Recherche appliquée

576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales, des traitements par injection et des séances d'imagerie sous anesthésie, la radiothérapie pouvant provoquer une nécrose de la tumeur, avant d'être tué pour prélever la tumeur et les organes voisins. Le porteur prévoit une grille de score entraînant la mise à mort au-delà de six points ou d'un volume tumoral de 1 500 mm3. Sur le remplacement, il affirme que l'étude de la réponse immunitaire à la radiothérapie impose le recours à l'animal.

Objectifs

Le cancer est désormais la première cause de mortalité dans les pays développés, devant les pathologies cardiovasculaires. L’impact du microenvironnement tumoral, notamment la présence de cellules immunitaires agressives, sur le développement tumoral est aujourd’hui clairement établie. La présence de ces cellules immunitaires (e.g. les lymphocytes T régulateur (Treg)) favorise l’échappement tumoral qui promeut le caractère agressif et invasif des cancers. L’objectif de ce projet est de développer de nouvelles sondes théranostiques (combinant des propriétés d’imagerie et de thérapie) pour évaluer la présence de ces cellules immunitaires au sein des tumeurs au court de divers traitements (radiothérapie, immunothérapies…), et également cibler spécifiquement ces cellules pro-tumorales dans le cadre de stratégies thérapeutiques (e.g. radiothérapie interne vectorisée). Cela permettra d’adapter les traitements de façon la plus individualisée possible à chaque patient grâce à un examen non-invasif d’imagerie moléculaire.

Bénéfices attendus

Le développement de nouveaux agents d’imagerie permettra à terme de réaliser ou affiner le diagnostic chez l’homme mais également de suivre l’efficacité des traitements tout en utilisant des méthodes non invasives. Ce projet aboutira également au développement de traceurs théranostiques permettant une utilisation diagnostique et thérapeutique ciblant les Treg, acteurs majeurs de l’agressivité tumorale, de l’invasion métastatique et de la résistance aux traitements.

Procédures

Les animaux subiront des injections de cellules par voie sous-cutanée (injection unique, 5 minutes sous anesthésie). Des traitements seront également administrés à certains animaux par voie intrapéritonéale ou intraveineuse (injections quotidiennes sur 15 jours maximum, 15 secondes de contention maximum par animal). Enfin, les animaux subiront des imageries in vivo (SPECT/CT, session d’imagerie de 45 minutes sous anesthésie maximum répétée une fois par semaine sur 8 semaines maximum).

Impact sur les animaux

Les animaux porteurs de tumeurs seront observés quotidiennement et suivis 3 fois par semaine depuis l’implantation des cellules. La pousse tumorale en SC peut occasionner une gêne à la mobilité qui sera évaluée. La radiothérapie peut entrainer l’apparition d’une nécrose tumorale de surface. Généralement cette nécrose est « sèche » et n’est pas associée à de la douleur. Cependant si cette nécrose était responsable de douleur (évaluée par palpation de la tumeur nécrosée) et /ou une taille de tumeur supérieure à 1500 mm3 les souris seraient sacrifiées. Les observations faites lors de la procédure 1 permettront d’adapter les points limites pour les procédures suivantes. Toute observation anormale sera répertoriée et suivie de mesures. Les critères d’arrêt du protocole par rapport à la souffrance et les points limites seront déterminés suivant le tableau en annexe 1. Si le score obtenu est > 6 points, l’animal sera sacrifié. Des mesures proactives seront systématiquement prises en cas de score compris entre 2 et 6 : notamment une supplémentation en nourriture en gelée si une perte de poids était observée, injection sous-cutanée de sérum physiologique en cas de déshydratation, une augmentation de la fréquence d’observation des animaux si des problèmes respiratoires ou des problèmes comportementaux étaient observés.

Devenir

L’analyse du microenvironnement tumorale nécessite le prélèvement de la tumeur et des organes avoisinants. L’analyse de la biodistribution des différents traceurs radioactifs nécessite également le prélèvement de différents organes justifiant ainsi le recours à l’euthanasie de tous les animaux inclus dans ce projet.

Remplacement

Etant donné que nous allons évaluer l’effet des modalités d’administration de la radiothérapie sur la réponse immunitaire, il nous est nécessaire de réaliser notre étude sur des modèles animaux. Le REMPLACEMENT des animaux est donc impossible pour cette étude. Toutefois l’étude préalable des molécules d’intérêts sur culture cellulaire permet de s’affranchir de l’utilisation d’animaux non justifiée (REMPLACEMENT)

Réduction

En comparaison avec une étude de « classique » qui nécessite l’euthanasie des animaux à chaque point de temps examiné, l’imagerie nous permet de répéter l’imagerie à différents temps chez le même animal et donc de REDUIRE le nombre d’animaux d’autant.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans des cages de 10 individus en présence d’enrichissement. Les irradiations seront réalisées sous anesthésie gazeuse et aucune toxicité n’est attendue aux doses utilisées. Enfin, la totalité des procédures d’imagerie impliquant les animaux (injection intraveineuse, sous-cutanée et imagerie) sera réalisée sous anesthésie suivie d’un réveil sous lampe chauffante pour réduire l’inconfort potentiel à son minimum permettant ainsi le RAFFINEMENT de l’étude.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans les études de l’activation du système immunitaire. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permet, sur un nombre d’animaux relativement réduit, de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Ainsi il faut prévoir seulement 20% d’animaux supplémentaires au moment du greffage des tumeurs. L’utilisation de cellules cancéreuses syngéniques des souris permet d’étudier la réponse des cellules immunitaires à la présence de cellules cancéreuses d’un même fond génétique. C’est pourquoi les tumeurs CT26 ou 4T1 seront greffées sur des souris Balb/c et les tumeurs MC38 sur des souris C57Bl/6. Des souris de 8 semaines de manière à avoir un système immunitaire mature et un poids corporel > 20 g seront utilisées.

8 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie intracérébrale d'environ quatre heures pour l'injection d'un vecteur viral, puis six mois de suivi avec huit prélèvements sanguins, sept ponctions lombaires, six IRM et quatre électromyogrammes, avant d'être tué pour analyse histologique. Le porteur destine ces données de toxicologie à une demande d'essai clinique auprès de la FDA et de l'ANSM. Sur le remplacement, il affirme que le cerveau du primate est le plus proche de celui de l'humain et que le recours au "gros animal" est exigé par l'agence réglementaire.

Objectifs

Les vecteurs adeno associés (AAV) sont parmi les vecteurs les plus efficaces pour transporter et intégrer des gènes d’intérêt dans des parties précises du système nerveux central, en particulier, le cerveau . Les AAV constituent une voie de thérapie pour des maladies neurodégénératives, notamment la maladie de Huntington. Le but de cette étude est de completer les données de toxicologie d’évaluer la faisabilité/efficacité de l’administration par voie chirurgicale intracérébrale (IC) dans la région du cerveau qui concerne la pathologie en question, de façon à choisir le type d’AAV le plus adéquat pour une pathologie donnée.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus pour ce projet sont l'obtention de toutes les données de tolérance à long terme pour l'application immédiate en recherche clinique à la fin de cette étude afin de répondre aux demande de la FDA (Food and Drug Administration) afin d'obtenir l'autorisation pour un essai de phase I/II et ainsi traiter les patients Huntington.

Procédures

- Une procédure chirurgicale (environ 4h) - 8 prelevements sanguins, 7 prelevements de Liquide céphalo rachidien (LCR) (sang + LCR maximum 15min), - 6 Imagerie par résonance magnétique (IRM) (environ 1h30) - 4 Electromyogramme (EMG) (maximum 45min). Dans ce projet, comme decrit precedemment, une meme anesthésie permet la réalisation de plusieurs gestes (prise de sang + Ponction lombaire + EMG ou IRM selon le timepoint d'étude).

Impact sur les animaux

Les 5 effets indesirables possibles sont: - un risque anesthésique - un risque infectieux pour l'administration intracerebrale - un risque chirurgical lié à l'administration intracérébrale via des catheters - un risque de fuite de LCR - la formation d'hématomes lors des prises de sang

Devenir

A la fin du projet soit 6 mois apres l'injection, l'ensemble des animaux (n=8) sera euthanasié pour permettre les etudes histologiques et de biodistribution composant l'etude Tox GLP permettant la soumission aux agences reglementaires (FDA et ANSM).

Remplacement

Toutes les études in vitro possibles ont été effectuées en amont de ce projet, en particulier la démonstration de la fonctionnalité des AAV. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de cette approche thérapeutique chez l’Homme fait l'obligation d'une étude de scale-up (efficacité, biodistribution, toxicité, etc) chez le gros animal (NHP). Ces étapes sont requises par l’ANSM pour toute demande d’autorisation d’étude clinique afin d'autoriser l'essai clinique chez l'Homme.

Réduction

8 animaux au total: 3 animaux par dose d'AAV et 2 animaux vehicule est le minimum statistique pour repondre à l'objectif du projet. L'etude statistique etant assez limité en terme de tox, prinicpalement T test ou Anova. La majeure partie des analyses etant une étude histologique par un anatomopathologiste certifié.

Raffinement

Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, les procédures sont réalisées par du personnel formé et experimenté notamment l'administration intracérébraleréalisée par un neurochirurgien expert de la technique. Enfin, le nombre d'anesthesie est minimisé en regroupant les procédures (prise de sang (volume adapté à la taille des animaux et validé par le vétérinaire), ponction lombaire) au sein de la meme anesthesie. Les animaux sont hebergés en groupe et recevront un enrichissement adapté.. Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens du projet, un suivi de poids à chaque anesthesie, l'utilisation de buprecare pour les ponctions lombaires pour eviter tout inconfort et enfin des antibiotiques (amoxicilline) lors de la chirurgie. L'administration intracérébrale d'AAV est parfaitement tolérée (expérience passée sur 20). Les prises de sang et ponctions lombaires (avec les memes volumes et frequence que decrite dans ce projet) sont menée en routine sur tous les animaux suivis par l'equipe et ne generent pas d'effets néfastes sur les animaux. Une observation journalière sera faite tout au long du projet. A la moindre anomalie un avis vétérinaire sera demandé et un traitement mis en place si necessaire. Si un animal ne presentait pas d'amelioration dans le suiv, il sera euthanasié avec avis vétériaire.

Choix des espèces

La capacité des vecteurs adeno associés (AAV) à pénétrer dans un organe donné et y faire exprimer un gène thérapeutique est dépendante de l'espèce. Dans les maladies que nous ciblons, il existe un modèle murin de la maladie, utilisé dans une première étape, déjà réalisée. Les organes du primate non humain (NHP) en particulier le cerveau, se rapprochent le plus de celui chez l’homme en terme de structure anatomique et connectivité fonctionnelle. L’administration du vecteur dans un cerveau proche du cerveau humain permet de définir au mieux les paramètres du protocole clinique (nombre de sites, volumes, débit, nombre de particules). L'injection de vecteurs AAV chez le NHP est le seul moyen d'évaluer au mieux la faisabilité, l'efficacité et la tolérance d'une telle approche thérapeutique réalisée préalablement chez les rongeurs. Les animaux seront utilisés entre 3 ans et 15 ans selon la disponibilité en elevage, nous avons besoin d'individus avec un cerveau completement developpé.

628 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit, par chirurgie stéréotaxique, une lésion chimique des neurones dopaminergiques reproduisant la maladie de Parkinson et l'implantation de fibres optiques, d'électrodes et d'un implant miniaturisé, avant une perfusion intracardiaque terminale. Le porteur nomme les tests comportementaux imposés, activité locomotrice, coordination sur tige tournante et épreuve en milieu aquatique, et reconnaît des déficits moteurs induits par la lésion. Sur le remplacement, il affirme que ces déficits ne peuvent être étudiés ni sur des organismes moins évolués ni in vitro et juge le recours à la souris nécessaire.

Objectifs

L’objectif du projet est de tester in vivo l’efficacité d’un implant miniaturisé (de quelques μm3) permettant à la fois de moduler par optogénétique l'activité des neurones d’intérêt au niveau des circuits des ganglions de la base, d’enregistrer les activités neuronales et de libérer des nanovolumes de différentes substances (L-DOPA, anti-inflammatoire) chez les souris vigiles sans contention et de valider ses effets bénétifiques sur les symptômes moteurs de la maladie de Parkinson.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche devrait permettre une meilleure compréhension de la pathophysiologie de la maladie de Parkinson et à terme permettre de développer un outil technologique innovant pour traiter les troubles moteurs des patients parkinsoniens et probablement d’autres pathologies du système nerveux central.

Procédures

Les animaux seront soumis à 1) une stéréotaxie sous anesthésie générale réalisée une seule fois (durée 30-45 min selon le type d’implantation, grade de séverité: modérée) pour induire la lésion unilatérale des neurones dopaminergique et implantater en même temps des fibres optiques, des électrodes d’enregistrement et/ou un implant miniaturisé, suivit, 2) d'un exemen neurologique (series de 6 tests comportmentaux, grade de séverité: légère) ) pour évaluer les effets bénéfiques de la stimulation optogéntique sur les fonctions motrices et motivationnelles (3-5 semaines d’analyses avec 1 à 2 jours séparant deux tests comportmentaux successifs durant 30 sec-30 min en fonction du test), 4) une perfusion intracardiaque pour mener des analyses complémentaires au niveau cellulaire.puis 3) une perfusion intracardiaque (5 min) pour effectuer des analyses complémentaires au niveau cellulaire.

Impact sur les animaux

1) Les animaux seront soumis à la lésion des neurones dopaminergique qui induit certains déficits moteurs. La lésion 6-OHDA a été largement caractérisée par la communauté scientifique et induit certains symptômes moteurs (ralentissement moteur, déficit d’initiation du mouvement et asymétries posturales) de la maladie de Parkinson. 2) Une manipulation lors de la connexion des fibres optiques ou des électrodes d’enregistrent. 3) une exposition à des tests comportementaux évaluant les effets bénéfiques des divers modulations optogénétiques sur les fonctions motrices et motivationnelles. Ces tests impliquent une mesure de l’activité locomotrice exploratoire spontanée dans differents environnements et une évaluation des capacités de coordination motrice sur une tige tournante et dans un milieu aquatique. L’inconfort généré par chacun de ces tests est réduit au minimum en habituant les animaux au préalable et en raccourcissant la durée d’exposition. 4) une perfusion intracardiaque pour mener des analyses complémentaires au niveau cellulaire.

Devenir

Mise à mort à la fin de la procédure pour les analyses au niveau cellulaires

Remplacement

Ce projet de recherche repose sur la modélisation de déficits comportementaux chez la souris qui ne peuvent être abordés via l’étude d’organismes modèles phylogénétiquement moins évolués, ou à fortiori des outils moléculaires in-vitro. La maladie de Parkinson fait intervenir des mécanismes complexes nécessitant l'utilisation d'animaux pour créer un modèle pouvant reproduire les symptômes de cette maladie. La dégénérescence progressive des neurones dopaminergiques induite par la neurotoxine sélective des neurones catécholaminergiques (6-OHDA) s’accompagne d’une réorganisation fonctionnelle des circuits neuronaux des ganglions de la base qui sous-tend le développement et l’expression des symptômes de la maladie de Parkinson. De fait, il est nécessaire de prélever le cerveau entier pour les analyses immunohistochimiques et biochimiques. Les cultures cellulaires ou organotypiques ne peuvent répondre à ce type de recherche. L'implant prototype doit également être caractérisé chez l’animal vigile avant l’approche chez l’homme.

Réduction

Ce projet, d'une durée de cinq ans, nécessitera l'utilisation de 628 souris mâles et femelles adultes, réparties en plusieurs groupes (n= 6 à 14/groupe en fonction du type d’expérience). Cet effectif tient compte de notre expérience de nombreuses années dans ce type d’expérimentation et il est basé sur une approche statistique permettant de vérifier notre hypothèse à 80% de chances pour un seuil de significativité de 5%. Cependant, il pourra être réduit en fonction des résultats marquants obtenus dans les tests comportementaux et du nombre de dispositifs à tester. En effet, au vu de la difficulté technique du projet, nous pourrons être amenés à tester moins de prototypes qu’anticipés. En fonction de leur taille finale, ils pourront être implantés dans d’autres structures telles que le cortex moteur ou le striatum également impliquées dans le contrôle du mouvement. Ce projet de recherche devrait permettre une meilleure compréhension de la pathophysiologie de la maladie de Parkinson et permettre à terme de développer une technologie nouvelle pour traiter les troubles moteurs des patients parkinsoniens et probablement d’autres pathologies du système nerveux central.

Raffinement

La chirurgie stéréotaxique pour effectuer la lésion dopaminergique, l’implantation les fibres optiques, et les optrodes a été optimisée pour réduire la durée de l’opération et minimiser la souffrance grâce à notre expérience depuis de nombreuse années dans ce type d’expérimentation. La souffrance est modérée car la chirurgie est réalisée sous anesthésie profonde. Les principaux paramètres vitaux (température, fréquence respiratoire) sont également contrôlés tout au long de la chirurgie. Afin de diminuer la douleur, un analgésique morphinique puissant à action prolongée (buprénorphine), est administré en préopératoire. En complément, un analgésique anti-inflammatoire (Rimadyl dilué dans 1ml de NaCl) est administré par précaution en début et fin d'opération pour anticiper l’apparition d’éventuelles douleurs et hydrater l’animal puis en postopératoire pendant au moins 3 jours, la durée de traitement dépendant de la réponse observée. Les animaux ne présentent pas de signes de souffrance ni stress après réveil de l’anesthésie. Le personnel animalier et expérimentateurs s’assurent d’une bonne récupération postopératoire des animaux. Une grille d’évaluation clinique (Annexe 1) est mise en place pour évaluer des signes de souffrance ou mal-être potentiels des animaux. Pendant la période post-opératoire des trois semaines, les animaux sont hébergés dans la pièce de post-chirurgie chauffée à 25°C, et le rythme des visites est augmenté (2 visites par jour). Après la période de récupération post-opératoire, les animaux sont remis dans leur pièce d’hébergement habituelle à l’animalerie et ne sont manipulés par l’expérimentateur en charge qu’après une période de réhabituation d’une à deux semaines. Ils sont hébergés en petits groupes (2 à 4) dans des cages individuellement ventilées (Techniplast), avec eau et nourriture à volonté. Ils ont à leur disposition de la litière foisonnante (diminuant le stress de l’animal et facilitant sa thermorégulation) ainsi que des bûchettes en peuplier et des tubes en PVC pour favoriser le bien-être et l’interaction sociale. L’analyse comportementale est réalisée chez les animaux vigiles qui ne doivent pas être stressés pour ne pas compromettre leurs performances. Pour cela, ils sont manipulés quotidiennement 3 à 4 jours avant le début des tests comportementaux et familiarisés à la connexion des fibres optiques ou des électrodes pour s’habituer à se mouvoir dans les différents environnements sans stress.

Choix des espèces

Le modèle de Parkinson chez le rongeur (injections 6-OHDA) est le plus utilisé au niveau international et considéré comme un bon modèle. L’expérimentation animale utilisant des souris sauvages et génétiquement modifiées est indispensable à la réalisation de notre projet et permet de cibler slectivement des propulations neuronales d'intêret et elucider leurs contributions dans le developpment des déficits moteurs de la maladie de Parkinson. L'ensemble des études est mené sur des animaux adultes à partir de12 semaines. Ce temps est nécessaire pour que le système nerveux soit mature et est classiquement utilisé pour mesurer les performances comportementales de souris adultes. Ceci nous permet de comparer les résultats obtenus avec nos données antérieures et ceux de la litterature.

884 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisées d'une étape à l'autre puis mises à mort pour prélever leurs organes. 52 femelles gestantes sont immobilisées dans un tube de contention sous lumière vive trente minutes, trois fois par jour pendant six jours, pour induire un stress prénatal, et leur descendance subit des tests de tolérance au glucose avec gavage et prises de sang à la queue. Le porteur décrit ce protocole comme un modèle de stress psychologique humain transposé à la souris. Sur le remplacement, il affirme que les méthodes alternatives sont peu représentatives des pathologies humaines et rend le recours à l'animal "incontournable", le stress et les désordres métaboliques étant des réactions de l'"organisme entier".

Objectifs

La prévalence mondiale du développement de maladies métaboliques est en perpétuelle augmentation à travers le monde. L’objectif de notre projet est d'étudier les mécanismes du stress sur le développement de ces pathologies dans la descendance.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre l'impact d'un stress prénatal se rapprochant d'un modèle de stress psychologique chez l'humain, chez la souris. Ce projet apportera des connaissances sur la physiopathologie des désordres métaboliques altérés par le stress au niveau cellulaire et moléculaire afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Pour générer des souris F1 issues de mères stressées, 52 femelles seront placées dans un tube de contention sous une lumière vive durant 30 min, 3 fois par jour, pendant 6 jours, du 13ème jour au 18ème jour de gestation. L'ensemble des souris F1, soit 624 sera soumis à un test de tolérance oral au glucose avec gavage sur animaux vigiles et avec prélèvement de sang à la queue. Parmi ces animaux, la moitié, soit 312 animaux seront soumis à deux tests de tolérance oral au glucose avec prélèvement de sang à la queue 3 mois après. Ces expériences seront réalisées sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Ce modèle n'induit pas de douleur spontanée chez la souris. Nous attendons le premier jour de la procédure de stress une stabilisation du poids ou une perte de moins de 3.5% du poids des mères gestantes en comparaison avec les mères gestantes non stréssées. Dès le deuxième jour de la procédure de stress les mères gestantes doivent reprendre du poids. Le stress réalisé sur les mères gestantes ne comporte pas d'effet visible comportemental. Nous attendons un stress léger sur la génération F1 qui pourrait se manifester sur les différents paramètres mesurés, notamment une augmentation de la glycémie à jeun ou en réponse à l'administration de glucose.

Devenir

Les animaux ayant servi à générer la descendance F1 seront mis à mort et des prelèvements d'organes seront réalisés. Les souris F1 sous régime normal ou sous régime particulier seront euthanasiées à différents âges : adulte jeune ou adulte mature après la procédure du test de tolérance oral au glucose. Différentes expériences seront réalisées ex-vivo et des prélèvements tissulaires seront collectés pour différentes études au niveau cellulaire et moléculaire.

Remplacement

Les méthodes alternatives, permettant une évaluation du statut métabolique au cours du temps de la descendance suite à un stress gestationnel sont peu représentatives des pathologies humaines. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale afin d'étudier les mécanismes engagés entre l'effet du stress in utéro et les désordres métaboliques observés chez la descendance. De plus, le stress et les désordres métaboliques sont des réactions intégrées de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans leur intégralité.

Réduction

Le nombre de 8 animaux par groupe expérimental est le minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, principalement due à la variabilité interindividuelle des réponses étudiées. L'ensemble des procédures seront réalisé lors de 3 expériences indépendantes.

Raffinement

Le suivi expérimental repose sur des techniques non-invasives : suivi du poids, observation du bien etre animal. L’utilisation de ces techniques non-invasives permet d’observer au cours du temps un seul animal, là où l’information devait être obtenue par euthanasie et autopsie de multiples individus à chaque stade permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux.

Choix des espèces

La souris présente des caractéristiques physiopathologiques proches de l'espèce humaine.

364 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur crée deux plaies dorsales par chirurgie sous anesthésie, on leur pose une puce télémétrique et on les traite au plasma froid une à deux fois par jour, pour mettre au point un modèle de plaie chronique infectée par des bactéries résistantes. Le porteur reconnaît une douleur et une gêne aux déplacements au réveil, et prévoit des prélèvements de peau et de rate après la mise à mort. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe pas d'alternative non animale et qu'aucun modèle in vitro ne représenterait un cas clinique.

Objectifs

L’objectif est à la fois d’optimiser les technologies plasmatiques existantes et de développer de nouvelles technologies pour éliminer les bactéries résistantes responsables d’infections nosocomiales. Les sources de plasma sont testées dans différents contextes pour leur efficacité antimicrobienne in vitro et in vivo en utilisant un modèle murin de plaie infectée. Des études mécanistiques sur la destruction bactérienne médiée par le plasma froid sont effectuées tandis que des échantillons de plaies provenant de patients facilement disponibles sont utilisés pour fournir du matériel réaliste pour étudier l’efficacité de cette nouvelle approche. Enfin, le traitement de plaies colonisées par des bactéries résistantes aux antibiotiques fourniront les données d’une preuve de concept. Les résultats du projet ne serviront pas uniquement à rendre prometteur l’utilisation du plasma froid contre les plaies infectées, mais également d’améliorer la cicatrisation de plaies afin de lutter contre le développement de l’antibiorésistance résistantes en médecine humaine et vétérinaire.

Bénéfices attendus

Au sein du projet global, il est attendu que l’utilisation du kINPen ou du Multijet avec un nouveau mélange de gaz soi efficace pour lutter contre l’infection par des bactéries résistantes aux antibiotiques et pour améliorer la cicatrisation des plaies d'animaux présentant un déficit cicatriciel. Cela se traduira notamment par une baisse significative de la colonisation bactérienne sur la plaie, et une éventuelle accélération de la cicatrisation des plaies. Un nouveau dispositif à plasma, le multijet, sera également utilisé. Il est attendu que ce nouvel outil soit aussi efficace , sinon plus, que le premier quant à la désinfection et la cicatrisation des plaies, permettant ainsi de traiter une surface de plaie plus importante et d’augmenter l’efficacité de la réponse immunitaire. A plus long terme, cela pourrait permettre de généraliser l’utilisation de divers dispositifs à plasma à l'être humain, chez des patients souffrant de troubles de la cicatrisation (diabète, immunodépression, etc.) ; mais aussi de lutter contre l’antibiorésistance s’installant notamment sur ces plaies dans le cas d’infections nosocomiales. Cela pourrait également offrir des opportunités de traitement dans divers domaines (chirurgie, ophtalmologie, oncologie, etc.). La généralisation de l’utilisation de ce système pour entièrement décontaminer du matérial médical en milieu hospitalier pourrait être envisagée.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie sous anesthésie général, suivi d'un protocole de gestion de la douleur post-opératoire (injection en intra-péritonéale des immunostimulants (introduction aiguille) une à deux fois par jour durant 3 jours. Les animaux auront une prise de sang à veine sub-mandibullaire (introduction aiguille) une fois tous les 5 à 7 jours pendant quelques secondes. Les animaux seront équipés d'une puce télémétrique (introduction aiguille) en début d'expérimentation (1 fois) pendant quelques secondes. Les animaux seront traités par le plasma à froid 1 ou 2 fois par jour pendant quelques minutes (non invasif).

Impact sur les animaux

Suite à la création des deux plaies dorsales, une douleur et une gêne possible dans les déplacements sont attendues au reveil de l’animal sans analgésie. Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après la prise de sang pourrait être observés.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort soit les 364 souris. Des prélèvements de tissus seront effectués post-morterm pour la partie histologie (zone de biospsie et rate) popur l'analyse biologique de la reconstruction de l'épiderme cutané. La décision est prise par les responsables scientifiques et concepteurs.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternatives non animales puisque l’objectif est d’évaluer l’efficacité des plasmas à gaz sur la cicatrisation d’une plaie en vue d’une standardisation de son utilisation chez l’être humain. Ainsi, il n’est pas possible de remplacer les animaux par un modèle in vitro qui permettrait de représenter au mieux un cas clinique.

Réduction

Les volumes de sang à prélever par animal et leur fréquence étant contraints, les volumes prélevés à chaque prise de sang seront « poolés » par 2 (animaux du même groupe et de même sexe pour limiter la variabilité). Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques garantissant une puissance de test de 80% minimum en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. L’étude statistique sera faite sur la base d’un test non paramétrique : Kruskall-Wallis pour l’étude de la réponse immunitaire d’animaux et cicatricielle.

Raffinement

Dès l'arrivée des animaux à l’animalerie, une semaine d’acclimatation sera effectuée pour limiter au maximum les perturbations liées à un nouvel environnement. Les animaux seront surveillés 2 fois par jour (télémétrie, signes cliniques tels que le poids, l’apparence et le comportement général). L’eau et la nourriture seront ad libitum. Les souris bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger). Les souris sont hébergées dans une animalerie A2 en portoirs ventilés. La pose des puces est faite sous anéthésie générale à l'isoflurane. Afin de diminuer la douleur de l'injection de la puce, un dépôt de Tronothane® 1 % (pramocaïne, gel). Pour la partie chirurgie et le suivi post-opératoire : Période préopératoire : injection pré-opératoire de buprénorphine (0,1 mg/kg, SC), au moins 20 minutes avant le début de la chirurgie Période opératoire : anesthésie gazeuse à l'isoflurane. Période postopératoire : injection post-opératoire immédiate de méloxicam (20 mg/kg, SC). Suivi Injection de buprénorphine (même dose) le soir. Injection de méloxicam (20 mg/kg SC, 1 fois/jour, à J1 et J2). Injection de buprénorphine (même dose) à la demande (2 fois/jour, à J1, J2 et J3) en fonction du résultat de l'évaluation de la douleur, si elle n'est pas contrôlée par le méloxicam. Visite animalier matin et soir.

Choix des espèces

Il n’existe pas d’alternatives non animales puisque l’objectif est d’évaluer l’efficacité des plasmas à gaz sur la cicatrisation d’une plaie en vue d’une standardisation de son utilisation chez l’être humain. Ainsi, il n’est pas possible de remplacer les animaux par un modèle in vitro qui permettrait de représenter au mieux un cas clinique. Age des souris = 6-7 semaines. Les souris doivent être de jeunes adultes pour pouvoir faire les biopsies (décrits dans les modèles publiés) et avoir un système immunitaire mature.

3 132 souris transgéniques humanisées pour des molécules HLA vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections vaccinales sous-cutanées répétées et des prélèvements de sang à la veine sous-maxillaire, avant d'être tuées pour prélever la rate et d'autres organes. Le porteur vise un vaccin peptidique dit universel censé couvrir plus de 80 % de la population mondiale, un bénéfice renvoyé au développement futur. Sur le remplacement, il affirme que la réponse immunitaire après vaccination ne peut être reconstituée hors d'un "organisme entier" et juge "indispensable" le recours aux souris transgéniques.

Objectifs

Une avancée majeure dans le traitement des cancers a été réalisée au cours de ces dernières années grâce à l’utilisation de l’immunothérapie. L’immunothérapie consiste à réactiver les cellules du système immunitaire contre les cellules cancéreuses. Bien que très efficace chez certains patients, une large proportion de personnes atteintes par le cancer ne répond pas à ces nouvelles thérapies (environ 80% des patients). De nombreuses études montrent à présent, que chez les patients traités par certaines immunothérapies, l’ajout d’une vaccination dirigée contre des cibles appelées «antigènes» présentes à la surface des cellules tumorales peut améliorer la destruction de la tumeur et induire une rémission ou une stabilisation des patients. Dans ce cas, l’efficacité de la réponse vaccinale dépend directement de la nature des antigènes sélectionnés pour cibler les tumeurs et de la capacité du système immunitaire à reconnaitre efficacement ces cibles tumorales. On appelle antigène toute substance capable de déclencher une réponse immunitaire visant à l'éliminer. Dans le cas des cancers, il s'agit le plus souvent de peptides (fragments de protéines) qui sont reconnus de manière spécifique par certains globules blancs, les lymphocytes T CD8 (étudiés dans le cadre de ce projet). Nous avons développé une méthode pour identifier des cibles tumorales très efficace pour détruire les tumeurs, consistant à activer le système immunitaire avec des antigènes bactériens très semblables à certains antigènes tumoraux. L’utilisation d’antigènes bactériens permet de réactiver une réponse immune similaire à celle pouvant exister lors d’une infection bactérienne et d’induire une réponse contre les tumeurs similaires à celle observée contre un pathogène étranger. Utilisés pour la vaccination des patients, ces antigènes bactériens semblables aux antigènes tumoraux pourraient devenir un nouvel outil pour le traitement des cancers. L’objectif de notre projet est de développer un vaccin thérapeutique efficace qui ciblerait la grande majorité de la population mondiale.

Bénéfices attendus

Les objectifs pour ce projet sont d'étendre nos connaissances scientifiques sur le mimétisme moléculaire peptidique à d'autres HLA et de développer un vaccin peptidique universel (pour tous).

Procédures

Les interventions auxquelles les souris seront soumises sont les suivantes pour la 1e procédure expérimentale (Immunisation par méthode prime-boost): • Vaccination par injection sous-cutanée : 2 injections à 14 jours d’intervalle • Prélèvement sanguins sur animaux vigiles : 3 prélèvements (le premier 4 jours avant la vaccination, puis 10 et 17 jours après la vaccination). Pour la procédure expérimentale n°2 (Cinétique de vaccination) : • Vaccination par injection sous-cutanée : 5 injections à 7 jours d’intervalle • Prélèvement sanguins sur animaux vigiles : 4 prélèvements (le premier 4 jours avant la vaccination, puis 10, 17 et 31 jours après vaccination)

Impact sur les animaux

Lors de l’immunisation des animaux et du suivi des cinétiques de vaccination, douleurs légères associées à une injection sous-cutanée et à des prélèvements de sang par voie sous-maxillaire (plaie réduite au point d’injection ou de prélèvement, œdème).

Devenir

Tous les animaux de cette procédure seront euthanasiés en fin d'expérience afin de pouvoir prélever leur rate et autres organes pour effectuer les analyses in vitro.

Remplacement

La mise en place d’une réponse immunitaire après vaccination est un phénomène complexe. Cela implique la reconnaissance des antigènes par des cellules spécifiques et la collaboration de différents types cellulaires (lymphocytes T, B et cellules présentatrices d’antigène). L’efficacité de la réponse immunitaire est favorisée par de nombreux facteurs solubles provenant du microenvironnement dans lequel l’antigène est présenté. Ces particularités (collaboration de différents types cellulaires et microenvironnement) ne peuvent pas actuellement être reconstituées en dehors d’un organisme vivant. L’étude d’une réponse immunitaire après vaccination sur organisme entier ne peut donc être remplacée et n’a pas d’équivalent expérimental n’utilisant pas d’animaux. Il est donc indispensable d’avoir recours aux modèles animaux transgéniques pour le HLA humain pour récapituler ces interactions complexes antre cellules et microenvironnement afin de démontrer la mise en place d’une réponse immunitaire après vaccination. Ce projet ne vise pas à l’évaluation directe d’une réponse anti-tumorale chez l’animal. La vaccination sera réalisée chez des animaux non porteurs de tumeur.

Réduction

En amont, 2 étapes ont permis de réduire le nombre de peptide et d’animaux qui seront utilisés : 1/ Une analyse in silico et la réalisation de tests in vitro ont permis de sélectionner un nombre restreint de peptides vaccinaux immunogènes et de forte affinité pour les HLA ciblés. 2/ L’analyse in silico via l’outil en ligne tools.iedb.org/population/ a permis de déterminer que le ciblage de 3 HLA-A (parmi les 68 possibles) et 2 HLA-B (parmi les 125 possibles) permet une couverture de 80% de la population mondiale. La réduction du nombre d’animaux a été réalisée pour permettre d’obtenir un nombre suffisant de données pour répondre à la problématique. L’utilisation d’outils statistiques du calcul de puissance de test et de taille d’échantillons (https://biostatgv.sentiweb.fr/?module=etudes/sujets#), permet de définir un nombre minimal d’animaux de 12 par groupe, en considérant un seuil de significativité à p

Raffinement

Le bien-être des animaux étant primordial, les souris sont acclimatées au moins 7 jours avant le début de la procédure expérimentale. A réception, les souris sont hébergées par 7 maximum par cage pour les femelles et 6 maximum par cage pour les mâles. Les animaux seront maintenus dans des conditions environnementales contrôlées (température, humidité, cycle jour/nuit), dans un espace suffisant, en groupe pour maintenir les interactions sociales, et avec un enrichissement environnemental permettant de répondre aux besoins physiologiques et comportementaux des souris (présence de petite maison permettant aux animaux de se cacher). Toutes les manipulations seront réalisées dans le respect de l’animal. Le temps de manipulation des animaux sera de plus réduit au maximum afin de réduire le stress des animaux et l’impact possible sur la réponse immunitaire. La procédure expérimentale (vaccination) est de classe de gravité légère et ne nécessite pas d’y associer un protocole d’anesthésie. Les prises de sang régulières seront effectuées afin de suivre l’évolution dans la circulation sanguine la reponse immunitaire, ce qui élève le niveau de la procédure à une classe modérée. Ces prélèvements de sang seront effectués à la veine sous-maxillaire, 1 fois par semaine (ou tous les 15jours), selon le chronogramme prédéfini (cf annexe). Un volume total prélevé inférieur à 10% du volume sanguin de l’animal (soit au total environ 100µL/semaine ou 200µL/15jours, pour une souris de 25g) sera effectué afin de ne pas causer de dommage aux animaux. Toujours pour le bien-être de l’animal, le prélèvement sera effectué par alternance sur les 2 côtés.

Choix des espèces

Le principe de la vaccination repose sur la présentation des antigènes par le système HLA chez l’Homme. Le système de présentation antigénique est différent d’une espèce à l’autre. Ainsi les antigènes reconnus chez la souris peuvent être très différents de ceux reconnus chez l’homme car présentés par des molécules CMH (complexe majeur d’histocompatibilité) différents. Le vaccin final développé dans le cadre de ce projet représente un mélange de plusieurs peptides restreints par le HLA. Ce vaccin sera un vaccin HLA universel qui traitera une grande majorité des patients cancéreux (prédiction >80%) car ciblant les HLA du locus A et B les plus représentés chez l’homme (HLA-A1, HLA-A3, HLA-A24, HLA-B7, HLA-B35 et HLA-A2). Ce projet nécessite donc l’utilisation de souris dites humanisées transgéniques pour les différents HLA humains et parfaitement caractérisées pour leurs réponses aux vaccins peptidiques humains (HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A24, HLA-B7 ou HLA-B35 restreint). Le modèle de souris transgéniques humanisées pour les différents HLA-A et HLA-B sont des modèles existants et relevant pour étudier l’immunogénicité de ces vaccins destinés à l’homme. Les études pourront être réalisées sur des souris adultes âgées au début de l’expérimentation de 7 jusqu’à 15 semaines, âge où le système immunitaire est mature et donc à partir duquel une réponse immunitaire peut être correctement évaluable. Pour chaque étude, des souris d’âges similaires seront utilisées (plus ou moins une semaine). En cas de variation de plus d’une semaine, les animaux seront répartis de façon équilibrée dans chacun des groupes afin d’assurer l’homogénéité des groupes.

1 010 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse de leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie stéréotaxique détruit leurs neurones dopaminergiques à la 6-OHDA et implante fibres optiques et électrodes, avant des tests comportementaux sur plusieurs semaines, une restriction alimentaire pour les tests de Skinner et une perfusion intracardiaque terminale. Le porteur étudie le rôle du zinc synaptique dans la maladie de Parkinson et renvoie d'éventuelles stratégies thérapeutiques au conditionnel. Il affirme que le recours aux souris génétiquement modifiées est "indispensable" faute d'outil pharmacologique ciblant le zinc synaptique.

Objectifs

Ce projet vise a élucider le rôle du zinc synaptique dans le développement des symptômes moteurs et non-moteurs de la maladie de Parkinson. Nous utilisons une panoplie d'outils de pointes de génétiques et d'optogénétiques pour cibler les neurones libérant le zinc synaptique et révéler la mise en jeu du zinc synaptique dans le development des symptôme de la maldie. Ce projet de recherche devrait aboutir à une meilleure compréhension de la physiopathologie de la maladie de Parkinson.

Bénéfices attendus

La chélation du zinc a été proposée comme piste thérapeutique pour la prise en charge des maladies neurovégétatives comme la maladie d’Alzheimer. Ce projet de recherche devrait permettre une meilleure compréhension du rôle physiopathlogique du zinc synaptique dans la maladie de Parkinson et pourrait aboutir à de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les neurones gluzinergiques dans le contexte de la maladie de Parkinson et d'autres maladies aparentées.

Procédures

Les animaux seront soumis à 1) une stéréotaxique sous anesthésie générale profonde réalisée une seule fois (durée 30-90 min selon le type d’intervention) combinant la lésion des neurones dopaminergique avec une implantation des fibres optiques et/ou des électrodes d’enregistrement, 2) des tests comportementaux pour évaluer les effets bénéfiques des divers modulations optogénétiques sur les fonctions motrices et cognitifs (3-6 semaines d’analyse avec 1 à 5 jours séparant deux test comportementaux successifs durant 5-30 min chacun), 3) une restriction alimentaire légère et temporaire lors des tests cognitifs de Skinner et 4) une perfusion intracardiaque (5-6 min) pour mener des analyses complémentaires au niveau cellulaire.

Impact sur les animaux

La procédure lésionnelle utilisée (lésion unilatérale complète ou lésion bilatérale partielle à la 6-OHDA) a été largement caractérisée par la communauté scientifique et elle est considéré comme l’outil de choix pour modéliser certains symptômes moteurs (ralentissement moteur, déficit d’initiation du mouvement et asymétries posturales) et non-moteurs (déficits cognitifs, comportement anxieux et dépressifs).

Devenir

Mise à mort à la fin de la procédure pour mener des analyses au niveau cellulaires. Les marquages immunohistochimiques sont indispensables pour vérifier l'étendue des lésions dopaminergiques, l'expression des opsines, les localisations des fibres optiques et des microélectrodes au niveau des structures ciblées.

Remplacement

Ce projet de recherche repose sur la modélisation de déficits comportementaux chez la souris qui ne peuvent être abordés via l’étude d’organismes modèles phylogénétiquement moins évolués, ou à fortiori des outils moléculaires in-vitro. La maladie de Parkinson fait intervenir des mécanismes complexes nécessitant l'utilisation d'animaux pour créer un modèle pouvant reproduire les symptômes de cette maladie. La dégénérescence progressive des neurones dopaminergiques induite par la neurotoxine sélective des neurones catécholaminergiques (6-OHDA) s’accompagne d’une réorganisation fonctionnelle des circuits neuronaux des GB qui sous-tend le développement et l’expression des symptômes de la maladie de Parkinson. De fait, il est nécessaire de prélever le cerveau entier pour les analyses immunohistochimiques et biochimiques. Les cultures cellulaires ou organotypiques ne peuvent répondre à ce type de recherche.

Réduction

Ce projet, d'une durée de cinq ans, nécessitera l'utilisation de 1010 souris mâles et femelles adultes, réparties en plusieurs groupes (n= 10 à 14/groupe en fonction du type d’expérience). Il repose sur l’utilisation d’une procédure lésionnelle et tests comportementaux robuste et largement validés par la communauté scientifique internationale, ce qui permet d’utiliser le minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des données fiables. L’estimation du nombre est basée sur une approche statistique permettant de vérifier notre hypothèse à 80% de chances pour un seuil de significativité de 5% . Cependant, l’effectif des groupes pourra être réduit en fonction des résultats marquants obtenus dans les tests comportementaux.

Raffinement

La chirurgie stéréotaxique pour effectuer la lésion dopaminergique, l’implantation les fibres optiques, et les optrodes a été optimisée pour réduire la durée de l’opération et minimiser la souffrance grâce à notre expérience depuis de nombreuse années dans ce type d’expérimentation. La souffrance est modérée car la chirurgie est réalisée sous anesthésie profonde. Les principaux paramètres vitaux (température, fréquence respiratoire) sont également contrôlés tout au long de la chirurgie. Afin de diminuer la douleur, un analgésique morphinique puissant à action prolongée (buprénorphine), est administré en préopératoire. En complément, un analgésique anti-inflammatoire (Caprofène dilué dans 1ml de NaCl) est administré par précaution en début et fin d'opération pour anticiper l’apparition d’éventuelles douleurs et hydrater l’animal puis en postopératoire pendant au moins 3 jours, la durée de traitement dépendant de la réponse observée. Les animaux ne présentent pas de signes de souffrance ni stress après réveil de l’anesthésie. Le personnel animalier et expérimentateurs s’assurent d’une bonne récupération postopératoire des animaux. Une grille d’évaluation clinique est mise ne place pour évaluer des signes de souffrance ou mal-être potentiels des animaux. Pendant la période post-opératoire des trois semaines, les animaux sont hébergés dans la pièce de post-chirurgie chauffée à 25°C, et le rythme des visites est augmenté (2 visites par jour). Après la période de récupération post-opératoire, les animaux sont remis dans leur pièce d’hébergement habituelle à l’animalerie et ne sont manipulés par l’expérimentateur en charge qu’après une période de réhabituation d’une à deux semaines. Ils sont hébergés en petits groupes (2 à 4) dans des cages individuellement ventilées (Techniplast), avec eau et nourriture à volonté. Ils ont à leur disposition de la litière foisonnante (diminuant le stress de l’animal et facilitant sa thermorégulation) ainsi que des bûchettes en peuplier et des tubes en PVC pour favoriser le bien-être et l’interaction sociale. L’analyse comportementale est réalisée chez les animaux vigiles qui ne doivent pas être stressés pour ne pas compromettre leurs performances. Pour celà, ils sont manipulés quotidiennement 3 à 4 jours avant le début des tests comportementaux et familiarisés à la connexion des fibres optiques ou des électrodes pour s’habituer à se mouvoir dans les différents environnements sans stress.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris est justifiée car elles représentent le modèle expérimental de choix pour étudier à travers des approches génétiques et optogénétiques les mécanismes physiopathologiques des maladies mentales liées à l’atteinte des ganglions de la base. Le recours aux souris génétiquement modifiées est indispensable dans le contexte de ce projet à cause de l’absence d’outils pharmacologiques permettant de cibler sélectivement le zinc synaptique ou empêcher son action sélectivement au niveau d’un type de récepteurs glutamatergiques. Comme pour tous nos travaux précédents, nous utiliserons des animaux adultes âgés à partir de 12 semaines. Ce temps est nécessaire pour que le système nerveux soit mature et est classiquement utilisé pour mesurer les performances comportementales de souris adultes. Ceci nous permet de comparer les résultats obtenus avec nos données antérieures et celle de la littérature.