis à mort à l’issu du protocole
Remplacement
Compte tenu des résultats obtenus in vitro montrant une réduction de la quantité de Pseudomonas aeruginosa (PAO1) en présence de Porphyromonas cliniques ainsi que les premiers résultats positifs in vivo pour la souche clinique, nous souhaitons poursuivre sur cette voie en confirmant la capacité protectrice de Porphyromonas, ainsi qu’évaluer son effet sur le système immunitaire. Nous ne pouvons pas répondre à cette question scientifique en utilisant des outils de culture cellulaire et tissulaire (culture in vitro et ex vivo), nous choisissons donc de conserver le modèle animal.
Réduction
Approche statistique : Le nombre de souris est déterminé de façon à mettre en évidence une différence de 1 log au niveau de la quantité de P. aeruginosa entre le groupe recevant uniquement du P. aeruginosa et celui recevant du Porphyromonas préalablement à l’instillation de P. aeruginosa. Nous avons choisi de suivre nos souris uniquement jusqu’à 24 h post-infection et non 7 jours pour limiter le nombre d’individus en nous basant sur l’expérience apportée par notre équipe lors de DAP précédentes. Nous nous limitons à une seule espèce de Porphyromonas (P. catoniae) alors que plusieurs espèces sont décrites dans le poumon et une seule souche clinique parmi les 7 isolées par notre équipe.
Raffinement
Avant toutes instillation intranasale, les animaux seront préalablement anesthésiés, une analgésie est mise en place en accord avec notre table de suivi de soins. De plus, les points limites seront monitorés régulièrement afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux
Choix des espèces
Les souris C57BL6/J ont été choisies, car leur sensibilité à P. aeruginosa permet de provoquer une pneumonie tout en évitant une mortalité trop importante. Par ailleurs ce modèle a déjà été étudié au sein de notre équipe de recherche à plusieurs reprises. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 8 semaines, car c’est l’âge des souris du même modèle retrouvé dans la littérature. C’est également l’âge des souris utilisées dans de précédentes expérimentations réalisées dans notre équipe, ce qui nous permettra de conserver le même modèle d’étude pour l’interprétation de nos résultats.
Le Fingolimod, inhibiteur du métabolisme de la sphingosine 1-phosphate, comme stratégie thérapeutique pour traiter les calcifications vasculaires associées à l’insuffisance rénale chronique
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
66 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Un régime enrichi en adénine provoque une insuffisance rénale chronique, puis un régime calcique induit des calcifications vasculaires, avant l'administration de fingolimod dont l'effet immunosuppresseur entraîne souvent une baisse persistante des lymphocytes. Les rats sont tués par anesthésie terminale au pentobarbital, avec un prélèvement de sang par ponction cardiaque et une nécropsie. Le porteur affirme qu'une vérification in vivo est nécessaire pour confirmer ses résultats in vitro et espère faire du fingolimod un traitement des patients insuffisants rénaux.
Objectifs
La calcification vasculaire (CV) est un processus actif de formation osseuse par des cellules locales, notamment des cellules du muscle lisse (CML), qui se transdifférencient en cellules calcifiantes entrainant l’apparition des dépôts de cristaux de calcium dans la paroi des vaisseaux. La CV est reconnue comme une complication majeure chez les patients atteints d’une insuffisant rénale chronique (IRC) en augmentant fortement leur morbidité dû à l’apparition des complications cardiovasculaires. Malheureusement, les mécanismes moléculaires impliqués dans la CV restent largement méconnus ainsi que des thérapies ciblées pour éviter sa progression. Nos résultats préliminaires montrent que des patients IRC sous hémodialyse avec un score modéré de calcification abdominale aortique, ont la concentration sérique de la sphingosine 1 phosphate (S1P), un lidpide bioactif, significativement augmentée par rapport aux patients sous hémodialyse sans calcifications. Nous retrouvons également cette augmentation dans le sérum d’un modèle murin d’IRC avec des CV, dans un modèle ex-vivo d’aorte calcifié ainsi que dans le milieu extracellulaire d’un modèle de transdifférenciation des CML en cellules calcifiantes. De plus, nous avons impliqué plusieurs partenaires de la voie métabolique de la S1P, dans le processus de transdifférenciation des CML en cellules calcifiantes. Le but de ce projet de recherche est de déterminer si l’inhibition générale du métabolisme de la S1P avec l’immunomodulateur fingolimod a des effets délétères dans la calcification des aortes de nos modèles in vivo et ex vivo ainsi que dans la transdifférenciation des CML d’origine vasculaire en cellules calcifiantes.
Bénéfices attendus
Notre objectif est d’apporter une contribution importante dans la compréhension de la physiopathologie des CV associées à l’IRC ; l’axe S1P étant potentiellement impliqué dans la transdifférenciation des CML vasculaires ainsi que dans l’apparition et l’entretien de la calcification de l’aorte. La physiopathologie des CV associées à l’IRC est toujours méconnue et peu de données sont disponibles sur les mécanismes de la néoformation osseuse qui a lieu dans les vaisseaux. Aussi, nous allons évaluer l’impact du blocage de l’axe S1P sur les CV dans notre modèle murin d’IRC et particulièrement sur l’ossification ectopique de l’aorte. Le fingolimod, que nous utilisons dans ce projet comme inhibiteur général de la voie de la S1P, pourrait agir à la fois comme un inhibiteur de la CV ainsi que comme un immunomodulateur. A terme, nos données devraient permettre de valider l’intérêt thérapeutique de l'inhibition du métabolisme de la S1P pour prévenir ou traiter les CV chez des patients IRC et fournir des pistes pour améliorer la prise en charge médicamenteuse des patients, qui n’est actuellement pas entièrement satisfaisante.
Procédures
Néphrectomie chimique : Induction d'une IRC par régime enrichi en adénine (0,75% w/w). Un régime enrichi en adénine est une méthode non chirurgicale pour induire une IRC chez le rongeur (néphrectomie chimique). Les animaux seront nourris pendant 4 semaines avec un régime alimentaire A04 supplémenté avec 0,75% (w/w) d'adénine (Sigma Aldrich) Ces régimes sont produits à façon par la société SAFE (Augy, France). Le régime adénine est bien toléré par les animaux et n'induit qu'un léger ralentissement de la croissance pondérale lié à une moindre prise alimentaire résultant d'une nette différence de palatabilité entre les aliments (Skafi et al, J Cell Physiol, 2019). A l'issue du régime adénine, les animaux récupérent ce retard de croissance. Induction des CV chez le IRC - Les animaux seront nourris pendant 4 semaines avec un régime alimentaire A04 supplémenté avec 1% (w/w) de calcium et 0.9%(w/w) de phosphore (Sigma Aldrich). Ce régime est produit à façon par la société SAFE (Augy, France). Ce régime est bien toléré par les animaux et n'induit pas de manifestation observable. Ils recevront 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi) des injections intrapéritonéales de calcitriol (1,25-dihydroxycholécalciférol ou vitamine D3) (Rocaltrol, Roche) à la dose de 80 ng/kg afin de maximiser la fixation du calcium alimentaire. Le calcitriol est dilué dans du propylène glycol (injection 0,3mL/100 g) qui est un véhicule métabolisé et dépourvu de toxicité.
Impact sur les animaux
A cause de son action immunosuppressive, l’effet secondaire le plus fréquent et le plus préoccupant du fingolimod est une lymphopénie qui s’installe chez les animaux dès le début du traitement et qui persiste, très souvent, tout au long de l’étude. Il a été démontré que dans un modèle d’arthrite induite par le collagène, 4 semaines de traitement avec le fingolimod dans l’eau de boisson à 0,1 mg/kg/jour permettent de diminuer l’incidence de la maladie et de restaurer partiellement la qualité osseuse chez le rat. En même temps, cette dose n’affecte pas le nombre de monocytes ou neutrophiles présents dans le sang périphérique. Dans un modèle murin d’Alzheimer, la même dose de 0,1 mg/kg/jour de fingolimod, également administrée diluée dans l’eau de boisson, ne modifie pas le nombre de lymphocytes par rapport au nombre total de leucocytes, même après 28 semaines de traitement. De plus, la présence du fingolimod dans l’eau de boisson, ne modifie la prise d’eau quotidienne par les animaux. Nous attendons donc du traitement avec le fingolimod à faible dose pendant 5 ou 7 semaines, des effets sur les CV, sans induction de lymphopénie. La procédure expérimentale N°1 nous servira à choisir la dose de fingolimod la plus adaptée à utiliser dans la procédure expérimentale N°2 qui ne provoque pas de lymphophénie et qui ne modifie pas a priori la prise d’eau et/ou de la norriture à cause de son gout. Dans la procédure expérimentale N°2 nous utiliserons un regime à base d’adenine pendant 4 semaines pour provoquer une IRC irreversible. Cette procédure à recemment été validé et publiée par notre équipe (Skafi et al, J Cell Physiol, 2019). Le régime adénine est bien toléré par les animaux et n'induit qu'un léger ralentissement de la croissance pondérale lié à une moindre prise alimentaire résultant d'une nette différence de palatabilité entre les aliments. A l'issue du régime adénine, les animaux récupérent ce retard de croissance.
Devenir
A la fin des procédures, tous les animaux seront euthanasiés à l'issue du protocole expérimentale par anesthésie terminale au pentobarbital sodique (60 mg/kg). Nous réaliserons également un prélevement terminal de sang par ponction cardiaque et une nécropsie (prélevement de différents tissus pour des études histologiques et biochimiques).
Remplacement
Nos résultats montrent qu’il existe un lien entre le métabolisme de la S1P et les CV dans l’IRC. Plusieurs partenaires de la voie métabolique de la S1P semblent être impliqués dans la transdifférenciation des CML en cellules calcifiantes. Des manipulations dans un modèle in vivo s’avèrent nécessaires pour vérifier nos résultats préliminaires obtenus in vitro. Le ciblage global du métabolisme de la S1P avec le fingolimod semble être une approche idéale pour l’inhibition de la calcification à la fois in vitro et in vivo. Si les résultats s’avèrent concluants, le fingolimod pourrait devenir un traitement de choix pour les patients IRC dans le but de prévenir, diminuer ou ralentir l’apparition des CV et en conséquence diminuer les accidents cardiovasculaires et la morbidité.
Réduction
La procédure expérimentale N°2 ne sera réalisée que si la procédure expérimentale N°1 donne les résultats attendus. La procédure N°1 nous permettra de vérifier que la présence du fingolimod dans l’eau de boisson ne modifie pas la prise d’eau/croquettes quotidienne par les animaux et n’induit pas une lymphopénie.
Raffinement
Les conditions d’hébergement et d’entretien des rats seront adaptés pour éviter des conditions délétères pour l’animal. Les animaux sont réceptionnés des établissements Janvier, deux semaines avant le début de l’expérimentation. La surveillance de l'environnement, fournitures et équipement auxquels les rats sont exposés est essentiel à l'entretien. L’état de bien-être est évalué quotidiennement par l’observation des signes physiologiques (perte de poids, aspects du pelage, morsures...). De la nourriture sera disposée au fond de la cage par prévention dès la période de stabulation afin de permettre aux rats de se nourrir en cas d’apparition de douleur au cours des procédures. Une couche importante de litière sera mise au fond de chaque cage, et le non enfouissement des rats étant un signe de mal-être nous y ferons attention.
Choix des espèces
Le présent protocole sera conduit sur des rats Sprague-Dawley. Les rats IRC développent en 4-5 semaines des CV lorsqu'ils sont soumis à un régime enrichi en P/Ca et qu'il recoivent des injections calcitriol. L'incidence des CV dans cette population est supérieure à 60%. Les rats Sprague-Dawley procedant de Janvier arriveront à l’animalerie avec 6 semaines et seront stabulés 2 semaines avant le début des expériences. A 8 semaines, les rats sont considerés comme jeunes adultes en ayant adquis leur maturité séxuelle à environ 6 semaines. Les rats auront un poids d’environ d’environ 200-250 g à l’arrivée à l’animalerie et de 300-350 g au début des manipulations.
Évaluation de l’effet thérapeutique du transfert adoptif de lymphocytes T humains optimisés dans le traitement de tumeurs solides humaines dans un modèle de souris immunodéficientes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris NSG immunodéficientes reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales humaines puis des injections hebdomadaires de lymphocytes T, une grosseur tumorale se développant dans le flanc. Les animaux sont tués pour des analyses post-mortem, ou plus tôt si trois signes cliniques notables ou un signe sévère apparaissent. Le porteur reconnaît que davantage d'animaux par lot serait préférable statistiquement mais retient cinq souris pour des raisons éthiques, et affirme que les cellules tumorales se comportent différemment in vitro et in vivo.
Objectifs
L’immunothérapie, devenue une thérapie de référence pour certains cancers métastatiques, consiste à améliorer les mécanismes de défenses spécifiques du patient pour éliminer la tumeur. Parmi les différentes stratégies, l'immunothérapie passive par transfert adoptif repose sur l’administration à un patient de cellules du système immunitaire reconnaissant un antigène tumoral spécifiquement exprimé par les cellules à éliminer. Des essais cliniques d’injection de lymphocytes ont déjà été réalisés et, s’ils ont montré une bonne tolérance, ils ont eu une efficacité anti-tumorale encore trop limitée. Ce programme de recherche préclinique vise à évaluer la faisabilité et l’efficacité thérapeutique, dans le traitement des cancers, de nouvelles approches d’immunothérapie passive par transfert adoptif de différents types d’effecteurs lymphocytaires T anti-tumoraux. Afin que cette étude soit la plus représentative possible de la pathologie humaine, un modèle de développement de xénogreffes de cellules tumorales et d’administration d’effecteurs lymphocytaires T humains optimisés sera établi dans les souris immunodéficientes NOD-SCID-IL-2Rγ [NSG]. Compte-tenu de la diversité importante des cancers, les différentes stratégies thérapeutiques pourront être testées dans deux modèles de cancers humains hautement immunogènes : le mélanome et le cancer colorectal. Les effecteurs lymphocytaires T humains utilisés seront des : - lymphocytes T cytotoxiques spécifiques d'antigènes tumoraux. - lymphocytes T modifiés génétiquement pour inactiver l'expression des gènes codant pour des Immune Checkpoint (IC), dont les ligands sont exprimés par les cellules tumorales préalablement injectées.
Bénéfices attendus
En conclusion, l’objectif principal de ce programme est d’obtenir, à l’aide de modèles "in vivo", des preuves de concept précliniques pouvant justifier la mise en place d’immunothérapies par transfert adoptif de lymphocytes T cytotoxiques optimisés par modification génétique visant à inactiver un ou plusieurs IC, dans le traitement des cancers. En fonction des données de faisabilité et d’efficacité obtenues, ces travaux pourront aussi permettre de prioriser le ciblage de certains de ces IC.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection sous-cutanée de 50µL de tampon PBS stérile (avec ou sans cellules) dans le flanc à J0 dans chaque procédure. Dans les procédures 2, 3 et 4, les animaux seront également soumis à des injections hebdomadaires (à partir de J7) en intraveineuse de 100µL de PBS stérile (avec sous sans cellules) pendant 3 semaines. Ces injections en elles-mêmes sont de l’ordre de la minute. La procédure d’injection des cellules tumorales dans le flanc sera réalisée sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (4%/air comprimé pour induction puis 2%/air comprimé pour le maintien).
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis aux nuisances ou effets indésirables suivants : - une douleur intrisèque à l’injection (piqûre) dans le flanc, de cellules dans un volume donné (50 à 100µL) de tampon phosphate salin. - un refroidissement des souris lors de l’anesthésie gazeuse. - le développement d’une grosseur tumorale dans le flanc est attendu.
Devenir
Tous les animaux inclus dans le protocole seront mis à mort, car des études ex-vivo seront effectuées à partir de prélèvements post-mortem effectués sur les animaux.
Remplacement
Remplacement : Les paramètres observés dans cette étude ne peuvent pas à ce jour être remplacés par des procédures "in vitro". L'évaluation chez l'homme du bénéfice thérapeutique de l’administration d’effecteurs immunitaires, nécessite le développement d'études précliniques permettant de vérifier la faisabilité de ces thérapies et de détecter la survenue de premiers effets secondaires délétères. Concernant l’immunothérapie anti-tumorale, il est établi que les cellules tumorales se comportent différemment "in vitro" et "in vivo", en terme de croissance, de résistance à la lyse et de capacité à instaurer un environnement délétère pour le système immunitaire. Notre étude permet d'évaluer l'efficacité du traitement proposé en conditions physiologiques (notamment en termes de migration de lymphocytes T injectés sur le site tumoral), et de définir les modalités optimales d’administration des effecteurs lymphocytaires. Compte-tenu de la difficulté de mise en place d’essais cliniques et de recrutement de patients éligibles, il paraît clair que les informations obtenues suite à ces travaux précliniques, couplées aux données obtenues "in vitro", auront une importance capitale lors du transfert en clinique.
Réduction
Réduction : Le nombre d'animaux a été réduit à des lots de 5 souris et les résultats seront analysés statistiquement par des tests de comparaison : test de Wilcoxon ou Mann -Whitney. D'un point de vue statistique, l'utilisation de plus d'animaux par lot semble préférable mais d'un point de vue éthique, le nombre d'animaux utilisé est réduit au minimum. Plusieurs études publiées dans notre domaine de recherche avec des modèles animaux similaires décrivent l'utilisation de 5 animaux par lot.
Raffinement
Raffinement : Pour leur confort, les animaux seront hébergés dans des cages adaptées (groupe de 5 souris par cage maximum), avec enrichissement (frisottis et/ou dôme) et accès libre à l’eau et à la nourriture. De façon à diminuer le stress, les différentes procédures seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Le bien-être des souris sera surveillé tout au long de l'étude avec une évaluation des signaux généraux (visite 3 fois par semaine en présence d’un signe clinique notable et visite quotidienne s’il y a présence de signes cliniques notables (cf annexe « gestion de la douleur »)). De plus, en présence de trois signes notables ou un signe sévère : les animaux seront mis à mort, après une anesthésie gazeuse à l’isoflurane (4%/air comprimé) par dislocation cervicale.
Choix des espèces
Les souris sont des modèles d'étude pertinents, notamment en immunothérapie anti-tumorale, de par leur facilité d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. L'utilisation préalable de ces animaux par des équipes scientifiques internationales permet à d’autres travaux de recherche de débuter avec une base solide (connaissances théoriques, modèles, équipement, ...). Le développement de xénogreffes de tumeurs humaines chez la souris nécessite l’utilisation de sujets immunodéficients (évite le rejet de greffe) tels que les souris NSG qui sont dépourvues de lymphocytes T, B et de cellules NK. Ces souris permettent la croissance de nombreuses lignées tumorales humaines et l'utilisation d'effecteurs T d'origine humaine. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (6-10 semaines) pour des raisons de maturité du développement squelettique et nerveux, facilitant non seulement le geste lié aux greffes de cellules tumorales et de lymphocytes T mais renforçant aussi la pertinence des effets thérapeutiques (transfert clinique chez des patients adultes).
Impact de l’épilepsie sur un modèle murin transgénique de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 083 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère. Des souris transgéniques Alzheimer reçoivent une injection de kaïnate pour déclencher des crises d'épilepsie, avec pour certaines l'implantation chirurgicale d'électrodes ou d'une pompe sous-cutanée, les crises pouvant provoquer des morsures de la langue et, dans moins de 10 % des cas, un arrêt cardiaque. Le porteur indique que l'euthanasie est "incontournable" pour étudier le cerveau. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle alternatif validé pour étudier ensemble épilepsie, neurodégénérescence et déclin cognitif.
Objectifs
L'association entre crise épileptique et mort neuronale (ou neurodégénérescence) a été observé à maintes reprises en clinique. Les sujets épileptiques présentent des troubles de la mémoire, de l’attention, mais aussi des déficits dans les fonctions d’exécution (comme la gestion du temps et de l'espace, l'élaboration de stratégies...). Dans la maladie d'Alzheimer, l’état de mal ou des crises épileptiques mal contrôlées pourraient servir de déclencheur. Malgré ça, à l’heure actuelle, aucune étude n’a intégré des modèles de crises épileptiques avec des modèles de la maladie d’Alzheimer. De plus, aucun mécanisme ou cible pharmacologique n’a été proposé pour limiter la progression de la maladie d'Alzheimer dans le contexte de crises épileptiques. Ce projet permettra de tester les hypothèses suivantes: 1-les crises épileptiques suffisent à déclencher de la neurodégénérescence dans le cerveau. 2-ces effets sont plus sévères avec l’âge (cette exploration est importante, à la vue de l’incidence importante et croissante des épilepsies chez les personnes âgées). 3-les crises épileptiques sont capables d’accélérer la mort neuronal dans un modèle préclinique de la maladie d’Alzheimer. Un traitement pharmacologique spécifique et adapté pourrait freiner le développement de la maladie d'Alzheimer associé à l’épilepsie.
Bénéfices attendus
En terme de santé publique, aucune étude n’a encore établi un lien de cause à effet entre une crise épileptique aigue et l’apparition de signes associés à des processus neurodégénératifs chez un même patient. Par contre, il est bien connu, qu’un état de mal épileptique peut entrainer des séquelles neurologiques à long terme. L’absence de connaissances fondamentales sur la prédiction de la trajectoire neurologique et du suivi clinique est un réel problème après l’apparition d’une première crise épileptique sans cause définie. Nous connaissons, néanmoins, l’existence d’un lien entre crises et neurodégénérescence dans la maladie d’Alzheimer car l’état épileptique a été démontré comme un facteur de risque chez l’homme. Avec cette étude, nous posons donc l’hypothèse d’un mécanisme reliant l’hyperactivité des neurones aux processus neurodégénératifs associés à la maladie d’Alzheimer. Ce projet nous permettra d’en appréhender les mécanismes fonctionnels et biochimiques sur le long terme et de tester le potentiel thérapeutique d’une nouvelle famille de molécules ciblant les principales hormones endogènes anti-inflammatoires, les glucocorticoïdes.
Procédures
Les animaux pourront être soumis à différentes interventions selon leur groupe, soit des procédures chirurgicales (< à 35 min), soit des injections intrapéritonéales, soit des analyses comportementales et enfin la mise à mort pour analyses des tissus cérébraux: implantation d'électrodes pour enregistrement d'électroencephalogramme + injection intrapéritonéale de Kainate + tests comportementaux (120 animaux) - injection intrapéritonéale de Kainate + tests comportementaux (288 animaux) - injection intrapéritonéale de Kainate (288 animaux) - implantation d'électrodes pour enregistrement d'électroencephalogramme + injection intrapéritonéale de Kainate + implantation sous cutanée d'une pompe osmotique + tests comportementaux (160 animaux) - injection intrapéritonéale de Kainate + implantation sous cutanée d'une pompe osmotique + tests comportementaux (128 animaux). Les animaux seront suivi au maximum pendant 8 semaines.
Impact sur les animaux
L'induction de l'épilepsie sur la souris engendre des décharges neuronales fortes et incontrolables. Ces crises « épileptiques », comme chez l’homme, peuvent entrainer l'animal à se blesser (morsure de la langue). Dans moins de 10 % des cas, un arrêt cardiaque peut également survenir. Si les crises devaient perdurer au dela des 2 heures suivant l'induction de l'épilepsie, une injection intrapéritonéale d’un calmant (le diazépam) permettra de diminuer l’apparition des crises. Cette injection induit une somnolence prolongée de l’animal, entrainant une possible déshydratation, qui est anticipée de façon systématique par l’injection intraperitonéale d’une solution saline stérile. Tous les tests comportementaux sont des tests non douloureux basés sur de l'exploration d'arènes ou de labyrinthes. La pose d'un implant crânien pour le suivi électroencéphalographique, ou de la pompe osmotique, peut entrainer un inconfort temporaire, et être associé à un grattage plus intense au niveau de la zone de cicatrisation.
Devenir
Dans la mesure où il sera nécessaire d’étudier l’impact des différents traitements sur le cerveau, l’euthanasie des souris est incontournable.
Remplacement
De manière très générale, il est aujourd’hui très difficile en neurosciences d’étudier le fonctionnement du cerveaux sur des modèles simplifiés et donc de remplacer l’étude sur l’animal dans sa globalité. En effet, il n'existe pas de modèles alternatifs validés pour étudier les crises épileptiques, la neurodégénérescence et le déclin cognitif (e.g., maladie d’Alzheimer) dans leur globalité.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé pour ne pas compromettre les objectifs du projet. Le nombre d'animaux nécessaire est basé sur une connaissance approfondie des modèles et de l'expérience acquise par notre équipe . Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé par un logiciel de statistique.
Raffinement
Afin de minimiser les effets du stress le jour de l'expérimentation (en particulier au moment des tests comportementaux), mais également afin de contrôler l’état général des animaux, l’animalier, et/ou l’expérimentateur, manipuleront quotidiennement les animaux et observeront leur comportement général, ainsi que leur apparence. Toutes observations anormales (comportement, poids, pelage, plaie,…) seront transmises à l’expérimentateur afin d’être traités dans les plus brefs délais et seront notés dans un tableau de suivi expérimental. Un animal sera euthanasié s’il présente, une perte de poids > à 15%, une attitude inhabituelle traduisant un mal être (prostration, agressivité...), ou l’apparition de toute altération de l’état général (altération du pelage, tumeur, excroissance, prolapsus…). Tous les tests comportementaux sont des tests non douloureux basés sur de l'exploration d'arènes ou de labyrinthes. Tous les tests seront réalisés dans une pièce dédiée et les animaux y seront placés au minimum 30 minutes avant les tests. La chirurgie sera réalisée sous anethésie générale et afin de minimiser la douleur liée à la chirurgie, un analgésique sera injecté en amont.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix au niveau international pour l’étude de la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer et de l’épilepsie. Ces études chez l’animal vigile sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements potentiels. De plus, l'utilisation d'animaux transgéniques (modèle Alzheimer) justifie également le choix de cette espèce. Une première caractérisation sera effectuée à l’âge de 3, 6 et 9 mois sur le modèle de souris Alzheimer. La caractérisation comportementale a déjà été effectuée sur ce modèle dans notre laboratoire et des déficits de mémoire apparaissent dès l’âge de 3 mois. Nous nous baserons donc sur ces résultats obtenus et sur les résultats obtenus aux âges de 3, 6 et 9 mois, pour choisir l’âge le plus pertinent afin de tester des traitements préventifs et/ou curatifs.
Génération d’anticorps monoclonaux dirigés contre des protéines virales en utilisant des souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque paire de souris reçoit deux injections d'antigène dans la patte, à douze jours d'intervalle, puis est tuée par dislocation cervicale deux jours plus tard pour prélever les ganglions poplités et en extraire les lymphocytes. Le porteur affirme qu'aucune méthode de remplacement n'existe pour obtenir des anticorps monoclonaux de souris et que les méthodes de prédiction informatique ne sont pas prouvées pour des antigènes complexes. Il retient la souris plutôt que le rat ou le lapin au motif d'un coût plus faible.
Objectifs
Le but des travaux est d’obtenir des anticorps monoclonaux de souris dirigés contre des protéines virales de polyomavirus et coronavirus. Ces travaux permettent d’obtenir des réactifs immunologiques indispensables à l’étude de ces virus et potentiellement de développer des immunothérapie. Après une semaine d’acclimatation, les souris (2 souris/ antigène) seront immunisées par voie intrapodale avec 50μl/patte de solution contenant 5 μg d’antigène et 2 μg de QuilA (adjuvant de l'immunité permettant de renforcer l'immunogénicité des protéines injectées). Après 12 jours, une seconde injection avec la meme posologie et voie d'administration sera réalisée. Les souris seront mises à mort 2 jours après la seconde injection et les ganglions poplités seront récupérés afin d’en extraire les lymphocytes. Les souris seront utilisées par paires en fonction des besoins, une paire de souris permettant de réaliser des anticorps monoclonaux pour un antigène. Ainsi, nous prevoyons un total de 40 souris pour 20 antigènes sur la periode de validité de la saisine (5 ans).
Bénéfices attendus
Le projet vise à produire des anticorps monoclonaux dans le but d'avoir des réactifs immunologiques indispensables à l’étude de ces virus. De plus, dans le cas ou ces anticorps sont neutralisants, ils pourront par la suite servir au développement de nouvelles immunothérapies dans des pathologies liées aux Polyomavirus et aux coronavirus.
Procédures
Après une semaine d'acclimatation, les souris seront immunisées par voie intrapodale avec 50μl/patte de solution comportant 5 μg d’antigène et 2 μg de QuilA (Adjuvant de l'immunité permettant de renforcer l'immunogénicité des protéines injectées) Cette intervention dure environ 1 minute. Après 12 jours, une seconde injection avec la meme posologie et voie d'administration et la même durée d'intervention sera réalisée. Les souris seront mises à mort par dislocation cervicale 2 jours après la seconde injection (duré d'intervention inférieur à 1 minute) et les ganglions poplités seront récupérés afin d’en extraire les lymphocytes.
Impact sur les animaux
La seule douleur qui sera ressentie sera celle des inoculations par voie intrapodale (aiguilles 26G). L’adjuvant utilisé n’induit qu’une inflammation légère et le volume injecté n'est que de 50 μl/patte. Au vu de la durée de l'expérimentation et de sa nature, génération d'une réponse immunitaire, les animaux n'ont aucune raison rationnelle de developper un syndrome algique suite à l'injection, il n'existe donc pas de point limite strict liée à l'immunisation . Néanmoins, toute dégradation de l’état de santé des animaux (prostration, pelage hérissé) conduira à leur euthanasie au CO2.
Devenir
Les 40 souris (2/antigène) à J14 seront euthanasiées par dislocation cervicale et prélèvement des ganglions poplités.
Remplacement
Aucune méthode de remplacement n’existe pour l’obtention d’anticorps monoclonaux de souris, l’induction d’une réponse immunitaire in vivo est nécessaire pour l’obtention de ces réactifs. Les methodes informatiques par prédiction n'ont pas encore fait l'objet de preuve de concept pour des antigènes complexes comme des particules virales.
Réduction
Le nombre de souris utilisé (N=2/ antigène) est le nombre minimum de souris requis pour l’obtention d’anticorps monoclonaux, nombre suffisant de lymphocytes.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement physique des cages d'hébergement systématique (abris en plastique rouge transparent et papier absorbant) ainsi qu'un enrichissement social (2/cage)
Choix des espèces
La souris est actuellement l’espèce de référence pour la génération d’anticorps monoclonaux. Les autres espèces utilisables, rat et lapin, sont d’un coût plus élevé. 7 semaines (incluant semaine d’acclimatation. Stade physiologique : croissance
Evaluation de l’efficacité de produits à visée antiadhérente dans un modèle de chirurgie des cornes utérines chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
96 rattes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque ratte subit une laparotomie et une chirurgie des cornes utérines pour tester des produits anti-adhérence, l'opération abdominale pouvant provoquer des douleurs post-opératoires, avant d'être tuée pour prélever ses cornes utérines. Le porteur indique utiliser les deux cornes de chaque animal pour tester deux produits et réduire ainsi le nombre de rattes. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou sur une autre espèce ne convient et que les produits ont été présélectionnés par méthode alternative.
Objectifs
Ce projet consiste à évaluer l'efficacité de produits anti-adhérence, destinés à la prévention de la formation d’adhésions intra-utérines post chirurgie. L’efficacité au niveau des cornes utérines sera réalisée en ex-vivo par imagerie médicale (scanner micro CT) et en histologie. Ces études, réalisées sur des rattes, ont pour but d’évaluer l’effet protecteur de différents produits anti-adhérence en comparaison à un produit de référence déjà présent sur le marché. Ce modèle in vivo est représentatif à la fois des adhérences observées après des chirurgies des cornes utérines chez la femme, mais également des modalités d’administration du futur produit chez le sujet traité. Les analyses par imagerie µCT permettrons d’évaluer les structures luminales de l’utérus et ainsi visualiser et localiser les potentiels adhérences. Ces analyses seront complétées par des analyses histologiques en fin de phase expérimentale.
Bénéfices attendus
Les adhésions sont une complication commune après de nombreuses chirurgies, incluant les chirurgies gynécologiques. Les adhésions post chirurgies peuvent entrainer des problèmes médicaux importants, comme l’infertilité, de la douleur chronique ou une perte de fonction. Des produits anti-adhérences peuvent ainsi aider à prévenir ou réduire le risque d’adhérences post-chirurgie en créant une barrière entre les tissues et l’organe pendant le process de réparation. Ce modèle animal permet de mimer ce qui est observer chez les femmes et ainsi tester de nouveaux produits. Ainsi, les dommages potentiellement infligés à un nombre restreint d’animaux lors de ces études sont justifiés au regard des futurs bénéfices éventuels dont pourront profiter les patientes présentant des adhérences intra-utérines.
Procédures
Tous les animaux subiront une laparotomie en vue d’une chirurgie des cornes utérines (à l’exception de l’animal contrôle chirurgie qui ne subira qu’une laparotomie) pour administration locale des produits anti-adhérence sous anesthésie générale réalisée par un chirurgien vétérinaire compétent.
Impact sur les animaux
Ce projet a pour objectif d’étudier les effets de produits anti-adhérence sur les tissus intra-utérins post-chirurgie. La chirurgie abdominale (laparotomie) peut entrainer des douleurs post-opératoires. Une surveillance poussée des plaies abdominales et l’utilisation d’analgésiques est donc prévus pendant la durée nécessaire au rétablissement des animaux.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de la phase expérimentale afin de prélever les cornes utérines et analyser les adhérences des tissus post-mortem via des analyses d’imagerie à rayons X et histologiques.
Remplacement
L’étude in-vivo chez le rongeur est la meilleure alternative en en termes de modèle chirurgical et de sélection de nouveaux produits candidats. La procédure expérimentale décrite dans le présent projet ne dispose pas de modèle in-vitro ou in-vivo sur une espèce alternative. Les produits tests ont été préselectionnés par méthode alternative in-vitro.
Réduction
L’utilisation des 2 cornes utérines de chaque ratte permet d’administrer 2 traitements différents par animal, ce qui permet d’optimiser l’utilisation de l’organe et ainsi réduire le nombre d’animaux nécessaire pour atteindre des données scientifiques robustes.
Raffinement
Afin d’éviter les phénomènes d’automutilation qui peuvent survenir suite à la chirurgie, une période d’acclimatation est prévue. Les animaux bénéficieront de 12 jours d’acclimatation minimum dont une période d’habituation de 7 jours minimum permettant aux groupes sociaux de se faire plusieurs jours avant la chirurgie. De plus, une surveillance accrue et quotidienne des rattes pendant 7 jours après la chirurgie (avec observation clinique de l’état général, observation des plaies abdominal, pesées) et l’utilisation d’analgésique pendant 3 jours après la chirurgie est prévu afin de prévenir et réduire la douleur post-chirurgicale. Des points limites adaptés à la procédure ont également été définis : - Perte de plus de 20% du poids maximum relevé dans l'étude, - Un état général de l'animal altéré associant différents signes cliniques (poil hérissé, dos vouté, prostration, perte de mobilité rendant l'abreuvement ou alimentation difficile, détresse respiratoire particulièrement si elle est accompagnée d’un écoulement nasal et/ou de cyanose, saignement ou écoulement purulent d’un orifice, écoulement au niveau des yeux, ataxie, tremblement) à l'appréciation des personnels en charge des animaux. - En soins post-opératoire : infection et/ou un gonflement de la zone opérée non compatible avec le comportement normal de l'animal, gonflement de la cicatrice, extériorisation d'organes par rupture de points.
Choix des espèces
Le rat est une espèce couramment utilisée pour réaliser des modèles chirurgicaux. En effet, l’anatomie du rat est bien connue et sa taille facilite les analyses histologiques et d'imagerie par rapport à des plus petites espèces. De plus, il s'agit d'un animal couramment employé en expérimentation animale, permettant ainsi d'une part de gérer plus facilement son bien-être au cours de l'étude et d'autre part de travailler sur des lots homogènes (âge et sexe fixés). De plus, c’est une espèce largement décrite dans la littérature pour la recherche sur les adhésions utérines et les traitements associés. Des rattes adultes seront utilisées dans ce projet pour avoir des utérus matures.
Apports postnataux en gangliosides : effets sur l’absorption intestinale des oméga-3 et leur incorporation dans la rétine.
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
96 rats vont être utilisés, tués au sevrage vers le vingt-et-unième jour, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les ratons sont nourris à la pipette chaque jour de leur quatrième au vingt-et-unième jour de vie, puis reçoivent un gavage intragastrique de marqueurs suivi d'un prélèvement de sang à la queue. Le porteur reconnaît que le gavage peut induire de rares fausses routes et que la prise de sang provoque une douleur qu'il qualifie de légère. Il affirme que seul un modèle animal rend compte de la complexité des fonctions en jeu, les retombées visant les formulations infantiles.
Objectifs
Les gangliosides sont des composants majeurs des membranes plasmiques, notamment des cellules intestinales, dont la composition varie au cours du développement. Ils régulent leurs propriétés et divers évènements de signalisation. En particulier, ils servent de récepteurs aux virus, bactéries et toxines et sont ainsi impliqués dans la mise en place de l’immunité intestinale chez le jeune. Très peu de données concernent leur rôle dans la fonction absorptive. Seul un travail ex vivo semble indiquer que les gangliosides favoriseraient l’absorption intestinale des lipides (Birecki, 2006). Les gangliosides sont naturellement présents dans l’alimentation, en particulier le lait maternel dont les composants bioactifs sont connus pour influencer la maturation intestinale et la mise en place de la fonction absorptive. Parmi les nutriments dont l’absorption intestinale est particulièrement critique en période post-natale figurent les acides gras polyinsaturés oméga-3. La rétine est un tissu particulièrement sensible aux apports alimentaires en période périnatale, notamment en oméga-3 qui sont fondamentaux pour le bon développement des fonctions visuelles. Chez l’enfant, des études cliniques ont montré que la consommation de formulations infantiles pauvres en acide linoléique et dépourvues en acide docosahexanoique (DHA) du fait de l’origine végétale des lipides, conduisait à une baisse d’environ 40% des taux de DHA dans le système nerveux et les globules rouges associée à une baisse significative de l’acuité visuelle et un retard de maturation des photorécepteurs (cellules rétiniennes en charge de la conversion du signal lumineux en signal nerveux) et une baisse significative de l’acuité visuelle ont été montrés, en comparaison des nouveau-nés allaités. Nous formulons l’hypothèse que les gangliosides apportés en période postnatale pourraient jouer un rôle dans la maturation intestinale et moduler l’absorption lipidique, notamment des oméga-3, favorisant ainsi leur incorporation dans la rétine. L’objectif de ce projet est de déterminer l’impact des apports postnataux en gangliosides sur les capacités d’absorption intestinale des oméga-3 et les conséquences sur leur incorporation dans la rétine.
Bénéfices attendus
Ces travaux permettront de vérifier les impacts positifs potentiels des apports postnataux en gangliosides sur les capacités de la muqueuse intestinale à absorber efficacement les oméga-3, ainsi que sur l’incorporation rétinienne des oméga-3, connus pour leurs bénéfices dans ce tissu en période de développement. De plus, mâles et femelles seront étudiés de façon à documenter un éventuel effet du sexe. Ainsi, ce projet devrait permettre de soutenir l’importance des apports en gangliosides dans le développement post-natal et le fait que les gangliosides font partie des composants bioactifs du lait maternel à considérer dans les questions de nutrition infantile. Il pourrait ouvrir la voie à des travaux visant une prise en compte des gangliosides dans les formulations infantiles et des recommandations nutritionnelles destinées aux femmes enceintes et allaitantes, à l’instar de ce qui s’est mis en place auparavant pour les oméga-3.
Procédures
Les animaux seront "biberonnées" un fois par jour entre J4 et J21, à l'aide d'une pipette souple par des solutions nutritionnelles (volumes adaptés à leur âge). Un gavage intra-gastrique de marqueurs de perméabilité intestinale suivi par un prélèvement de sang à la queue (quelques gouttes, environ 60 uL) sont prévus une seule fois dans la vie des ratons (J19/J20).
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales de ce projet sont de classe légère. Des nuisances peuvent être attendues lors du gavage intra-gastrique de la solution permettant la mesure de la perméabilité intetsinale ion vivo ainsi qu'au moment du prélèvement d'une goutte de sang à la queue pour les dosages. Le gavage intra-gastrique peut induire des fausses routes mais c'est extrêmement rare chez les ratons de 20 jours et lorsque réalisé par du personnel compétent. Le prévèlement de sang à la queue peut induire une douleur qui reste légère car la zone est peu innervée.
Devenir
Les aniamaux sont gardés en vie à l'issu de chaque procédure et seront mis à mort à l'âge du sevrage à J21/22.
Remplacement
L’objectif de cette expérimentation est d’évaluer les effets d’une supplémentation nutritionnelle post-natale sur l’accrétion lipidique de la rétine. Seul un modèle animal permet de rendre compte de la complexité des différents fonctions physiologiques qui interviennent (digestion, absorption intestinale, distribution et incorporations tissulaires). L’expérimentation animale ne peut donc pas être remplacée.
Réduction
Le nombre d’animaux a été estimé à 10 par groupe sur la base d’un calcul d’effectif à partir de données bibliographiques permettant d’estimer l’effet attendu (sur l’accrétion en oméga-3 dans la rétine mais également sur les voies mécanistiques explorées telles que la perméabilité intestinale et la mesure d’expression de transporteurs lipidiques), pour une puissance de test statistique de 90% et un risque d’erreur de 5%. Toutes les analyses seront réalisées à partir d’un seul animal. L’utilisation des mâles et des femelles dans les groupes expérimentaux valorise au maximum les animaux obtenus à la mise bas.
Raffinement
L’environnement des mères gestantes et allaitantes sera enrichi (matériau cellulosique pour le nid, tunnel, bâton à ronger). Les procédures prévues relèvent toutes de la classe de sévérité « légère » : biberonnage selon réflexe de tétée des nouveau-nés, administration orale de marqueurs de perméabilité intestinale. Les animaux seront suivis par un personnel compétent dans le respect de la charte nationale sur l’éthique de l’expérimentation animale. Les protocoles ne devraient pas entraîner de souffrance pour les animaux, cependant ils feront l’objet d’une visite quotidienne, y compris le week-end. Les points limites clairement définis conduiront à la mise à mort des animaux le cas échéant.
Choix des espèces
Le rat est une espèce couramment utilisée dans notre laboratoire et bien adaptée à nos recherches. La taille des ratons facilite la manipulation et le biberonnage. Cette espèce, en particulier la souche choisie, possède également des qualités maternelles qui participeront de la réussite de l’expérimentation. La taille des organes d’intérêts des ratons au sevrage fournira un matériel suffisant pour réaliser nos analyses. Les mères seront commandées gestantes auprès du fournisseur (J1 de gestation) et 10 d’entre elles seront gardées pendant toute la période de lactation. Les petits seront utilisés de la naissance au sevrage (J21) puisque l’expérimentation vise à déterminer les effets de la supplémentation post-natale pendant la durée de la lactation.
Evaluation de l’activité anticancéreuse de nanomédicaments à base de vecteurs synthétiques biodégradables sur un modèle de greffe sous-cutanée de cellules tumorales
- Recherche appliquée
- Cancers
221 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des souris nude immunodéprimées reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales, puis des séances d'imagerie et des administrations hebdomadaires de traitement pendant trois semaines, la tumeur pouvant métastaser et provoquer des douleurs. Les animaux sont tués une fois un point limite atteint, dont un volume tumoral dépassant 1500 mm3. Le porteur affirme que la distribution et la toxicité d'un médicament doivent être analysées dans un "organisme entier" et que les systèmes 3D existants, dépourvus de vaisseaux, ne peuvent pas remplacer l'animal.
Objectifs
Le projet global de l’équipe est de fabriquer de nouvelles formulations galéniques injectables par voie sous cutanée (SC), de type nanoppolymères contenant des molécules à visée thérapeutique dans le domaine du cancer. La plupart des chimiothérapies anticancéreuses actuelles présentent une toxicité systémique importante limitant l’augmentation des doses administrées et donc les résultats thérapeutiques. Les nanomédicaments, qui incorporent des molécules médicamenteuses dans des véhicules de taille nanométrique (milliardième de mètre), représentent un espoir important pour le traitement de cette pathologie de par leur capacité à cibler des tissus ou des cellules malades. Afin de permettre aux patients en oncologie de s'injecter en autonomie par voie sous cutanée leur chimiothérapie (i.e., Paclitaxel, PTX), 6 nanopolymeres ont été développés et ont fait preuve de résultats prometteurs in vitro (cytotoxicité, injectabilité, diffusion sous cutanée, innocuité, relargage du PTX). Des études d’innocuité permettant de vérifier que ces nanopolymères n’ont pas d’effet toxiques au niveau du tissu sous-cutané, ainsi que des études de pharmacocinétiques permettant d’évaluer la biodisponibilité du principe actif dans le sang après injection SC ont également déjà démontré des résultats prometteurs. L'objectif de cette étude est alors de tester l’efficacité anti-tumorale de ces nouveaux polymères couplés au paclitaxel en comparaison au paclitaxel standard intra-veineux (IV), ainsi que leur biodégradabilité et leur toxicité éventuelle. La définition du schéma d'administration optimal sera guidé par un modèle mathématique de type PK/PD (pharmacocinétique/pharmacodynamique). Des études de biodistribution des nanopolymères pourront être menées en parallèle afin de notamment pouvoir expliquer le différentiel d'efficacité observé.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendues sont la définition du nanopolymère et de son schéma d'administration optimaux, permettant l'administration sous cutanée du PTX chez le patient. Bien que ce projet soit effectué sur le cancer du sein, le PTX est indiqué dans bien d'autres types de cancer (bronchopulmonaires non à petites cellules, ovaire, sarcomes de Kaposi associés au sida) et donc ce nanopolymère pourra être bénéfique chez un grand nombre de patients.
Procédures
Greffe de cellules cancereuses murine sur animal anesthésié (1 greffe par animal), Imagerie sur animal anesthesié (1 fois par semaine par animal) Administration des traitements (1 fois par semaine pendant 3 semaines par animal)
Impact sur les animaux
Les animaux seront greffées de cancer du sein pouvant métastaser et donc engendred de la douleur. Les injections des tratitement se font par voie sous cutanée et et voie intraveineuse rétro orbitale, ainsi une douleur courte au site d'injection peut apparaitre. Les animaux seront anesthésiés à l'aide d'une cage à induction ce qui peut les stresser quelques minutes avant l'endormissement. La mesure quotidienne du volume tumoral sur animal vigile peut également être stressant pour l'animal.
Devenir
Pour les deux procédures, les animaux seront mis à mort une fois le point limite atteint.
Remplacement
Le développement de nouveau médicament nécessite la mise en place d’expérience chez l’animal car la distribution du médicament et sa toxicité éventuelle doivent être analysés dans un organisme entier pour tenir compte des mécanismes de défense et de métabolisation qui seront mis en place par l’organisme et qui ne peuvent pas être reproduit in vitro du fait de l’implication de nombreux systèmes biologiques (système immunitaire notamment). Il existe des systèmes 3D mais ils sont construits avec seulement deux/trois types de cellules et ils manquent de vaisseaux. Ils ne permettent pas de mimer l’extravasation des nanomédicaments et leur pénétration dans la masse tumorale. Seule une étude chez l’animal permettra de reproduire l’interaction des nanomédicaments avec les composants du sang, leur passage de la circulation vers les organes et la tumeur et ainsi d’évaluer leur efficacité thérapeutique.
Réduction
Le nombre de souris par groupe expérimental a été calculé avec un test de puissance pour s’affranchir des variations individuelles et pour garantir la validité statistique de l’étude (risque fixé à 5% et puissance à 80%). La variable de jugement principal est la taille de la tumeur avec une moyenne dans le groupe contrôle de 1.3 cm3 et dans les groupes traités de 0,9 cm3 avec un écart-type de 0,3. Le nombre a été évalué à 8 souris. Compte tenu du taux de prise de greffe qui est d’environ 80%, 20% d’animaux supplémentaires seront ajoutés à l’étude. L’analyse statistique des données sera effectuée avec un test Anova avec un post test «Bonferroni». Nous prenons comme controle uniquement les nanopolymères seuls à DMT et non à DMT et 15mg/kg. Notre projet comprend une étape de modélisation mathématique permettant de réduire le nombre de tests à effectuer pour définir les modalités d'administrations optimales. Les études de biodistribution sont faites par imagerie et sont donc longitudinales et non invasives.
Raffinement
Le bien être animal est respecté: - temps d'acclimatation de 10 jours avant toute procédure - souris hébergées en groupe - enrichissement des cages (dômes (Plast Hut) et cotons prédécoupés spécifiques/stériles (Cell Nest) (Fournisseur Safe), - prévention de la douleur(40 mg/kg/jour d'ibuprofène , réduction du stress (les manipulations telles que les administrations, biodistribution) seront conduites sous anesthésie générale et aucun stress ou souffrance particulière n’est attendue au cours des diverses étapes des tests) - définition des points limites et évaluation quotidienne (volume tumoral au-delà de 1500mm3, difficultés respiratoires importantes, prostration, atonie, défaut d'alimentation avec perte de poids supérieure à 15%, ou toute autre manifestation de comportement anormal)
Choix des espèces
Les médicaments, durant leur transport dans l’organisme, vont interagir avec les éléments du système immunitaire et être soumis à une métabolisation (hépatique, rénale, …) qui peut provoquer l’apparition de métabolites pouvant être plus ou moins actifs voire toxiques. Cette chaine de phénomènes complexes ne peut pas être modélisé ou mimée in vitro. Il est donc nécessaire de mener ces études sur des animaux vivants pour reproduire tous ces processus et évaluer la toxicité et la fraction de substance active qui arrive dans le sang. La plupart des études publiées dans la littérature concernant l’évaluation de nouveaux médicaments anticancéreux sont effectuées sur la souris. Nous utiliserons des souris nude athymiques pour la greffe de cellules tumorales humaines (SWISS nude nu/nu). Les souris nude étant dépourvues de réponse immunitaire T, elles seront dans l’incapacité de rejeter les cellules cancéreuses humaines qui seront implantées. Les données bibliographiques se réfèrent principalement à des études effectuées sur des souris de 4-6 semaines. L'utilisation d’animaux de cet âge permettra une comparaison plus aisée avec les données déjà publiées dans la littérature et permettra ainsi de mieux évaluer la performance de nos nanopolymères. De plus le cancer touche généralement une population adulte.
Evaluation préclinique sur modèle murin parkinsonien de la fonctionnalité des neurones dopaminergiques, et de l’impact de la photobiomodulation
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections d'une neurotoxine, le MPTP, destinée à provoquer des symptômes parkinsoniens modérés comme une perte de mobilité et une posture prostrée, puis une illumination proche infrarouge, avant d'être tuées pour prélever leur cerveau. Le porteur revendique la recherche d'un traitement curatif comme une nécessité tout en renvoyant les résultats de l'essai clinique en cours à quatre ou cinq ans. Il justifie le recours à la souris par le fait que le modèle MPTP est un modèle de référence déjà utilisé dans son laboratoire.
Objectifs
La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative qui touche de plus en plus de personnes. Cette maladie se traduit par des tremblements, des difficultés à se mouvoir, des troubles cognitifs et moteurs, des sautes d’humeur ainsi que des troubles de la personnalité. Elle prend naissance à cause d’un dysfonctionnement progressif des ganglions de la base situés dans le cerveau. Les traitements les plus utilisés actuellement pour limiter les symptômes sont une administration de L-Dopa, qui est un substitut de dopamine (neurotransmetteur impliqué dans la maladie), ou encore un implant cérébral (Stimulation Cérébrale Profonde). Ces 2 traitements sont pour le moment symptomatiques et ont une durée d’efficacité limitée dans le temps. Il n’y a aucun traitement curatif permettant à l’heure actuelle de guérir cette maladie. Lors des 10 dernières années, des équipes ont étudié les effets de la photobiomodulation (PBM), qui est une technique d’illumination de tissus ou d’organes par un rayon proche infra-rouge, sur le cerveau dans un contexte préclinique mettant en place des modèles animaux parkinsoniens. Les résultats sont très encourageants avec des réductions de symptômes observés sur les différentes études menées. Une étude clinique est en cours chez des patients parkinsoniens pour évaluer le potentiel thérapeutique de la PBM pour ralentir l’avancée de la maladie. Ce projet consiste à mieux comprendre les effets de la PBM, sur des souris parkinsoniennes (induits par administration d’une neurotoxine, le MPTP). L’objectif de l’étude est d’évaluer si la PBM permet de préserver la fonctionnalité des neurones impliqués dans le processus de la maladie de Parkinson. En effet, nous ne savons toujours pas si la PBM garde la fonctionnalité de ces neurones intacte. Des neurones peuvent en effet rester en vie mais ne plus fonctionner; les symptômes restent donc présents. A l’inverse, si les neurones préservés conservent ou retrouvent même partiellement une fonctionnalité, traduite par une production de dopamine les symptômes de la maladie diminuent. Pour évaluer les effets de la PBM sur la dégénérescence fonctionnelle des neurones, il est nécessaire d’étudier si les cellules préservées par la PBM sont encore fonctionnelles ou si elles perdent tout de même leur activité. Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes mis en œuvre, et donc d’adapter et d’interpréter au mieux les résultats cliniques.
Bénéfices attendus
La maladie de Parkinson est une pathologie neurodégénérative et un problème de santé public. Il n’existe pour le moment que des traitements symptomatiques possédant une efficacité limitée dans le temps. La recherche d’un traitement curatif efficace de cette pathologie est donc une nécessité. Des études préalables ont déjà permis d’identifier la photobiomodulation (PBM) comme une alternative thérapeutique permettant de préserver la survie des neurones dopaminergiques dont la dégénérescence est responsable des symptômes de la maladie. Un essai clinique est en cours et les résultats ne seront connus que d’ici 4 à 5 ans. Néanmoins, son interprétation sur l’évaluation de la maladie et les symptômes associés nécessitera d’avoir des éléments de compréhension des mécanismes mis en jeu par la PBM, et notamment de savoir si la lumière permet, en plus de la survie des neurones, de préserver leur fonctionnalité. En effet, des neurones vivants mais non fonctionnels ne produisent plus de dopamine ; si la PBM permet de restaurer (même partiellement) la fonctionnalité des neurones, on peut espérer réduire certains symptômes (recul de la pathologie). Le modèle MPTP choisi induit des symptômes modérés, permettant aux animaux de rester autonomes (mais ralentis) le temps du protocole. Ce modèle est représentatif de patients dans les premières années après le diagnostic quand il reste encore 30 à 50% des neurones dopaminergiques à préserver et/ou rendre à nouveau fonctionnels. Si les résultats démontrent que la PBM restaure une partie de la fonctionnalité des neurones, cela ouvrira la porte au traitement de patients plus avancés dans la maladie, auxquels on peut espérer redonner de la mobilité en réduisant les symptômes, et en rendant à nouveau fonctionnels la petite proportion de neurones encore présents. Enfin, cette étude ouvrira des pistes d’applications pour d’autres pathologies neurodégénératives, ou de défaut de fonctionnalité des neurones.
Procédures
Un groupe d’animaux tests de 12 individus maximum sera mis en place au début de l’étude, afin que l’expérimentateur puisse se former aux gestes nécessaires qu’il aura à effectuer lors de la réalisation de ce projet. Ces animaux seront, dans la mesure du possible, des animaux issus de procédures expérimentales précédentes afin de réduire le nombre d’animaux à utiliser pour la procédure expérimentale. Pour pouvoir être inclus dans cette nouvelle procédure, ces animaux ne devront pas avoir subi de procédures autres que légères. Une fois la procédure réellement commencée, les animaux ne seront pas manipulés avant d’avoir observé une période d’acclimatation à l’expérimentateur ainsi que d’adaptation à l’environnement (habitat et salles dans lesquelles se dérouleront les procédures). Lors de la procédure, les animaux seront soumis à 2 prises de sang sous anesthésie générale gazeuse (le sang sera prélevé dans les deux cas par la veine de la queue), comprenant des prélèvements de 0,15ml maximum, à T=0 avant les premières injections et à J=6 avant la mise à mort. Les animaux seront également soumis à 2 injections (MPTP ou sérum physiologique, d’un volume permettant de rester en dessous du seuil limite de volume d’injection chez la souris, à savoir, 100µl/10g de poids corporel et permettant d’atteindre 25 mg/kg) par voie intrapéritonéale, à T=0 et T=24h. Les volumes d’injections seront calculés pour chaque animal après la pesée de ce dernier. Pour l’illumination, les animaux seront juste maintenus par contention sous le dispositif d’illumination pendant 90 secondes (dispositif allumé ou éteint), cette intervention arrivera 4 fois, à T=0, 6, 24, et 30 h. Pour la ponction du liquide céphalorachidien, les animaux seront sous anesthésie générale et ne seront pas réveillés.
Impact sur les animaux
Les animaux seront traités avec une neurotoxine, le 1-méthyl-4phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP). Cette procédure a pour but d’induire des symptômes parkinsoniens modérés aux animaux afin de pouvoir observer les effets de la photobiomodulation (PBM), qui est ici le traitement, sur la protection des fonctionnalités des neurones dopaminergiques impliqués dans la maladie. La dose injectée de MPTP aux souris va amener des symptômes parkinsoniens modérés. Les effets indésirables attendus sont donc une perte de mobilité partielle, des troubles de la locomotion et une inactivité relative illustrée par une posture plus facilement prostrée. Le protocole expérimental est rédigé pour durer 6 jours. Ces effets seront observés dans un intervalle allant de quelques heures après la première injection de neurotoxine à T=0 jusqu’à la mise à mort à J=6, soit des effets d’une durée comprise entre 5 et 6 jours. A noter qu’il est recensé dans la littérature que le modèle MPTP peut induire une hyperthermie (augmentation de la température corporelle) fugace suivie d’une hypothermie (baisse de la température corporelle) de quelques heures. Ces observations sont recensées sur certaines souches de souris, mais aucune de ce genre n’est recensée sur la souche de souris utilisée ici. Néanmoins, un suivi de la température corporelle des animaux sera mis en place dans les 24 heures suivant les 2 injections de MPTP, et la température de la pièce d’hébergement sera adapté aux éventuelles variations de température corporelle des souris. Si des observations sont portées sur ces changements éventuels de températures, ils seront retranscrits dans les résultats de l’étude afin d’apporter de nouvelles informations sur ce point dans l’état de l’art du modèle murin MPTP, ce qui permettra pour des procédures futures sur cette souche de souris de prendre ces éléments en compte et donc de prendre des dispositions particulières pour améliorer le bien-être des animaux. Lors des prélèvements sanguins, l'anesthésie gazeuse est brève (quelques minutes), les animaux seront sur une plaque chauffante durant l'anesthésie et la phase de réveil, nous ne nous attendons donc pas à des effets indésirables particuliers sur les animaux. Pour éviter tout stress lors du test de comportement une phase d'habituation va être réalisée et le test Open Field n'est pas un test contraignant pour les animaux.
Devenir
Les animaux sont obligatoirement mis à mort dans cette procédure, afin de pouvoir prélever les pièces anatomiques qui permettront par la suite d’effectuer les dosages de neurotransmetteurs, de métabolites d’intérêt, et les tissus nécessaires aux coupes histologiques. La mise à mort permet donc de pouvoir prélever les cerveaux des animaux, qui sont essentiels pour pouvoir évaluer la neuroprotection, ainsi que les fonctionnalités préservées ou non par photobiomodulation des neurones dopaminergiques impliqués dans la maladie de Parkinson.
Remplacement
Les animaux seront traités avec une neurotoxine, le 1-méthyl-4phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP). Cette procédure a pour but d’induire des symptômes parkinsoniens modérés aux animaux afin de pouvoir observer les effets de la photobiomodulation (PBM), qui est ici le traitement, sur la protection des fonctionnalités des neurones dopaminergiques impliqués dans la maladie. La dose injectée de MPTP aux souris vont amener des symptômes parkinsoniens modérés. Les effets indésirables attendus sont donc une perte de mobilité partielle, des troubles de la locomotion et une inactivité relative illustrée par une posture plus facilement prostrée. Le protocole expérimental est rédigé pour durer 6 jours. Ces effets seront observés dans un intervalle allant de quelques heures après la première injection de neurotoxine à T=0 jusqu’à la mise à mort à J=6, soit des effets d’une durée comprise entre 5 et 6 jours. A noter qu’il est recensé dans la littérature que le modèle MPTP peut induire une hyperthermie (augmentation de la température corporelle) fugace suivie d’une hypothermie (baisse de la température corporelle) de quelques heures. Ces observations sont recensées sur certaines souches de souris, mais aucune de ce genre n’est recensée sur la souche de souris utilisée ici, que ce soit dans l’état de l’art ou les travaux sur ce même sujet effectués précédemment. Néanmoins, un suivi de la température corporelle des animaux sera mis en place dans les 24 heures suivant les 2 injections de MPTP, et la température de la pièce d’hébergement sera adapté aux éventuelles variations de température corporelle des souris. Si des observations sont portées sur ces changements éventuels de températures, ils seront retranscrits dans les résultats de l’étude afin d’apporter de nouvelles informations sur ce point dans l’état de l’art du modèle murin MPTP, ce qui permettra pour des procédures futures sur cette souche de souris de prendre ces éléments en compte et donc de prendre des dispositions particulières pour améliorer le bien-être des animaux.
Réduction
La procédure se déroulera sur un rythme de 12 animaux par semaine (répartis aléatoirement selon les groupes). Pour le traitement des résultats, les données seront confrontées par les tests statistiques appropriés. Au préalable, l’étude de mise au point sera arrêtée dès que les gestes nécessaires à la bonne réalisation des procédures seront acquis ; les dosages seront mis au point sur ces pièces anatomiques. Si des animaux ont été réalisés dans des conditions qui les rendent incluables dans le groupe correspondant (Contrôle + photobiomodulation), cela permettra de réduire le nombre d’animaux à utiliser pour atteindre les 12 animaux par groupes prévus initialement. Le groupe n=12 est donc déterminé en fonction de 2 choses : 1) Avoir assez d’individus au sein de chaque groupe pour pouvoir effectuer les tests mentionnés plus haut dans cet encadré de manière correcte, avec une vraie puissance statistique robuste. Ce nombre est déterminé grâce à l’état de l’art et l’expertise de l’équipe. 2) Au sein des individus, il y a n=2 souris qui sont déclarées dans cette demande d’autorisation de projet pour pallier à d’éventuels soucis d’analyses sur certains animaux au cours de la procédure expérimentale. En effet, il est admis qu’en expérimentation préclinique, la variabilité interindividuelle entre les individus inclus dans l’étude peut parfois amener des situations de non réponse à l’induction de la maladie ou une non réponse au traitement testé. De plus, des conditions d’hébergement et de manipulation identiques peuvent amener de temps en temps un stress ou une réponse de la part des animaux totalement différente ; pouvant entraîner une impossibilité d’inclusion de l’individu en question dans les données traitées. Sans cette marge de n=2 individus, le nombre d’animaux pris en compte dans les résultats peut engendrer un sous-effectif au sein de certains groupes ce qui rendrait caduque les analyses statistiques des résultats, rendant ainsi les données et résultats obtenus inexploitables. Afin de se prémunir de ce scénario, même rare, il est déclaré ici n=12 pour chaque groupe, en accord avec la règle de REDUIRE au maximum le nombre d’animaux à utiliser.
Raffinement
Une fois les souris réceptionnées, elles seront transférées dans leurs cages propres, avec un temps d’acclimatation de minimum 7 jours avant le début des protocoles. Les zootechniciens veilleront à leur bien-être au quotidien, à leur adaptation à leur nouvel environnement ainsi qu’à la nourriture et la boisson. Un enrichissement de leur milieu de vie sera mis en place pour assurer le bien-être des souris (tunnels en carton, « nids » en coton etc). Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligée aux animaux, ces derniers seront parfaitement habitués aux manipulations et bénéficieront d’une surveillance quotidienne. Les conditions d’hébergement des animaux respecteront strictement toutes les normes relatives au bien-être animal en vigueur. Nous n’attendons pas de gêne ou de douleur induite par le protocole d’illumination. Par expérience, le protocole envisagé pour rendre les animaux MPTP ne génère pas de douleur et les symptômes moteurs induits permettent à l’animal de rester autonome. Il est recensé que le modèle MPTP peut induire une hyperthermie (augmentation de la température corporelle) fugace suivie d’une hypothermie (diminution de la température corporelle) de quelques heures. Ces observations sont recensées sur seulement certaines souches de souris. Aucune observation de ce genre n’est recensée sur la souche utilisée ici. Néanmoins, un suivi de la température corporelle des animaux sera mis en place dans les 24 heures suivant les 2 injections de MPTP, et la température de la pièce d’hébergement sera adapté aux éventuelles variations de température corporelle des souris. Le seul prélèvement effectué sur les animaux impliquant un réveil est une prise de sang à T=0. Elle sera effectuée par veine de la queue selon la méthode préconisée par les instances du bien être animale. Les animaux seront sous anesthésie générale gazeuse. Les autres prélèvements se font sous anesthésie sans réveil via injection d’anesthésiques appropriés. Le vétérinaire en charge des animaux sera contacté si un animal présente une souffrance inhabituelle ; une euthanasie précoce pourra être décidée en concertation avec l’équipe de recherche, la SBEA et le vétérinaire si besoin, le tout en accord avec les observations des points limites établis (perte de poids, toilettage, singes de souffrance…)Une intervention appropriée sera prise en compte par le personnel responsable selon la situation.
Choix des espèces
Afin de standardiser nos études nous utiliserons des souris traitées au MPTP, comme dans les publications passées en revue sur ce même sujet d’étude. En effet, ce modèle fait partie des modèles de référence afin de mener des études précliniques sur la maladie de Parkinson. En plus d’être bien référencé dans la littérature, ce modèle détude est déjà utilisé lors des précédentes études sur les effets de la photobiomodulation sur la neurodégénérescence des cellules dopaminergiques de la substance noire compacta. Enfin, le modèle murin est bien connu et maitrisé au sein des laboratoires. Le mécanisme d’action de la photobiomodulation (PBM) semblant générique, les résultats obtenus via l’étude sur les souris devrait, qui plus est, bénéficier à une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeu par la PBM dans d’autres maladies neurodégénératives. La bibliographie et les études antérieures sur cette thématique, s’appuyant eux même sur la littérature et l’état de l’art existant sur les modèles murins MPTP démontrent une vraie cohérence entre la souche de souris proposée ici et le modèle d’expérimentation. En effet, avec des injections de 25 mg/kg de MPTP par animaux, sur un modèle Parkinson aigu destiné à ne durer que 6 jours, nous nous trouvons dans une fenêtre de 40 à 60 % de neurones dopaminergiques supprimés, ce qui correspond environ au stade moyen de diagnostic et de prise en charge de la maladie de Parkinson chez l’Homme. Les 2 injections espacées de 24 h à la dose de 25 mg/kg permettent une dégénérescence progressive jusqu’à 7 ou 8 jours en moyenne, avant un recouvrement d’une partie des neurones dopaminergiques. Les animaux étant mis à mort au bout de 6 jours pour le prélèvement des pièces anatomiques, le recouvrement des neurones dans ces délais chez les animaux n’est pas un problème et reste cohérent avec le modèle envisagé ainsi que l’état de l’art sur le sujet. Ce projet nécessite de travailler avec des animaux adultes afin que les résultats obtenus ne soient pas biaisés par d’éventuels processus développementaux non impliqués dans la pathologie. Dans le but d’éviter tout biais dû aux cycles hormonaux, et dans un souci d’homogénéité des résultats, des rongeurs mâles seront utilisés.