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Etude neuro-comportementale d’un modèle de souris mutante de l’autisme
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Elles reçoivent une puce sous-cutanée sous anesthésie puis passent une série de tests comportementaux, le Live Mouse Tracker sur trois jours et trois nuits, un labyrinthe en Y et un test de reconnaissance sociale, avant d'être euthanasiées par dislocation cervicale pour prélèvement des cerveaux. Le projet cherche à cerner le rôle d'un gène dans l'autisme au moyen de trois lignées mutantes. Sur le remplacement, le porteur affirme que le modèle animal reste "indispensable" et "nécessaire" pour observer l'effet du gène à l'échelle de l'"organisme entier".
Objectifs
L’autisme est un trouble neuro-développemental, dont les premiers signes sont perceptibles avant l’âge de 3 ans. Ces symptômes sont dus à un dysfonctionnement cérébral. Les personnes autistes perçoivent ainsi le monde d’une façon différente. Le TSA (Trouble du spectre de l’autisme) affecte le développement de l’enfant dans la communication, les interactions sociales et le comportement. De plus, une déficience intellectuelle (DI) peut être associée à l’autisme, avec un impact sur les capacités intellectuelles d’une manière plus ou moins importante. La déficience intellectuelle s’observe à travers des difficultés de raisonnement, d’apprentissage, d’attention, de mémorisation ou de résolutions de problèmes. Plus de 1300 gènes ont été décrits ayant une implication dans les déficiences intellectuelles et/ou le TSA, et jusqu'à présent, les études fonctionnelles ont été limitées à quelques anomalies génétiques unique. Des mutations dans notre gène d’intérêt sont identifiées chez des individus mâles présentant des TSA et une récente étude montre que 23 patients avec des mutations de ce gène présentaient un retard de développement global léger à modéré et des degrés variables de déficience intellectuelle. L’objectif de notre projet est l’étude de la contribution spécifique de notre gène dans les troubles autistiques. Pour ce faire, nous utiliserons 3 modèles de souris mutantes de ce gène (3 mutations différentes) qui nous permettront de déterminer la fonction du gène en étudiant le comportemental social des souris et améliorer la compréhension de la maladie et permettre la découverte de nouvelles thérapies. Nous utiliserons le protocole Live Mouse tracker qui permet de mesurer le comportement social individuel d’animaux en groupe par détection vidéo. Nous analyserons aussi les cerveaux par imagerie IRM.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à comprendre comment les mutations de notre gène d’intérêt conduisent à des déficits dans les neurones causant la déficience intellectuelle et l’autisme. La caractérisation comportementale et anatomique des souris mutantes sera essentielle pour comprendre l'implication de ce gène dans l'autisme.
Procédures
Tous les animaux vont être soumis à l’ensemble des protocoles suivants selon l’âge: *14 semaines : implantation sous cutanée de puce pour identification de taille 2x12mm sous anesthésie générale. Durée : moins d’une minute *16 semaines : Live mouse tracker, permet de mesurer le comportement individuel d’animaux en groupe par détection vidéo. Durée : 3 jours et 3 nuits. *17 semaines : test du labyrinthe en Y, les souris explorent librement pendant 5 minutes. *18 semaines : test de reconnaissance sociale qui évalue la préférence d’une souris pour un congénère par rapport à un objet placé dans un compartiment opposé. Le test est effectué pendant 2 jours consécutifs. La durée est de 10min le premier jour et 20min le 2eme jour
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux sont liées aux procédures expérimentales qui seront appliquées aux souris à savoir l'implantation des puces RFID pour le test du LIve Mouse Tracker
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées par dislocation cervicale pour collecte des cerveaux et analyse moléculaire.
Remplacement
Une partie de l’étude de caractérisation du gène ne nécessite pas l’utilisation d’animaux vivants et est étudié in vitro sur des lignées cellulaires modifiées génétiquement. Cependant, le modèle animal reste indispensable et nécessaire pour identifier l’effet de la modification du gène à l’échelle de l’organisme entier dans le cadre du déficit intellectuel ; le système in vitro ne pouvant apporter un même niveau d’information.
Réduction
24 animaux par lignée seront nécessaires à ce projet, soit 72 souris au total (3 lignées à étudier) . L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible, et en cherchant à atteindre une puissance statistique de 80%. Le test statistique utilisé sera student-test (comparaison des mutants Vs contrôles).
Raffinement
Nous réduirons au maximum les techniques douloureuses ou stressantes. Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique, et si cette douleur devait persister, les animaux seront euthanasiés pour éviter toute souffrance. Les animaux seront pesés et observés toutes les semaines en plus du suivi quotidien habituel. Une anesthésie générale sera appliquée lors de la procédure d'implantation des puces RFID.
Choix des espèces
La souris est l'animal de choix pour les études comportementales. Notre objectif est d'étudier l’importance des mutations de notre gène d'intérêt dans les troubles autistiques et dans le déficit cognitif. De plus, aucun modèle d’expérimentation in vitro ne peut mimer ou refléter toute la complexité des phénomènes comportementaux. Les animaux seront âgés de 14 semaines environ au début des tests comportementaux, afin d'étudier des animaux adultes.
Immunothérapie anti-Galectine 9 dans le cancer du sein triple négatif: preuve de concept chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur mammaire leur est greffée à partir de cellules cancéreuses, puis elles reçoivent jusqu'à huit injections d'un anticorps, avant mise à mort au plus tard trente jours après. Le porteur décrit une perte de poids et des difficultés respiratoires possibles liées au développement de métastases. Il annonce espérer démontrer l'efficacité d'une immunothérapie et juge le modèle animal seul capable de reproduire ces mécanismes tumoraux.
Objectifs
Un des cancers du sein les plus agressifs, qui représente 15 à 20% des cancers du sein, présente un taux élevé de rechute. L’absence de thérapies spécifiques le rende difficile à traiter. Nos données montrent que les cellules de cancer du sein triple négatif résistant à une irradiation présentent de façon plus abondante une protéine particulière appelée Gal9. Cette protéine pourrait servir de cible thérapeutique pour lutter plus efficacement contre cette maladie. L’objectif scientifique de ce projet est de tester l’efficacité thérapeutique d’un anticorps ciblant Gal9 dans un modèle de cancer du sein triple négatif chez la souris. Notre projet consistera dans un premier temps à faire pousser des tumeurs à partir de cellules irradiées in vitro. Les cellules seront irradiées puis injectées dans la glande amammaire. La croissance des tumeurs sera suivie et comparée à des tumeurs issues de cellules non irradiées. La deuxième phase de notre projet dépendra de l’efficacité de notre première procédure. Elle consistera à injecter des cellules irradiées ou non irradiées à des souris et de traiter immédiatement ces souris avec un anticorps ciblant Gal9. Ce traitement devrait permettre de minimiser le développement du cancer, en particulier chez les souris dont les tumeurs expriment fortement Gal9.
Bénéfices attendus
Nous espérons démontrer l'efficacité d'une thérapie ciblant Gal9 dans ce cancer particulièrement agressif. Les patientes atteintes d’un cancer du sein triple négatif et soumises à de la radiothérapie pourraient être particulièrement éligibles à cette thérapie.
Procédures
1 Injection sous-cutanées sous anesthésie gazeuse (10 minutes) Injections intra-péritonéales sur animaux vigiles (jusqu’à 8, à raison de 2 par semaine)
Impact sur les animaux
Le développement des tumeurs pourrait s'accompagner d'une perte de poids en plus d'une gêne physique pour les animaux. Des effets indésirables liés à la présence de métastases sont envisageables ; ils se traduiraient par des difficultés respiratoires plus ou moins prononcées. La grille de points limites que nous proposons permettra de tenir compte de ces potentiels effets indésirables. En ce qui concerne l'injection d'anticorps anti-(gal9), plusieurs papiers ont déjà été publiés à ce sujet et ne montrent pas d'effets indésirables particuliers.
Devenir
Les animaux seront systématiquement mis à mort à la fin de chaque procédure, au maximum 30 jours après le début du traitement. Les raisons sont les suivantes: - le score maximum de points limites sera atteint, - les souris n'auront pas de tumeur primaire mais seront susceptibles d'avoir développé des métastases pulmonaires - les souris auront bien répondu à l’immunothérapie et l’analyse des réponses immuno-inflammatoires sera nécessaire pour l'expliquer.
Remplacement
Nous avons accumulé de nombreuses expériences sur modèles cellulaires mais nous devons maintenant tester l’utilité de notre traitement sur l’animal puisqu’il n’existe pas de modèle non animal permettant de reproduire les mécanismes complexes impliqués dans le développement tumoral et les réponses immunitaires associées.
Réduction
Un test statistique adapté a été utilisé pour calculer le nombre nécéssaire et suffisant de souris. Pour chaque condition expérimentale, un nombre de 10 souris par groupe pour un total de 70 souris.
Raffinement
L’état général des souris sera contrôlé visuellement quotidiennement en ouvrant chaque cage. Les tumeurs seront mesurées tous les 2 jours (lundi au vendredi). La grille sera également utilisée tous les 2 jours. La souffrance des animaux ne devrait pas dépasser un niveau de contrainte équivalent à l’introduction d’une aiguille. Cependant, une grille d’évaluation de la douleur, adaptée à ce projet, a été élaborée pour surveiller l’état général de l’animal, son apparence et son comportement, révélateurs du niveau de douleur. En cas d’atteinte d’un niveau défini de points limites, la mise à mort de l’animal sera anticipée.
Choix des espèces
Ce projet s’inscrit dans la continuité d’études réalisée dans des modèles développés in vitro et vise à valider la pertinence de notre travail dans le cancer du sein triple négatif. Il est essentiel de tester la pertinence de notre cible thérapeurique dans un modèle beaucoup plus complexe que des cultures cellulaires et de tester son action anti-cancéreuse. La souris est une espèce qui permet de récapituler assez fidèlement les étapes du développement du cancer du sein en intégrant les réponses des cellules de l'immunité observées chez l'humain. Le cancer mammaire est majoritairement présent chez l'adulte. Pour cette raison, nous utiliserons des souris adultes de 8 semaines.
Effets in vivo des inhibiteurs de DYRK1A sur la prolifération des cellules bêta du pancréas
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
192 rats, dont des rats rendus diabétiques, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent pendant quatre semaines un inhibiteur par injection, voie orale ou patch, avec des prélèvements sanguins hebdomadaires par section du bout de la queue et des tests métaboliques, avant d'être tués pour analyse du pancréas. Le projet vise une "preuve de concept" pour une molécule candidate contre le diabète. Le porteur n'attend "aucun effet indésirable" hormis la douleur des piqûres et des coupures de queue, et affirme qu'il n'existe "pas de méthode de remplacement".
Objectifs
Le diabète est une maladie chronique associée à une diminution de la masse des cellules β du pancréas qui sécrètent l’insuline. La régénération des cellules béta est désormais considérée comme une stratégie thérapeutique de premier plan. Au cours des dernières décennies, des études ont été menée pour identifier les cibles moléculaires pouvant être modulées afin de restaurer la masse β cellulaire et parmi elles l'enzyme DYRK1A. Nous proposons d’étudier, in vivo, un nouvel inhibiteur de DYRK1A, plus puissant et plus spécifique que ceux actuellement disponibles pour la recherche et ayant comme particularité d’être actif sous différentes voies d’administration ( intra-péritonéale, transdermique et orale). Durant 4 semaines nous administrerons, selon ces trois voies, deux doses de cet inhibiteur à deux modèles animaux, le rat Wistar non diabèrique et le rat Goto Kakizaki ( GK) diabétique. Nous analyserons par des tests in vivo l'évolution de la glycémie et de l’Insulinémie. Enfin, à l’issue des traitements, les animaux seront sacrifiés et une étude par des approches d'immunohistochimie sera menée pour analyser les aspects structurels et fonctionnels du pancréas .
Bénéfices attendus
Le bénéfice majeur de cette étude sera la livraison d'une preuve de concept solide indiquant que l’inhibiteur EMD92 est un candidat potentiel pour une pharmacothérapie ciblée sur les patients diabétiques. En plus de construire une meilleure connaissance de l'implication de DYRK1A dans la régulation de la croissance des cellules β au cours du diabète, des résultats positifs sur les rats diabétiques GK nous permettront de proposer une stratégie thérapeutique « curative », capable de prévenir la progression du diabète, grâce à la restauration d'une masse cellulaire β fonctionnelle
Procédures
Dans ce projet des rats mâles Wistar et GK âgés de 8 semaines recevront les molécules d'intérêt selon 3 voies d’administration et durant 4 semaines : -32 rats Wistar et 32 rats GK recevront une injections intrapéritonéales (IP) 1 jour sur 2, -32 rats Wistar et 32 rats GK recevront par voie orale (dans l’eau de boisson) -32 rats wistar et 32 rats GK recevront par diffusion transdermique (par patch). Un prelèvement de sang de 10 microlitres sera réalisé une fois par semaine jusqu'a la fin du traitement. A l'issue du traitement tous les animaux ( 96 rats wistar et 96 rats GK) subiront des tests métaboliques durant lesquels il recevront une injection soit de glucose pour mesurer la tolérance à cette molécule, soit d'insuline pour etudier leur sensiblité à cette hormone. Au cours du test de tolerance au glucose 4 prélèvements de sang seront faient de chacun 10 microlitres.
Impact sur les animaux
Les molécules étudiées ne sont pas censé induire de toxicité, aucun effet indésirable n’est donc attendu sur les animaux. De plus, ces molécules ne pouvant pas traverser la barrière hémato-encéphalique, aucune neurotoxicité ne devrait être observée. Par contre de legers effets indésirables pour l'animal seront liés à la piqure d'aiguille lors de l'injection en intrapéritonéale des molécules, du glucose et de l'insuline pendant les tests in vivo ainsi qu'à la coupure de l'extrémité de la queue lors des prelèvements de sang.
Devenir
Aprés le traitement à l'EMD tous les animaux sont gardés en vie. Aprés les tests métaboliques les animaux sont mis à mort.
Remplacement
Pour ce projet il n'existe pas de méthode de remplacement à celle faisant appel aux modèles animaux. Ils sont les seuls à nous permettre d'appréhender les paramètres structurels du pancréas, à savoir les interactions entre les cellules bêta et les cellules acinaires/canalaires qui entrent dans la constitution du pancréas. Le choix du rat Wistar et du rat diabétique GK pour cette étude réside dans le fait qu'il présente de grandes similitudes dans sa physiologie et physiopathologie avec celle de l'Homme
Réduction
Nous constituerons des groupes expérimentaux comportant un nombre d'animaux réduit au maximum, mais permettant de prendre en compte la variabilité individuelle de la réponse à l’inhibiteur. Les résultats seront analysés et validés par des tests statistiques adaptés : Mann-Whitney, Wilcoxon ou Anova (différences significatives P
Raffinement
Pour le traitement nécessitant une injection ainsi que pour les tests in vivo, les animaux sont préparés à la contention par les expérimentateurs. La douleur liée à l'injection est celle du niveau d'une piqure de l'aiguille. Ces méthodes sont en accord avec la classe lègère des procédures.
Choix des espèces
Le choix du rat pour cette étude réside dans le fait que cette espèce présente de grandes similitudes dans sa physiologie et physiopathologie avec celle de l'Homme. Les rats seront utilisés à l’âge adulte de 8 semaines. A cet âge, les rats GK développent le diabète et les cellules béta du pancréas sont altérées. Le traitement à l’EMD92 a pour but de rétablir cette défection en augmentant la masse béta cellulaire. Pour les rats Wistar, le traitement à l’EMD92 indiquera l’effet de la molécule sur les cellules béta d’un pancréas sain.
Evaluation d’un nouveau type d’aiguille pour la technique d’ablation percutanée par micro-ondes permettant la destruction de lésions tumorales rénales et hépatiques sur modèle porcin
- Recherche appliquée
- Cancers
5 porcs vont être utilisés, opérés sous anesthésie générale et tués sans réveil, dans des procédures classées sans réveil. Chaque animal subit huit ablations par micro-ondes, quatre au foie et quatre aux reins, avant d'être tué pour mesurer les volumes détruits. L'objectif est de vérifier les tables d'un fabricant d'aiguilles d'ablation, établies jusqu'ici sur des tissus cadavériques. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou informatique ne reproduit la perfusion des tissus vivants et juge "nécessaire" de travailler sur animal vivant.
Objectifs
Les techniques d’ablation percutanée permettent la destruction de lésions tumorales par une approche mini-invasive. L’ablation par micro-ondes présente plusieurs avantages par rapport aux autres techniques aussi bien au niveau des effets indésirables pour les patients que pour la facilité d’utilisation pour le praticien. Le principe de l’ablation par micro-ondes est de déposer localement une énergie qui induit une agitation moléculaire et donc une élévation de température significative entrainant alors une destruction cellulaire, afin d’obtenir un volume d’ablation contenant l’intégralité de la lésion plus une marge de sécurité. Pour cela, deux paramètres, la puissance et la durée d’application, sont adaptés au volume d’ablation souhaité. Il est donc nécessaire de disposer de tables fiables permettant de prévoir le volume d’ablation selon les valeurs de ces deux paramètres. La plupart des fournisseurs ne proposent que des tables basées sur des études expérimentales cadavériques, or la perfusion tissulaire (processus qui alimente les organes en nutriments et oxygène nécessaires à son activité) peut entrainer un refroidissement et donc une réduction du volume d’ablation. L’objectif de l’étude est de déterminer les volumes d’ablation réels que ce nouveau type d'aiguille permet d’obtenir au sein de foies et reins perfusés et de s’assurer de la conformité et de l’absence de variabilité entre les volumes d’ablation étalonnés par le constructeur et les volumes d’ablation réels. L'objectif in fine est d’offrir aux praticiens et aux malades de tumeurs rénales et hépatiques le traitement le plus adapté.
Bénéfices attendus
Le cancer du foie est le 6ème cancer le plus fréquent au monde et de la 2ème cause de mortalité par cancer. Le cancer du rein est le troisième cancer des voies urinaires et génitales. La technique d’ablation percutanée par micro-onde permet de traiter avec efficacité ces deux cancers. Elle est particulièrement adaptée pour les patients fragiles chez qui la chirurgie est délicate. La précision du volume d’abblation obtenu est essentiel. L’objectif de l’étude est de déterminer les volumes d’ablation réels que ce nouveau type d'aiguille permet d’obtenir au sein de foies et reins perfusés. Cela permettra de s’assurer que les tables mises à disposition par le fabricant et établis à partir de modèles cadavériques sont conformes avec la réalité. L'objectif in fine est d’offrir aux praticiens et aux malades de tumeurs rénales et hépatiques le traitement le plus adapté.
Procédures
La veille du traitement, les animaux seront mis à jeun pour la nuit. Le jour du traitement, les animaux seront placés sous anesthésie générale et sous antalgiques. A l’aide d’un guidage échographique , l’aiguille permettant de déposer localement l’énergie micro-ondes sera introduite en percutanée dans les zones à traiter : foie ou reins. Quatre ablations percutanées hépatiques et quatre ablations rénales (2 par rein) seront réalisées sur chaque animal avec différents paramètres (puissance et durée d’application). Une échographie de contraste sera réalisée à la fin du traitement pour évaluer la zone d’ablation. A la fin du traitement des 8 zones, les animaux seront mis à mort afin de récupérer les organes traités pour les analyser.
Impact sur les animaux
La procédure se fait sous anesthésie et analgésie et aucune nuisance ou effet indésirable n’est attendu au cours de ce projet.
Devenir
Les 5 porcs du projet seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever leurs foie et reins pour les analyser (mesure du volume de l’ablation et degré de nécrose).
Remplacement
Des études préalables pour évaluer la technique ont été faites sur modèles animaux cadavériques. Il n'existe pas de modèle in vitro ou de modèle simulé par ordinateur qui puissent imiter la perfusion tissulaire pouvant entrainer un refroidissement et donc une réduction du volume d’ablation. Il est donc nécessaire de travailler sur animal vivant.
Réduction
Un minimum de cinq animaux sera nécessaire pour évaluer la reproductibilité des volumes par type d’application (puissance / temps de traitement). Afin de réduire le nombre d’animaux, plusieurs applications (8 au total) seront réalisées sur le même animal car le foie et les reins du porc sont suffisamment grands pour le permettre.
Raffinement
Les porcs arriveront sur place au minimum 7 jours avant la procédure pour leur permettre de s’habituer aux lieux et ainsi diminuer leur stress. Ils seront logés par groupes sociaux afin de respecter leur comportement grégaire, dans un box sur litière de paille ou de copeaux de bois agrémenté de jouets. En cas de température inférieure à 10 degrés dans l’animalerie, un système de chauffage individuel sera activé. le personnel animalier observera deux fois par jour le comportement des animaux afin de repérer d’éventuels signes de mal-être ou de souffrance. Ces signes inhabituels seront immédiatement signalés au responsable de l’expérimentation. Les animaux qui présenteraient des signes de mal-être ou de souffrance seront soignés et si jugé nécessaire par le vétérinaire traitant retirés de l’essai. La procédure se déroulera sous anesthésie générale et sous antalgiques pour éviter des souffrances à l’animal.
Choix des espèces
Le modèle choisi est le porc, car la taille, l'anatomie et la physiologie de ses organes (foie, reins) sont comparables à celles de l'homme. Les animaux auront un poids d'environ 70 kg et auront entre 4 et 5 mois pour avoir une taille d’organes comparable à ceux des humains.
Validation de vecteurs viraux AAV pour leur capacité à traverser la barrière hémato-encéphalique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une injection intraveineuse unique de vecteurs viraux dans la queue puis sont tuées quatre semaines plus tard pour analyse, afin d'identifier un vecteur capable de franchir la barrière hémato-encéphalique. Le porteur évoque le syndrome de Rett comme application, mais l'étude porte ici sur la sélection du vecteur, non sur un traitement. Il décrit une évaluation préalable in vitro sur neurones et organoïdes, tout en jugeant la souris "indispensable et nécessaire".
Objectifs
Le syndrome de Rett est une maladie d'origine génétique définie par un trouble grave et global du développement du système nerveux central. Seules les filles sont atteintes de cette pathologie, les garçons étant très rares et mourant d'une encéphalopathie néonatale sévère. Ce syndrome entraine un polyhandicap avec déficience intellectuelle sévère et infirmité motrice, ainsi que des troubles respiratoires et cardiovasculaires. Il se manifeste par une régression rapide des acquis après 6 à 24 mois de développement normal. Aujourd’hui, une prise en charge globale des symptômes permet à ces patients de vivre plusieurs dizaines d’années, mais il n'existe malheureusement pas de traitement curatif à ce jour. La thérapie génique est une approche prometteuse, visant à corriger le gène muté MECP2. Dans ce but, on utilise souvent des virus adéno-associés (AAV) comme des transporteurs ou vecteurs pour délivrer le matériel génétique visant à corriger la pathologie. Ces vecteurs présentent une inocuité et une expression à long terme des gènes thérapeutiques dans le cerveau de rongeurs, de primates, mais aussi chez l'homme. Une injection directe dans le cerveau ne permet cependant qu'une correction localisée des cellules portant la mutation au site d'injection. Par ailleurs, les injections dans des sites multiples dans le cas des troubles neurodégénératifs peuvent potentiellement augmenter la survenue d’effets indésirables. L'objectif est ainsi de développer des vecteurs AAV pouvant être injectés par voie intraveineuse périphérique et qui soient capables de passer la barrière hémato-encéphalique. Dans le cadre de ce programme, différents types de vecteurs AAV vont être générés, évalués in vitro sur des cellules et des organoides cérébraux, puis in vivo dans un modèle de souris, afin de valider la capacité de ces AAV à passer la barrière hémato-encéphalique de manière efficace, de vérifier le tropisme cérébral et l'absence de distribution dans d'autres organes. Après identification du vecteur AAV présentant les caractéristiques optimales répondant à ces critères, celui-ci sera évalué dans un modèle de souris du syndrome de Rett, portant des mutations dans le gène MECP2, afin de valider l'effet thérapeutique (cette étude fera l'objet d'une demande d'autorisation séparée).
Bénéfices attendus
L'identification de vecteurs AAV permettant de passer de manière efficace la barrière hémato-encéphalique ouvrira la voie à de nombreuses applications de thérapie génique dans le cadre des pathologies du système nerveux central, dont ici en exemple le syndrome de Rett pour lequel aucune thérapie n'existe à ce jour.
Procédures
On pratiquera une injection des vecteurs AAV par voie intraveineuse, sur l'ensemble des animaux (160 souris), en une administration unique, à l'age de 6 semaines. Les animaux seront analysés 4 semaines après administration des vecteurs.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux sont liés à l'injection de vecteurs AAV par voie intraveineuse, tel que des saignements au site d'injection. Il y a notamment toujours une goutte de sang après chaque injection, mais c’est la preuve que l’injection est réussie et que le produit a bien été injecté dans la veine. Pour limiter les saignements, on réalise une compression immédiatement après l'injection, qui favorise ainsi l'hémostase. Dans de rares cas, l'injection IV ne réussit pas du 1er coup, auquel cas le geste est répété. Les injections se font ainsi à l'extrémité de la queue afin de pouvoir remonter le long de la veine et réinjecter le cas échéant.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés 4 semaines après l'administration des vecteurs pour procéder aux analyses post-mortem (histologiques et de biologie molculaire)
Remplacement
L'objectif de cette étude est d'identifier le vecteur AAV qui permet de passer la barrière hémato-encéphalique avec efficacité, dans la perspective de traitement par thérapie génique de pathologies du système nerveux central. La librairie de vecteurs AAV sera d'abord évaluée in vitro en culture de cellules neuronales, dans des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes (iPSC) de patients et dans des organoides cérébraux. Seuls les variants qui permettent d'obtenir les résultats in vitro les plus prometteurs seront évalués in vivo dans le modèle souris, modèle animal qui reste indispensable et nécessaire pour évaluer l'efficacité de transduction des vecteurs AAV à l'échelle de l'organisme entier, notamment dans le cadre de l'étude du passage de la barrière hémato-encéphalique.
Réduction
Dans le cadre de cette étude, nous utiliserons 5 souris par vecteur AAV et par dose, dans deux fonds génétiques différents. L'efficacité de transduction dans le cerveau, et donc de passage de la barrière hémato-encéphalique, sera évaluée par quantification du génome viral par ddPCR, et par analyse de la fluorescence sur 10 coupes sagittales de cerveau. Ce nombre de souris et de coupes sera suffisant pour définir le vecteur AAV présentant le meilleur tropisme pour le cerveau, et ce de manière qualitative / semi-quantitative, par dénombrement des cellules transduites fluorescentes. Concernant l’analyse de la fluorescence, il s’agira d’une analyse qualitative. A partir du moment où on voit un signal GFP dans le cerveau, cela signifiera qu’on a franchi la barrière hémato- encéphalique. On pourra affiner en faisant un score semi-quantitatif (rare cellules, quelques cellules, beaucoup de cellules). Concernant les quantifications du génome viral par ddPCR, nous réaliserons une analyse non paramétrique de Krustal-Wallis sur l’ensemble des groupes, suivi d’une analyse post hoc de Dunn pour les multiples comparaisons. Le seuil alpha sera de 0.05.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance de l'animal. Après les injections des vecteurs AAV par voie intraveineuse, les animaux seront observés pour s'assurer de leur bien-être et de l'absence de saignement au niveau du site d'injection. En cas de signe de souffrance, le personnel qualifié et le vétérinaire pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de l'euthanasie de l'animal.
Choix des espèces
Le modèle souris est nécessaire pour évaluer la capacité des vecteurs AAV à passer la barrière hémato-encéphalique, dans la perspective de traitement par thérapie génique de pathologies du système nerveux central. De plus, il existe des modèles de souris du syndrome de Rett, portant des mutations dans le gène Mecp2, ces modèles étant utilisés dans un 2è temps pour évaluer l'efficacité thérapeutique du vecteur AAV optimal. L'injection par voie intraveineuse sera réalisée sur des animaux de 6 semaines, où le passage de la barrière hémato-encéphalique serait le plus efficace d'après la littérature. Il s'agit aussi de l'age qui sera indiqué dans l'évaluation de l'effet thérapeutique des AAV dans les modèles de souris du syndrome de Rett (stade symptomatique similaire au stade retenu en vue d'applications en clinique humaine, chez des sujets jeunes présentant des symptomes du syndrome de Rett).
Optimisation de combinaisons de radiothérapie, chimiothérapie et immunothérapie pour un modèle murin de tumeur cérébrale orthotopique
- Recherche appliquée
- Cancers
490 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une tumeur cérébrale leur est implantée par chirurgie stéréotaxique, puis elles reçoivent radiothérapie, chimiothérapie et immunothérapie, avec un suivi par imagerie et des prélèvements sanguins, avant mise à mort. Le projet cherche à optimiser des combinaisons de traitements contre le glioblastome, dont le porteur rappelle la médiane de survie d'environ treize mois. Il juge "indispensable" de tester ces combinaisons et n'envisage qu'une étude in vivo à ce stade.
Objectifs
Les nouvelles techniques de radiothérapie (RT) permettent de délivrer des traitements hypofractionnés (avec des fractions de 3 à 15-20Gy) tout en évitant de fortes toxicités radio-induites. Depuis plusieurs années il est décrit dans la littérature que la radiothérapie modifiait le microenvironnement tumoral. La description de ces mécanismes a entrainé un intérêt à associer la RT à des immunothérapies. Cependant, jusqu’à récemment l’effet des modalités d’administration de la RT sur la réponse immunitaire n’était pas connu. L’objectif de ce projet est de décrire la réponse immunitaire radio-induite selon le fractionnement de la radiothérapie et la combinaison avec des chimiothérapies et/ou immunothérapie, pour un modèle de glioblastome orthotopique afin de pouvoir optimiser les combinaisons de traitements.
Bénéfices attendus
Le traitement standard du glioblastome en clinique n’a pas évolué depuis 2005. Pourtant cette pathologie présente une incidence de 3/100 000 habitants et la médiane de survie des patients est d’environ 13 mois. Il est donc indispensable de développer/tester de nouvelles combinaisons de traitements dans le but de les évaluer rapidement via des essais cliniques. Les combinaisons de radiothérapie et immunothérapie sont de plus en plus développé en essais cliniques pour d’autres localisations que des tumeurs cérébrales. Ces combinaisons semblent plutôt bien tolérées et pour plusieurs indications les premiers résultats sont très encourageants. Les résultats obtenus dans ce projet permettront de proposer une combinaison de RT + immunothérapie +/- CT optimisé sur le schéma de fractionnement de la RT et son effet sur la réponse immunitaire.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure de chirurgie stéréotaxique pour implantation de cellules tumorales, puis 7 jours plus tard à un traitement par radiothérapie (1 ou 4 fractions espacées de 24h - non invasif sous anesthésie) et/ou chimiothérapie (per os 5 fois par semaine pendant 3 semaines et/ou immunothérapie (intrapéritonéale 3 fois par semaine pendant 3 semaines). Le volume tumoral sera suivi par IRM ou imagerie optique à J7, J14, J21 (procédure non invasive sous anesthésie). 150 µL de sang sera prélevé à J0, J7, J14 et J21 sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Les nuisances / effets indésirables peuvent provenir de trois éléments du protocole : 1) la procédure de chirurgie intra cérébrale par technique de stéréotaxie ; 2) la radiothérapie intracérébrale ; 3) la croissance tumorale intra cérébrale. 1) La chirurgie stéréotaxique pour l’implantation des tumeurs sera réalisée selon la procédure enseignée par l’université de Strasbourg lors du DU de chirurgie intra cérébrale, et déjà utilisée par nos collaborateurs qui se sont proposés pour nous assister pour les premières injections. Une étude pilote de 10 souris est prévue afin de pouvoir affiner si besoin les points limites détaillés dans ce protocole. Ces souris bénéficieront d’un suivi plus fin (notamment durant les heures post-opératoires….). Les effets indésirables potentiels attendus lors de la procédure de chirurgies, sont: une hypothermie post opératoire, une infection post opératoire, des signes de douleurs, et d’éventuels signes neurologiques comme amaurose, ataxie, parésie, syndrome vestibulaire, convulsions. 2) Concernant la procédure de radiothérapie externe, peu d’effets indésirables sont attendus puisque ce traitement sera délivré en plusieurs faisceaux et avec une précision qui permet de délivrer la dose souhaitée sur la tumeur tout en évitant la dose reçue aux organes à risque avoisinants. Les traitements par CT et immunothérapie ont déjà été réalisés dans ces conditions sans entrainer de toxicités particulières. 3) Enfin une tumeur intra cérébrale de taille trop importante peut entrainer des symptômes tels qu’un comportement atypique, et d’éventuels signes neurologiques comme amaurose, ataxie, parésie, syndrome vestibulaire, convulsions ainsi qu’une perte de poids ou une douleur. Si des signes de douleur sont observés (animal prostré, perte d’orientation, perte de poids de plus de 20%, cf tableau annexe), les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure, selon le schéma décisionnel suivant : -Les animaux dont la greffe n’aura pas prise -Euthanasiés à des temps différents selon le planning de l’étude -Euthanasiés si points limites atteints L’ensemble des souris seront euthanasiées de la même manière : dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane.
Remplacement
A ce stade de nos connaissances, seule une étude in vivo sur des modèles animaux syngéniques (animaux pour lesquels une greffe de cellules cancéreuses d’origine murine pourra former une tumeur) de développement tumoral permettra d’analyser l’effet de l’inhibiteur de PAR1 (traitement en développement) seul et/ou combiné à la radiothérapie et/ou chimiothérapie et/ou immunothérapie sur l’efficacité thérapeutique et la réponse immunitaire. De plus, notre étude repose sur l’effet de la radiothérapie hypofractionnée (forte dose administrée à en 1 ou 4 séances) sur le recrutement de cellules immunitaires au sein de la tumeur (selon les cellules présentes elles peuvent accélérer ou ralentir l’efficacité de la radiothérapie). Le modèle animal est le seul permettant de tels objectifs impliquant la présence de plusieurs types de cellules dans une tumeur.
Réduction
Les effectifs sont justifiés par l’importante variabilité des résultats obtenus sur l’étude du système immunitaire dans l’efficacité du traitement pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre de paramètres mesurés par animal a été optimisé et nous avons privilégié les études longitudinales (avec évaluation de la croissance des tumeurs et/ou de leur composition en différents types de cellules au cours du temps après traitement). Dans une démarche de Réduction, les quantités de cellules injectées ainsi que les coordonnées stéréotaxiques utilisées pour les injections seront celles optimisées par nos collaborateurs de ce projet qui ont testé cette année plusieurs conditions et fixé les conditions optimales d’injections. Ces échanges de protocole au sein d’une collaboration nous permettent d’éviter de répéter ces étapes d’optimisation et ainsi de réduire le nombre d’animaux à utiliser, notamment dans l’étude pilote de la procédure N°1. La prise tumorale dans des souris sélectionnées est homogène permettant sur un nombre d’animaux relativement réduit de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Ainsi il faut prévoir seulement 20% (8+2 souris/groupe) d’animaux supplémentaires (pour garantir des volumes de tumeurs homogène au moment du traitement) au moment du greffage des tumeurs. L’utilisation de cellules cancéreuses syngéniques des souris (qui se sont initialement développées dans les mêmes types de souris) permet d’étudier la réponse des cellules immunitaires à la présence de cellules cancéreuses d’un même fond génétique. Afin de garantir la répétabilité et la fiabilité des résultats il est nécessaire de réaliser les expérimentations en triplicat (trois expérimentations indépendantes).
Raffinement
Les souris seront maintenues dans des cages (ayant une surface de 800 cm2 (425 x 266 x 185 mm)) de 10 individus en présence d’enrichissement. Les séances de radiothérapie seront réalisées sous anesthésie gazeuse et aucune toxicité n’est attendue aux doses utilisées. Les injections de chimiothérapies (CT) et d’immunothérapie seront réalisées sans anesthésie en intra péritonéale ou en par voie orale selon les formulations des médicaments. Les traitements par CT et immunothérapie ont déjà été réalisés dans ces conditions sans entrainer de toxicités particulières. Cependant si des signes de douleur sont observés (animal prostré, perte d’orientation, perte de poids (cf tableau annexe Points limites)), les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse. Toutes les manipulations susceptibles de générer de l’inconfort ou de la douleur (transplantation, irradiation) seront réalisées sous anesthésie générale. Les souris seront observées quotidiennement et la croissance des tumeurs évaluée régulièrement. Les symptômes seront gradés à l’aide d’une grille d’évaluation (état de stress, niveau de la douleur, poids…) et l’animal pris en charge selon le score obtenu (traitement de la douleur si nécessaire). Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin d’éviter toute souffrance des animaux.
Choix des espèces
Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans les études de l’activation du système immunitaire. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permettant sur un nombre d’animaux relativement réduit de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Ainsi il faut prévoir seulement 20% (8+2 souris/groupe) d’animaux supplémentaires au moment du greffage des tumeurs. L’utilisation de cellules cancéreuses syngéniques des souris permet d’étudier la réponse des cellules immunitaires à la présence de cellules cancéreuses d’un même fond génétique. Souris de 8 semaines minimum, âge adulte de manière à avoir un système immunitaire mature et un poids corporel plutôt stable > 20 g, ainsi qu’une bonne tolérance aux anesthésies, d’après les données de la littérature.
Fourniture de primates non-humains équipés en vue de raffiner la réalisation d’études extérieures
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles immunitaires
Macaques à longue queue : 150
Macaques rhésus : 50
Singes vervets : 50
300 primates non-humains, ouistitis, macaques et singes vervets, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, puis transférés vivants vers d'autres laboratoires. Chez un fournisseur, chaque animal subit une chirurgie sous anesthésie générale, jusqu'à deux heures, pour implanter des cathéters ou des dispositifs de télémétrie, avec douleur et inflammation à l'abdomen et aux membres et une mobilité réduite pendant sept jours. Le porteur présente cette préparation chirurgicale comme un "raffinement" bénéfique pour l'animal et le client, destiné à limiter les ponctions lors des études ultérieures. Les usages finaux, détaillés dans d'autres autorisations, ne figurent pas dans ce résumé.
Objectifs
La préparation des animaux chez le fournisseur en vue de l’utilisation chez les utilisateurs est une étape bénéfique pour l’animal et pour le client. Elle inclut l’équipement des animaux avec des dispositifs permettant de raffiner les études des utlisateurs. En effet, les dispositifs concernés permettront le suivi des paramètres physiologiques de manière non invasive ainsi que la réalisation d’administrations et/ou de prélèvements sanguins répétés en réduisant la douleur liée aux ponctions répétées.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de certaines études, le suivi des paramètres physiologiques (température, activité, ECG, pression artérielle…) est primordial non seulement en tant que variable de mesure mais également dans le cadre de l’application des points limites. L’implant de télémétrie permet de réaliser ce suivi de manière continue et non invasive sur un animal éveillé et libre de ses mouvements et représente ainsi un raffinement de l’étude. De la même manière, certaines études notament pharmacocinétiques peuvent nécessiter de nombreuses administrations ou prélèvements sanguins. L’implantation de cathéters à demeure avec chambre sous-cutanée permet de réaliser ces actes sur animal éveillé sans provoquer de douleur liée aux ponctions répétées. Ainsi, la fourniture de primates équipés permet de raffiner la réalisation d’études extérieures.
Procédures
Tous les animaux impliqués dans ce projet subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale pour l’implantation de matériel d’administration/prélèvement (durée maximum de la chirurgie: 2h) ou de monitoring des paramètres physiologiques (durée maxmimum de la chirugie 1h).
Impact sur les animaux
Stress dû à la contention et la capture, douleur et inflammation locale au niveau de l’abdomen liées à l’implantation du dispositif permettant de suivre les paramètres physiologiques de l’animal et douleur et inflammation locale au niveau des jambes liées à l’implantation des cathéters de prélèvement et d’injection. Durant 7 jours, l’animal peut présenter une réduction de la mobilité.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie après avis favorable d’un vétérinaire pour vérifier leur état de santé et autoriser le transfert des animaux chez le client réalisant l’étude.
Remplacement
Le primate est un modèle de choix pour l’étude de nombreuses pathologies, comme par exemple les fièvres hémorragiques ou encore le SIDA, mais également dans le cadre des études réglementaires de mise sur le marché de nouveaux candidats médicaments. Tous les projets des équipes partenaires dans lesquels les animaux issus du présent projet sont utilisés font l’objet d’une autre autorisation de projet où sont détaillées les raisons pour lesquelles l’utilisation des animaux et donc des primates non-humains ne peut pas être évitée.
Réduction
Le nombre d’animaux déclarés dans ce projet est seulement une estimation à la hausse mais dépendra de la demande. Notre expertise et nos compétences dans le domaine nous permettent de limiter les complications opératoires et donc le nombre d’animaux nécessaires. D'autre part, nous réutilisons des animaux issus de projets antérieurs.
Raffinement
Chaque chirurgie d’implantation est réalisée sous anesthésie générale et couverture antalgique appropriée et est supervisée par l’un des 3 vétérinaires du site. Ce projet ne nécessite pas l’isolement d’animaux, ils seront donc hébergés au minimum par paire. Un temps de récupération post-chirurgie de minimum 7 jours est laissé aux animaux avant tout transfert pendant lequel une surveillance accrue est mise en place pour vérifier l’absence de signes d’infection et de comportements anormaux évocateurs de douleur. Toutes nos animaleries font l’objet d’un planning de mise à disposition d’enrichissements adaptés à chaque espèce. Les enrichissements sont soit structurels (divers perchoirs, balançoires…), périodiques (jeux de manipulations proposés selon un rythme hebdomadaire) ou alimentaires (graines dans la litière pour fourragement, glaçons surprises, friandises…). Ce programme est supervisé par le responsable du bien-être animal du site.
Choix des espèces
A ce jour, le primate est le modèle de choix pour de nombreuses études notament dans le domaine infectieux par exemple mais également dans le cadre des études réglementaires de mise sur le marché de nouveaux candidats médicaments. Le choix de l’espèce utilisée par les équipes partenaires dépend de leurs recherches et est dûment justifiée dans chaque autorisation de projet dont elles font l’objet. Animaux jeunes sevrés et adultes (soit entre 8 mois et 30 ans), dépendant des besoins des utilisateurs. Le choix du stade de développement des animaux utilisés par les équipes partenaires dépend de leurs recherches et est dûment justifié dans chaque autorisation de projet dont elles font l’objet. Nous apportons conseil et expertise au client pour un choix pertinent face à la question scientifique posée.
Etude de validation de la diffusion d’Angiotensine II et de Phenylephrine par implantation de mini-pompes osmotiques chez la Souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
28 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une minipompe est implantée sous leur peau par chirurgie pour diffuser deux molécules provoquant une hypertension, avec des échographies sous anesthésie et des prélèvements sanguins répétés, avant mise à mort pour analyses. Le projet ne vise pas une connaissance nouvelle mais à vérifier la fiabilité du matériel servant à modéliser l'hypertension chez la souris. Le porteur juge cette étape "indispensable" pour valider ses futures études pharmacologiques.
Objectifs
Le but de ce projet est d'analyser de manière précise une modalité d'administration d'un mélange de composés utilisé chez la Souris pour modéliser l'hypertension. En effet, afin de reproduire des conditions pathologiques sur le modèle Souris, nous utilisons une diffusion continue d'une faible dose de deux molécules (Angiotensine 2 et Phenylephrine) dans la cavité péritonéale. Cette diffusion est gérée par une mini-pompe placée en sous-cutané, qui doit envoyer durant une période de 28 jours complets une concentration continue de la solution dans l'organisme afin de soumettre le système cardiaque à une surcharge vasculaire entrainant une hypertension. Ce protocole est ensuite utilisé pour modéliser les atteintes observées chez l'Homme afin d'étudier des gênes ou des composés potentiellement utilisables pour réduire ces symptomes. Néanmoins, nous avons observé dans une étude précédente que durant la dernière semaine de traitement, après le 21ème jour de diffusion, nous observions une forte réduction de l'hypertension sur une modèle génétiquement modifié. Cela nous questionne sur la durée réelle de diffusion des composés dans l'organisme. Pour répondre à ce point, nous souhaitons réaliser une étude de validation de ce protocole.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de mettre en évidence de manière robuste la variabilité expérimentale possible due au matériel employé pour modéliser l'hypertension chez la Souris. Cette étape est indispensable pour pouvoir poursuivre nos études pharmacologiques sur le modèle Souris et conclure sans équivoque sur les données générées dans ce cadre.
Procédures
Les animaux subiront plusieurs échographies pour surveiller leurs fonctions cardiaques. Elle seront anesthésiée par voie gazeuse. Des prélevements sanguins seront réalisés sur animaux vigiles ou anesthésiés selon la décision du manipulateur, afin de favoriser le bien-être de l'animal (le prélevement vigile se fait à la veine temporale superficielle et s'avère moins stressant qu'une anesthésie gazeuse couplée au prélevement au sinus orbital) Une implantation de minipompe sera réalisée sous la peau lors d'un geste chirurgical. Celui-ci sera couplé à l'utilisation d'antalgiques avant, pendant et après l'incision pour éviter toute souffrance aux souris.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une implantation sous-cutanée des mini-pompes. Celles ci restent sous la peau durant l'ensemble du projet, et ont une longeur de 3 cm et un diamètre de 0.7 cm. La chirurgie est simple et maitrisée pour cette implantation et aucune complication n'a été observée dans le projet précédent. Une couverture analgésique durant l'implantation et dans les jours suivant celle-ci, couplée à des conditions antiseptiques permettent de s'assurer du maintien des animaux dans des conditions optimales. Suite à cette implantation, les animaux effectueront une anesthésie gazeuse pour passer une échographie cardiaque chaque semaine. Celle-ci dure environ 30 minutes et les animaux se réveillent spontanément. Durant cette anesthésie, un prélevement sanguin à la veine temporale superficielle sera effectué.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem biochimiques et histologiques.
Remplacement
Etant donné que ce protocole vise à modéliser un phénomène cardiaque complet, à savoir la mise en place d'une hypertension, nous ne disposons pas actuellement de modèles alternatifs n'utilisant pas l'animal.
Réduction
Dans ce protocole, nous avons planifié d'utiliser 14 animaux par groupes expérimentaux. En effet, nos études précédentes nous ont montré que l'effectif idéal se situe entre 12 et 14 animaux par groupe expérimental selon la variabilité de la réponse au mélange pharmacologique observée. De ce fait, nous prévoyons un total de 28 animaux recevant une minipompe, pour obtenir des conclusions statistiques tout en anticipant une variabilité possible. Les données générées seront analysées par des tests paramétriques (analyse de variance et test de Student).
Raffinement
Les animaux seront hebergés dans des conditions optimales d'animalerie, en groupes, avec un enrichissement, nourriture et boisson à volonté. Les animaux recevront un antalgique par injection intra-péritonéale avant leur anesthésie. Ils auront un antalgique en post-opératoire pour couvrir les douleurs possibles lors de la cicatrisation. Lors des échographies, les animaux seront anesthésies par voie gazeuse. Chaque semaine, les animaux seront pesés et évalués pour constater leur état général et s'assurer qu'aucune dégradation de celui-ci n'est constatée. Si ce cas se présentait, un protocole spécifique serait mis en place avec une surveillance quotidienne approfondie. En cas de perte de poids supérieure à 20% sur une semaine, prostration avec vocalisation, lésion du site d'implantation, hypothermie, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
nous utilisons le modèle souris car il nous offre un accès à de nombreuses lignées génétiquement modifiées et que le système cardiaque peut être étudié et est suffisamment proche de l'humain pour offrir une valeur prédictive dans notre approche translationnelle. Les animaux seront agés de 1 an, afin d'être dans des conditions similaires à notre étude précédente.
Restauration de la sensibilité au glucose au niveau de la veine porte – réduction de la dose efficace
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
6 porcs miniatures vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie puis des séances d'imagerie au fil d'une succession de cinq procédures dont la dernière est terminale, pour tester une substance censée moduler la détection du sucre près du foie. Le porteur présente le diabète de type 2 comme concernant environ 500 millions de personnes et annonce une "solution thérapeutique innovante". Il justifie le recours au porc par sa taille proche de l'humain et l'impossibilité de reproduire in vitro la régulation de la glycémie sur un "animal entier".
Objectifs
Le projet vise à définir la dose minimale d’une substance susceptible de moduler la manière dont le système de détection de l’arrivée de sucre situé à proximité du foie renseigne le cerveau après le repas. L’objectif final est de traiter le diabète de type 2 en limitant les effets secondaires néfastes qui sont malheureusement classiques avec les thérapeutiques actuelles. Le modèle retenu est celui du porc miniature car il développe spontanément un des permisses du diabète de type 2 lorsqu’il est soumis à un régime alimentaire pléthorique. De plus, la taille de l’animal permet un abord chirurgical identique à celui qui sera réalisé à terme chez l’homme. Enfin, sa taille est adaptée à une imagerie du système de détection de l’arrivée du sucre.
Bénéfices attendus
Le bénéfice prévu vise à disposer d’une solution thérapeutique innovante pour le traitement du diabète de type 2. Cet objectif est réaliste car nous avons préalablement mis en évidence les mécanismes qui conduisent à la réduction d’efficacité du système de détection de l’arrivée de sucre. Cette réduction est parallèle à la survenue de la réduction de l’efficacité de l’insuline - un phénomène connu comme étant la prémisse de l’établissement du diabète de type 2. Cette cascade survient, en l’absence de prise de charge, chez tous les patients au cours de l’apparition du diabète de type 2, c’est à dire environ 500 millions de personnes dans le monde par an.
Procédures
Pour ce projet, 6 animaux seront utilisés sachant que les données sur des animaux témoins ont déjà été obtenus dans le cadre d’un projet antérieur. Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale dont la durée interventionnelle est de 10 minutes. Les animaux subiront également des imageries (2 imageries par animal) pour évaluer l’efficacité de la thérapeutique. Ces animaux sont produits à cet effet dans une structure agréée qui tient compte de l’éthique animale et assure l’élevage et le suivi quotidien des animaux dans les meilleures conditions de bien-être conformément à la législation et à la règle des 3R.
Impact sur les animaux
Ce projet sera réalisé́ en s’assurant qu’aucune angoisse, douleur ou souffrance inutile ne soit ressentie lors de toute intervention sur les animaux. Une observation quotidienne et une interaction positive quotidienne avec les animaux sera effectuée pour s’assurer de leur bien-être. En cas d’effet inattendu, les traitements appropriés seront mis en œuvre en accord avec les responsables du bien-être animal de notre établissement utilisateur.
Devenir
Ce projet correspond à la succession temporelle de 5 procédures - les 4 premières conduisant à la réutilisation de l’animal pour la procédure suivante, la cinquième et dernière étant terminale. A la fin de chaque procédure, les animaux seront suivis par un vétérinaire pour décider d’enclencher la procédure suivante. Trois procédures sont de classe légère, une procédure de classe modérée (chirurgie) et une sans réveil.
Remplacement
Les procédures ne peuvent être faites que sur l’animal entier car la régulation de la glycémie est liée à une série de réponses biologiques non reproductibles intégralement in-vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux est volontairement réduit car les données sur les animaux témoins ont déjà été obtenues dans le cadre d’un projet antérieur. Cette réduction significative du nombre d’animaux n’induit donc pas une réduction de la significativité statistique alors qu’elle divise par deux le nombre d’animaux impliqués.
Raffinement
Des points limites sont fixés au préalable, et un suivi des animaux est effectué́ de façon très régulière. Les procédures chirurgicales et d’imagerie ont été́ conçues et validées par un vétérinaire en incluant une valence analgésique forte. Les méthodes d’imagerie sont les plus sophistiquées possible à ce jour indépendamment de l’espèce utilisée. La méthode chirurgicale est reconnue comme celle produisant les suites post-opératoires néfastes les plus limités possibles.
Choix des espèces
Le porc s’impose comme un modèle privilégié pour les études en nutrition et neurosciences. En contexte nutritionnel délétère, le miniporc adulte développe une obésité similaire à la pathologie humaine. Les animaux seront des jeunes adultes lorsque leur croissance aura atteint un plateau i.e. > 1,5 an. Ceci se justife par le fait que la condition visée par notre solution thérapeutique est celle de l'obésité chez l'adulte
Elevage d’un modèle murin de dysplasie spondyloépiphysaire congénitale (projet multi-site 2/2)
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
4 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Il s'agit d'élever et de faire se reproduire par fécondation in vitro une lignée porteuse d'une forme de nanisme, les femelles recevant des hormones de superovulation puis étant tuées pour prélever leurs ovocytes, les mâles étant tués pour leur sperme. Les animaux porteurs de la mutation expriment eux-mêmes un phénotype pathologique avant d'être sacrifiés. Le porteur affirme que le projet "ne peut pas se faire sans modèle animal" pour valider un futur traitement, et décrit le choix du rongeur par son faible coût de reproduction.
Objectifs
Le but de ce projet est de produire des lots par fécondation In Vitro (FIV), après maintien et superovulation d'un modèle murin de dysplasie spondyloépiphysaire congénitale (lignée SEDc). la collagénopathie de type 2 la plus fréquente. Ces lots seront utilisés afin de développer un traitement contre cette maladie. La SEDc est une dysplasie osseuse génétique qui cause une forme rare de nanisme chez l'être humain (1 naissance sur 100 000). Elle est caractérisée phénotypiquement par une petite taille avec un raccourcissement du tronc et du cou, induisant un risque important d'instabilité au niveau des vertèbres cervicales pouvant provoquer une paralysie. Les patients souffrent également d'anomalies au niveau de la rétine et d’une perte d'audition. Cette pathologie est due à des mutations perte de fonction dans le gène du collagène de type 2.
Bénéfices attendus
Ce projet aura des bénéfices pour l’homme à plusieurs niveaux. Actuellement, il n’existe pas pour cette maladie de traitements qui restaurent une croissance osseuse et qui permette donc aux patients de grandir mais surtout qui élimine les complications dues à cette pathologie. Ce projet pourra donc offrir à long terme des solutions thérapeutiques pour soigner cette maladie. De plus, cette maladie étant encore peu connue, ce projet permettra à court terme de mieux comprendre sa physiopathologie grâce au modèle de souris malades.
Procédures
Les femelles seront injectées avec des hormones qui vont stimuler leurs production d’ovocytes. Ces femelles seront ensuite euthanasiées pour récupérer les ovocytes. Ils seront utilisés pour une FIV avec du sperme récolté à partir d'un mâle qu'il est nécessaire de mette à mort également.
Impact sur les animaux
Avant de réaliser les injections d'hormones et de sacrifier les animaux pour prélever les ovocytes et le sperme, les souris SEDc seront hébergés pendant une à deux semaines et pourront exprimés un phénotype plus ou moins modéré. Ensuite, les femelles de ce projet seront injectées avec des hormones puis seront euthanasiées afin de prélever les ovocytes qui serviront pour les FIV. Les mâles seront également sacrifiés pour prélever le sperme. Avant le prélèvement de sperme et d’ovocytes, une attention particulière sera apportée à chacun des animaux qui seront surveillés quotidiennement. Les animaux seront évalués sur leur aspect physique, leur comportement et leur poids selon une grille d’observation spécifique à ce projet.
Devenir
Tous les animaux seront sacrifiés pour prélever les ovocytes et le sperme afin de réaliser des fécondations in vitro.
Remplacement
Ce projet ne peut pas se faire sans modèle animal car avant de pouvoir envisager un traitement, et de commencer une étude clinique sur les patients souffrant de SEDc, il est nécessaire de démontrer que les molécules choisies ont l'effet attendu au niveau du modèle animal de la maladie et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.
Réduction
Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins finaux. Le nombre d’animaux est calculé selon les protocoles expérimentaux de manière à obtenir le minimum d’animaux par groupe permettant des résultats significatifs et homogènes. Des analyses statistiques ont pour cela été utilisées. De plus, et afin d'optimiser les rendements de la superovulation et des FIV, la dose optimale et l'âge des femelles ont préalablement étés définis pour chaque souche en effectuant des injections préliminaires dose-réponse et par expérience.
Raffinement
Les points limites sont observés pendant toute la durée du projet. Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille d’évaluation spécifique au modéle. Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages contenant un enrichissement minimum (bâtons de bois et matériel de nidification).
Choix des espèces
Le répertoire comportemental des rongeurs correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles animaux simples à élever, relativement peu coûteux à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Ils sont un modèle de choix pour les études précliniques en raison de leur petite taille, de leur courte gestation, de leur durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Le génome des souris est largement bien caractérisé et très comparable au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de celui-ci un modèle de choix fiable pour extrapoler les résultats et en tirer des résultats valables pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les demandes et les objectifs scientifiques du projet. Nous utiliserons pour ce projet des femelles âgées de minimum 3 semaines pour les donneuses d'ovocytes (idéalement de 3 à 6 semaines) et des mâles de plus de 10 semaines pour les donneurs de sperme.
Recherche translationnelle préclinique de nouvelles molécules thérapeutiques pour le traitement des maladies inflammatoires chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Rats : 1200
7 440 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent des composés candidats et des agents inducteurs par diverses voies pendant deux semaines, avec des prélèvements sanguins sous anesthésie, avant d'être tués pour prélever des tissus. Le projet vise à cribler de nouvelles molécules anti-inflammatoires dans le cadre d'un programme de recherche pharmaceutique. Le porteur annonce peu de signes cliniques hormis des inflammations locales, et affirme que le recours au modèle animal est "indispensable" une fois les molécules validées in vitro.
Objectifs
On dénombre environ 80 maladies immuno-inflammatoires telles que le psoriasis, la sclérose en plaques, la polyarthrite rhumatoïde, le lupus et les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. On estime que 5 à 8% de la population mondiale est touchée par une maladie auto-immune, caractérisée par une réponse inadaptée du système immunitaire qui se retourne contre les propres tissus du patient. Notre programme de recherche vise à découvrir des molécules qui agissent via des mécanismes d’action innovants et qui peuvent ainsi représenter des options thérapeutiques pour tous les patients.
Bénéfices attendus
L’objectif ultime est de pouvoir supprimer spécifiquement le mécanisme à l’origine d’une maladie auto-immune, sans impacter le bon fonctionnement du système immunitaire. Ces nouvelles molécules fourniront aux patients des thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices ciblées qui pourront grandement améliorer leur qualité de vie.
Procédures
Dans ce projet, les animaux recevront des agents biologiques et composés par diffrentes voies d'administration définies par la réglementation. L'administration des composés (durée = 1 min/animal) se fera 1 à 2 fois par jour sur une durée de maximale de 2 semaines. L'induction avec des agents biologiques (durée = 1 min/animal) se ferra 1 à 2 fois au cours de l'étude de 2 semaines. Un à deux prélèvements sanguins seront également effectués sur animaux préalalement anesthésiés (durée = 2-3 min/animal) pour suivre la pharmacocinétique des composés testés sur l'ensemble de l'étude de 2 semaines.
Impact sur les animaux
Les animaux ne développeront pas de signes cliniques notoires hormis des inflammations locales légères.
Devenir
Les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés pour collecte de tissus
Remplacement
L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et validées in vitro.
Réduction
Nous utilisons des modèles établis dans la littérature que nous utilisons en routine dans notre établissement utilisateur depuis 5 ans. Une analyse statistique rétrospective a permis de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe pour obtenir une distribution normale et présentent une variabilité acceptable. Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude.
Raffinement
Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 5 jours sera réalisée avant l'entrée en étude et leur environnement sera enrichi avec du materiels de nidification. Afin de pallier l'inconfort lié aux procédures, un programme d'anesthésie sera envisagé. Des analgésiques seront utilisées en cas de signes de douleur. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, une surveillance journalière et des points limites précoces et spécifiques aux modèles ont été établis conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou au sacrifice anticipé de l’animal
Choix des espèces
Les espèces animales utilisées dans le cadre de ces recherches sont la souris et le rat. Les différents modèles seront mis au point, sur la base de la littérature et sur des modèles déjà bien documentés afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour les mises au point. En accord avec la littérature pour les différents modèles, les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’évaluer les composés à visée anti-inflammatoire, sur un système immunitaire mature.
Evaluation d’additifs détoxifiants de mycotoxines spécifiques affectant l’espèce aquacole
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
5 000 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent dans leur alimentation des mycotoxines puis des additifs censés en neutraliser les effets, avec une prise de sang en fin d'étude et une mise à mort pour prélever sang, contenus intestinaux et organes. Le porteur décrit des atteintes possibles aux yeux, au système digestif, au foie et aux reins, une nage anormale et une perte de poids. Il affirme qu'il est "indispensable" de tester ces additifs sur l'espèce destinataire pour en démontrer l'efficacité auprès de l'autorité européenne, la finalité restant la performance des élevages.
Objectifs
Le projet s'étend sur 5 années dans le but de réaliser des études d'efficacité avec des additifs alimentaires considérés comme bénéfiques pour atténuer les effets négatifs des mycotoxines retrouvées dans les régimes alimentaires, afin de permettre aux animaux d'exprimer au mieux leur potentiel de croissance et de maintenir leur immunité et leur bien-être. Les mycotoxines sont produites sur une large variété de denrées alimentaires avant, pendant et après la récolte. Lorsqu’elles sont présentes en trop grande quantité dans l'alimentation des animaux, une fois ingérées par l’animal, elles peuvent s'avérer toxiques, notamment chez les poissons d’élevage et peuvent avoir des conséquences sur leur santé et leurs performances. Les mycotoxines peuvent affecter très négativement les performances zootechniques et la rentabilité économique des élevages. Les mycotoxines, contaminants courants de l'alimentation humaine et animale affectant la santé et le bien-être, sont des métabolites secondaires de faible poids moléculaire secrétés par des moisissures appartenant principalement aux genres Aspergillus, Penicillium et Fusarium. Parmi les centaines de mycotoxines connues, les plus préoccupantes sont les aflatoxines, l’ochratoxine A, les trichothécènes (DON, T-2 toxin), la zéaralénone et les fumonisines. Une des stratégies de prévention aux mycotoxines est l’utilisation d’additifs fixateurs de toxines pouvant être ajoutés à l’aliment afin de réduire l’absorption intestinale des toxines en les liant ou en les transformant en produits moins toxiques. Les enzymes constituent un fixateur de toxines permettant de transformer les mycotoxines en composés moins toxiques conduisant à une amélioration des performances des animaux. Les études in vivo vont faire appel à des procédures expérimentales entrainant notamment l’utilisation de régimes alimentaires contenant des mycotoxines à des teneurs contrôlées afin d’être représentatifs des régimes alimentaires distribués en élevage aquacole. De ce fait, aucun effet négatif supplémentaire sur le bien-être des poissons ne sera engendré. Ces régimes seront distribués afin d’induire des changements sur la performance, l’ingestion, la réponse immune, l’état de santé intestinale, l’utilisation et le métabolisme des nutriments qui serviront à évaluer l’impact des additifs sur les changements induits par les mycotoxines.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront d’identifier et de mieux appréhender le fonctionnement et l’efficacité de molécules à détoxifier des contaminants courants de l’alimentation des animaux et par conséquent à améliorer la nutrition et la santé animale. En effet, l'un des principaux défis de la détoxification des denrées alimentaires et des aliments pour animaux, et en particulier des mycotoxines, est la spécificité de l’additif détoxifiant à éliminer ou à neutraliser efficacement l'effet toxique du contaminant de l'aliment sans produire d'autres métabolites dangereux et, d'autre part, à ne pas altérer et, idéalement, améliorer les valeurs nutritionnelles de l'aliment. Une diversité de réponses physiologiques peut être observée en fonction de la nature des mycotoxines, de leur concentration et des espèces de poissons qui les ingèrent. Ce projet contribuera à caractériser l’efficacité de chaque additif utilisé en prévention aux mycotoxines sur les changements induits an niveau des performances, de l’ingestion, de la réponse immune, de l’état de santé intestinale, et de l’utilisation des nutriments.
Procédures
Prises de sang unitaires au niveau de la veine caudale en fin d’étude (pas plus de 10% du volume sanguin circulant estimé à 40 ml/kg de poids corporel est prélevé en une seule fois, soit 100 µl pour un poids estimé à 250 g)
Impact sur les animaux
Changement comportementaux (nage anormale), morphologqiues et de couleur de la peau. Perte de poids, ralentissement de la croissance en cas de réduction de l'ingestion alimentaire (refus alimentaire) pendant toute la durée de l'étude. Dommages aux niveaux des yeux, du système digestif, hépathique et rénal.
Devenir
A la fin de chaque procédure expérimentale, les animaux sont mis à mort pour le prélèvement d'échantillons biologiques (sang, contenu intestinaux,organes).
Remplacement
La recherche expérimentale mise en oeuvre pour étudier la réponse aux mycotoxines, du groupe des fumonisines ou d'autres groupes, susceptibles d’être présentes dans les rations alimentaires des poissons, nécessite le développement de détoxifiants spécifiques comme les enzymes qui vont entrer dans la composition des aliments afin de réduire ou d’éliminer les effets négatifs des toxines chez les espèces aquatiques. Lors du processus de développement et d’enregistrements de ces additifs alimentaires, il est indispensable de tester l’efficacité des additifs développés sur l’animal auquel il est destiné, cela afin d’en démontrer l’efficacité et l’innocuité auprès de l'autorité européenne de sécurité des aliments (EFSA) qui autorisera la mise sur le marché pour l’alimentation animale dans la catégorie des substances pour la réduction de la contamination des aliments par les mycotoxines pour animaux (code EFSA 1m03). En outre, les données recueillies dans le cadre de cet essai seront utilisées pour développer des stratégies de réduction toxicologique pour les espèces aquatiques.
Réduction
Une analyse statistique, spécifique du produit à tester est réalisée en amont sur la base d’études antérieures afin de déterminer le nombre minimum d’échantillons permettant d’obtenir cette différence significative (puissance de l’expérience) et donc de réduire le nombre d’animaux à utiliser dans les différentes études à venir. De plus, le raffinement appliqué aux études limitera le nombre et la diversité des échantillons prélevés à la seule finalité de l’étude. Selon, le protocole de l’étude, le nombre de traitements, et la distribution normale ou non de la population, un test paramétrique (Fischer ; t-test, etc.), non paramétrique (Kruskal-Walli, etc.) ou une analyse de variance à un ou plusieurs facteurs seront réalisés et suivis d’un test de comparaison multiple (Newman-Keuls, Bonferonni, Duncan, etc.) permettant de classer les moyennes des différents traitements. D’autres méthodes de test statistique sont susceptibles d’être utilisées, en fonction des paramètres étudiés.
Raffinement
Avant toute manipulation (pesée ou prélèvement) au cours d’une étude, les truites arc en ciel sont sédatées à raison de 40 mg de MS-222/L ou/et anesthésiées à raison de 80 mg de MS-222/L et tamponné avec la double quantité de bicarbonate de sodium (BS) Les densités restent inférieures à 80 kg de poissons/m3. La capture et le stress dus à la sortie des bassins pour la pesée par groupe des animaux et pour les prises de sang (approche ventrale) sont réduits par une manipulation délicate des animaux par les applicateurs, un séchage modéré des poissons, le port de gants, l’utilisation d’une mousse humide pour poser l’animal sur le support de contention et d’un point de pression sur le site de prélèvement comme décrit dans le procédure interne « Geste technique sur animaux vivants : prises de sang » qui définit le volume limite de prélèvement sanguin et les périodes de récupération nécessaires. Les conditions d’hébergement des animaux sont définies de telle sorte que la densité des animaux par bassin, les paramètres environnementaux (température…) ou encore la qualité d’eau procurent le maximum de confort aux animaux, et restent supérieurs ou égaux à la législation en vigueur (Arrêté du 01/02/2013). Aucun animal ne reste isolé sans contact visuel ou tactile avec ses congénères.
Choix des espèces
Les additifs alimentaires développés sont destinés à être incorporés dans les aliments destinés aux poissons. Il peut s’agir de la truite qui fait partie de la famille des salmonidés, utilisée comme modèle pour les poissons d’eau froide. Truites : tous les stades du cycle de vie peuvent être utilisés et généralement entre 50 g et 250 g.