Recherche appliquée

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de vaccination puis une greffe de cellules tumorales sous la peau, pour tester si une vaccination prévient l'apparition de tumeurs des voies aérodigestives. Le porteur indique que des tumeurs sont attendues, au moins dans les groupes témoins, et prévoit des points limites de taille et d'aspect. Il affirme que le recours à des souris immunocompétentes est "indispensable" et invoque le même fond génétique de l'"organisme entier" pour éviter le rejet de greffe.

Objectifs

Les carcinomes épidermoïdes de la tête et du cou (CETC) définissent un groupe hétérogène de tumeurs malignes qui se développent au dépend de l'épithélium des voies aérodigestives supérieures (cavité orale, pharynx et larynx). Les CETC sont le 6ème cancer le plus fréquent dans le monde, avec plus de 600 000 cas diagnostiqués chaque année. Leur incidence est particulièrement élevée en Europe de l'Ouest, et dans le Nord et le Nord-Est de la France (23 cas/100.000 habitants). Les CETC diagnostiqués à un stade précoce sont traités par radiothérapie ou chirurgie, et le pronostic est bon avec une survie globale à 5 ans d'environ 90%. Cependant, la majorité des CETS sont diagnostiqués à un stade localement avancé. La prise en charge de ces tumeurs de haut grade est multimodale et repose sur la combinaison de la chirurgie, de la radiothérapie et de la chimiothérapie à base de platine. Malgré des modalités de traitement agressives, le pronostic des CETC ne s'est que marginalement amélioré au cours des trois dernières décennies, avec une survie globale à 5 ans inférieure à 45-50 %. Ces traitements sont agressifs, avec de nombreux effets secondaires qui impactent très négativement la qualité de vie des patients, et malgré cela, le pronostic de ces tumeurs reste sombre, avec une survie globale à 5 ans inférieure à 50%. Très récemment, les immunothérapies (qui visent à mobiliser le système immunitaire du patient contre la tumeur) ont été développées pour la prise en charge des patients avec une tumeur ORL. Ces alternatives thérapeutiques peuvent provoquer des réponses tumorales complètes et de longue durée, mais ce uniquement chez environ 20% des patients. Nous souhaitons évaluer l’hypothese qu’un traitement de ces cancers avec des thérapies ciblées deja utilisees dans la pratique clinique puisse provoquer une mort cellulaire particuliere qui stimule le systeme immunitaire. Cette mort cellulaire, dite immunogène, pourrait à son tour stimuler la réponse aux immunothérapies et en augmenter leur efficacité. L’enjeu de ce projet est donc la réalisation d’une expérience d’immunisation (vaccination) sur de modèles murins de cancer et l’évaluation de la capacité de cette vaccination à prévenir l’apparition ou la progression tumorale de manière prophylactique.

Bénéfices attendus

Cette approche nous permettra d’établir si les protocoles de vaccination que nous avons mis au point sont capables de mobiliser le système immunitaire. Si une action anti-tumorale prophylactique est démontrée, cela permettra d’établir un rationnel solide sur l'induction d'une MCI. Cette mort cellulaire immunogène, pourrait à son tour stimuler la réponse aux immunothérapies et en augmenter l’efficacité pour des stratégies thérapeutiques futures.

Procédures

Chaque souris engagée dans ce projet sera d'abord injectée en sous-cutanée avec une suspension cellulaire pour la phase de vaccination. Une semaine plus tard, une deuxième injection sous-cutanée de suspension de cellules tumorales sera réalisée pour induire une tumeur.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront 2 injections sous-cutanées à une semaine d'intervalle. Ce geste ne devrait pas engendrer de douleur ou de souffrance particulière. La deuxième injection a pour but d'effectuer une greffe tumorale. Nous nous attendons donc à observer l'appartition de tumeurs, au moins pour les groupes témoins si la vaccination devait être un succès. Les souris seront surveillées tous les jours afin d'observer leur état général (état du pelage, comportement...). Des points limites sont définis (aspect et taille de la tumeur par exemple) pour pouvoir soustraire un animal avant qu'une souffrance ou une douleur ne s'installe.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet. En effet, il est nécessaire de pouvoir continuer l'étude en réalisant des analyses au laboratoire à partir des tissus prélevés sur ces animaux.

Remplacement

Après plusieurs travaux in vitro très encourageants, l’utilisation d’un modèle animal est indispensable. La démonstration de la mobilisation de la réponse immunitaire en réponse au traitement est impossible in vitro, et demande l’utilisation de souris immunocompétentes, chez lesquelles le déclanchement d’une réponse immunitaire anti-tumorale est réalisable par des expériences de vaccination. Ainsi, les enjeux de ce projet sont la démonstration de l’efficacité in vivo de cette modalité thérapeutique, qui pourra à terme trouver une application dans l’amélioration de la prise en charge des patients. La démonstration de capacité de notre protocole vaccinla à induire une MCI complète nécessite des éléments de preuves in vivo, chez des modèles murins immunocompétents, à travers des expériences de vaccination. Cette approche est la seule admise dans la littérature permettant de prouver la mobilisation du système immunitaire et la constitution d’une mémoire immunitaire anti-tumorale.

Réduction

Le projet nécessitera un nombre maximum de 120 souris. Ce nombre a été réduit au maximum tout en restant suffisant et statistiquement robuste pour apporter des réponses claires à notre projet.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des conditions sanitaires contrôlées en disposant d’un enrichissement adapté (carrés de coton pour la fabrication des nids ainsi que des tunnels ou maisonnette). Les animaux sont surveillés quotidiennement comme l'exige la réglementation en vigueur. Un suivi régulier comprenant l’observation de critères définis (poids, taille des tumeurs, état général) sera effectué. Des points limites ont été établis (taille et aspect de la tumeur) permettant de soustraire l’animal au protocole, limitant ainsi dans le temps une souffrance et un stress potentiels.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris de la lignée C57BL/6. Ceci se justifie par le fait que les lignées cellulaires que nous allons utiliser sont dérivées de carcinome ORL de souris C57BL/6. Il est indispensable que les lignées cellulaires et l'organisme entier utilisé pour cette étude que faut le même fond génétique pour éviter un phénomène de rejet de greffe (les souris C57BL/6 étant immunocompétentes). Des souris de 6 à 8 semaines seront utilisées. En effet, l’âge de 6-8 semaines correspond à la période de maturation de la réponse immunitaire, et plus particulièrement de la réponse lymphocytaire.

2 112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent des mutations mimant la sclérose latérale amyotrophique et subissent des chirurgies cérébrales, implantation de pompes, pose d'électrodes sous-durales et injection intracérébrale, puis des tests glycémiques, métaboliques et des tests comportementaux non détaillés sur trente-cinq jours. Le porteur indique que les chirurgies provoquent des douleurs atténuées par des analgésiques et prévoit de retirer un animal dont l'état ne s'améliore pas sous 48 heures. Il affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur un modèle animal dont l'hypothalamus est bien caractérisé et conclut que la souris ne "saurait être remplacée".

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA), la plus fréquente des maladies du système moteur adulte (2 à 3 nouveaux cas pour 100 000 habitants), reste une pathologie incurable et présente un pronostic extrêmement sévère, conduisant au décès, 2 à 5 ans après l’apparition des premiers symptômes. La SLA présente des formes sporadiques (90%) et familiales (10%). Diverses lignées de souris transgéniques ont été mises au point, récapitulant les symptômes de la maladie : une dégénérescence des neurones moteurs cortico-spinaux et des motoneurones spinaux, une dénervation des muscles striés squelettiques accompagnée d’une atrophie musculaire et d’une paralysie progressive se finissant par la mort. Ces lignées transgéniques sont à la base des recherches expérimentales dans le domaine de la SLA. Outre les symptômes moteurs, la SLA est aussi accompagné par une perte de poids très importante (chez l’homme et modèles murins) due à une diminution de la prise alimentaire, associée à un changement de la dépense énergétique. Il a été observé récemment que les modèles transgéniques ont aussi des dysfonctionnements du sommeil et du métabolisme. Ces altérations à l’origine de ces symptômes n'ont pas encore été demontrees. Chez la souris, l’hypothèse expliquant les bases cellulaires de ces dysfonctionnements sont un défaut fonctionnel des neurones hypothalamiques impliquées dans la régulation de la balance énergétique, la prise alimentaire et le sommeil. Ceci suggère l’existence d’un défaut hypothalamique touchant le contrôle de la prise alimentaire et la qualité/quantité de sommeil aussi chez le patient SLA. De plus d'un point de vue moléculaire, il a été montré que l'une des molécules impliquées dans la maladie, est un élément central de l’horloge interne. Ce dernier gène particulièrement contrôle de façon remarquable le rythme de prise alimentaire et le sommeil. Ceci faisant le lien entre la pathologie étudiée et les problèmes de l'horloge interne. Nous investiguerons donc, dans cette etude, le sommeil et le metabolisme de ces lignees transgeniques mimant la SLA.

Bénéfices attendus

Ces expériences nous permettront de déterminer si les défauts fonctionnels de l’hypothalamus peuvent être reversés et ainsi ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour la SLA. Au-delà de la SLA, ce projet est destiné à contribuer à l’effort commun de recherche sur l’étiologie des maladies neurodégénératives du système moteur.

Procédures

Les animaux subiront des procédures chirurgicales (implantation de pompes iPRECIO durée 2h, implantation d’électrodes subdurales durée 3h, injection intracérébrale durée 2h) en plus de test glycémique (durée 2h), comportementaux et métaboliques. Ces expériences dureront maximum 35 jours et prennent en compte le développement de la pathologie dans les 2 lignées transgéniques. Les prélèvements ne seront fait qu’en phase terminale d’une procédure.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons à des douleurs causées par les procédures chirurgicales qui seront atténuées par des antalgiques et analgésiques avant, pendant et après la chirurgie ainsi qu’une surveillance quotidienne pendant la période de récupération des souris. Nous préviendrons toutes infections par l’apport d’antibiotique a la fin des procédures chirurgicales. Enfin, nous ne laisserons aucune souris dans la souffrance en nous référant à la feuille en Annexe 1. Il sera pris la décision de sortir une souris de l’étude si les conditions de la souris ne montrent pas d'amélioration sous 48 heures.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort pour des analyses biochimiques et immunologiques, après avoir collecté sang, tissus et organes.

Remplacement

La SLA est une maladie d’origine multifactorielle et multicellulaire. Les cultures cellulaires ne permettent pas de modéliser l’aspect intégré de cette pathologie. Nous avons donc besoin de recourir à des modèles animaux qui présentent, en outre, une organisation du système nerveux proche de celle de l’homme pour réaliser ce projet de recherche.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux dans ce projet, les animaux destinés aux analyses biochimiques ou histologiques seront au préalable inclus dans les études fonctionnelles. Le nombre de souris incluses dans ce projet a été précisément calculé à partir des observations faites dans le laboratoire lors d’études préliminaires ce qui a permis de calculer la puissance statistique et d’éviter les biais de taille d’effet (nombre suffisant permettant l’exploitation statistique). Le logiciel GPower nous a permis de calculer le nombre minimum nécessaire par groupe à 24. Secondairement lorsque les données seront récoltées nous utiliserons une analyse statistique ANOVA à un facteur avec une analyse post-hoc pour analyser les résultats.

Raffinement

Les animaux auront accès ad libitum à l’eau et à la nourriture, bénéficieront de conditions d’hébergement conformes à la réglementation en vigueur. L’enrichissement de l’environnement des animaux (coton compressé pour faire des nids, maisons en plastique rouge), le maintien des interactions sociales et la surveillance quotidienne des animaux permettront de s’assurer de leurs bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la pathologie étudiée afin qu’il puisse être pris en charge. Des points limites (perte de poids, difficultés métaboliques, etc.) permettant de soustraire l’animal à la souffrance ont été établi. De plus, nous appliquerons également le principe de raffinement au niveau des méthodes de pré-anesthésie, d’anesthésie et de prise en charge analgésique en cas de procédure.

Choix des espèces

La souris est un modèle important et pertinent dans l’étude de la SLA. Pour intégrer la complexité de la pathologie, et notamment des implications du dysfonctionnement de hypothalamus, il est indispensable de travailler avec un modèle animal possédant une structure hypothalamique bien caractérisée. De plus, les modèles transgéniques de souris sont des modèles expérimentaux très puissants (génétique connue, commercialisation d’outils moléculaires, etc.). En conséquence, dans le cadre de la question biologique posée, le modèle animal choisi ne saurait être remplacé par un autre. Les animaux seront utilisés à partir de 30 jours, au moment du sevrage, car l’injection de DREADDS nécessite d’être faite sur des souris âgées de 30 jours car le DREADDS est laissé 15 jours avant de pouvoir conduire un quelconque effet. Pour les pompes iPRECIO et l’EEG des animaux de 65 jours seront utilisés pour pouvoir observer les effets au stade présymptomatique.

125 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie du fémur pour y greffer un biomatériau, puis quatre séances d'imagerie sur trois mois avant d'être tué pour analyse des tissus. Le porteur indique une douleur modérée traitée par analgésique et précise que les rats dont le fémur n'a pas été correctement stabilisé sont tués et remplacés. Il présente cette étape animale comme un préalable "impératif" avant des essais sur de plus gros animaux puis en clinique.

Objectifs

La reconstruction des pertes de substances osseuses importantes, telles qu'elles se produisent dans les cas d'accidents graves, de cancers ou de métastases osseuses, reste un challenge. Les greffes d'os autologue (lambeaux osseux, prélevés chez le patient) sont le traitement de référence mais ils présentent de nombreux inconvénients, en raison de la quantité limitée d'os que l'on peut prélever sur un site sain, et des conséquences de ce prélèvement sur son état général et sur sa qualité de vie. En outre, ces procédés chirurgicaux complexes ne sont pas toujours réalisables en raison de contre-indications d'ordre anatomique, vasculaire ou médicale. Le but des recherches qui seront menées durant les 5 prochaines années, est de développer un procédé de reconstruction osseuse avec greffe d'un biomatériau capable de se substituer à l'os manquant dans un premier temps, puis idéalement de permettre la régénération d'un os nouveau.

Bénéfices attendus

Les résultats des expériences conduites sur ce modèle animal sont un préalable à la poursuite de travaux impliquant d'autres modèles, notamment chez le gros animal. Des résultats médiocres obtenus avec un biomatériau conduisent à l'arrêt de l'étude de celui-ci. A l'inverse, des résultats positifs (régénération osseuse au moins partielle, supérieure à celle observée avec le matériau de référence) permettent d'envisager le dépôt de demandes de financement pour la poursuite des études : tests chez le gros animal, puis essais cliniques.

Procédures

Chaque animal sera soumis à une chirurgie orthopédique (il s'agit d'un acte chirurgical unique d'une durée de 20 minutes), puis à 4 séances d'imagerie de rayons X (durée de l'examen: 15 minutes) et d'IRM (durée de l'examen: 30 minutes) à J2, J28, J56, J72, éventuellement J90.

Impact sur les animaux

Les opérations réalisées pourront entraîner une douleur modérée. Celle-ci sera traitée par l'injection intra-péritonéale de buprénorphine. Dans certains cas, une réduction de la mobilité des animaux pourra être constatée, si les fixateurs externes destinés à stabiliser le fémur n'ont pas été parfaitement posés. Dans ce cas, les animaux concernés seront sacrifiés et remplacés par d'autres.

Devenir

Les animaux sont maintenus en vie jusqu'à 3 mois après l'opération. Ils sont tous sacrifiés à J90 pour procéder à une analyse histologique des tissus dans la région opérée.

Remplacement

L'utilisation en clinique d'un nouveau procédé chirurgical avec un biomatériau nécessite impérativement une phase d'expérimentation pré-clinique. Des études in vitro ont été réalisées pour éliminer une éventuelle toxicité cellulaire du biomatériau (nHA +/- Sr) et pour évaluer le potentiel de différenciation ostéoblastique de ce complexe. Le modèle de défait osseux critique sur la diaphyse fémorale de rat a été décrit dans plusieurs études antérieures.

Réduction

L'utilisation de systèmes d'imagerie non invasie (IRM et microtomographie de rayons X) permet de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés. En effet, le suivi de chaque animal permet d'obtenir des informations sur le processus de régénération et sur divers autres paramètres biologiques à différents temps, sans avoir besoin de sacrifier les animaux. Sans ces procédures, il faudrait envisager des groupes de rats pour chaque temps expérimental où une analyse est requise.

Raffinement

L'utilisation de l'imagerie non invasive par microtomographie de rayons X constitue en soi un raffinement dans la mesure où il limite le nombre d'animaux et permet d'obytenir un grand nombre d'informations sur le même animal tout au long de l'expérience. Pendant la chirurgie, une cage après l'autre sera amenée dans la salle d'opération afin d'éviter toute source de stress par contact visuel, olfactif et sonore des animaux opérés et des animaux à opérer. Après la chirurgie, chaque rat se réveillera dans une cage à part pour éviter le contact avec des conégnères non anesthésiés. L'anesthésie se fera par inhalation d'isoflurane, et la profondeur de l'anesthésie sera vérifiée par immobilité, réflexe de retrait et fréquence respiratoire. La prise en charge de la douleur sera prise en charge par l'injection sous-cutanée d'un analgésique: 0.3 mg par kg de buprénorphine juste avant l'intervention et 24 heures après comme recommandé. Si nécessaire, une troisième dose peut être appliquée après 48 heures. Pour réduire le risque d'infection au niveau du site opératoire, un antibiotique prophylactique (céfazoline, 100 mg/kg) sera injecté par voie sous-cutanée le jour de l'opération et le lendemain (protocole calqué sur celui utilisé en clinique). Après le réveil, le rat reviendra dans sa cage d'origine. Les rats seront hébergés par 3 dans des cages comportant des tunnels, avec accès illimité à l'eau et à la nourriture, placées dans une salle dont les paramètres d'ambiance (température, hygrométrie) sont parfaitement contrôlés.

Choix des espèces

le rat wistar a été choisi à la suite de travaux réalisés dans notre laboratoire et par d'autres équipes portant sur l'analyse des propriétés hostologiques et biologiques des membranes induites en site osseux fémoral chez le rat. Il est d'autre part décrit dans de nombreuses études dans le monde. Autres critères retenus: animaux adultes , poids 225-250 grammes la croissance du squelette doit être arrivée à son terme il faut des animaux de poids suffisant pour supporter la procédure

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit deux injections de virus, une souche atténuée candidate au vaccin puis la souche pathogène, et subit jusqu'à sept prises de sang. Le porteur indique que l'infection par le virus du Nil occidental peut provoquer paralysie, prostration, dos voûté et perte de poids d'au moins 20 %, l'animal étant tué dès l'apparition d'un signe sévère. Il affirme que l'étude d'une réponse protectrice "ne peut être effectuée qu'in vivo".

Objectifs

Le virus du Nil Occidental (West Nile Virus) est un flavivirus pouvant conduire à des cas sévères d’encéphalite virale (dans 1 infection sur 150 environ chez l’homme). Cela pouvant conduire à la mort de la personne infectée. Il n’existe à ce jour que des traitements symptomatiques et il n’existe aucun vaccin efficace chez l’homme. La mise en place d’un vaccin atténué contre le WNV est donc d’intérêt clinique. Nous avons décrit dans les dernières années différentes mutations permettant d’atténuer le virus WNV. Ainsi des mutations dans la protéine de membrane réduisent significativement la production virale par rétention réticulaire. De plus une mutation dans la protéine d’enveloppe abrogeant la glycosylation de la protéine E conduit également à une souche atténuée. Cependant ces virus ne sont pas complètement atténués, et la probabilité de réversion est théoriquement importante. Notre objectif est de générer un virus vivant atténué comportant simultanément plusieurs des mutations décrites, et tester la capacité de ce virus à répliquer, et à éliciter une réponse immunitaire protectrice contre une infection d’épreuve. En un premier temps, nous testerons l’atténuation du virus in-vivo, i.e. l’absence de symptômes sévères et l’absence de mortalité. Nous confirmerons que chez l’animal aucun virus révertant n’émerge (i.e. les mutations sont maintenues). Enfin nous testerons l’efficacité de ce virus à induire une protection contre une infection secondaire par le virus WNV sauvage (challenge).

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est d’étudier un triple mutant du virus WNV (1 mutations dans la protéine E, deux mutations dans la protéine M) qui pourrait constituer un virus atténué, sûr et au potentiel vaccinal. Les 3 mutations étudiées dans ce projet ont déjà été décrites indépendamment dans la littérature mais mis en évidence une atténuation partielle ou pourraient muter et redevenir pathogène.

Procédures

Chaque animal sera soumis à deux injections de virus (souche vaccinale puis souche pathogène ; quelques minutes par injections), et à 7 prises de sang au maximum (alternance veine caudale et rétro-mandibulaire ; quelques minutes par prise de sans).

Impact sur les animaux

Les souris seront suivies et mises à mort dans le cas de souffrance selon les critères définis. Suite à l’infection par le virus West Nile, les souris sont susceptibles de développer les symptômes suivants : Symptômes sévères : paralysie, prostration, dos fortement voûté, perte de poids supérieure ou égale à 20%, facies douloureux. Symptômes légers : réduction de la motricité, isolement, dos légèrement voûté, perte de poids inférieure à 20%, poils ébouriffés. Dans le cas de l’apparition d’un symptôme sévère, l’animal sera immédiatement mis à mort. Dans le cas de l’apparition de deux symptômes légers, l’animal sera immédiatement mis à mort.

Devenir

Les souris ont reçu du virus et un traitement potentiellement vaccinal, elles ne peuvent donc ni être réutilisées ni replacées ni adoptées, et sont donc mises à mort.

Remplacement

L’étude de la capacité d’un virus atténué à induire une réponse protectrice ne peut être effectuée qu’in vivo. Nous aurons au préalable confirmé que le virus est capable de réplication efficace et incapable de réverter in vitro. Le modèle souris (Balb/c) est un modèle précédemment utilisé pour les essais vaccinaux précliniques contre les infections à WNV.

Réduction

Nous commencerons par une expérience préliminaire sur 18 souris femelles, qui permettra de valider le nombre d’animaux à utiliser dans les expériences suivantes pour atteindre la significativité. Les groupes contrôles pour lesquels on connait bien la mortalité en réponse au virus WT, est nécessaire pour tester l’inoculum viral ; nous aurons dans ce groupe 3 animaux. Les expériences ne seront réalisées sur les mâles que si les résultats sont concluants chez les femelles. Nous commencerons par travailler chez les femelles car elles sont plus faciles à gérer. Bien que des différentes immunologiques entre mâles et femelles peuvent être décrits dans certains, cas, il n’y a eu aucune différence observée au cours les études antérieures.

Raffinement

Les souris seront suivies 3 fois par semaine (quotidiennement à partir de J7 post challenge). Pour réduire les risques de souffrance inutile, les animaux seront mis à mort selon les critères de suivi. Les souris seront suivies et mises à mort dans le cas de souffrance selon les critères définis. Suite à l’infection par le virus West Nile, les souris sont susceptibles de développer les symptômes suivants : Symptômes sévères : paralysie, prostration, dos fortement voûté, perte de poids supérieure ou égale à 20%, facies douloureux. Symptômes légers : réduction de la motricité, isolement, dos légèrement voûté, perte de poids inférieure à 20%, poils ébouriffés. Dans le cas de l’apparition d’un symptôme sévère, l’animal sera immédiatement mis à mort. Dans le cas de l’apparition de deux symptômes légers, l’animal sera immédiatement mis à mort. En cas de problèmes de motricité, la nourriture et du gel d’hydratation seront déposés directement dans cage. En cas de symptômes légers, davantage de coton dentaire sera ajouté.

Choix des espèces

La souris Balb/c est un modèle à la fois simple et bien décrit de mammifère pour évaluer la capacité vaccinale de virus atténués WNV. S’ils sont positifs, les résultats chez la souris constitueront une première preuve de l‘efficacité vaccinale de ce virus atténué, permettant alors d’envisager la conduite d'autres essais précliniques. En règle générale, les jeunes animaux sont plus sensibles aux Flavivirus neurotropes et sont donc préférentiellement utilisés. Nous utiliserons dans cette étude des animaux âgés de 3 à 4 semaines, afin que les souris soient âgées de 8 à 9 semaines au moment de l’épreuve.

2 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent dès le quatorzième jour de vie l'injection d'un carcinogène chimique, puis subissent un régime induisant une forte prise de poids, des prélèvements sanguins réguliers et un développement tumoral du foie pouvant provoquer amaigrissement et altération de l'état général. Les retombées annoncées pour les patients, de nouveaux outils diagnostiques et thérapeutiques, sont renvoyées au conditionnel et au long terme. Le porteur affirme que le modèle murin est "indispensable" car il constitue selon lui le "seul modèle préclinique" permettant de modifier l'expression des gènes de façon ciblée.

Objectifs

Le foie est un organe vital qui intervient dans le stockage du glucose, la fabrication de la bile et la détoxification. L'incidence du cancer du foie (CHC) est en forte augmentation depuis 20 ans et ce cancer représente la 3ème cause de mort par cancer dans le monde. Ce cancer grave dispose de très peu de traitements efficaces et l’apport de nouvelles stratégies thérapeutiques représente donc un enjeu majeur dans la prise en charge de cette maladie. Bien que des progrès aient été accomplis dans le déchiffrage des mécanismes moléculaires du CHC, la dissection des événements précoces de la carcinogenèse hépatique, notamment comprendre la transformation tumorale des hépatocytes, cellules majoritaires du foie, est centrale pour élucider la pathogénie sous-jacente de la maladie. Des études récentes ont montré que le développement du CHC était intimement lié à un contexte d’altérations génétiques, métaboliques et inflammatoires favorisant un remaniement du cycle de division de l’hépatocyte, cellule majoritaire du foie. Dans ce cadre, nos travaux visent notamment à décrypter les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le cycle de division des hépatocytes, pour assurer ainsi le maintien de l’intégrité du tissu hépatique.

Bénéfices attendus

Les résultats de notre projet permettront de déterminer les mécanismes par lesquels l’hépatocyte assure le maintien de l'intégrité du génome, et en particulier lors des maladies métaboliques et inflammatoires du foie conduisant au développement d’un cancer du foie. Les retombées de nos travaux devraient conduire à élaborer chez l’Homme de nouveaux outils diagnostic/pronostic et des stratégies thérapeutiques innovantes pour ce cancer grave sans traitement effectif.

Procédures

Une injection rétro-orbitale sera réalisée (une fois, à 5 semaines de vie, durée : 1 minute) sur animal anesthésié. Une injection intra-péritonéale de tamoxifène sera réalisée (une fois, à 6 ou 7 semaines de vie suivant le lot expérimental, durée 30 secondes) sur animal vigile. Un prélèvement sanguin au niveau de l'apex de la queue de l'animal sera réalisé pour une mesure de glycémie de manière bi-mensuelle (16 répétitions, entre le 4ème et 12ème mois de régime, durée 30 secondes-1 minute). Une injection intra-péritonéale de Diethyl-nitrosamine (carcinogène chimique) sera réalisée (une fois, à 14 jours de vie, durée 30 secondes) sur animal vigile. Une injection intra-veineuse (veine de la queue) sera réalisée (une fois, à 6 semaines de vie, durée 5-7 secondes) sur animal vigile.

Impact sur les animaux

Nous procéderons à une injection intrapéritonéale et un certain inconfort, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine) pourra être ressenti par les animaux. Du par le régime alimentaire auquel seront soumis les animaux, une prise de poids importante est attendue. Du fait de l’injection IV par la veine caudale, une douleur transitoire dans cette région pourra être ressentie. Du fait d’un développement tumoral attendu au niveau du foie, les animaux pourraient être sujets à une altération de leur état général (asthénie, perte de poids...).

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie par une méthode réglementaire de l’ensemble des animaux (2240).

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence dans notre cas le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les processus de carcinogenèse du foie.

Réduction

Nous estimons que pour ce projet, 2240 animaux seront étudiés. Les groupes expérimentaux seront constitués du minimum d’animaux nécessaire et suffisant pour permettre une analyse statistique robuste des effets observés. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive (injection intra-orbitaire) sera précédée d’une courte anesthésie générale (mélange gazeux d'O2-Isofluorane [0.5-2.5%]). La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, la mise à mort anticipée de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Pour ce projet de recherche, nous avons choisi la souris du fait de la disponibilité de modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées dans ce projet de recherche sont de jeunes adultes (5 à 6 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux, capacité essentielle notamment dans la régulation des lésions hépatiques qui prennent place dans la séquence NAFL/NASH. Une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l'expérimentation.

246 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation du cerveau sous anesthésie puis des administrations par le nez de vésicules issues de cellules souches, avec des tests comportementaux comme le labyrinthe en Y, le labyrinthe surélevé et le rotarod, pour limiter les séquelles cognitives de la radiothérapie. Le porteur indique surveiller les animaux quotidiennement et les mettre à mort en cas d'écoulement nasal marqué, de tête penchée ou d'une perte de poids de 20 %. Il affirme qu'un modèle in vivo est obligatoire pour valider cette stratégie thérapeutique.

Objectifs

La radiothérapie ou un surdosage consécutif aux applications médicales sont très souvent associés au traitement des tumeurs du système nerveux central. 50-90% des patients survivants au traitement de tumeurs du cerveau par radiothérapie présentent dans les 6 mois suivant le traitement des troubles cognitifs tardifs. Les rayonnements ionisants induisent au niveau cérébral un stress oxydatif chronique, une neuro-inflammation, l’apoptose des cellules endothéliales, une raréfaction vasculaire et une atteinte des zones de neurogenèse induisant à terme des troubles cognitifs. Par conséquent, il est indispensable de développer de nouveau traitement. L’efficacité thérapeutique des vésicules extracellulaires issues de cellules souches mésenchymateuses pour le traitement des lésions intestinales radio-induites ou musculo-cutanées a été démontré. Les VE-CSM favorisent le processus de néovascularisation et le processus de réparation tissulaire. L’objectif de ce projet est de proposer une thérapie innovante basée sur l’administration intra-nasale des VE-CSM afin de limiter les conséquences vasculaires et neuropathologiques de la radiothérapie cérébrale et à long terme les troubles cognitifs. Dans le cadre du respect de la règle des 3R, les protocoles expérimentaux sont établis avec un nombre d’animaux réduit mais suffisant pour obtenir des résultats pertinents. Les animaux seront irradiés avec un Sarrp au niveau cérébral. Les animaux seront euthanasiés à différents temps post-irradiation. Les études fonctionnelles, moléculaires et cellulaires seront réalisé sur animaux vigiles ou anesthésiés. Des prélèvements seront réalisés sur un modèle murin anesthésié avant ou après euthanasie. Le nombre total d’animaux utilisés pour ce projet sera de 246.

Bénéfices attendus

Le succès de cette preuve de concept thérapeutique sur l’injection des VE-CSM sera complétée par un autre modèle de radiothérapie fractionnée (3*5Gy) et dans le futur avec une validation sur gros animal qui ouvrirait vers des perspectives de transfert clinique pour limiter la toxicité associée au traitement des tumeurs cérébrales par radiothérapie.

Procédures

Irradiation cérébrale sous anesthésie gazeuse : 10 min sous anesthésie gazeuse isoflurane Administration intra-nasale sous anesthésie gazeuse : environ 5 min par administration Tests comportementaux : - Labyrinthe en Y : 10 min, réalisé 4 fois (1, 2, 4 et 6 mois) - Labyrinthe en croix surélevé : 5 min, réalisé 4 fois (1, 2, 4 et 6 mois) - Rotarod : 3 fois 3 min par séance (1h entre chacun des 3 passages), réalisé 2 fois (4 et 6 mois) Analyse echodoppler sous anesthésie gazeuse : 10 min sous légère anesthésie gazeuse isoflurane Prélèvement sanguin (80uL) 1 fois sous anesthésie gazeuse isoflurane avant euthanasie, durée du prélèvement sanguin 15 secondes

Impact sur les animaux

Les animaux seront observés quotidiennement pendant toute la durée des expérimentations. La souffrance de l’animal sera évaluée quotidiennement par le suivi de son comportement et de son aspect physique (piloérection, perte de poids, prise alimentaire). Si un animal montre des difficultés à se déplacer tel qu’un comportement et/ou déplacement anormal, une prise alimentaire diminuée : des croquettes humidifiées ou du gel de transport seront déposés dans la cage. Également, après l’inoculation nasale, si un animal présente un écoulement nasal important et/ou une tête penchée, il sera euthanasié. Enfin, si un animal montre une perte de poids de 20%, piloérection et/ou dos rond, l’animal sera euthanasié.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser les prélèvements des structures cérébrales.

Remplacement

Le nouveau développement de stratégie thérapeutique doit être validé sur des modèles pré-cliniques. Ici le 1er modèle utilisé est la souris sur lequel nous maîtrisons les techniques fonctionnelles (vasculaire, inflammatoires, comportementales/cognitifs) pour valider notre approche thérapeutique.

Réduction

Les modèles d’expérimentation utilisés sont fortement influencés par la physiologie. Pour l’évaluation des paramètres vasculaires et inflammatoires le nombre de 10 animaux comptabilisés dans chaque protocole expérimental est nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement robustes (Anova, Ttest). Afin d’évaluer les paramètres cognitifs, un nombre de 15 animaux est indispensable pour obtenir des résultats exploitables (Anova, Ttest).

Raffinement

Un suivi des animaux quotidien sera réalisé afin d’appliquer les points limites pour limiter la souffrance des animaux.

Choix des espèces

Afin de développer et proposer des thérapies, nous sommes dans l’obligation d’utiliser un modèle in vivo. Le modèle murin sélectionné pour ce travail est le plus pertinent puisqu’il est le plus utilisé dans les études précliniques. Également, nous avons déjà démontré dans différents modèles murins soumis aux rayonnements ionisants l’efficacité thérapeutique des VE-CSM dans les processus de néovascularisation et la réparation tissulaire. Enfin, nous maîtrisons les techniques indispensables afin d’évaluer les paramètres vasculaires, inflammatoires et cognitifs pour démontrer l’efficacité de notre traitement.