Recherche appliquée

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est rendu obèse par un régime riche en lipides, puis soumis à des mises à jeun, des tests de tolérance au glucose et des prélèvements de sang à la queue, pour évaluer l'effet d'un prébiotique et de vitamines B sur les améliorations métaboliques liées à la perte de poids. Les organes sont ensuite prélevés après mise à mort. Le porteur affirme que l'étude du microbiote et des variations de poids "ne peut être réalisée in vitro" et "nécessite" le recours à la souris.

Objectifs

L'incidence de l'obésité sévère et des complications métaboliques associées est en constante augmentation, constituant un problème de santé publique majeur au niveau mondial. L'obésité est un facteur de risque de développement de complications cardiométaboliques comme le diabète de type 2. Par ailleurs, l'altération de la composition et de la fonctionnalité des bactéries peuplant notre intestin, appelé microbiote intestinal, semble également être un élément clé dans ce contexte. On note notamment une diminution du nombre d'espèces bactériennes ainsi que des modifications fonctionnelles du microbiote intestinal en situation pathologique telle que le diabète de type 2 ou l'obésité sévère. Parmi les nombreux paramètres physiologiques modulés par le microbiote intestinal, on trouve la production de certaines vitamines. Ainsi, l'altération de la production bactérienne des vitamines B pourrait avoir un impact sur le statut vitaminique, inflammatoire et métabolique de l'hôte. Des résultats préliminaires ont montré que chez des patients atteints d'obésité, les taux circulant de certaines vitamines et leur production bactérienne étaient diminués suggérant un déficit en vitamines dans ce contexte. Enfin, on sait que la perte de poids dans ce contexte, présente un grand nombre de bénéfices pour l'hôte: amélioration de la réponse au glucose, diminution de l'inflammation; Notre hypothèse est donc qu'en situation de perte de poids suite à une obésité sévère, une supplémentation en vitamines associée à une modulation des bactéries du microbiote intestinal par un apport en fibres, potentialiserait les bénéfices déjà connus de la perte de poids. Suite à une obésité induite par l'administration d'un régime enrichi en lipides, nous échangerons le régime par un régime standard moins riche en lipides. En parallèle, les animaux seront supplémentés en vitamines et fibres avant et/ou pendant la perte de poids.

Bénéfices attendus

A la vue des expériences préliminaires et de la littérature, la double supplémentation en FOS et biotine devrait permettre de limiter la prise de poids, notamment de masse grasse et de limiter aussi l'altération du métabolisme gludicidique induits par le régime HFD. De même il est attendu que lors de la perte de poids induite par un changement de régime, cette double supplémentation permette de potentialiser les effets métaboliques de la perte de poids. Par ailleurs, ces résultats permettront une translation chez l'Homme plus aisée et la mise en place d'études adéquates pour améliorer la prise en charge de l'obésité sévère chez l'Homme.

Procédures

Les animaux seront soumis à des mesures de la composition corporelle permettant de déterminer leur pourcentage de masse maigre et de masse grasse toutes les deux semaines. Pour cela les animaux vigiles sont placés dans un tube s'adaptant à leur taille le temps de la mesure. Cette mesure est non invasive, silencieuse et rapide (2 minutes) ce qui permet de limiter le stress subit par les animaux. Les animaux seront également soumis à des tests de tolérance au glucose pour lesquels une mise à jeun de 6h est nécessaire suivie d'une ingestion de glucose par les animaux et de mesures de leur glycémie aux temps 0, 15, 30, 60 et 90 min post-ingestion à l'aide d'un appareil mesurant le taux sanguin de glucose à partir d'une goutte de sang prélevée à la queue. En parallèle aux temps 0, 15, 30 et 60 min, 30μl de sang sont prélevés à la queue à l’aide d’un tube adapté pour effectuer un dosage sérique d’insuline. Tout au long de cette procédure, tout sera fait pour limiter le stress des animaux.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables du projet sont ceux liés à l'induction de l'obésité. En effet, la consommation d'un régime enrichi en lipides tel que celui utlisé ici peut mener à une élévation du taux de cholestérol sanguin, une altération de la glycémie et de la réponse au glucose, qui sont des facteurs de risque cardiovasculaire.

Devenir

La collecte des organes chez les souris préalablement traitées avec le FOS et la biotine dans le contexte de la perte de poids induite en échangeant le régime hyperlipidique par un régime standard chow nous permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans les paramètres métaboliques mesurés au cours du suivi. Pour cela, la collection d'organes après l'euthanasie des animaux est nécessaire.

Remplacement

L’étude de l’écosystème microbien digestif et son impact sur les maladies métaboliques, ne peuvent être réalisés in vitro. En effet, la majorité des bactéries digestives ne survivent en dehors de leur hôte, en l’occurrence la souris, ce qui nécessite le recours au modèle murin. Par ailleurs, les variations pondérales entrainent des modifications au niveau d’un grand nombre d’organes et nécessite donc d’être étudiée in vivo. De plus, les grandes fonctions systémiques (immunité, inflammation) participent de manière très importante au développement des désordres métaboliques, qui ne saurait donc être évaluée en l’absence de ces systèmes. La souris est l’espèce choisie dans la majorité des études antérieures portant sur les maladies métaboliques. Les souris sont faciles à manipuler et les administrations orales bien maitrisables ; de plus, la présence de notre établissement utilisateur sur le site nous permet d’utiliser ce modèle dans de bonnes conditions d’expérimentation.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, le design expérimental présenté correspond au nombre minimal de groupes et de souris nécessaires afin d’obtenir des résultats scientifiquement pertinents et statistiquement fiables. Le calcul de puissance indique que 10 souris par groupe « traitement » est le nombre minimal permettant d’obtenir des résultats statistiquement fiables compte tenu de la variabilité interindividuelle des paramètres mesurés (poids, tolérance au glucose).

Raffinement

Nous prendrons soin de faire exécuter toutes les manipulations par des personnes expérimentées et compétentes afin de réduire la sévérité et l’intensité de la douleur, ainsi que le stress généré au maximum. Nous avons également choisi un matériel et des procédures adéquats pour limiter la douleur et le stress, avec en particulier l’utilisation des sondes de gavage en plastique fines et souples. Un suivi quotidien sera réalisé afin de veiller au bon état de santé des animaux. De plus, la mise en place de points limites permettra de repérer au plus tôt tout problème. De plus, un suivi hebdomadaire de prise alimentaire et du poids sera réalisé, ce qui permet, en plus des données expérimentales, de s’assurer du bon état de santé des animaux ainsi que de les habituer aux manipulations et ainsi de générer moins de stress lors des procédures ultérieures (tests de tolérance au glucose).

Choix des espèces

La souris est l’espèce choisie dans la majorité des études antérieures portant sur les maladies métaboliques. Les souris sont faciles à manipuler et les administrations orales bien maitrisables ; de plus, la présence de notre établissement utilisateur sur le site nous permet d’utiliser ce modèle dans de bonnes conditions d’expérimentation. Nous souhaitons observer les effets sur l’état métabolique des animaux à l’âge adulte ; les animaux seront donc âgés de 8 semaines au début du traitement et de la mise sous régime. Une semaine d’habituation sera observée après la réception des animaux afin de limiter leur stress.

2 860 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une à trois injections et une greffe de cellules tumorales pour induire un mélanome, la plupart des injections étant faites sans anesthésie, que le porteur juge plus traumatisante que l'acte lui-même. Il décrit comme principal risque l'ulcération de la tumeur, et toutes les souris sont mises à mort en fin d'étude pour des analyses post-mortem. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune alternative n'existe et que ces expériences sont "indispensables" car les interactions in situ ne peuvent être modélisées in vitro.

Objectifs

Notre projet vise à déterminer le rôle précis d’un récepteur de signal de danger dans les réponses immunitaires anti-tumorales dans un modèle de mélanome chez la souris. Pour cela nous utiliserons des modèles de souris conditionnellement déficientes pour ce récepteur et nous leur injecterons des cellules tumorales suivi ou non de transfert adoptif de lymphocytes T protégeant ou attaquant la tumeur et nous étudierons la pousse tumorale, le phénotype des cellules immunitaires recrutées au sein de la tumeur et des ganglions drainants. Enfin nous évaluerons l’influence de traitements immunothérapeutiques dans ces modèles de souris.

Bénéfices attendus

Le cancer est un problème de santé publique majeur, et la 2ème cause de mortalité dans le monde. Récemment, des traitements développés chez la souris visant à lever les phénomènes de tolérance immunitaire contre le cancer ont prouvés leur efficacité chez l’Homme et redonnés un espoir de réduire la mortalité liée à cette maladie. Ces traitements n’ont néanmoins pas encore permis d’éradiquer la maladie. Ce projet permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et d’améliorer les immunothérapies visant à inhiber la tolérance immunitaire aux tumeurs et augmenter l’efficacité des vaccins contre le cancer.

Procédures

Les animaux seront soumis à des Injections sous cutanées, intra péritonéales, intraveineuses. Chaque animal recevra entre 1 et 3 injections selon la procédure: procédure 1 : 1 seule injection sous-cutanée; procédure 2: une injection sous-cutanée et une injection intraveineuse (sur animal anesthésié) 1 à 3 jours plus tard; procédure 3: 1 injection sous-cutanée et 2 injections intrapéritonéales, chacune à 7 jours d'intervalle. Sauf cas indiqué, les procédures ne justifient pas l’utilisation d’anesthésiques. Une procédure de sédation rendrait en effet l’ensemble de la procédure plus traumatisante pour l'animal que la procédure expérimentale elle-même.

Impact sur les animaux

Les procédures de notre projet sont bien établies et réalisées par du personnel expérimenté pour leur réalisation. Les nuisances et effets indésirables possibles ont donc peu de chance de se produire. Etant donné les précautions prises dans l’exécution du projet, les risques comportent principalement l’ulcération de la tumeur chez les animaux porteurs de tumeurs et les éventuelles réactions secondaires (irritations cutanées, diarrhées, poil hirsute, perte de poids) aux traitements immunothérapeutiques. Pour éviter leur apparition, le comportement des animaux sera contrôlé régulièrement (tous les jours par le zootechnicien et 3 fois par semaine par l’expérimentateur). Nous serons vigilants aux changements de comportement et d’aspect des souris et les évalueront au moins 3 fois par semaine à l’aide d’un système de scoring détaillé. L’apparition de nuisance ou d’effet indésirables donnera lieu à une réponse graduée en fonction du score. Parmi les actions à prendre, figurent le traitement des animaux par des analgésiques ou la mise à mort des animaux qui atteidraient un point limite.

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique que l’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de l’étude de façon éthique par des personnes expérimentées.

Remplacement

En termes de remplacement, aucune alternative à l'utilisation d'un modèle murin n'étant disponible pour cette recherche, ces expériences chez la souris sont indispensables car les interactions complexes se déroulant in situ ne peuvent être modélisées in vitro. Mais pour les tests fonctionnels nous remplacerons chaque fois que possible l’utilisation des animaux par des tests in vitro. Il est à noter que parmi les 10 molécules les plus efficaces en cancérologie développées depuis 20 ans, toutes ont été découvertes grâce aux modèles murins. En particulier les découvertes de James Allison et de Tasuku Honjo leur ont valu le Prix Nobel en 2018, signe que l’immunothérapie est un espoir contre le cancer et que les avancées majeures passent par l’étude de modèles animaux.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons établi des procédures expérimentales tenant compte de l'effectif minimal pour atteindre une puissance statistique suffisante. L’utilisation de techniques modernes de phénotypage et les tests in vitro développés par notre équipe permettra également de réduire le nombre de souris utilisées. Des études exploratoires sur un petit nombre de souris seront réalisées pour sélectionner les meilleures stratégies avant d’évaluer leur impact sur un nombre plus important d’animaux. Pour mener à bien le projet sur l'ensemble des lignées, 2860 souris seront étudiées.

Raffinement

Dans un souci de raffinement, nous avons mis en place des points limites précis et un système de score afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligée aux animaux. Les animaux seront contrôlés régulièrement et scorés par du personnel formé et compétent afin de détecter les changements de poids d’aspect et l’apparition de comportements associés à la douleur. En cas de signes précoces d’ulcération tumorale ou de souffrance, les animaux recevront des antidouleurs, et s’ils présentent de l’hypothermie ou des difficultés à se nourrir, ils seront placés dans des cages chauffées ou en présence de nourriture humidifiée respectivement. Ils seront mis à mort si le diamètre tumoral dépasse une valeur seuil ou s’ils perdent une valeur seuil de leur poids. Les souris âgées de 7 à 15 semaines seront hébergées en groupe en accord avec la législation en vigueur avec un nombre maximum de 5 souris par cage dans un environnement enrichi (lanières de papier permettant la nidification) avec un accès illimité à la nourriture et l'eau de boisson au sein d’une animalerie A2 avec surveillance informatique du respect des paramètres environnementaux (température, hygrométrie). Les animaux seront anesthésiés pour la réalisation des procédures les plus stressantes pour l'animal.

Choix des espèces

La souris est un modèle valide en immunologie, en immunologie des tumeurs et particulièrement dans les études visant à mieux décrire une voie de signalisation. L’homme et la souris ont un système immunitaire proche et partagent les mêmes sous-populations de cellules immunitaires. Les modèles mimant le développement tumoral existent et sont très bien caractérisés. Nous pourrons facilement implémenter ces modèles et ainsi minimiser le nombre de souris nécessaires pour notre étude. Par ailleurs, le modèle souris offre l’avantage de pouvoir utiliser des outils immunologiques puissants permettant de suivre les cellules spécifiques d’antigène. Du fait de l’utilisation de ces modèles très spécifiques, le projet tel qu’il est ne pourrait pas être réalisé dans une autre espèce animale. Nous utiliserons des souris adultes de 7 à 15 semaines d’âge, conditions favorables permettant d’obtenir un stade de maturité immunitaire suffisant tout en limitant le temps d’hébergement total.

500 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un trou est foré dans le crâne de chaque animal sous anesthésie et une sonde y est scellée au ciment dentaire et à trois vis, avant des recueils de liquide céphalorachidien pouvant durer neuf heures, pour mesurer l'effet de molécules à tester sur les neurotransmetteurs. Le porteur signale des nuisances liées à l'opération et à l'hébergement individuel, et les rats sont ensuite tués au CO2 pour prélever le cerveau et vérifier la position de la sonde. Il justifie le recours au rat par la "nécessité" de tester les molécules sur un système nerveux "intègre".

Objectifs

La technique de microdialyse va permettre de vérifier l'activité sur différents systèmes neurochimiques centraux d'une molécule à tester. Ceci permettra de comprendre son mode d'action mais également de vérifier son innocuité, son absence d'effets indésirables sur certaines zones du cerveau. On pourra ainsi confirmer des effets comportementaux observés, cibler certaines pathologies ou alors s'assurer par exemple que les nouvelles molécules testées n'interagissent pas avec les circuits de la récompense et n'aient pas de propriétés addictives.

Bénéfices attendus

La mise en place de ce projet va permettre de comprendre les mécanismes fins d'action de nos nouvelles molécules au niveau synaptique, d'établir des corrélations avec des observations comportementales. Ce projet permettra de cibler certaines pathologies présentant des altérations neurochimiques bien déterminées (Alzheimer, Parkinson, schizophrénie...) ou alors s'assurer par exemple que les nouvelles molécules testées n'interagissent pas avec les circuits de la récompense et n'aient pas de propriétés addictives.

Procédures

La technique de microdialyse se décompose en 2 phases: - implantation d'un guide canule au niveau du cerveau : l'animal est anesthésié (kétamine/xylazine), un trou est foré au niveau du crâne et la sonde est positionnée et scellé avec du ciment dentaire et 3 vis. L'ensemble de la procédure dure maximum 45 minutes. - recueil des dialysats : l'animal est placé dans une enceinte, une sonde est insérée dans le guide canule et du liquide céphalo-rachidien artificiel mis à circuler à un débit déterminé (0.5 à 2 µl/min). Un échantillon de liquide céphalo-rachidien est collecté toutes les 20 à 30 minutes sur une durée de 9h maximum.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux peuvent avoir plusieurs origines : - nuisances liées aux suites de l'opération d'implantation (mauvaise récupération post anesthésie, plaie sur le crâne mal cicatrisée) - Hébergement individualisé - Lors du recueil, problème de tolérance au nouveau produit à tester.

Devenir

Les animaux issus des sessions de recueils sont sacrifiés à l'aide d'une concentration croissante de CO2, les cerveaux sont prélevés afin de vérifier la bonne implantation des sondes.

Remplacement

L’utilisation de rats en microdialyse est justifiée par la nécessité de pouvoir tester sur un système nerveux intègre l'effet de nouvelles molécules. En effet, l'objectif de la microdialyse est de mesurer l'évolution au cours du temps de la quantité de différents neurotransmetteurs au niveau de la fente synaptique. Cette libération de neurotransmetteurs peut être influencée par les nombreuses interactions des systèmes neurochimiques situés dans d'autres structures que celle recevant la sonde de microdialyse.

Réduction

L'intérêt de la microdialyse est qu'elle permet notamment d'observer les effets d'un traitement sur un animal vigile avec plusieurs observations au cours du temps, cet animal étant son propre témoin. Cette technique permet ainsi de limiter le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Un effort important a été réalisé afin d'optimiser l'anesthésie des animaux au moment de l'implantation du guide canule. L'association kétamine / xylazine permet une sédation et une analgésie correcte et couvrant largement le temps de l'opération. Jusqu’à 3 jours après l’implantation, si l’animal présente des signes de mal être (poils hérissé, yeux mi-clos, prostration) alors il reçoit une administration de carprofène (une administration s.c. par jour maximum, 5 mg/kg, 1ml/kg, Carprofelican, Dechra, 50 mg/mL, dilué 10 fois). Si après 3 jours, nous ne constatons pas d’évolution de l’état du rat alors il est euthanasié. Si nous constatons dans les 3 jours que la plaie ne cicatrise pas (présence de saignements / croutes, boursouflures) l’animal peut être à nouveau réanesthésié (isoflurane) afin de refaire des points de sutures. Si 5 jours après le réveil de l’anesthésie, un animal n’a pas repris de poids, alors il est euthanasié. Pour compenser l'hébergement individualisé des animaux, un enrichissement du milieu (balles, blocs de bois, lambeaux de papier) est ajouté dans la cage. Les cages d'hébergement en polycarbonate transparent sont placées côte à côte afin de favoriser le contact visuel entre animaux.

Choix des espèces

- La taille adéquat de l’animal : ni trop petit pour des microdissections de structures déterminées du cerveau, ni trop gros pour des problèmes de gestion et d’organisation d’un laboratoire. - Le rat est déjà largement caractérisés d’un point de vue comportemental et neurochimique et il a un système nerveux suffisamment évolué pour extrapoler à l’homme certains résultats. De plus, la neuroanatomie est particulièrement bien détaillée chez le rat et il existe de très bons atlas stéréotaxiques permettant des implantations précises (par ex : Paxinos et Watson, 1996). Les animaux sont utilisés à l'âge adulte. En effet, les coordonnées stéréotaxiques des structures d'intérêt sont obtenues à partir d'atlas stéréotaxiques déterminés pour des animaux adultes.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, hors animaux reproducteurs et de maintien de la lignée. Porteuses d'une mutation reproduisant l'ataxie de Friedreich, les homozygotes développent une ataxie vers trois mois et sont suivies par des tests comportementaux réguliers et des électromyogrammes, avant l'injection d'un vecteur de thérapie génique et une mise à mort à neuf mois pour analyses. Le porteur qualifie ces tests de comportement d'"indolores et sans stress" pour l'animal. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'évaluer cette approche et qu'une validation in vivo est "indispensable".

Objectifs

L’ataxie de Freidreich (AF) est une maladie génétique rare qui se caractérise par une maladie neurologique avec une dégradation progressive des fonctions motrices et sensorielles qui conduit à une perte des mouvements volontaires. La maladie est dû a une perte de frataxine, une protéine essentielle pour le bon fonctionnement des neurones. Les approches thérapeutiques pharmacologiques développées ciblant principalement les effets secondaires sont à ce jour faiblement efficaces et l’AF reste une maladie incurable. Une approche de thérapie génique permettant de restaurer les taux physiologiques de frataxine est en cours de développement. Un nouveau modèle murin avec une mutation ponctuelle dans la frataxine a été généré, afin de mimer les effets d’une mutation ponctuelle identifiée chez certains patients. Ce modèle est en cours de caractérisation, mais nous savons que ce modèle développe un phénotype neurologique progressif entre 3 et 9 mois, similaire à la maladie humaine. Ce modèle murin nous permettra donc de comprendre les états précoces de la maladie, et de développer une approche préclinique de thérapie génique. Le projet a 2 axes : 1) caractériser le phénotype neurologique du modèle au cours du temps, notamment au cours des trois premiers mois et 2) appliquer et optimiser un protocole de thérapie génique avec un vecteur permettant d’exprimer la frataxine à des niveaux proches de l’endogène.

Bénéfices attendus

Il y a plusieurs bénéfices attendus de ce projet. Le premier sera de valider ce nouveau modèle qui présente des faibles taux de frataxine de façon ubiquitaire et une mutation retrouvée chez l’Homme. Ce modèle pourra être utiliser pour continuer à comprendre la pathophysiologie de la maladie afin de développer des nouvelles approches thérapeutiques. Le deuxième bénéfice sera de continuer à développer au niveau préclinique une approche de thérapie génique.

Procédures

A partir de la naissance les animaux seront observés 2x /semaine (pour surveiller leur poids et taille). Des tests de comportement indolores et sans stress pour l’animal, effectués par le même expérimentateur, nous permettront d’identifier avec précision les défauts locomoteurs et de suivre l’évolution du phénotype. Les tests seront utilisés en conformité avec la littérature et les procédures établies au laboratoire. Ces tests seront effectués tous les 15 jours jusqu’à 12 semaines, et ensuite 1 fois par mois jusqu’à l’âge de 9 mois. Des mesures d’électrophysiologie par électromyogramme (EMG) seront effectués afin de mesurer la réponse proprioceptive des animaux et de corréler ses résultats aux données comportementales à 2 et 3 mois, puis 1 fois tous les 2 mois. A 9 mois, les souris seront mises à mort et les tissus d’intérêt seront prélevés pour des analyses biochimiques et histopathologiques. (Procédure 1) Une deuxième cohorte de souris sera générée pour le prélèvement de tissus pour une caractérisation biochimique et histopathologique, à différents temps (naissance, 7 jours, 3 semaines, 6 semaines, 3 mois et 6 mois), ce qui correspond à différentes phases clés dans la progression de la maladie. Le point de 9 mois sera obtenu à partir de la cohorte de la procédure 1. (Procédure 2) Enfin deux autres cohortes seront générées pour évaluer une approche de thérapie génique, d’abord en pré-symptomatique puis en postsymptomatique. Après injection intraveineuse du vecteur médicament (vecteur exprimant la frataxine) soit avant symptômes (Procédures 3) ou après l’apparition des symptômes (Procédure 4), des tests de comportements ainsi que des mesures d’électrophysiologie seront effectués comme en procédure 1 pour évaluer l’effet thérapeutique. A 9 mois, les souris seront mises à mort pour prélèvement de tissus pour des analyses.

Impact sur les animaux

Les lignées utilisées pour l'élevage sont maintenues à l’état hétérozygote, portant un seul allèle muté et un allèle sauvage. Elles n'ont pas de phénotype dommageable et ne nécessitent donc pas de surveillance particulière. Seuls les animaux homozygotes pour la mutation du gène de la frataxine issues des croisements entre deux souris hétérozygotes ont une réduction de la taille globale et développent des symptômes d’ataxie vers le 3ème mois, aspect qui nécessite d’être affiné. De la nourriture gélifiée sera proposée aux animaux dès l’apparition des signes de la maladie, détectés par les tests de comportement que nous effectuerons.

Devenir

Pour des analyses biochimiques et histologiques une mise à mort est nécessaire en fin de procédure en respectant les points limites et la progression de la maladie.

Remplacement

Ce projet vise à optimiser une approche de thérapie génique pour l’ataxie de Friedreich afin d’améliorer la vie des patients et de ralentir la progression de la maladie, voire la stopper de façon pérenne sans induire des effets secondaires invalidants. Tous les outils moléculaires utilisés ont été testés dans des cellules en culture mais il est indispensable de réaliser une validation in vivo sur un modèle murin de la maladie. Ce modèle est le premier modèle qui reproduit génétiquement une mutation ponctuelle retrouvée chez l’homme.

Réduction

Il est estimé que le projet mobilisera sur 5 ans un maximum de 720 animaux hors animaux reproducteurs et maintien de la lignée. Toutes les procédures sont conçues pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, tout en tenant en compte du nombre minimum nécessaire pour pouvoir appliquer les tests statistiques adaptés. Les travaux de notre équipe et les données préliminaires de nos collaborateurs nous permettent d’estimer le nombre de souris pour avoir une valeur statistique suffisante (20 souris par condition pour les tests de comportement et 10 souris par condition pour les analyses biochimiques et histologiques). Autant que possible, les mêmes animaux seront utilisés pour réaliser les analyses fonctionnelles, histologiques, moléculaires et biochimiques. Si aucun phénotype moléculaire/histologique n'est observé à 6 semaines, les cohortes prévues pour les points plus précoces ne seront pas générés. En l’absence de différence entre les mâles et les femelles, les données seront combinées afin de diminuer de moitié l’effectif.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement et leur poids et taille seront mesurés 2x / semaine. Dès les premiers signes cliniques (défauts à la locomotion ou perte de poids), de la nourriture gélifiée sera mise à leur disposition dans la cage. Des points limites prédictifs sont déjà établies et validés par la communauté scientifique avec un « scoring » adapté aux modèles d’ataxie.

Choix des espèces

Il n’existe à ce jour pas de méthodes alternatives pour évaluer la pertinence d’une approche de thérapie génique pour le traitement de l'Ataxie de Friedreich, notamment de la composante neurologique de la maladie. Il est alors nécessaire d’utiliser un modèle animal pour comprendre et proposer des approches thérapeutiques de la pathologie. La frataxine humaine sauvage est capable de compenser l’absence de frataxine murine endogène dans des modèles cellulaires et murins. Malgré l’existence de modèles cellulaires, une étude chez l’animal est indispensable pour déterminer la pertinence de cette approche de thérapie génique et afin d’établir une preuve de concept et l’innocuité de cette stratégie. Cette étape préliminaire est cruciale avant de pouvoir considérer une application chez l’Homme. Les études aux stades post-nataux débuteront à la naissance et se termineront à 9 mois au plus tard, et avant d’atteindre les points limites fixés dans cette étude. Nos collaborateurs ont déjà établi que les animaux avaient un phénotype à 3 mois, mais n’ont pas testé les stades avant.

3 chiens vont être utilisés, réutilisés ensuite, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque chien reçoit sous anesthésie générale une injection de kaolin en huit points d'un membre pour déclencher une inflammation avec douleur, gonflement et légère fièvre, le modèle étant décrit comme réversible en cinq à dix jours. Le porteur héberge les animaux à l'isolement pendant l'étude et affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative pour prouver l'efficacité des anti-inflammatoires chez le chien. Il présente ce modèle comme "nécessaire" pour évaluer un nouvel anti-inflammatoire vétérinaire.

Objectifs

De nombreuses circonstances nécessitent d'administrer des produits anti-inflammatoires chez le chien afin de lutter contre la douleur, la fièvre et/ou un processus inflammatoire. La recherche tente de développer de nouveaux anti-inflammatoires pour une meilleure prise en charge des animaux. Au cours du cycle de développement d'un médicament vétérinaire à visée anti-inflammatoire, il est nécessaire d'évaluer l'intensité et la durée de cet effet soit lors d'essais cliniques sur des animaux présentant une inflammation spontanée, soit lors d'essais précliniques sur des animaux présentant une inflammation induite, Une mise au point de la technique d'induction de l'inflammation par une injection sous cutanée d'une solution de Kaolin au niveau d'un membre de l'animal en se basant sur les données bibliographiques existantes a été effectuée avec un effet du kaolin qui apparait dans les 24h après injection et qui est réversible au bout de 5 à 10 jours, des données insuffisantes non interprétables ont été obtenues avec grosse variabilité individuelle. L'objectif de cet amendement au projet est donc : 1-collecter plus de données interprétables pendant toute la durée notamment sur les premiers jours qui suivent l'induction. 2-de valider un modèle reproductible avec un minimum de variabilité.

Bénéfices attendus

Mise au point d'un modèle reproductible avec un minimum de variabilité permettant son utilisation pour évaluer l'efficacité d'un anti-inflammatoire chez le chien. Ce modèle sera nécéssaire pour évaluer l'efficacité d'un nouvel anti inflammatoire afin de lutter contre la douleur, la fièvre et/ou un processus inflammatoire.

Procédures

Injection d'une suspension de kaolin au niveau des métatarses, en 8 points par animal, sous anesthésie générale, intervention de moins de 1h par animal

Impact sur les animaux

Ce modèle peut entrainer de la douleur au site d'injection, un gonflement de l'extrémité du membre induit ou/et une légère hyperthermie. Les animaux seront observés plusieurs fois par jour par un personnel expérimenté pour une prise en charge rapide si besoin.

Devenir

Modèle réversible spontanément, sévérité cumulée modérée. Retour de tous les animaux dans le stock.

Remplacement

Il n'existe pas de méthode alternative permettant de prouver l'efficacité (intensité, durée d'action) des anti-inflammatoire chez le chien, il est donc nécessaire de recourir à ce modèle. Ce modèle sera nécéssaire pour évaluer l'efficacité d'un nouvel anti inflammatoire afin de lutter contre la douleur, la fièvre et/ou un processus inflammatoire. Ce modèle In vivo ne peut pas etre remplacé, il est nécessaire de recourir à l'animal.

Réduction

3 animaux est le nombre minimum pour avoir des résultats représentatifs, pour pouvoir démontrer la reproductibilité de ce modèle tout en minimisant la variabilité.

Raffinement

Les animaux seront hébergés individuellement de l'induction jusqu'à la fin de la phase animale. Cet hébergement en individuel est nécessaire durant l'étude pour éviter que les animaux ne rentrent en contact avec la zone induite d'un autre animal (douleur) et pour permettre une meilleur observation des animaux. Une attention particulière sera portée aux animaux pour avoir un enrichissement du milieu adapté pour éviter l'ennui: contact visuel et olfactif entre congénères, surface suffisante de l'hébergement, présence de jouets.

Choix des espèces

Le chien est l'espèce cible des modéles inflammatoires et l'étude des variabilités individuelles Adulte, système immunitaire inné et adaptatif mature