Recherche appliquée

220 rats vont être utilisés, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie créant un défaut osseux au fémur, puis un suivi par micro-scanner sous anesthésie toutes les deux semaines pendant deux mois, avant l'euthanasie pour analyses histologiques. Le porteur revendique un modèle déjà maîtrisé et reproductible dans son unité, et affirme qu'aucune approche in vitro ne permet d'évaluer les biomatériaux au regard de la réglementation. Les retombées annoncées, de nouveaux dispositifs de comblement osseux pour les patients, restent formulées au conditionnel.

Objectifs

Si les greffes de tissus osseux sont désormais courantes pour réparer un os à la suite d’une fracture ou d’autres lésions, cette stratégie présente des limites. C’est pourquoi notre équipe travaille sur le développement de fragments d’os synthétiques ou hybrides (incluant des cellules souches) qui sont nommés des biomatériaux. Ces biomatériaux doivent être à la fois souples et résistants, mais aussi poreux afin qu’ils puissent être colonisés par des cellules. Pour étudier le potentiel ostéogénique du biomatériau (c'est à dire sa capacité à reformer de l'os) nous souhaiterions avoir recours à un modèle animal déjà développé et maîtrisé au sein de notre unité. Ce modèle est facile à mettre en œuvre et reproductible. Le modèle étudié est un défaut osseux au niveau du fémur du rat afin d'évaluer le pouvoir régénérant des biomatériaux implantés. La formation de l'os sera suivie dans le temps grâce à une technique d'imagerie de pointe, indolore et non invasie : un système de tomographie préclinique micro scanner X. L'objectif étant à terme de pouvoir proposer aux patients des matériaux implantables efficaces et adaptés.

Bénéfices attendus

Ce projet permettrait le développement de nouveaux dispositifs médicaux (matériaux de comblement ou membranes pour la régénération osseuse guidée) qui pourraient être proposés aux patients atteints de pathologie osseuses ou accidentés (fracture...).

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie au niveau du fémur (création d'un défaut). Cette intervention dure environ 30 min par animal. Elle est réalisée sous anesthésie générale et le suivi des animaux durant la phase de récupération est renforcé. Suite à l'opération, le suivi par micro scanner de la régénération osseuse pour chaque rat sera réalisé à des intervalles de temps espacés (toutes les 2 semaines). Lors de cette procédure d'imagerie non invasive, les rats seront anesthésiés à l'isoflurane (et maintenu au masque dans l'enceinte du scanner). L'acquisition du microscanner dure environ 15 min. Il est envisagé de réaliser 5 fois cette acquisition sur chaque rat (suivi longitudinal sur 2 mois, avec une acquisition à: T0, 2, 4, 6 et 8 semaines).

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une intervention chirurgicale sur un site orthopédique, cette intervention ne nécessite pas de fixation interne de l'os. Toutefois, la chirurgie pourra engendrer une douleur modérée pour les animaux et leur mobilité sera atteinte lors des premiers jours post-opératoires. Les signes de douleur et de récupération des animaux représente ceux communément observés pour une telle intervention chez l'Homme suite à une reconstruction osseuse suite à un accident par exemple. Une surveillance rigoureuse sera établie afin de pallier à ces inconvénients et de mettre toutes les mesures en place afin de prendre en charge les animaux.

Devenir

Suite à la chirurgie, les animaux seront suivi par microscanner sur 2 mois (examen d'imagerie non invasive). Après le dernier temps d'acquisition (2 mois après la chirurgie), les animaux seront euthanasiés par les expérimentateurs formés à ce geste, afin de pouvoir réaliser des analyses histologiques sur ces animaux et poursuivre les examens post-mortem permettant de valider le pouvoir ostéogénique du biomatériau étudié.

Remplacement

Les produits destinés a être implantés chez l'Homme doivent nécessairement être testés chez l'animal avant les essais cliniques. Il n'existe pas de méthode basée sur une approche in vitro permettant d'évaluer ces matériaux pour répondre à l'objectif du projet et à la réglementation en vigueur dans le cadre de l'évaluation des dispositifs médicaux implantables chez l'Homme.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux utilisé, un suivi longitudinal par analyse au micro scanner sera réalisé.

Raffinement

Pour réduire l’angoisse, une période d’adaptation d’une semaine sera respectée avant le début des expérimentations. Une cage après l’autre sera amenée à la salle de chirurgie, séparée de la zone d’hébergement des animaux pour éviter toutes sources de stress des animaux opérés et des animaux à opérer. Après la chirurgie, chaque rat se réveille dans une cage à part pour éviter le contact avec des congénères non anesthésiés. Après le réveil complet, le rat reviendra dans sa cage d’origine. Les examen d'imagerie par micro-scanner sont réalisés sous anesthésie générale, avec un suivi des paramêtres tout au lon de l'exeman. Le raffinement des conditions d’hébergement est réalisé notamment par l'enrichissement de l’environnement d’hébergement (la litière en copeaux, jouets, bâtons à ronger mis à disposition) et suivi quotidien des animaux par le personnel qualilié et attentif au bien-être des animaux.

Choix des espèces

Le Rat est une espèce adaptée à la première étape de validation chez l'animal de matériaux destinés au traitement des pertes osseuses. De par sa taille, il permet de réaliser des lésions circulaires de diamètre suffisant au niveau du fémur. Le rat permet ainsi de valider la biocompatibilité, la stabilité dans le temps et l'efficacité thérapeutique du produit, étape primordial dans le cadre du processus de validation d'un disposition médical à destinée humaine. Des rats adultes de 10 semaines, d'un poids d'environ 400 g seront utilisés. En effet les animaux utilisés doivent avoir achevé leur développement et leur croissance.

2076 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart envoyés ensuite à l'abattoir et une partie mise à mort pour des prélèvements de tissus. Le projet laisse les queues entières et expose les animaux à la caudophagie, les morsures de queue entre congénères, pour tester des additifs et des formulations alimentaires censés en réduire la fréquence. Le porteur décrit un bénéfice attendu de mise sur le marché d'une ou plusieurs solutions, et affirme que la complexité des régulations physiologiques ne permet pas de recourir à des modèles in vitro. Les prises de sang sont réalisées sur animal vigile, avec un maximum de trois tentatives par prélèvement.

Objectifs

Mordiller et mordre sont des comportements naturels chez le porc, qui passe une partie de son temps à explorer son environnement, en reniflant, manipulant et mordillant tout ce qui est à disposition (objets, paille, différents éléments de sa case). Ces comportements s’expriment également vis-à-vis des autres animaux présents et font partie des comportements sociaux. Par ailleurs, la mise en place de la hiérarchie lors de la constitution du groupe s’accompagne d’agressions plus ou moins marquées et de morsures chez certains animaux. Ces comportements peuvent aussi survenir quand les porcs cherchent à accéder à des ressources convoitées, comme l’auge, l’abreuvoir, ou la zone de confort. Dans certaines situations, la fréquence des morsures augmente et provoque des lésions graves sur un ou plusieurs porcs. Ces morsures s’exercent majoritairement sur la queue des animaux et on parle dans ce cas de caudophagie. L’importance de la caudophagie en France est mal connue. Des observations menées en 2016 en abattoir dans l’ouest de la France sur des animaux issus de 263 élevages différents indiquent que plus de 40 % des élevages avaient au moins un porc avec une lésion sévère. L’évolution de la réglementation va dans le sens de l’arrêt de la coupe des queues chez le porcelet, fait de manière routinière aujourd’hui pour empêcher la caudophagie. L’arrêt de cette pratique risque d’augmenter la prévalence de la caudophagie si des solutions ne sont pas trouvées. Il est donc nécessaire de travailler sur cette problématique. L’objectif du projet est de tester différentes stratégies permettant de lutter contre la caudophagie dans les élevages de porc. Différentes solutions pourront être mises en œuvre selon les essais : ajouts d’additifs, modulation du niveau des nutriments, etc. Le projet étudiera la caudophagie chez les porcs depuis le sevrage à 21 jours d’âge, jusqu’à l’abattage, à environ 180 jours d’âge ; car tous ces stades sont concernés.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la mise sur le marché d'une ou plusieurs solutions ou additifs permettant d’empêcher totalement ou a minima de diminuer la prévalence et l’importance des cas de caudophagie chez le porc.

Procédures

Tous les animaux du projet auront les queues entières (le projet utilise des animaux de 21 à 180 jours d'âge environ) et pourraient souffrir de caudophagie, de la même façon que les porcs engraissés en élevage classique. Des points limites stricts seront appliqués afin de limiter la souffrance des animaux. Les prises de sang pourront être réalisées sur animal vigile. Au maximum 15 animaux par traitement expérimental pourront être prélevés avec au moins 7 jours de récupération entre 2 prélèvements et un maximum de 3.85% de la volémie totale de l’animal par prélèvement. Pour chaque prise de sang, le nombre de tentatives sera limité à 3 pour réduire le temps de prélèvement (estimé à environ 5 minutes par prise de sang) et la douleur engendrée. Les prélèvements de salive et de fèces seront réalisés sur animaux vigiles. Ces prélèvements n’étant pas invasifs, ils pourront être réalisés sur l’ensemble des animaux de la procédure. Le nombre de tentative par prélèvement de fèces est fixé à 3 maximum (au maximum 3 stimulations de 30 sec). Des prélèvements de tissus pourront être réalisés après euthanasie des animaux. Le temps de prélèvement de salive est estimé à environ 10 minute par animal.

Impact sur les animaux

s porcs pourront être atteints de caudophagie dans des proportions limitées, puisque le respect des points limites permettra d’éviter que des stades de caudophagie trop importants soient atteints.

Devenir

A la fin de chaque essai, les animaux entreront dans le circuit de consommation pour la plupart, sauf ceux ayant reçu un additif non autorisé dans l’Union européenne et ceux sur lesquels des prélèvements de tissus seront réalisés. Ces derniers seront mis à mort puis partiront à l’équarrissage.

Remplacement

L’objectif du projet est de développer des solutions permettant de lutter contre la caudophagie dans les élevages de porc : ajouts d’additifs, modulation du niveau des nutriments, etc. L'effet d'une solution nutritionnelle ou d'un changement de teneur en nutriments dans l’aliment sur les performances de croissance des porcs est la résultante d'une série de mécanismes et régulations physiologiques (digestives, métaboliques, endocrinologiques) interagissant entre elles. La complexité de ces interactions ne permet donc pas d'utiliser des modèles alternatifs comme la modélisation ou la mise en place d'études in vitro. Par ailleurs, l'évaluation des paramètres d’intérêt du projet (prévalence de la caudophagie, et croissance en particulier) ne peut être réalisée que sur des animaux vivants.

Réduction

Dans ce projet, il s’agit d’étudier la prévalence de l’apparition de la caudophagie ainsi que la sévérité des lésions observées, il faut donc utiliser le test du Chi². Une différence de 20% de prévalence entre 2 traitements expérimentaux permet d’établir que le traitement a un effet significatif sur la caudophagie. Le minimum de cas à observer pour que cette observation ait un sens, est fixée à 7 individus. Avec ces éléments, le nombre minimal d’animaux par traitement expérimental doit être de 35 individus en période de post sevrage. En engraissement, le nombre d’animaux par traitement est augmenté à 72 porcs par traitement, car il y a moins d’animaux par case, ce qui diminue la probabilité d’observer de la caudophagie.

Raffinement

L’état de santé des animaux sera vérifié quotidiennement par les techniciens animaliers de l’établissement utilisateur. Si un porc présente des signes de stress, des douleurs (caudophagie, boiteries, blessures…), alors il sera écarté de l’étude. Des points limites stricts et définis à l’avance sont appliqués tout au long du projet. De plus, le nombre de tentatives de collecte d'échantillons biologiques sera limité et la manipulation des animaux sera restreinte afin de réduire la souffrance ou le stress appliqué à ces animaux. Par ailleurs, ce projet sera réalisé en condition « élevage » pour que les réponses observées soient directement transposables sur le terrain. Les cases seront enrichies avec des jouets sous optimaux et minimes en nombre suffisant pour respecter la règlementation. Des interactions sociales entre les animaux seront possibles car les porcs seront logés collectivement.

Choix des espèces

L'espèce choisie pour la réalisation du projet est le porc car les phénomènes physiologiques (digestifs, métaboliques, endocrinologiques) et la prévalence de la caudophagie étudiés dans le cadre de ce projet sont hautement spécifiques de l'espèce porcine. En période de post-sevrage, les animaux pèseront en moyenne entre 6 et 30-35 kg. En période d’engraissement, les animaux pèseront en moyenne entre 30-35 et 125 kg. C’est pendant ces phases que les problèmes de caudophagie sont observés.

345 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart reçoivent une greffe de tumeur du pancréas par chirurgie, puis des injections d'agents de contraste radiomarqués et un prélèvement de sang intracardiaque suivi de la mise à mort, pour étudier la détection du zinc par imagerie. Le porteur indique un suivi par grille de score, avec mise à mort si la perte de poids dépasse 20 % ou si les signes cliniques s'aggravent. Il affirme que la complexité des tumeurs pancréatiques ne peut se modéliser que sur un "organisme vivant entier".

Objectifs

Le zinc revêt un intérêt particulier car il s'agit d'un micronutriment essentiel requis pour plus de 300 processus cellulaires différents. La teneur en zinc est particulièrement importante dans le pancréas : le zinc est relargué avec l’insuline et est impliqué dans le diabète mais aussi dans le cancer pancréatique. C’est estimé que le cancer du pancréas deviendra la deuxième cause de mortalité liée au cancer au cours de la prochaine décennie, dans les pays occidentaux. Son pronostic actuel est extrêmement mauvais avec un taux de survie global à 5 ans de seulement 3% en raison de l'absence de symptômes spécifiques et de l'absence de diagnostic précoce. Des chercheurs ont développé des agents de contraste détectables en IRM sensibles au zinc. Après complexation avec le zinc présent au niveau du pancréas, il va s’ensuivre une variation du signal sur l’image du pancréas. Des études précédentes, déjà validées par le ministère, ont permis l’obtention de preuve de concept de la détection IRM de Zn2+ in vivo dans le cadre du diabète et dans le cadre de l’adénocarcinome de pancréas. Néanmoins, la technique d'IRM ne permet pas une quantification absolue de l'agent de contraste dans un organe d'intérêt du fait que le signal dépend à la fois de la concentration locale d’agent mais aussi de son environnement. L’utilisation d’un analogue radioactif permet l’accès à la distribution relative de l’agent dans l’organisme (biodistribution) car l’activité qui est retenue par chaque organe dépend exclusivement de la concentration locale en agent. L’objectif de cette saisine est d’étudier la biodistribution in vivo (par tomographie d’émission monophotonique, TEMP) et ex vivo (prélèvement d’organes post-mortem à des temps précis), des agents de contraste développés (et validés en IRM) en souris saines et souris modèle de cancer de pancréas (modèles adénocarcinome et insulinome), à l'aide des analogues marqués à l'111In ou à l'165Er, deux émetteurs gamma possibles de visualiser par TEMP.

Bénéfices attendus

L'objectif de cette demande est donc d'évaluer la possibilité de détecter et quantifier le zinc par TEMP, grâce à des agents de contraste dédiés, développés par le client, dans des souris témoins saines et modèles de cancer du pancréas. Des biodistributions ex vivo de ces agents de contraste sont réalisées. L'objectif à long terme de ce projet sera de fournir un diagnostic précoce aux populations à haut risque afin d'accroître leur taux de survie et d'améliorer le suivi des patients après traitement.

Procédures

270 souris auront des greffes orthotopiques au niveau du pancréas (procédures 1, 2, 3) Elles seront placées sous paracétamol (analgésique) dans l'eau de boisson la veille de l’intervention (500mg dans un biberon de 200mL) jusqu’à 24h post induction. L'induction sera réalisée sous anesthésie gazeuse (isoflurane 2% dans l'air). A la fin de l’intervention, une injection de tolfédine 4mg/kg (anti inflammatoire) sera réalisée en sous cutané (50μL) et renouvelée le lendemain de l'intervention. Elles subiront une seule chirugie lors de l'induction tumorale qui durera 20 minutes maximum. 75 souris vigiles (dont 60 avec des tumeurs pancréatiques) recevront 2 fois 150μL d'agent de contraste radiomarquée par voie intraveineuse au niveau de la queue (à un temps précoce J7 et à un temps tardif J21 ou J35) (procédure 2) et 180 souris vigiles (dont 120 avec des tumeurs pancréatiques) recevront 1 fois 150μL d'agent de contraste radiomarquée par voie intraveineuse au niveau de la queue. 180 souris vigiles portant une tumeur du pancréas recevront une IP de 50μL de glucose 40% (modèle insulinome dans les procédures 1, 2 et 3). 180 souris ((dont 120 avec des tumeurs du pancréas) anesthésiées à l'isoflurane (2% dans l'air) subiront un prélevement sanguin de 400μL en intracardiaque qui sera immédiatement suivi par la mise à mort sans réveil intermédiaire. (procédure 3)

Impact sur les animaux

Les dommages attendus lors de ce projet sont dûs au développement tumoral pancréatique. Pour suivre cela, nous mettons en oeuvre une grille de scoring qui permettra de prendre les mesures nécessaires afin d'éviter toute souffrance chez l'animal. En pratique, une perte de poids et une modification du comportement pourront être observés (diminution de la locomotion, prostration, amaigrissement, aspect du pelage).

Devenir

Procédure 1: A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir prélever les foies et les pancréas post mortem pour le dosage du Zinc présent. Procédure 2: A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort. Les souris ayant des tumeurs pancréatiques et ayant été injectées avec des agents de contraste radiomarquées ne peuvent être réutilisées. Procédure 3: A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort, afin de pouvoir prélever différents organes (pancréas, rate, foie, coeur, poumons, reins, cerveau, intestins, muscles) post mortem afin de quantifier précisément des molécules marquées à l'111In ou à l’165Er préalablement administrées.

Remplacement

Le modèle animal souris est fondamental dans notre cas, puisqu'à notre connaissance il n'existe pas de modélisation capable de représenter la complexité des tumeurs pancréatiques et la distribution des agents de contraste à tester in vitro ; cette étude ne peut se faire que sur un organisme vivant entier.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles.

Raffinement

Les animaux seront suivis par observation individuelle chaque jour de la semaine pour anticiper, le cas échéant, le développement de douleurs ou de souffrances. Les animaux seront également suivis individuellement par pesée 1 fois par semaine. Si une perte de poids est supérieure à 20% du poids initial, cela entraînera la mise à mort de l’animal (points limites). Par ailleurs, l’absence de socialisation des animaux, le changement d’aspect de la peau (reflet de la qualité du toilettage de l’animal) et l’absence de toilettage seront évalués quotidiennement pour anticiper la souffrance des animaux. Les modèles de tumeur pancréatique peuvent se dérouler sur une période maximale de 35 jours postinjection des cellules. De par notre expérience, à J35, les tumeurs auront une taille inférieure ou égale à 100mm3. Si toutefois un animal venait à présenter des signes de souffrance, il serait mis à mort avant. Une grille de scoring sera utilisée pour le suivi clinique des animaux :ASPECT GENERAL, COMPORTEMENT/ LOCOMOTION, PHYSIOLOGIE CLINIQUE Chaque animal sera mis à mort dès que le score d’un paramètre sera égal à 2, ou dès que le total des scores sera strictement supérieur à 3. De plus, l’imagerie TEMP est une approche non invasive pratiquée sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Le modèle d’adénocarcinome chez la souris a été décrit et mis en oeuvre par notre équipe depuis plusieurs années. La lignée immunodéprimée Swiss nude est la lignée qui répond le mieux à l’induction de l’adénocarcinome. Les niveaux de zinc changeant avec la lignée et le sexe des souris, cette même lignée sera utilisée comme témoin et pour l’induction des insulinomes. Des souris femelles âgées adultes de 6-8 semaines seront utilisées conformément aux études déjà publiées sur ce modèle.

36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de vaccination puis la greffe chirurgicale d'un fragment de tumeur gastrique sous la peau, pour tester si cette vaccination ralentit le développement tumoral. Le porteur indique qu'une tumeur va croître et pourrait gêner les déplacements, avec une douleur modérée en cas d'ulcération. Il qualifie la vaccination de modèle "gold standard" dans la littérature et affirme qu'un passage à l'"organisme entier" est "indispensable" après la phase in vitro.

Objectifs

Notre projet repose sur une procédure de vaccination chez la souris en lui administrant des cellules traitées qui induirait une MCI (mort cellulaire immunogène). Cette MCI induite par vaccination permettrait de ralentir ou d’empêcher le développement de tumeur, induite dans un second temps chez les souris vaccinées en procédant à l’implantation d’une tumeur de cancer gastrique en sous-cutané. Cette procédure est considérée, dans la littérature, comme le " gold standard" permettant de démontrer l'induction de la MCI. Cette mort cellulaire, dite immunogène, pourrait à son tour stimuler la réponse aux immunothérapies et en augmenter l’efficacité.

Bénéfices attendus

Le cancer gastrique (CG) est un cancer très agressif associé à une médiane de survie de 10 mois et à un taux de survie à 5 ans inférieur à 25%. La stratégie thérapeutique actuelle repose sur la chirurgie combinée à la chimiothérapie à base de sels de platine (oxaliplatine). Ce traitement est agressif, avec de nombreux effets secondaires qui impactent très négativement la qualité de vie des patients, et le pronostic de ces tumeurs reste sombre. Très récemment, les immunothérapies (qui visent à mobiliser le système immunitaire du patient contre la tumeur) ont été développées pour la prise en charge des patients avec une tumeur CG. Ces alternatives thérapeutiques peuvent provoquer des réponses tumorales complètes et de longue durée, mais ce uniquement chez environ 20% des patients. Nous souhaitons évaluer l’hypothèse qu’un traitement de ces cancers avec des thérapies ciblées déjà utilisées dans la pratique clinique puisse provoquer une mort cellulaire particulière qui stimule le système immunitaire. Le but ultime est d’ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement des cancers gastriques.

Procédures

Les 36 souris engagées dans ce projet subiront d'abord une injection sous-cutanée. Une semaine plus tard, un fragment de tumeur de la même lignée cellulaire sera implantée en sous-cutanée . Cette intervention nécessite une anesthésie, en effet, une incision est faite sur le flanc droit pour insérérer le fragment tumoral et un point de suture est réalisé pour refermer. Les animaux sont ensuite suivis durant maximum 4 semaines.

Impact sur les animaux

Les animaux engagés dans ce projet subiront une première injection (vaccination) en sous-cutané au niveau du flanc gauche. Une semaine plus tard, une chirurgie sera pratiquée pour implanter en sous-cutané un fragment de tumeur sur le flanc droit des mêmes animaux. Cette étape nécessite de faire une incision de la peau sur quelques millimètres et donc de faire un point de suture après l’implantation. Cette chirurgie dura une quinzaine de minutes. Un développement de tumeurs est attendu sur les animaux. Les tumeurs grossiront et pourront gêner les souris dans leurs déplacements. Si la peau au niveau de la tumeur devait s'ulcérer, une douleur modérée pourrait apparaître.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet. En effet, il est nécessaire de pouvoir continuer l'étude en réalisant des analyses au laboratoire à partir des tissus prélevés sur ces animaux.

Remplacement

Après plusieurs travaux in vitro très encourageants, l’utilisation d’un modèle animal est indispensable. En effet, la démonstration la plus robuste de ces phénomènes repose sur la vaccination de modèles animaux. La démonstration de la mobilisation de la réponse immunitaire en réponse au traitement est impossible in vitro, et demande l’utilisation de souris immunocompétentes, chez lesquelles le déclanchement d’une réponse immunitaire anti-tumorale est réalisable par des expériences de vaccination. Ainsi, les enjeux de ce projet sont la démonstration de l’efficacité in vivo de cette modalité thérapeutique, qui pourra à terme trouver une application dans l’amélioration de la prise en charge des patients.

Réduction

Le projet nécessitera un nombre maximum 36 souris. Ce nombre a été réduit au maximum tout en restant suffisant et statistiquement robuste pour apporter des réponses claires à notre projet.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des conditions sanitaires contrôlées en disposant d’un enrichissement adapté (carrés de coton pour la fabrication des nids ainsi que des tunnels ou maisonnette et des bâtons de bois à ronger). Les animaux sont surveillés quotidiennement comme l'exige la réglementation en vigueur. Un suivi régulier comprenant l’observation de critères définis (poids, taille des tumeurs, état général) sera effectué. Des points limites ont été définis (taille et aspect de la tumeur) permettant de soustraire l’animal au protocole limitant ainsi dans le temps la souffrance et le stress potentiels.

Choix des espèces

La preuve d'une Mort Cellulaire Immunogène (MCI) complète nécessite des éléments in vivo, chez des modèles murins immunocompétents, à travers des expériences de vaccination. Cette approche vaccinale est la seule approche admise dans la littérature permettant de prouver la mobilisation du système immunitaire et la constitution d’une mémoire immunitaire anti-tumorale. Il nous est donc indispensable, après la phase in vitro de passer à un modèle d'organisme entier, ici la souris. Des souris de 6 à 8 semaines seront utilisées. En effet, l’âge de 6 à 8 semaines correspond à la période de maturation de la réponse immunitaire, et plus particulièrement de la réponse lymphocytaire.

576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales du foie, par chirurgie dans l'organe ou par injection sous la peau, puis des traitements par voie intrapéritonéale ou par plasma froid et un suivi par imagerie sous anesthésie, pour évaluer de nouvelles thérapies des cancers hépatiques. Le porteur indique que la contrainte principale tient au développement tumoral et prévoit des points limites. Il affirme qu'il n'est "pas possible de recréer in vitro la complexité d'un organisme entier".

Objectifs

Les cancers primitifs du foie (carcinome hépatocellulaire et cholangiocarcinome) représentent 7000 et 2000 nouveaux cas par an en France. Ce sont deux tumeurs de très mauvais pronostic. Les traitements curatifs (ablation de la tumeur, transplantation du foie) ne peuvent être proposés qu'à un nombre restreint de patients (40%). Cependant, l'efficacité des traitements curatifs est grevée par la récidive tumorale liée à la dissémination métastatique ou à l’émergence d’une nouvelle tumeur si le foie malade cirrhotique est laissé en place. Il n'existe pas de traitement de prévention de la récidive. Les patients ayant un CHC non opérable bénéficient depuis 2008 d'un traitement systémique palliatif, le sorafenib, mais son efficacité est limitée et l'émergence de résistances est rapidement objectivée. Aucun traitement palliatif montrant un bénéfice sur la survie ne peut être proposé aux patients ayant un cholangiocarcinome non opérable. Dans ce contexte, la recherche que nous menons a pour objectif de caractériser et quantifier l’activité de nouvelles thérapies (médicaments, traitement physique) pour le traitement des tumeurs hépatiques et de poursuivre les études dans des modèles précliniques. La preuve d’activité/efficacité anti-tumorale des nouvelles thérapies sera faite au préalable in vitro sur des lignées humaines de carcinome hépatocellulaire ou de cholangiocarcinome. Des évaluations seront ensuite conduites in vivo dans un nouveau modèle que nous souhaitons développer (fait l’objet de la présente demande), greffes syngéniques (orthotopique) et ectopiques (sous la peau). Cependant, certaines thérapies pourraient s'avérer aussi efficaces pour limiter la dissémination métastatique et le modèle de xénogreffe sous-cutanée ou orthotopique chez la souris immunodéprimée ne permet d'étudier cet aspect car la composante immunitaire est essentielle à la progression tumorale et conditionne la réponse aux traitements. Dans ces modèles, nous étudierons les traitements pour lesquels nous aurons montré au préalable in vitro un effet sur les capacités proliférative/migratoires et invasives des cellules cancéreuses. Afin que le bien-être animal soit au mieux respecté, des critères précis d’interruption du protocole seront définis.

Bénéfices attendus

Le carcinome hépatocellulaire et le cholangiocarcinome sont des tumeurs primitives du foie de mauvais pronostic pour lesquelles il n’existe que très peu d’options thérapeutiques systémiques et locales. Ce projet a pour objectif d’améliorer les thérapies existantes et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans le traitement des tumeurs hépatiques.

Procédures

Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à la mise en place des modèles de carcinome hépatocellulaire et le cholangiocarcinome et à leurs traitements. Pour cela, les animaux seront soumis dans un premier temps à une greffe de cellules tumorales orthotopique (cellule transplanté au niveau de l’organe cible par chirurgie sous anesthésie et analgésie) ou ectopique (injection sous-cutanée sur animal vigile). Une partie des animaux sera ensuite impliquée dans différents traitements seul ou en combinaison : injection intra-péritonéale ou plasma froid atmosphérique sous anesthésie. Les animaux seront suivis de manière longitudinale par imagerie non invasive effectuée sous anesthésie générale pour suivre la croissance tumorale. Enfin, les animaux seront euthanasiés en vue des différents prélèvements nécessaires aux analyses Tout au long du projet, les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter toute anomalie où point limites. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées et la SBEA et/ou le vétérinaire pourront être sollicité, le cas échéant.

Impact sur les animaux

La principale contrainte concerne le développement tumoral intrinsèquement lié à la question scientifique du présent projet. Les traitements devraient quant à eux réduire les effets liés au développement tumoral avec de possible effets secondaires mais qui restent très limité. Toutefois, afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter toute anomalie. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (analgésique, soins, etc.) et la SBEA et/ou le vétérinaire pourront être sollicité, le cas échéant.

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet (n=576) seront euthanasiés à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses ultérieures.

Remplacement

Dans la mise en œuvre de ce projet, un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement et l’évaluation de thérapies innovantes anti-cancers. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Nous travaillons avec des souris immunocompétentes afin de préserver le microenvironnement immunitaire et car ces animaux constituent des modèles validés pour l’étude de la progression tumorale et tester de nouveaux traitements. Nous souhaitons pour nos études développer un modèle de greffe syngénique (de même espèce, c.-à-d. injection de cellules de souris tumorales chez des souris immunocompétentes) i/ orthotopique (dans le foie) et ii/ ectopique (sous la peau). L’utilisation d’un modèle murin de greffes de cellules cancéreuses du foie de souris (même espèce) se justifie à double titre : tout d’abord, il permet de recréer au plus près l’environnement dans lequel prolifèrent les cellules tumorales, en particulier le microenvironnement immunitaire. Deuxièmement (concerne le modèle orthotopique), il permet d’analyser la capacité des cellules tumorales à métastaser et d’étudier l’efficacité des thérapies sur la dissémination métastatique.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Un nombre de 12 souris par groupe est prévu afin de pouvoir réaliser des statistiques. Un total de 576 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.).

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Nous travaillons avec des souris immunocompétentes afin de préserver le microenvironnement immunitaire et car ces animaux constituent des modèles validés pour l’étude de la progression tumorale et tester de nouveaux traitements. Description du ou des modèle(s) : Les lignées murines de cancer du foie dont sont issues de tumeurs de souris C57BL/6j. Nous utiliserons donc des souris de même fond génétique commerciales ou transgéniques pour nos gènes d’intérêt. Justification des stades/sexe : Des animaux de sexe femelle ou mâle seront utilisés entre 6 et 8 semaines d’âge. A cet âge, les souris sont jeunes et la croissance tumorale est optimale, et ce quel que soit le sexe. Dans le cadre de ce projet nous utiliserons indifféremment des femelles ou des males afin d’avoir une représentation du genre dans nos expériences. Quel que soit le sexe, la croissance tumorale est similaire.

190 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent l'implantation sous la peau de pompes délivrant de l'angiotensine II pour accélérer une atteinte cardiaque, puis des prélèvements de sang, des épreuves de course sur tapis roulant et des échographies sous anesthésie, pour tester une thérapie génique de la glycogénose de type III. Le porteur indique attendre un possible dommage rénal lié à l'angiotensine, jugé limité par la durée courte d'administration. Il affirme que le mécanisme de défense contre les virus est "impossible à recréer en laboratoire" et que le recours à l'animal est "indispensable".

Objectifs

-Etudier l’efficacité d’une approche de thérapie génique pour la glycogénose de type III (GSD III) dans un nouveau modèle rat de la pathologie présentant une hypertrophie du ventricule gauche à 9 mois. -Administration de l'Angiotensine II pour accélérer le développement du phénotype cardiaque afin d’évaluer l’effcicacité des produits de therapie génique sur le traitement ou la prévention de l’apparition de la pathologie cardiaque.

Bénéfices attendus

Développement d’un traitement de thérapie génique pour la glycogénose de type III

Procédures

-Implantation de les pompes d’Ang II. Procédure chirurgicale légère car l’implantation se fait sous le peau. La procédure d'implantation durera 10 minutes maximum. Les pompes resteront sous le peau un maximum de 14 jours. -Prélèvements du sang sont réalisés sur animal anesthésié lors d’un prélèvement au sinus rétro-orbitaire ou sur animal vigile à la veine sous-maxilliare. La procédure de prélèvement de sang est rapide, 5 minutes maximum de l’endormissement de l'animal à son réveil après le prélèvement. Pour le prélèvement dans la veine sous-mandibulaire, le prélèvement durera entre 30 sec et 1min maximum. -Evaluation fonctionnelle: tapis roulant (course maximum 10 minutes) et wirehang (moins d'un minute). -Echocardiographie et ECG sur animaux anesthésiés : la durée maximale sera de 15 minutes pour chaque procédure de l’endormissement au réveil de l’animal après les examens.

Impact sur les animaux

Le dommage collatéral que pourrait causer l’administration d’Ang II pourrait être le développement d’un dommage rénal, car l’effet direct est l’augmentation de la tension artérielle. Par contre on n'éspère pas avoir un dommange rénal car le temps de dosage sera que de 15 jours.

Devenir

Ils seront éuthanasiés par surdosage d’anesthésique (0,35 ml/kg d'EUTHASOL en tant que 140mg de pentobarbital sodique par kilo) à la fin du protocole afin de prélever les tissues: coeur, foie et muscles squelettiques pour analyser en premier lieu l'accelaration de la cardiomyophatie avec l'infusion de la AngII (fibrose et hypertrophie des cardiomyocites), asin que la correction par nos produits de therapie genique de la cardiomyopathie et de la pathologie musculaire et du foie présent chez les patients GSDIII et que le modèle de rat reproduit.

Remplacement

Dans le cas particulier des maladies génétiques, le principe de la thérapie génique repose sur l’utilisation de corps étrangers à l’organisme pour véhiculer le gène « médicament » jusqu’aux cellules à traiter. Pour apporter le cDNA de l’enzyme GDE (enzyme de débranchement du glycogène) jusqu’aux cellules du foie, nous utilisons des virus modifiés. L’organisme est entrainé à lutter naturellement contre les virus et ce mécanisme de défense est à ce jour impossible à recréer en laboratoire. Le recours à l'animal est donc indispensable pour vérifier le pouvoir thérapeutique des virus modifiés que nous utilisons. Nous testerons les virus que nous avons sélectionnés après nos premières expériences réalisées sur des cellules: tous les virus qui ne produisaient pas suffisamment d’enzyme GDE fonctionnelle ont ainsi été éliminés.

Réduction

Lors de la procédure 1, nous identifirons la dose, l’âge et le temps d’administration optimals de l’Ang II, cela nous permettra d’utiliser ces paramètres dans les procédures suivantes. Nous réaliserons une analyse statistique afin d'avoir le nombre d’animaux nous permettant de répondre à la problématique posée. Nous avons utilisé un test unilatéral standard de comparaison des moyennes afin d’avoir 90% de chance (Z1-β=-1.282) de détecter une baisse de la force chez le rat GSDIII avec un risque d’erreur de 5% (Z1-α =-1.645). Formule : n=2*((σ²/Δ²)*(Z1-α+Z1-β)²) - σ :déviation standard attendue (σ=0,261) - Δ : différence entre les moyennes (Δ=0,4998) D’où n=5 rats GSDIII par groupe.

Raffinement

Prélèvement de sang dans la veine sous-maxillaire sur rat vigile ou à la queue sur rat anesthésié pour mésurer la glycemie. L'échocardiographie est non invasive et sans douleur, mais pour réaliser cet examen dans les meilleures conditions pour les animaux, les rats seront anesthésiés par voie gazeuse, ça sera aussi le cas pour l'ECG. La minipompe d’Ang II est placée sous la peau des rats anesthésiés par voie gazeuse.

Choix des espèces

Nous avons choisi le modèle rat car dans un autre modèle rat de glycogénose de type II (maladie de Pompe), une atteinte cardiaque majeure a été identifiée. Le rat GDS III est le modèle de la glycogénose de type III, voilà pourquoi nous utiliserons ce rat et non le rat GDS II qui est le modèle pour la glycogénose de type II. De plus, le modèle rat a une taille qui permet de mieux étudier la morphologie du coeur par échocardiographie. Les procédures 1-2 nous permettront de définir la dose et le temps d'administration de l'Ang II ainsi comme la durabilite du phenotype apres l'enlevement des pompes. L'expérience que nous avons chez la souris et les rats nous a montré que les animaux accumulent du glycogène à partir de la naissance et qu'ils montrent un phénotype d'hypoglycemie à partir de 6 semaines. Donc nous utiliserons des rats de 6 semaines minimun.