Recherche appliquée
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Etude de l’efficacité in vivo d’un médicament candidat pour le traitement du syndrome de Hutchinson Gilford (HGPS)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
218 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses d'une mutation reproduisant la progéria, elles reçoivent un composé par gavage cinq à sept jours par semaine pendant quatre semaines, pour évaluer un candidat médicament contre l'atteinte cardiaque de cette maladie. Le porteur décrit un phénotype dommageable, avec un poids dépassant rarement 15 à 17 grammes, une survie moyenne d'environ 117 jours, des anomalies du squelette et de la peau et des troubles cardiaques souvent mortels. Il affirme que ce modèle murin est le "seul" modèle mammifère reproduisant fidèlement la maladie humaine.
Objectifs
Le syndrome de Hutchinson-Gilford (HGPS), ou Progéria, est une maladie génétique rare conduisant à un vieillissement prématuré. Les enfants atteints par cette pathologie présentent des atteintes sévères du système cardiovasculaire responsables d’une mortalité précoce par infarctus du myocarde ou accident vasculaire cérébral vers l’âge de 13 ans. Cette pathologie est due à une mutation hétérozygote d'un gène conduisant à la production d’une protéine toxique. A l’heure actuelle, aucun traitement n’est disponible. Pour réfléchir à de nouvelles pistes thérapeutiques, nous nous sommes intéressés aux liens entre l’accumulation de la protéine toxique et la survenue de l’atteinte du système cardiovasculaire conduisant au décès prématuré des enfants. Nos travaux récents ont en particulier permis de démontrer que l’accumulation de cette protéine conduit à d’autres anomalies cellulaires qu’on a réussi à restaurer grâce à une molécule antivirale et antinéoplasique (anticancéreux) testée sur des cellules de souris mutantes de notre gène d’intérêt. De plus avant de réaliser des tests d’efficacité in vivo et d’envisager un essai thérapeutique sur les patients, nous avons évalué dans une étude précédente, la tolérance à cette molécule et défini les doses maximales tolérées sur des souris du même fond génétique que notre modèle de souris mutantes. Notre projet a donc pour but d’évaluer l’effet de notre molécule sur la survenue des troubles cardiaques observés dans la Progéria et de comparer ses effets à une autre molécule de référence. .
Bénéfices attendus
Il n’existe à ce jour aucun traitement de la progeria et les enfants décèdent très jeunes d’une atteinte vasculaire. Plusieurs études ont clairement établi que la perte des cellules des vaisseaux sanguins induite par l'accumulation de la protéine toxique est l’un des facteurs majeur déclenchant le décès prématuré. Toute molécule capable de ralentir voire stopper la mort de ces cellules sera donc d’un grand bénéfice pour les patients. Enfin, nous avons choisi de réaliser ces tests en administrant les molécules par voie orale car il s’agit d’un mode d’administration peu invasif et compatible avec un transfert vers un essai thérapeutique sur des enfants.
Procédures
maintien d’une lignée à phénotype sévère, gavage (5X/semaine, sur une durée de 4 semaines pour 2 groupes, 7x/semaine sur une durée de 4 semaines pour un groupe): chaque gavage dure moins d'une minute pour une souris. mise à mort par prélèvement intracardiaque, la durée est de 5 min par souris.
Impact sur les animaux
Le phénotype du modèle animal utilisé est considéré comme dommageable. En effet, il présente de nombreux signes cliniques retrouvés dans la pathologie humaine. Les souris homozygotes pour la mutation, présentent un décrochage dans les courbes de poids, avec des poids ne dépassant que très rarement 17g pour les males et 15g pour les femelles. La lignée est également caractérisée par une mortalité prématurée. En effet, la moyenne de survie basée sur l’ensemble des 7 publications utilisant ce modèle et présentant ce type d’étude est de 117 jours, soit 16,5 semaines environ. Enfin, des anomalies squelettiques sont également à noter, comme une lordokyphose, ou des anomalies cutanées avec un pelage pouvant devenir épars. Enfin, des problèmes cardiaques importants sont souvent responsables de la mort prématurée de ces souris.
Devenir
les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des procédures afin de prélever les tissus en vue d'analyse post-mortem
Remplacement
Cette étude a pour but d’évaluer les propriétés thérapeutiques d’un antiviral/anticancéreux sur l’atteinte cardiaque observée chez les patients Progeria. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle vivant. Notre modèle de souris mutantes est le seul modèle mammifère disponible à ce jour reproduisant fidèlement les anomalies observées chez les patients HGPS. Elle permet donc de réaliser des essais précliniques et d’obtenir des preuves de principe d’efficacité thérapeutique en vue d’une mise en œuvre d’essais thérapeutiques chez l’Homme.
Réduction
Le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats d’efficacité et de pharmacocinétique interprétables. Dans cette étude, nous comparerons troix groupes de souris mutantes, à savoir des souris traitées avec notre molécule à tester, des souris traités avec une molécule de référence et des souris traitées avec une solution sans molécule active. Chaque groupe sera composé de 5 souris males et 5 souris femelles. Nous avons évalué le nombre de souris nécessaires pour pouvoir valider de façon statistique l’hypothèse que l’effet du traitement entre les groupes n’est pas nul. En fonction de ces paramètres, 10 souris par groupe seront nécessaires pour faire face à une perte éventuelle de 10% des souris au cours de l’essai.
Raffinement
Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance de l'animal. Afin de maintenir un état nutritionnel correct, nous utiliserons, si nécessaire, une alimentation sous forme de gels, facile à ingérer par les souris. En cas de signe de souffrance, le personnel qualifié et le vétérinaire pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de l'euthanasie de l'animal.
Choix des espèces
Le génome de notre modèle de souris reproduit exactement la même séquence génomique humaine, il a fait l’objet d’une étude poussée et reproduit les anomalies phénotypiques et moléculaires du HGPS. C’est donc le modèle le plus pertinent pour évaluer l’effet de nouveaux médicaments pour ce syndrome. Les animaux seront traités à partir de l'age de 4 semaines, avant que la pathologie ne se développe, jusqu'à l'age de 8 semaines, afin d'analyser les effets de notre molécule sur les troubles vasculaires.
Caractérisation des fibroblastes infiltrant les tumeurs pulmonaires dans le modèle transgénique Kras/Tp53.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue. Vingt souris de réforme servent, sous anesthésie et sans réveil, à entraîner un geste technique au niveau du larynx, tandis que 88 souris porteuses de tumeurs pulmonaires, dans des procédures de souffrance sévère, sont suivies par imagerie sous anesthésie pour étudier les fibroblastes qui isolent la tumeur des lymphocytes. Le porteur indique surveiller poids et respiration, avec une mise à mort au-delà de 20 % de perte de poids. Il affirme qu'un modèle in vivo est "indispensable" pour isoler et caractériser ces fibroblastes.
Objectifs
Le cancer du poumon est la principale cause de décès par cancer dans le monde. Les traitements des stades précoces par la chirurgie et la radiothérapie conduisent à des rémissions mais les stades métastatiques ont une faible survie. Les nouvelles approches par immunothérapie permettent de détruire les cellules cancéreuses en stimulant le système de défense immunitaire du patient (lymphocytes T). Ces nouvelles approches ont conduit à des résultats spectaculaires de rémission durable de tumeurs solides (mélanome et cancer du poumon principalement). Toutefois, cette stratégie thérapeutique fonctionne chez un nombre limité de patients (30% environ), incitant à étudier et comprendre les éléments contrôlant cette résistance. Une caractéristique fréquemment observée chez les patients ne répondant pas aux immunothérapies est l’exclusion des lymphocytes T des ilots de cellules tumorales. Maintenus à distance les lymphocytes T sont inaptes à détruire les cellules tumorales. Les fibroblastes associés aux tumeurs (CAF) semblent en partie responsables de cette exclusion en formant une barrière autour des ilots tumoraux. L’objectif de ce projet est de caractériser in vivo dans un modèle transgénique de tumeur pulmonaire chez la souris, les différentes populations de CAF et d’étudier leurs interactions avec les lymphocytes T infiltrant les tumeurs. Pour cela nous avons choisi un modèle transgénique murin inductible de tumeurs pulmonaires qui permet d’étudier les interactions entre les cellules tumorales pulmonaires et le microenvironnement fibroblastique et immunitaire. Cette recherche fondamentale pourrait déboucher sur des applications cliniques en proposant des thérapies innovantes ciblant les CAF afin d’augmenter l’efficacité des immunothérapies.
Bénéfices attendus
Les retombées à venir et les bénéfices attendus de ce projet sont importants car une meilleure caractérisation des cellules composant le microenvironnement tumoral a un impact majeur sur l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques antitumorales. Ainsi, l’identification de cibles pour manipuler les CAF et libérer les lymphocytes T afin qu’ils infiltrent les îlots tumoraux permettrait de guérir un nombre plus important de patients par immunothérapie.
Procédures
Tous les gestes techniques de ce projet sont réalisés sous anesthésie : - Induction de l’expression du transgène par administration à l’entrée de la trachée- réalisée sous anesthésie générale des souris transgéniques 108 souris sont concernées. Le geste n’est pas douloureux mais l’anesthésie générale est obligatoire pour garantir une immobilité de l’animal et l’accès au larynx. Durée de l'anesthésie : 20 minutes. - Une anesthésie gazeuse des souris est réalisée pour le suivi longitudinal des tumeurs pulmonaires par imagerie. Celle-ci est réalisée tous les 15 jours à partir de 8 semaines post induction : 3 imageries maximum pour le temps précoce 10-12 semaines (44 souris concernées) et 8 imageries maximum pour le temps tardif 20-24 semaines(44 souris concernées). Durée de l'anesthésie : 10 min - Une anesthésie gazeuse des souris est réalisée pour l’administration intra-veineuse de lymphocytes T La cornée est protégée par un onguent durant l’anesthésie générale. Durée de l'anesthésie : moins de 5 minutes
Impact sur les animaux
Les souris inductibles élevées n’ont pas de phénotype dommageable car le transgène ne s’exprime qu’après une étape d’induction. Cette induction dans les cellules épithéliales pulmonaires conduit au développement de tumeurs pulmonaires chez 100% des animaux en 3 mois. Les dommages sont causés par le développement des tumeurs pulmonaires qui induisent à long terme une perte de poids importante et une difficulté respiratoire. Dans cette étude, une définition de points limites prédictifs et suffisamment précoces permet d’éviter la survenue de douleur en suivant la croissance des tumeurs par imagerie et par suivi du poids des animaux.
Devenir
Mise à mort pour les 20 souris de réforme utilisées dans la procédure sans réveil d’apprentissage de la technique d’administration au niveau du larynx afin de vérifier la qualité du geste technique. Euthanasie des 88 souris induites porteuses de tumeurs pulmonaires pour prélèvement post mortel des poumons et analyse
Remplacement
Ce projet est fondé sur ces observations préliminaires réalisées sur des tumeurs humaines. L’établissement d’un modèle de tumeur pulmonaire murine est indispensable afin d’isoler et de caractériser la fonction de ces CAF. Il sera complété par des approches alternatives ex vivo Seul un modèle in vivo permet de modéliser toutes les interactions cellulaires et d’apprécier l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques.
Réduction
Le nombre maximal d’animaux utilisés pour ce projet sera de 108 souris pour 5 ans. L'imagerie des animaux permet des analyses et un recueil de données longitudinales et donc contribue à la réduction du nombre d'animaux Les analyses cellulaires des CAF seront réalisées sur N=6 souris par temps (10-12 sem et 20-24 sem post induction) . Une caractérisation des CAF sera réalisée et une corrélation avec une exclusion des lymphocytes T des ilots tumoraux sera recherchée (test de correlation de Pearson) Le nombre de souris par groupe a été défini à minima tout en permettant une analyse fiable. Afin d’apprécier la reproductibilité des résultats obtenus l’expérience sera répétée une fois avec le même nombre d’animaux par groupe. 10 souris transgéniques porteuses de tumeurs pulmonaires seront nécessaires à chacun des temps afin d’obtenir suffisamment de CAF pour les analyses de single cell RNA
Raffinement
La bonne connaissance du modèle tumoral, un suivi adapté des points limites (suivi des tumeurs par imagerie et pesées des animaux) et la manipulation des animaux sans stress, sous anesthésie si besoin, par des personnes compétentes en expérimentation animale permettent de limiter au maximum le stress et la douleur des souris. Les tumeurs seront mesurées par imagerie. Les animaux sont pesés 1 fois/sem. La grille de score jointe est appliquée pour confirmer le bon état général de l’animal. Les points limites plus spécifiques pour ce modèle sont une perte de poids>20% du poids à l’induction, une dypsnée..
Choix des espèces
Le choix d’un modèle tumoral préclinique chez la souris est justifié du fait de l’existence de modèles de souris génétiquement modifiées qui reproduisent la physiopathologie des tumeurs humaines. Le modèle transgénique choisi ici reproduit la pathologie de certains cancers pulmonaires humains. De plus, de nombreux outils sont disponibles (anticorps, cytokines, souris transgéniques possédant des lymphocytes T spécifiques de tumeurs) qui permettent d’étudier précisément la réponse immunitaire antitumorale dans cette espèce. Les souris transgéniques seront induites à l’âge de 3 à 4 mois pour l’expression du transgène et utilisées dans les procédures, 10 à 12 semaines ou 20 à 24 semaines post induction donc âgées de 6 mois à 12 mois. Souris adultes avec un système immunitaire mature
Effets rénaux de la protéine Claudine 14 (Cldn14)
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Soumises deux semaines à un régime riche en calcium, elles sont ensuite anesthésiées pour un prélèvement de sang et l'ablation des reins, qui entraîne leur mort, afin d'étudier le rôle d'une protéine rénale. Le porteur indique que le régime, jugé moins appétent, peut réduire la prise de nourriture et faire perdre du poids, avec des points limites de surveillance. Il affirme qu'un modèle cellulaire in vitro ne peut pas restituer la complexité des transports ioniques d'un épithélium rénal.
Objectifs
L’adaptation de l’organisme aux variations des apports de calcium pourrait impliquer la protéine Cldn14 exprimée dans la branche ascendante large de l’anse de Henle (BLAH). L’expression de Cldn14 augmente en régime riche en calcium et, dans des modèles cellulaires de cellules épithéliales, la protéine Cldn14 peut interagir avec la protéine Cldn16. On ne sait ni si ces interactions protéiques existent dans le tissu natif, ni si elles sont nécessaires à l’adaptation de la BLAH, ni s’il est pertinent de chercher des anomalies de la protéine Cldn14 chez les patients ayant une perte rénale de calcium. Objectif: déterminer si l’adaptation du transport de calcium dans la BLAH native, en réponse à une augmentation des apports calciques, implique la protéine Cldn14.
Bénéfices attendus
Les résultats permettront de déterminer l'implication (ou l'absence d'implication) de la protéine Claudine 14 dans l'adaptation du rein à un régime riche en calcium. Plus généralement, cette étude apportera des éléments permettant de mieux comprendre les mécanismes d'adaptation des mammifères aux variations de leur environnement, en particulier alimentaire. En effet les apports de calcium peuvent varier considérablement et rapidement en fonction du type de nourriture consommée : une adaptation rapide à ces changements est nécessaire dans le but de maintenir l ‘homéostasie.
Procédures
Les animaux sont soumis successivement - à un régime alimentaire riche en calcium pendant 2 semaines - à une anesthésie terminale au cours de laquelle un prélèvement sanguin puis une exérèse des reins sont pratiqués, entrainant la mort de l'animal
Impact sur les animaux
Le régime riche en calcium peut avoir un gout perçu comme moins agréable que la nourriture standard par certains animaux : dans ce cas, les animaux concernés peuvent diminuer leur prise de nourriture et perdre du poids. L'évolution du poids et la quantité de nourriture consommée font l'objet d'une surveillance et, le cas échéant, des points limites s'appliquent.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure : en effet, des tests fonctionnels rénaux doivent être réalisés à la fin de la procédure, nécessitant le prélèvement des reins sous anesthésie générale et donc l'euthanasie.
Remplacement
Le projet explore les mécanismes de l'adaptation rénale à un régime riche en calcium et permet la mesure directe de transport ionique à travers un épithélium spécialisé intact. La complexité des déterminants des transports ioniques transépithéliaux est telle qu'un modèle cellulaire in vitro ne peut pas la restituer
Réduction
Les méthodes choisies testent directement l’hypothèse énoncée en utilisant la microperfusion in vitro, méthode de référence dans le domaine : cette approche maximise la probabilité d’obtenir des réponses non ambiguës à la question posée. Les données seront comparées par un test de Student pour variables non appariées. Nous utiliserons 20 souris par groupe (10WT et 10KO pour le transport de calcium, 10WT et 10KO pour le transport de sodium) du fait de notre expérience des différences quantitatives attendues et des tests statistiques utilisés. Les manipulations des animaux sont réduites au minimum et la seule contrainte imposée est l’alimentation avec un régime riche en calcium pendant 2 semaines.
Raffinement
Toutes les procédures le nécessitant seront réalisées sous anesthésie. Les animaux bénéficient d’un environnement enrichi et leur souffrance est prise en compte et atténuée au maximum. Les manipulations des animaux sont réduites au minimum et la seule contrainte imposée est l’alimentation avec un régime riche en calcium pendant 2 semaines. Des points limites ont été définis et les animaux sont l'objet d'une surveillance au cours des différentes procédures exposées dans la demande
Choix des espèces
Le modèle d'inactivation constitutionnelle du gène Cldn14, codant pour la proteine Cldn14, a été développé chez la souris Les animaux sont nourris avec le régime riche en calcium à partir de l'âge de 2 mois. Les animaux ont alors terminé leur phase de croissance rapide et sont considérés comme matures ; la taille de leur rein permet la dissection d'une branche large ascendante de longueur suffisante pour pouvoir mesurer le transport transépithélial de calcium et celui de sodium
Modèles d’étude pour les pathologies infectieuses humaines : souris humanisées pour le système immunitaire et/ou le foie
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
5 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Greffées avec des cellules humaines, elles subissent une irradiation sublétale, des prélèvements de sang, des chirurgies puis une infection par des virus comme le VIH ou les hépatites B et C, pour étudier ces infections et tester des traitements. Le porteur indique que certaines souris présentent un poids réduit lié à une déficience hépatique et peuvent développer une dermatite, avec mise à mort si le score de souffrance atteint le point limite. Il présente ce modèle comme le "seul" permettant ces infections et comme une alternative au recours aux primates non-humains.
Objectifs
Ce projet utilise le seul modèle murin expérimental qui permet de suivre la progression in vivo des infections par des virus à tropisme restreint aux humains et aux primates non-humains. Dans ce projet, nous souhaitons étudier la physiopathologie induite par l’infection des virus de l’immunodéficience humaine (VIH), d’Epstein-Barr (EBV), de l’hépatite B (VHB), et de l’hépatite C (VHC) en suivant les réponses immunitaires, et évaluer l’impact des nouvelles approches antivirales ou vaccinales. Ce type d’expérimentation ne peut pas être mené chez l’hôte naturel de ces virus pathogènes (l’homme) et s’avère de plus en plus difficile à mettre en place chez des primates non-humains. Pour répondre à la nécessité croissante d’utiliser des modèles expérimentaux reproduisant l’infection par ces virus, des modèles de souris humanisés pour le système immunitaire (souris HIS), ou pour le foie avec l'ajout d'hépatocytes humains (souris HUHEP), ont été développés au cours des deux dernières décennies. Comme premier modèle, nous avons généré des souris immunodéficientes (BRGS), par l’invalidation fonctionnelle des gènes codant pour certaines protéines. Les principaux mécanismes de rejet de greffe sont absents chez ces souris ce qui permet l’établissement d’une xénogreffe hématopoïétique humaine après injection de cellules souches hématopoïétiques humaines (HSC). Des études précédentes ont montré que les souris HIS étaient susceptibles aux infections par les virus HIV ou EBV, et modélisaient les réponses immunitaires humaines. Un second modèle murin immunodéficient porte en plus un gène urokinase plasminogen activateur (uPA) qui est toxique pour les hépatocytes dans le foie, ce qui induit une déficience hépatique. Ces souris sont greffées avec des hépatocytes humains adultes sains qui participent à la régénération du foie et constituent le modèle HUHEP. Des études précédentes ont montré que les hépatocytes humains pouvaient être infectées par les virus VHB et VHC ainsi que par le parasite de la malaria (Plasmodium falciparum) chez ces souris HUHEP. La combinaison des deux modèles ci-dessus, dite HIS-HUHEP permet une étude approfondie des interactions entre le système immunitaire et le foie dans le cadre d’infections hépatiques (VHB, VHC, P. falciparum). Celui-ci permet de décortiquer les mécanismes d’infection et de mieux comprendre la pathogénèse complexe induite par ces microbes invasifs.
Bénéfices attendus
Ces modèles animaux permettront de mieux caractériser les mécanismes d'infection et de réplication des virus (VIH, EBV, VHB, VHC), le rôle du système immunitaire dans l'évolution des pathologies, ainsi que de tester des nouvelles stratégies thérapeutiques et vaccinales. Bien que des traitements thérapeutiques existent pour les patients atteints de VIH, un vaccin thérapeutique permettrait de contrôler les infections de manière pérenne. Il n’existe pas de vaccin préventif pour le VIH et le VHC, ainsi des millions de nouvelles infections surviennent par an, ne permettant pas d’éliminer ces virus de la population globale. Bien qu’un vaccin sûr et efficace existe pour le VHB, plus de 260 millions de personnes sont actuellement infectées et seul 1% de ces patients ont accès aux traitement thérapeutiques, le VHB induit des hépatocarcinomes à mauvais pronostique. Ces traitements, comme celui pour le VIH, doivent être pris à vie, induisant un coût élevé pour la société et un risque de survenu d’échappement virologique. Ainsi, les recherches se poursuivent pour développer des vaccins, ou des traitements curatifs, pour ces pathologies. L’interaction entre la réponse immunitaire et le virus est essentiel dans la progression de la pathologie, comprendre ces mécanismes d’action est une clé de voute pour développer des nouveaux concepts de traitements à visé thérapeutiques, ou des vaccins. Or, les modèles animaux qui permettent d’étudier ces interactions sont rares étant donné que ces virus n’infectent que des cellules humaines ou de chimpanzés. Afin de modéliser ces questions, nous avons développé des modèles de souris greffées avec des cellules humaines qui sont susceptibles à ces virus, permettant d’étudier les réponses immunitaires antivirales humaines. L’ensemble de ces études participe à comprendre la physiopathologie induite par ces virus chez l’humain, et à développer des nouveaux traitements thérapeutiques et des stratégies vaccinales afin d’éliminer ces maladies.
Procédures
Les procédures expérimentales décrites prévoient les interventions suivantes : irradiation avec des doses sous-létales (une fois par vie, 1-3 minutes), prélèvements sanguins en retro-mandibulaire (chaque prélèvement dure quelques secondes et est réalisé tous les 15 jours au maximum), anesthésie et procédures chirurgicales (une fois par vie, environ une heure et demi par animal), infection par des virus (une fois par vie, chaque infection dure quelques secondes).
Impact sur les animaux
Le degré de gravité des procédures est considéré comme léger (injections et prélèvements) ou modéré (conséquences potentielles à long terme de l’irradiation sous létale ou chirurgie). Les animaux portant le transgène uPA ont un poids réduit (autour de 10% en dessous du poids normal) du à leur déficience hépatique qui entraîne des défauts métaboliques. Ce poids diminué n’affecte pas le comportement des animaux, n’entraîne pas de souffrances, ni de stress, d’après nos observations sur plusieurs années d’expérimentation. Les animaux humanisés pour le système immunitaire et exprimant le transgène TSLP peuvent développer une dermatite. Afin de soulager la dermatite, les animaux seront traités avec une solution antiseptique (bétadine) avec un anesthésiant locale (lidocaine) et ils pourront être hébergés sur une litière de cellulose plus adaptée aux peaux sensibles. Leur phénotype est suivi toutes les semaines selon les critères et les points limites suivants : 1. Apparence global de l’animal score 0 : normal score 1: poils ébouriffés, rougeur de peau ou perte de poils sur moins de 50% du corps, expression faciale modérée, animal en mouvement score 2: dos voûté, perte de poils sur plus de 50% du corps, expression faciale sévère, absence de mouvement, prostration. 2. Conditions corporelles (cachexie) score 0: BCS (Body Condition Scoring) 3: L’animal est bien conditionné. La colonne vertébrale est continue. Vertèbres palpables seulement avec une pression ferme. score 1: BCS 2: L’animal est sous-conditionné. Segmentation de la colonne vertébrale évidente. Les os du bassin dorsal sont facilement palpables. score 2: BCS 1 : L’animal est amaigri. Structure squelettique extrêmement visible et peu ou pas couverte par la chair. Vertèbres distinctement segmentées 3. Poids score 1: perte de plus de 10% du poids score 2: perte de plus de 20% du poids Le point limite est défini par la détection d’un score =2 Si un score > 0 est observé, les animaux auront une surveillance renforcée. Si un score = 2 est observé, les animaux seront mis à mort.
Devenir
A l’issu de la procédure expérimentale #1 les animaux seront mises en expériences suivant les procédures expérimentales # 2, 3, 4 et 6. A la fin de ces procédures expérimentales les animaux seront mis à mort pour être analysés afin de caractériser la physiopathologie et la réponse immunitaire induite par les virus VIH, VHB, VHC, EBV. A l’issu de la procédure expérimentale #5 les animaux seront mis en accouplement.
Remplacement
Ce projet nécessite un modèle expérimental soutenant l’ensemble des mécanismes de la physiopathologie induite par une/des infection(s) virale(s). Or, de nombreux exemples démontrent que les tests d’efficacité de thérapies antivirales in vitro ne se confirment pas systématiquement in vivo en phase clinique chez l’Homme du fait des dynamiques complexes mises en jeu dans l’organisme (cinétique de l’infection; distributions cellulaires ; bio-distribution des composés; réponse immunitaire). Historiquement, les modèles infectieux de choix restent le macaque pour le VIH (avec le virus simien apparenté VIS ou l’hybride SHIV) et le chimpanzé pour le VHC et le VHB. En proposant comme modèle alternatif la souris humanisée pour le système immunitaire et/ou le foie, nous appliquons de manière relative le principe de remplacement en écartant l’utilisation de primates non-humains, avec l’avantage supplémentaire d’utiliser un modèle expérimental directement adapté au pathogène humain natif. A ce titre, les souris HIS et HIS-HUHEP sont le seul modèle expérimental correspondant à ces critères (mis à part l’Homme lui-même, chez lequel il est éthiquement inacceptable de tester directement de nouvelles stratégies préventives ou thérapeutiques).
Réduction
Le plan d’étude bénéficie de nos connaissances antérieures obtenues avec des souris humanisées sur l’infection par le VIH et le VHB. De plus, nous utilisons un modèle de souris HIS qui est à la pointe du domaine, ce modèle est sans cesse optimisé pour une meilleure prise de la xénogreffe humaine, ce qui diminue la variabilité intrinsèque au modèle et réduit d’autant le nombre d’animaux requis par expérience. Il sera essentiel de compter un minimum de 10 animaux par groupe, du fait de cette variabilité intrinsèque, et d’inclure l’ensemble des groupes contrôles pour valider les conclusions de chaque étude. La planification des expériences en amont et la concertation entre les membres de l’équipe seront des atouts pour l’élaboration d’une méthodologie efficace, et le recours à un nombre limité d’animaux.
Raffinement
Les cages d’hébergement sont enrichies avec un coton dentaire permettant une nidification, et avec des refuges en forme de dômes en cellulose dans les cages de croisements. Par ailleurs, le stress des animaux est largement diminué par l’utilisation d’analgésiques et d’antalgiques lors de la majorité des procédures. L’isoflurane par voie respiratoire présente l’avantage d’être un anesthésiant permettant des séquences d’endormissement courtes et répétées. Les soins post-opératoires tels que des pansements, du gel oculaire, une réhydratation par voie sous-cutanée, et une alimentation hydratante (DietGel) sont inclus dans nos protocoles expérimentaux.
Choix des espèces
La souris HIS est le seul modèle d’hématopoïèse humaine expérimentale soutenant une infection productive par le VIH. La souris HUHEP greffée avec des hépatocytes humains est permissive aux infections hepatotropiques (VHB, VHC, P. falciparum). Il s’agit d’un modèle de petite taille, d’une manipulation aisée et d’un coût relativement faible par rapport aux modèles classiques de l’infection (primates non-humains). A l’heure actuelle, seule la souris propose un niveau d’ingénierie génétique suffisante pour permettre la construction à façon de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe humaine efficace et prolongée. Les souris humanisées pour le système immunitaire (HIS) sont générées par injection de cellules souches hématopoïétiques humaines CD34+ dans des souriceaux nouveau-nés (
Importance physiologique de la modulation nutritionnelle dans le traitement des désordres métaboliques du foie chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
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- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
460 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries seize semaines avec un régime riche en gras et en sucre, elles subissent des jeûnes, des gavages ou injections et des prélèvements de sang à la queue lors de tests de tolérance, avant une mise à mort par dislocation cervicale sous anesthésie. Le porteur affirme que ce régime n'engendre ni douleur ni anxiété d'après l'observation du comportement, et classe en modéré la souffrance liée au jeûne, au gavage et aux prélèvements. Il affirme que l'usage d'animaux est "essentiel", une enzyme clé n'étant pas exprimée par les lignées cellulaires.
Objectifs
Les points de contact entre les mitochondries et le réticulum endoplasmique (RE), appelés MAMs pour Mitochondria-Associated Membranes, ont un rôle crucial dans le contrôle de l'homéostasie glucido-lipidique de l’hépatocyte. Ces plateformes dynamiques peuvent être régulées par différents facteurs, notamment les nutriments. Des données récentes montrent que les MAMs sont altérées dans le foie de modèles murins d'obésité, de résistance à l’insuline et de stéatose hépatique, faisant des MAMs une cible thérapeutique privilégiée pour la prévention ou le traitement des désordres métaboliques hépatiques associés à l’obésité. Ces derniers sont étroitement associés à une diminution de la concentration plasmatique en certains acides aminés comme l'arginine, la glycine et la bétaine. Par ailleurs, des travaux in vitro ont démontré que les acides aminés arginine, citrulline, glycine et bétaine sont capables de réguler les MAMs par des voies de signalisation que l'on peut cibler par des molécules pharmacologiques comme la tetrahydrobioptérine (pour arginine et citrulline) et la S-adenosyl-méthionine (pour la glycine et la bétaine). L'objectif de ce projet consistera à 1) valider l'intérêt d'une supplémentation en acides aminés dans la prévention des désordres métaboliques hépatiques (résistance à l'insuline, stéatose) associés à l'obésité, 2) démontrer que les bénéfices santé sont associés à une restauration de d'intégrité des MAMs dans le foie des souris traitées et 3) valider in vivo les voies de signalisation impliquées par l'utilisation de molécules pharmacologiques.
Bénéfices attendus
Le projet présenté vise à apporter des preuves de concept, d'une part sur l'intérêt de certains acides aminés dans la prévention des désordres métaboliques hépatiques associés à l'obésité, d'autre de l'intérêt des MAMs comme cible thérapeutique pour la prévention des désordres métaboliques hépatiques associés à l'obésité chez l'Homme. Le projet apportera des connaissances mécanistiques solides pour soutenir une approche très originale et porteuse de potentiel d'innovation pour la santé humaine pour le futur proche.
Procédures
L'intervention principale sur les animaux consistera en de petits prélèvements sanguins au niveau de la queue lors de tests de tolérance au glucose et au pyruvate qui seront réalisés sur animal vigil, à jeun depuis 6h (tolérance au glucose) ou 10h (tolérance au pyruvate), respectivement. Après anesthésie locale (crème lidocaïne) et incision au scalpel à l'extrémité de la queue, des ponctions de 4-5 µL de sang seront réalisées à la veine caudale avant et 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes après gavage oral (pour la moitié des souris) ou injection intrapériotonéale (pour l'autre moitié des souris) de glucose (2mg/g) ou injection intrapériotonéale (pour toutes les souris) de pyruvate (1.5 mg/g) pour suivre la glycémie à l'aide d'un glucomètre. Après le premier prélèvement, les suivants seront réalisés par simple grattage du caillot sanguin. La durée du jeune avant chaque test a été optimisée afin de limiter la nuisance infligée à l'animal tout en garantissant l'obtention d'un résultat métabolique fiable et reproductible, donc interprétable. Les protocoles se termineront par un jeune de 10h avant la mise à mort des animaux. Cette durée de jeune est indispensable pour garantir la qualité des mesures réalisées sur le foie de animaux.
Impact sur les animaux
D’après les premiers protocoles réalisés, 16 semaines de régime riche en gras et en sucre n’engendrent pas de douleur ou d’anxiété comme évalué par l’observation régulière du comportement des animaux, et n'empêchent pas les animaux de bouger dans la cage, notamment pour se nourrir et boire. Par ailleurs, selon les connaissances actuelles, il est peu probable que les interventions nutritionnelles testées aient des effets indésirables sur la santé et le bien-être des animaux. Lors de la mise à mort, l’utilisation de la dislocation cervicale sur animal anesthésié est une méthode rapide qui respecte les réglementations en vigueur pour les petits rongeurs. La douleur associée à la mise à jeun, au gavage ou aux injections intrapéritonéales, et aux prélèvements sanguins à la queue sont des contraintes dont le degré de sévérité est évalué de classe modérée.
Devenir
Les protocoles se termineront après anesthésie des animaux (kétamine/xylazine: 100/20 mg/kg soit 220µL de mélange pour une souris pesant 20g) et mise à mort par dislocation cervicale pour pouvoir récupérer différents tissus et organes. La nécessité de faire des anlayses histologiques et biochimiques justifie la mise à mort pour récupérer les tissus et organes.
Remplacement
L'utilisation d'animaux est essentielle pour la réalisation du projet car il requiert l'analyse des effets de régimes sur un organisme complexe, et d'un point de vue mécanistique, l'étude ne peut être conduite sur des lignées cellulaires immortalisées, qui n'expriment pas une enzyme clé impliquée dans nos mécanismes, la GNMT.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire a été réduit au maximum afin que la taille de l'échantillon permette de dégager des résultats statistiquement fiables sur des souris mâles et femelles.
Raffinement
Nous aurons pour objectif d'optimiser les procédures expérimentales pour réduire au maximum l'inconfort et les stress subis par les animaux. En particulier, nous n'utilisons pas de procédures susceptibles d'induire un dépassement de point limite de souffrance. Le raffinement sera appliqué tout au long de la vie des animaux. Pour cela, nous planifierons les protocoles de façon à éviter les perturbations susceptibles de procurer le stress de l'animal. Les protocoles ont été prévus de façon à obtenir le plus d'informations possibles par animal en imposant en même temps, un "moindre coût" en terme de mal-être de l'animal. Nous utiliserons une procédure d'analgésie pour les prises de sang, et une procédure d'anesthésie et de mise à mort par dislocation cervicale. Enfin, nos procédures de raffinement nous permettront de générer des résultats de meilleure qualité et d'exploiter au mieux les résultats obtenus.
Choix des espèces
Le travail avec des animaux est indispensable pour mimer au plus près la réalité de la surnutrition, de l'obésité et des désordres métaboliques comme dans l’espèce humaine. Le travail en épidémiologie sur l’Homme permet, en effet, de faire des corrélations entre la surnutrition et l'apparition de l’obésité et des désordres métaboliques. Le travail sur l’animal nous permet de montrer un effet causal, des manipulations nutritionnelles sur les paramètres biologiques ciblés et leurs bénéfices métaboliques à l'échelle de l'organe et du corps entier.
Evaluation de la survie de souris présentant une pneumonie à Pseudomonas aeruginosa avec ou sans prophylaxie à Porphyromonas
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent par voie nasale, sous anesthésie, une bactérie responsable de pneumonie grave, puis leur survie est suivie pendant sept jours pour tester l'effet protecteur d'un probiotique. Le porteur indique que les souris infectées sans protection peuvent perdre du poids et présenter douleurs, mobilité réduite voire inactivité, une analgésie étant administrée en cas de douleur effective. Il affirme ne pas pouvoir répondre à la question par des cultures cellulaires et conserve donc le modèle animal.
Objectifs
Pseudomonas aeruginosa (PA) est une bactérie responsable d’infection pulmonaire grave chez les patients atteints de mucoviscidose et chez les patients en réanimation. Cette bactérie, au gré de successives antibiothérapies, devient résistante à tous les antibiotiques habituellement utilisés. Aussi il est capital de rechercher des alternatives thérapeutiques aux antibiotiques comme les probiotiques. Les probiotiques sont des microorganismes qui, administrés en quantités adéquates, confèrent un bénéfice à la santé de l’hôte. Lors d’une étude précédente, l’analyse du microbiote respiratoire de patients atteints de mucoviscidose a permis de mettre en évidence un genre bactérien particulier : Porphyromonas. Ce genre bactérien et plus particulièrement Porphyromonas cationae (PC) semble être prédictif de l’infection à PA. Il a été montré chez ces patients, que ceux qui avaient moins de Porphyromonas dans les poumons, avaient plus de risque de se coloniser à PA. Par la suite, il a également été montré que la quantité de PC pulmonaire venait à diminuer, voire disparaître, préalablement à la colonisation à PA alors que PC restait stable chez les patients non colonisés. Précédemment, nous avons testé une souche clinique de Porphyromonas catoniae isolée de patients atteints de mucoviscidose qui semblerait plus efficaces in vivo. Nous avons réalisés 2 expérimentations indépendantes qui ont permis de valider l’effet bénéfique observée ; (réduction significative de la quantité de Pseudomonas aeruginosa à 24h post infection) avec la souche clinique de Porphyromonas catoniae. Nous souhaitons donc poursuivre ces expérimentations afin d’évaluer la survie à l’infection, en complément des diminutions de charge bactérienne, avec un modèle murin d’infection pulmonaire à PA avec ou sans prophylaxie à PC.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de recueillir des données sur l’intérêt de l’utilisation de souches cliniques de Porphyromonas comme potentiels bactéries bénéfiques (probiotiques) à visée anti-Pseudomonas aeruginosa, pathogène clé de plusieurs pathologies respiratoires humaines dont la mucoviscidose.
Procédures
Les animaux recevront deux suspensions bactériennes par instillation nasale à 18h d’écart sous anesthésie gazeuse, La durée de chaque instillation dure moins d'une minute. A la suite de quoi, une courbe de survie sera réalisée sur 7 jours.
Impact sur les animaux
L’installation intranasale de bactérie peut induire un stress chez les animaux. L’utilisation d’anesthésie gazeuse lors de l’instillation permet de diminuer significativement le stress chez les animaux, par ailleurs un geste maitrisé par l’expérimentateur, une surveillance accrue (deux fois par jour minimum) des animaux avec un score validé par une publication et l’administration d’un antalgique en cas de dégradation de l’état des animaux permettent également une diminution de ces effets. Lors de la réalisation de la courbe de survie, le groupe témoin recevant seulement PA peut être sujet à une perte de poids, des douleurs, une mobilité réduite voire, une inactivité. Ces derniers seront gérés en accord avec le score choisi, induisant une antalgie en cas de douleur effective. Pour les groupes essais et témoin PC recevant du Porphyromonas, aucun effet indésirable n’est attendu au vu des expérimentations précédentes.
Devenir
A l'issue de la procédure, toutes les souris seront mises à mort afin d'analyser les différents groupes, réaliser les courbes de survie et procéder aux tests statistiques permettant de démontrer le bénéfice thérapeutique d'une proxylaxie par Porphyromonas lors d'une infection à Pseudomonas aeruginosa.
Remplacement
Compte tenu des résultats obtenus in vitro montrant une réduction de la quantité de Pseudomonas aeruginosa souche PAO1 (PAO1) en présence de Porphyromonas cliniques ainsi que les premiers résultats positifs in vivo pour la souche clinique, nous souhaitons poursuivre sur cette voie en confirmant la capacité protectrice de Porphyromonas, ainsi qu’évaluer sa persistance dans le poumon après instillation. Nous ne pouvons pas répondre à cette question scientifique en utilisant des outils de culture cellulaire et tissulaire (culture in vitro et ex vivo), nous choisissons donc de conserver le modèle animal.
Réduction
L’analyse de la survie sera réalisée par comparaison du pourcentage de survie au 7eme jour. Dans l’hypothèse d’une mortalité de 100% dans le groupe des souris infectées par Pseudomonas aeruginosa (souche PA01) et d’une mortalité de 60% dans le groupe des souris ayant reçu une administration prophylactique de Porphyromonas cationae clinique (PC 103) et infectées par PA01 (Groupe PC 103+PA 01) ; le nombre de souris nécessaire par groupe est de 20 souris (risque alpha=0.05, puissance du test 1-béta=90%) Afin de réduire le nombre d’animaux, nous choisissons de limiter le groupe contrôle (Sérum physiologique) à 10 souris car nous n’attendons pas de mortalités Le nombre total de souris sera donc de (3*20) + (1*10) soit 70 souris. Par ailleurs, nous nous limitons à une seule souche de Porphyromonas (P. catoniae ou PC) alors que plusieurs espèces sont décrites dans le poumon. La souche PC103 utilisée lors de ce projet a été préalablement sélectionnée parmi les 7 autres souches cliniques isolées lors d’une précédente étude menée au laboratoire. PC103 a été sélectionnée sur sa capacité à réduire in vitro la croissance de PAO1, sa production d’acides gras à chaines courtes, et son action sur des macrophages, également in vitro.
Raffinement
Avant toutes instillation intranasale, les animaux seront préalablement anesthésiés (isoflurane gazeux), une analgésie est mise en place en cas de dépassement du score M-CASS 11 (de la buprénorphine pour réduire la douleur). Une mise à mort par CO2 sera pratiquée en cas de besoin au cours du suivi ou à la fin du protocole pour les animaux ayant survécus. De plus, les points limites seront monitorés régulièrement afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux.
Choix des espèces
Les souris C57BL6/J ont été choisies, car leur sensibilité à P. aeruginosa permet de provoquer une pneumonie tout en évitant une mortalité trop importante. Par ailleurs ce modèle a déjà été étudié au sein de notre équipe de recherche à plusieurs reprises. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 8 semaines, car c’est l’âge des souris du même modèle retrouvé dans la littérature. C’est également l’âge des souris utilisées dans de précédentes expérimentations réalisées dans notre équipe, ce qui nous permettra de conserver le même modèle d’étude pour l’interprétation de nos résultats. Les animaux seront utilisés après 1 semaine d’acclimatation à l’animalerie.
Origine de Troubles du Spectre Autistique dans un modèle de rat : étude du métabolome et rôle du microbiote intestinal maternel.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
420 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie étant tuée pour prélever les cerveaux et 66 renvoyés vers l'élevage. Des rattes gestantes reçoivent une injection d'acide valproïque pour induire un modèle d'autisme, subissent une greffe de microbiote fécal et une échographie sous anesthésie, et leur descendance passe quatre tests comportementaux comme le labyrinthe en Y et l'enfouissement de billes. Le porteur indique que le valproïque provoque quelques minutes de pelage hérissé, prostration et flancs creusés, et que les tests génèrent un léger stress. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative pour modéliser les troubles du spectre autistique.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment différents facteurs de l’environnement vont avoir un impact sur le microbiote intestinal maternel, et de mieux comprendre comme la modification de microbiote sera liée à un développement cérébral anormal à l’origine des TSAs.
Bénéfices attendus
Mieux comprendre l'implication du microbiote intestinal maternel dans le développement des troubles du spectre de l'autisme chez le rat.
Procédures
Les rattes gestantes fournissant les fèces pour la greffe de microbiote fécal seront massées chaque jour pour la récolter de leur fèces fraiches (sortie du côlon). Les rattes gestantes ayant reçu une greffe de microbiote fécale ainsi que leurs ratons subiront une anesthésie et l'injection d'un produit de contraste pour échographie. Il y aura 4 tests comportementaux: - labyrinthe en Y : 5 min - scorage des stéréotypies motrices : 10 min - enfouissement de billes : 15 min - interaction sociale directe : 10 min
Impact sur les animaux
L'effet de l'injection de l'acide valproïque induit une légère souffrance. Différents symptômes sont observés pendant quelques minutes (pelage hérissé, prostration, et flancs creusés) et tout redevient normal au bout d'environ 10 min. Les tests comportementaux, de par le changement de l'environnement des ratons, peuvent générer un léger stress chez l'animmal, donc une contrainte pour ces derniers.
Devenir
Procédure 1: tous les animaux sont réutilisés car des prélèvements seront effectués à GD19. Procédure 2: tous les animaux sont réutilisés car ils sont concernés par la procédure 3. Procédure 4: tous les animaux sont réutilisés car ils sont concernés par la procédure 5. Procédure 5: tous les animaux sont réutilisés car des tests comportementaux seront réalisés avec les progénitures Procédure 3: mise à mort des animaux concernés par cette procédure et récupération des cerveaux pour des analyses immunihistochimiques.
Remplacement
Il n'existe pas de méthodes alternatives permettant de modéliser les Troubles du Spectre Autistique.
Réduction
Le nombre d'animaux est réduit au maximum tout en permettant de pouvoir observer des différences à un seuil significatif de 0,1 %.
Raffinement
Tout sera mis en oeuvre pour maximiser le bien-être des animaux pendant le protocole. Les animaux seront en cycle inversé pendant l'ensemble du protocole. Les mères seront en présence d'enrichissement Sizzle Nest, bâton en bois, papier absorbant et maison pour une nidification optimum. Les animaux seront observés 2 fois par jour. Toutes les stratégies d'analgésie et de soin seront mises en oeuvre pour réduire au maximum tout incofort qui pourrait être induit par ce modèle.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les espèces les plus adaptées pour pouvoir mener ces études, la taille de leur cerveau est compatible avec la résolution spatiale des caméras du microTEP. De plus, le modèle de rat exposés à l'acide valproïque pendant la gestation est l'un des plus couramment utilisé et décrit pour étudier les TSA. Dans ce projet, certains prélèvements sont réalisés au 19ème jours de gestation. Ce stade a été choisi pour avoir des échantillons prénataux dans le modèle à un stade permettant d’obtenir les quantités nécessaires notamment pour le liquide amniotique nécessaires aux analyses métabolomiques. Ce stade correspond chez l’homme à la fin du second trimestre de grossesse. D’autres prélèvements sont réalisés à 7 jours de vie postnatale. Ce stade correspond chez l’homme à la fin du dernier trimestre de grossesse. Les TSAs sont considérés comme un groupe d’affections prénatales, d’où l’objectif d’avoir des prélèvements à des stades correspondants au développement prénatal chez l’homme. L’étude comportementale et l’imagerie seront réalisées comme classiquement dans le modèle à l’adolescence.
TL-EVOTEC-EARLYTOX Evaluation précoce de la toxicité de produits futurs candidats médicaments
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 28000
Cochons d'Inde : 1120
Hamsters dorés : 1120
Gerbilles de Mongolie : 1120
59 840 animaux non-humains, en majorité des souris et des rats mais aussi des cochons d'Inde, des hamsters dorés et des gerbilles, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent sur 28 jours maximum des administrations répétées de composés candidats médicaments à doses élevées, avec des prélèvements de sang, pour détecter précocement une toxicité. Le porteur indique que la recherche de doses toxiques ou maximales tolérées peut provoquer inconfort, stress, dommages réversibles voire irréversibles et douleur. Il reconnaît que des tests in vitro remplacent déjà des animaux mais affirme qu'il n'existe pas de test couvrant l'ensemble des systèmes biologiques, et cale le nombre d'animaux sur les normes ICH et OCDE.
Objectifs
Le projet a pour objectif : • d’étudier les putatifs mécanismes de toxicité liée à l’administration de la molécule d’intérêt. La détection précoce de toxicité permet d’arrêter le développement d’une molécule avant des études de toxicologie règlementaires couteuses d’un point de vue éthique et économique. Ces effets toxiques pourront être reliés à la concentration circulante du candidat médicament administré grâce à des données de toxicocinétique générées en parallèle. • de déterminer dans le cas de toxicité des biomarqueurs pertinents qui pourront être par la suite étudiés chez l’homme. •de caractériser éventuellement des populations répondeuses ou non à la molécule d’intérêt en associant des méthodes d’analyses ex vivo de génomique, protéomique ou métabolomique
Bénéfices attendus
Le projet vise à détecter très tôt dans le développement de effets de toxicité d'un composés test ce qui obligatoirment impliquerait l'arrêt du développement d’une molécule avant même les études de toxicologie règlementaires coûteuses d’un point de vue éthique, en animaux, et économique. Le projet
Procédures
Les animaux subissent des adminsitrations uniques voire répétées sur 28 jours maximum de composé d'intérêt à des doses élévées afin d'identifier des effets secondaires susceptibles d'être observés chez l'homme. Pour les voies d'administration contraignantes, les animaux sont anesthésiés pour éviter tout inconfort ou souffrance inutile. Des prélèvements de sang sur animaux vigiles ou anesthésié sont également effectués pour mesurer les concentrations du composés d'intérêt dans le sang ou les tissus pour évaluer l'exposition des animaux au composé ou suivre un biomarqueur qui réflète l'évolution de lésions. Le maximum d'administrations quotidienne est de 4 et ceux pendant 28 jours maximum. La durée de ces administrations vont de quelques secondes pour une voie orale à moins d'une heure pour les perfusions longue durée sur animal contraint et à plus d'une heure pour des animaux libre de leurs mouvements. Le maximum de prélèvements de sang est limité au volume totale de sang prélevé sur une semaine qui doit être infèrieur à 10% du volume de sang total. La durée de ces prélèvements n'excèdent pas 2 minutes.
Impact sur les animaux
La recherche de dose toxiques ou de doses maximales tolérées occasionne de l'inconfort, du stress, des dommages réversibles voire irréversibles et potentiellement de la douleur chez les animaux. Les administrations et les prélèvements répétées de sang sur animal vigile vont également générer du de l'inconfort et du stress sachant que si la voies d'adminsitration ou de prélèvements est jugées douloureuse ou dangereuse pour l'animal ou l'opérateur , l'animal est systématiquement anesthésié.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en fin d'étude
Remplacement
De nombreux test in vitro de toxicité remplacent déjà les animaux. Il s'agit de tests orientés sur un organes. Il n'existe pas de tests englobant l'ensemble des systèmes biologiques
Réduction
Le nombre d'animaux est défini par les recommandations internationales comme les normes ICH, OCDE
Raffinement
L'ensemble des procédures contraignantes jugées douloureuses pour les animaux sont faites sous anesthésie générale par inhalation ou par injection de composés à propriétés anesthésiantes. Les étapes de contention sont limitées (
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est défini par les lignes directrices internationales (ex. ICH, CHMP, OECD, WHO, FDA, MHLW) et sur des bases scientifiques telles que la cible thérapeutique visée, le(s) véhicule(s) envisagé(s) et les données disponibles de pharmacocinétique, de métabolisme et de toxicologie in vitro. Le stade adulte est celui utilisé afin de disposer d’animaux dont les systèmes biologiques sont matures. Exceptionnellement, des animaux nouveau-nés pourraient être utilisés si un impact sur le développement de l’animal doit être évalué.
Évaluation préclinique de la thérapie génique chez des souris déficientes en FVIII d’un anticorps thérapeutique
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris hémophile reçoit une injection de thérapie génique, des prélèvements sanguins rétro-orbitaux toutes les quatre semaines, puis un test de temps de saignement où l'extrémité de la queue est sectionnée sur trois millimètres. Le porteur indique que les animaux, encore sous anesthésie et ayant perdu du sang, sont tués par dislocation cervicale sans réveil. Il affirme que les tests in vitro ne reproduisent pas l'ensemble du processus de coagulation.
Objectifs
L'hémophilie A est une maladie hémorragique rare affectant principalement les hommes (1 naissance de garçons sur 5000 environ). Il s'agit d'une maladie génétique et le gène affecté est celui du facteur VIII, une protéine clé de la cascade de la coagulation. Si la maladie n'est pas traitée, l'espérance de vie est en moyenne de 15 ans. Le traitement standard de l'hémophilie A repose sur l'injection intraveineuse régulière (2-3 fois/semaine) de facteur VIII soit recombinant, soit purifié à partir de plasma. Ce traitement est lourd et coûteux. Récemment un anticorps thérapeutique qui peut se substituer au facteur VIII a été développé. Cet anticorps (Emicizumab) a montré une très bonne efficacité chez les patients hémophiles A sévères et est désormais approuvé par les autorités de santé. Il est administrable par voie sous-cutanée 1-2 fois/mois. L’Emicizumab ne normalise pas la coagulation mais transforme une hémophilie sévère en hémophilie mineure. De ce fait, un traitement par Emicizumab n’est pas toujours suffisant et doit parfois être utilisé en combinaison avec d’autres agents procoagulants. L’effet de telles associations est encore très mal connu et lors des essais cliniques sur l’Emicizumab, il y a eu malheureusement des accidents pro-thrombotiques et des cas de décès de patients dus à un emballement du système de coagulation. De plus, son utilisation est coûteuse et de ce fait 70% des patients dans le monde n'ont pas accès à ce type de thérapie. L'objectif de ce projet est de répondre à ces 2 limites, le risque de thrombose par utilisation d'un anticorps thérapeutique mimant le FVIII et le coût élevé d'un traitement par injection d'un anticorps purifié de façon régulière. Pour répondre à cet objectif, le but de notre projet est de tester in vivo un nouvel anticorps thérapeutique développé par une biotech, qui comme l’Emicizumab a montré in vitro qu’il corrigeait l’hémophilie. Cet anticorps a montré dans des tests in vitro que contrairement à l'Emicizumab il évitait les thromboses. Il sera exprimé in vivo par l’utilisation d’un vecteur viral qui permettra en une injection une expression sur plusieurs années de la thérapie. Il s'agira de déterminer si cette nouvelle thérapie est efficace pour corriger les saignements anormaux observés chez un organisme vivant hémophile.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de répondre à plusieurs attentes actuelles concernant les traitements des patients hémophiles : 1) Eviter les effets secondaires des nouveaux traitements notamment les risques de thromboses chez certains patients. 2) Utiliser un système thérapeutique, la thérapie génique, éliminant les injections intraveineuses répétées qui sont douloureuses pour les patients. 3) Réduire le coût des traitements et rendre plus accessible les traitements au 70% de la population mondiale hémophile qui n'a toujours pas accès à une thérapie. L'espérance de vie d'un patient hémophile sévère sans thérapie est de 15 ans.
Procédures
Les souris sont injectées vigiles au niveau de la veine latérale de leur queue avec 200 µl d'un solution d'AAV. Elles sont observées pendant 12 semaines avec un prélèvement rétro-orbitalde sanguin toutes les 4 semaines. Ce prélèvement sera réalisé sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane. Au terme des 12 semaines de suivi, un test de temps de saignement sera réalisé afin de vérifier l'efficacité fonctionnelle de l'anticorps exprimé. Le test de temps de saignement sera réalisé sur les souris sous anesthésie (l’extrémité de la queue de la souris est sectionnée sur 3 mm à l'aide d'un scalpel stérile). Les animaux sont gardés en vie au maximum 35 minutes lors du test de coupure de l’extrémité de leur queue (5 minutes pour l'anesthésie, suivie de 30 minutes pour le test de saignement).
Impact sur les animaux
Pendant les 12 semaines maximums de suivi de l'expérience, les souris hémophiles à la suite de l'injection de la thérapie génique risquent principalement de développer des hémorragies. Pendant le temps de saignement, l'animal sera sous anesthésie par un mélange Xylazine (10 mg/kg) –Kétamine (100 mg/kg). Si pendant cette période, l’animal présente des signes de réveil, une nouvelle dose d’anesthésiant sera administrée (demi-dose par rapport à la dose initiale).
Devenir
Tous les animaux sont encore sous anesthésie à la fin de la procédure où ils subissent un test de saignement qui dure 30 minutes. Ils auront alors perdu pour certain un volume de sang important. Il est plus éthique de ne pas réveiller les souris utilisées dans la procédure de ce projet et de les euthanasier par dislocation cervicale.
Remplacement
Le système de la coagulation est complexe, faisant intervenir de nombreux acteurs, autant des molécules procoagulantes que leurs inhibiteurs mais aussi des phospholipides membranaires, des cellules sanguines, les vaisseaux sanguins et les tissus. Actuellement les tests disponibles in vitro, même s’ils se sont beaucoup améliorés depuis quelques années, ne permettent pas de reproduire l’intégralité de ce processus. Par conséquent, afin de tester l’efficacité anti-hémorragique du Bi8 via thérapie génique, il est crucial de pouvoir tester son effet dans un modèle animal d'hémophilie A.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à l’ensemble de l’étude a été défini pour chaque procédure de façon à avoir une réponse statiquement analysable sur tous les paramètres mesurés. Les mêmes souris permettront de mesurer différents paramètres : taux d’expression de l'anticorps thérapeutique, efficacité du traitement à restaurer la coagulation, effet du traitement sur le bien-être et sur la survie de l’animal, sur le bilan de cellules sanguines. Nous prévoyons d’utiliser 50 souris déficientes en FVIII pour ce projet.
Raffinement
Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien-être des animaux avec des groupes sociaux stables sans isolement, un accès à volonté à la nourriture et à la boisson. Les animaux bénéficieront d’un enrichissement du milieu : morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid, en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques et analgésiques. Les animaux seront suivis individuellement et ils seront obligatoirement euthanasiés aux points limites définis dans la procédure. L’anesthésie générale sera induite dès la sortie du groupe afin d’éviter tout stress. L’ensemble des expériences sera effectué par une personne habilitée à expérimenter sur animaux.
Choix des espèces
Le modèle murin d'hémophilie A (souris déficientes en facteur VIII) est bien caractérisé et a été utilisé dans la littérature scientifique comme un modèle préclinique valide d’hémophilie, reproduisant la pathologie humaine et permettant ainsi les tests de nouvelles thérapies anti-hémorragiques notamment la thérapie génique. Les souris seront injectées entre 6-12 semaines lorsqu'elles auront atteint un poids de 18-25 gr. La durée de suivi des expériences de thérapie génique (6-12 semaines) est alors compatible avec une fin de procédure à un âge compris entre 12 et 24 semaines. A ce stade, leur poids est tout à fait compatible avec la réalisation des expériences de saignement pour tester l'efficacité de la thérapie.
Mise au point chez le rat et la souris du traitement EUK-LPR de thérapie génique synthétique non-virale non-intégrative pour la prévention de l’insuffisance hépatocellulaire post-hépatectomie
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 150
750 animaux, 600 souris et 150 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger à modéré. Les rats subissent une laparotomie avec injection intraportale, les souris des injections et prélèvements intraveineux hebdomadaires pendant jusqu'à trois mois, pour mettre au point un traitement de thérapie génique du foie développé par une société commanditaire. Tous les animaux sont mis à mort en fin d'étude pour analyser le sang et les organes. Le porteur situe la demande dans le prolongement d'un programme antérieur mené d'abord sur cellules puis sur l'animal.
Objectifs
La présente demande fait suite à celle soumise le 22/07/2015 au Comité d’Ethique en Expérimentation Animale des Pays-de-la-Loire et approuvée le 29/09/2015 (EU0164 – SCAHU-Angers), ainsi que par le Ministère de la Recherche le 4/12/2015. La précédente étude a été réalisée au Service Commun d’Animalerie du CHU d’Angers (SCAHU) entre le 01/02/2016 et le 30/09/2019. Cette demande est relative à un traitement de thérapie génique synthétique, est un nouveau procédé thérapeutique non-viral non-intégratif qui est développé par la société Eukarÿs, le sponsor de cette étude. La thérapie génique repose sur l’administration par voie intravasculaire d'ADN synthétique produit in vitro, mais de structure chimique tout à fait conventionnelle. La structure de cet ADN synthétique est conçue pour prévenir son éventuelle intégration génomique et donc de modification du génome. Cet ADN synthétique permet l’expression sous contrôle du système C3P3, technologie développée par la société Eukarÿs, lequel permet la synthèse autonome d’ARN messager (ARNm) cible in vivo. La thérapie génique synthétique est donc un traitement non-viral et non-intégratif. Plusieurs étapes de ce protocole (procédures 1 à 3) sont d’ailleurs réalisées avec un gène rapporteur pour faciliter la mise au point de cette technologie. Le traitement de thérapie génique synthétique EUK-LPR qui fait l’objet de la présente demande est destiné à prévenir une insuffisance hépatique en cas de résection chirurgicale majeure du foie. Cette intervention chirurgicale est réalisée pour des indications tumorales (par exemple pour métastases hépatiques ou hépatocarcinome) ou non-tumorale (par exemple pour kyste hydatique) chez environ 10.000 malades/an en France. L’insuffisance hépatique qui fait suite à une hépatectomie majeure constitue le principal risque de cette intervention chirurgicale invasive, puisqu’elle conduit au décès post-opératoire de 5%-20% des patients. EUK-LPR vise donc à réduire la mortalité de cette invention chirurgicale en induisant sélectivement la prolifération hépatocytaire avant la résection chirurgicale hépatique, de manière à en augmenter la masse fonctionnelle. Les études antérieures ont permis de tester et d’optimiser un gène artificiel permettant la croissance hépatique. Ce protocole décrit les études requises pour la poursuite développement d’EUK-LPR avec deux types d’études selon le mode d’administration par voie intraveineuse ou intraportale.
Bénéfices attendus
Cette demande est relative à aux études non-réglementaires requises pour le développement du traitement de thérapie génique synthétique EUK-LPR. Ce traitement est destiné à prévenir une insuffisance hépatique secondaire à une résection chirurgicale majeure du foie qui constitue le principal risque de cette intervention chirurgicale, puisqu’elle conduit au décès post-opératoire de 5%-20% des patients. EUK-LPR vise donc à réduire la mortalité de cette invention chirurgicale en induisant sélectivement la prolifération hépatocytaire avant la résection chirurgicale hépatique, de manière à en augmenter la masse fonctionnelle.
Procédures
Tous les animaux des procédures 1 à 7 seront soumis à des prélèvements intraveineux hebdomadaires (600 souris et 150 rats). La durée des études est variable et peut aller jusqu’à 3 mois. Les animaux des procédures 1-2-3-6-7 seront soumis à des injections intraveineuses hebdomadaires (600 souris). La durée des études est variable et peut aller jusqu’à 3 mois. Les animaux des procédures 4-5 seront soumis à une injection intraportale unique après laparotomie (150 rats). La durée des études est variable et peut aller jusqu’à 28 jours.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont les suivantes : 1°) maintien en captivité des animaux, les modalités de stabulation étant décrites plus loin dans le texte, 2°) prélèvements sanguins uniques ou répétés selon les procédures, 3°) pour les animaux testés aux procédures 1-3 et 6-7, injection intraveineuse périphérique unique ou répétées, 3°) pour les animaux testés aux procédures 4 et 5, laparotomie et injection intraportale, 4°) pour tous les animaux, mise à mort à la fin de l’ étude, dont les modalités sont décrites plus loin dans le texte.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chacunes des études de la présente demande, le sang/plasma, ainsi que les organes de ces animaux devant être analysés.
Remplacement
Les phases préliminaires de ce programme réalisées le cadre de la précédente demande APAFiS ont été effectuées successivement dans des cellules en culture, puis chez l’animal. Ces études ont permis de tester et d’optimiser un gène artificiel permettant la croissance hépatique qui, administré par injection intravasculaire intra-portale chez le rat, permet d’augmenter de 18% la masse hépatique en 4 jours. Ce gène sera utilisé pour les études décrites dans la présente demande (procédures 4 à 7). Les prochaines étapes portent sur la réalisation d’études précliniques non-réglementaires chez l’animal pour lequel il n’existe pas de solution de remplacement satisfaisante et sont requises pour les futures études cliniques chez l’homme.
Réduction
Ce protocole a été conçu de manière séquentielle avec analyse des résultats pas-à-pas de manière à éviter la mise à mort inutile d’animaux. Les phases exploratoires pourront être interrompues prématurément en cas d’efficacité insuffisante ou de mauvaise tolérance du traitement, dans le but de réduire le nombre d'animaux. De plus, selon l’effet observé, la taille des groupes sera si possible réduite. Les études de cette demande étant exploratoires, la taille des groupes (n=10) ne repose donc pas sur des hypothèses statistiques préalables, mais sur l’usage courant en recherche animale. Ce protocole est cependant conçu de manière séquentielle avec analyse des résultats pas-à-pas, ce qui permettra si possible de réduire la taille des groupes afin éviter la mise à mort inutile d’animaux. L’analyse statistique des principales variables à l’état basal et sous traitement seront décrites au moyen de méthodes descriptives standard (moyenne, SD, médiane). Pour les variables de distribution ordinale, les comparaisons entre groupes se feront par test du χ-2 (n>5) ou test exact de Fisher (n≤5). Pour les variables quantitatives continues de distribution normale, éventuellement après log-transformation, les comparaisons statistiques entre groupes seront réalisées par t-test de Student (comparaison de deux groupes) ou ANOVA éventuellement avec ajustement de Dunnett (comparaison de plus de deux groupes par rapport à un groupe contrôle). En cas de variable quantitative continue de distribution non-normale, la comparaison sera réalisée par des tests non-paramétriques : U de Mann-Whitney ou W Wilcoxon (comparaison de deux groupes entre eux) ou H de Kruskall-Wallis (comparaison de plus de 2 groupes).
Raffinement
La souffrance des animaux sera réduite par une prise en charge de la douleur appropriée. Les animaux seront examinés et pesés une fois par jour, ce qui permettra de déterminer d’évaluer précisément un score de douleur et d’angoisse de l’animal. Ce score permettra de statuer sur la continuité du protocole en cours et les actions à mener, jusqu’au stade éventuel d’atteinte du point limite entrainant la mise à mort immédiate de l’animal (cf. Annexe). Un calcul du score de la douleur sera réalisé comme suit pour décider de l’action à mener : 1 point si symptômes modérés (lésion sans effraction cutanée, agitation/agressivité, hypomotilité/hyporéactivité, incoordination modérée, stéréotypies, poil piqué, zone anogénitale souillée, persistance du pli cutané, coloration jaune ou bleue des muqueuses), 3 points si symptômes majeurs (difficulté/impossibilité de mobilisation, difficultés respiratoires, incoordination marquée, gonflement abdominal, voussure du dos/ dos cambré), 5 points si symptômes indiquant l’atteinte d’un point limite (lésion sévère (automutilation, plaie suintante, masse ulcérée…), tremblements généralisés, convulsions, perte de poids supérieure à 10% en 24 heures). Ce score permet de définir l’action à mener : Score=0 : aucune douleur ; score 1≤Score
Choix des espèces
EUK-LPR est conçu pour être injecté par deux voies vasculaires : intra-portale principalement pour les indications tumorales de résection hépatique, ou intraveineuse périphérique pour les indications non-tumorales. Ces deux modes d’administration seront étudiés chez des animaux de laboratoire dans le but de générer des résultats aussi fiables que possible. La souris est l’espèce privilégiée pour la réalisation des études de ce protocole en raison du plus faible espace requis pour leur élevage. Les études nécessitant une administration voie intra-veineuse, les études seront donc réalisées chez la souris de laboratoire. Cependant, les études réalisées par voie intra-portale ne peuvent être facilement réalisées chez la souris en raison de la taille réduite du tronc porte. Ces études seront donc réalisées chez les rats de laboratoire, le diamètre du tronc porte permettant un cathétérisme facile. Il est d’ailleurs à noter que les études antérieures réalisées par voie intra-portale l’ont été dans cette espèce. Les études seront réalisées chez des animaux adultes, le traitement EUK-LPR étant développé - au moins initialement - pour patients adultes. A noter qu'il est vraisemblable que des études complémentaires seront réalisées chez animaux plus jeunes, en vue d’études cliniques chez l’enfant ou l’adolescent.
Mesure du couplage neuro-vasculaire par co-acquisition TEP/UltraSons chez le rat : application à la neuropharmacologie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
158 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie crânienne de quatre heures pour poser une prothèse, puis un isolement pouvant durer soixante jours et plusieurs séances d'imagerie sous anesthésie, pour mesurer le couplage neurovasculaire par TEP et ultrasons en neuropharmacologie. Le porteur indique que la fenêtre crânienne empêche de regrouper ou d'adopter les rats, qui sont donc euthanasiés dès la dernière acquisition. Il juge "indispensable" le recours à des animaux vivants, la modélisation et l'in vitro ne restituant pas ces interactions.
Objectifs
La tomographie par émission de positons (TEP) est une modalité d’imagerie qui permet d’étudier la fixation d’un médicament sur sa cible cérébrale. L’imagerie ultrasonore (US) permet quant à elle d’étudier les variations du débit sanguin cérébral qui sont la conséquence de l’effet des médicaments sur le cerveau (réponse hémodynamique). L’objectif de ce projet est d’associer ces deux modalités de neuro-imagerie innovantes de manière simultanée pour mieux comprendre l’effet des médicaments sur le cerveau. Le phénomène de pharmacorésistance ou la tolérance à certains médicaments pourrait s’expliquer par une réponse hémodynamique atténuée lors de l’interaction du médicament avec sa cible. Cela pourrait s’expliquer par un déficit des mécanismes de couplage entre les cibles neuronales et la réponse hémodynamique, c’est-à-dire le couplage neuro-vasculaire. On pense que la qualité du couplage neuro-vasculaire peut être appréciée in vivo en mesurant les paramètres TEP et US de manière simultanée. L’imagerie hybride TEP/US sera réalisée chez le rats témoins. Certains animaux recevront un médicament testé à dose unique et/ou après un traitement prolongé. L’os du crâne atténue les US. Une « fenêtre » chirurgicale devra donc être mise en place sur chaque animal. Cela consiste à ôter et remplacer une partie de l’os du crâne par une résine dans des conditions d’asepsie et sans générer de douleur. La chirurgie et l’imagerie seront réalisées sous anesthésie générale. Au total, 158 rats seront utilisés sur 5 ans. Cela permettra d’optimiser les conditions expérimentales et de suivre les effets de 4 protocoles de traitements médicamenteux différents. Compte tenu des contraintes techniques liées aux traitements et aux modalités d’imagerie, la taille des groupes a été fixée à 8 rats par groupe. Les traitements étudiés sont des médicaments parfaitement connus, déjà utilisés chez l’animal voire chez l’Homme: ils n’induisent pas de toxicité. Les animaux seront surveillés quotidiennement et pesés 3 fois par semaine. Ils feront aussi l’objet de mesures de comportement simples et peu génératrices de stress comme la mesure de l’activité locomotrice. Ce protocole ne peut pas être remplacé par des études de pharmacologie in vitro qui permettent seulement de mettre en évidence l’interaction d’une molécule isolée avec une cible ou un système biologique isolé. Seules les expériences in vivo récapitulent la complexité et l’ensemble des effets des médicaments sur le cerveau.
Bénéfices attendus
Actuellement, chacune de ces techniques est utilisée séparément en routine en recherche préclinique. Réalisées en même temps, elles permettront de diviser au moins par 2 le nombre d’animaux nécessaires par rapport à l’utilisation de l’imagerie TEP puis US isolées. Surtout l’approche simultanée TEP-US ne nécessite pas le sacrifice de l’animal, il sera donc possible de réaliser plusieurs sessions d’imagerie chez un même animal pour mesurer l’évolution de l’effet des médicaments au cours du temps. Cela permettra de diminuer encore plus le nombre d’animaux grâce à la puissance des tests statistiques appariés. A terme, ce protocole devrait permettre d’offrir une méthode d’imagerie optimisée pour mieux comprendre l’effet des médicaments sur le cerveau et de mettre en évidence des mécanismes de tolérance ou de résistance.
Procédures
1. Procédure chirurgicale sous anesthésie et analgésie. Temps=4h 2. Isolement à 1 animal par cage afin de préserver l’intégrité de la prothèse, pendant 60 jours maximum avant euthanasie (le temps de réaliser les traitements et les sessions d’imagerie, en prenant en compte un risque d’échec de radiosynthèse du traceur et la reprogrammation des examens). 3. Les animaux utilisés pour la mise au point de l’acquisition US pourront participer à 5 acquisitions US de 90 min maximum, sous anesthésie générale, espacées de 48h au minimum. 4. Maximum 2 acquisitions espacées de 7 jours au minimum en TEP-US sous anesthésie générale incluant injections i.v par cathéter caudal Temps 90 min 5. 1 traitement chronique, quelques minutes quotidiennement, sur animal vigile pendant 15 jours maximum 6. Etude du comportement pendant 15 min, au maximum 2 fois par jour pendant la durée du traitement (15 jours maximum).
Impact sur les animaux
La procédure chirurgicale est conduite sous anesthésie générale et des analgésiques sont également utilisés. La récupération post-opératoire inclut un traitement antalgique. Aucune douleur n’est attendue. Les injections nécessaires à l’enregistrement TEP-US se font également sous anesthésie générale à l’isoflurane. Pas de douleur attendue. Les animaux ne peuvent pas s’arracher la prothèse crânienne qui est parfaitement solidaire de l’os et qu’ils ne peuvent pas voir ou sentir. Cependant, afin de les protéger des conflits avec leurs congénères, les animaux opérés sont hébergés individuellement par cage, dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne-nocturne de 12h. L’hébergement individuel en cage transparente et ouverte, à côté d’autres cage, permet ainsi un partage de l’odorat et du visuel avec les autres animaux présents dans le cages voisines afin de minimiser l’effet négatif sur le bien-être animal. De plus, un enrichissement supplémentaire tel qu’un deuxième matériel de nidification sera ajouté. Les médicaments testés auront vraisemblablement un effet sur le comportement (apathie, diminution ou augmentation de l’activité locomotrice) mais ne sont aucunement toxiques pour l’animal aux doses testées. Le stress induit par l’administration des médicaments sur animal non anesthésié est limité par une habituation à la manipulation préalable. Pour les injections répétées, les sites d’injection parentérale seront alternés afin de ne pas induite de lésion au point d’injection.
Devenir
La présence d’un volet chirurgical au niveau du crâne empêche le rassemblement avec d’autres rats et une adoption ultérieure : les animaux opérés seront donc euthanasiés dès que possible, soit immédiatement après la dernière acquisition TEP-US.
Remplacement
Ni la modélisation informatique ni l’expérimentation sur cellules in vitro ne permettent encore d’appréhender les processus complexes relevant de mécanismes impliquant des interactions entre neurones, cellules gliales et réseau vasculaire, dans un contexte de régulation circulatoire sanguine. Il est donc indispensable d’utiliser des animaux vivants capables d’exprimer les troubles neurologiques et de valider les biomarqueurs d’imagerie étudiés. Au maximum, toutes les adaptations possibles de l’imagerie US (sensibilité, résolution spatiale, résolution temporelle…) seront mises au point au préalable sur des objets en plastique remplis d’eau ou de gel qui miment les propriétés physiques de la tête et du cerveau. Néanmoins, 30 rats seront tout de même nécessaires pour finaliser la mise au point de cette nouvelle technique d’imagerie : les données collectées sur ces animaux serviront à l’élaboration d’un référentiel (animaux non traités), ce qui permettra au final de réduire le nombre de sujets nécessaires. La réalisation d’une imagerie US sur tout la profondeur du cerveau directement chez l’Homme n’est pas possible à ce jour du fait de l’épaisseur de la boite crânienne.
Réduction
L’utilisation conjointe des deux techniques (imagerie TEP et ultrasonore (US)) permet de diviser par deux le nombre d’animaux actuellement nécessaire à la collecte séparée de données TEP et US indépendamment l’une de l’autre. De plus, ces techniques d’imagerie permettent d’étudier plusieurs régions cérébrales en même temps, dans l’ensemble du cerveau. Pour la mise au point de la méthode : 30 rats serviront à l’apprentissage de la technique chirurgicale et à la mise au point des paramètres physiques de la méthode TEP-US. Ce nombre pourra être revu à la baisse si les objectifs sont atteints avec un nombre inférieur d’animaux. Pour l’étude de l’effet de 4 traitements dont la tolérance chez l’animal voire chez l’Homme est parfaitement connue, le nombre d’animaux nécessaires à cette étude a été calculé grâce à une planification précise afin d’en réduire au maximum le nombre. Il a été estimé à 128 pour les 5 ans à venir. Ce nombre est un minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Avant chirurgie : Les animaux seront acclimatés pendant les 5 jours suivant leur arrivée aux conditions de température et d’humidité de l’animalerie. Ils seront deux par cage (enrichie en tunnel de camouflage, bâtonnets de bois et papier Kraft). Il y aura une période d’habituation des animaux aux manipulations par les personnes intervenantes sur ce projet avant toute expérimentation. Après chirurgie : Les chirurgies se feront sous anesthésie générale et en étant vigilant sur les conditions d’asepsie. Une surveillance continue de l’état de l’animal aura lieu de l’induction de l’anesthésie au réveil de l’animal. Pendant toute la durée de l’expérimentation, les animaux seront observés individuellement tous les jours et pesés 3 fois par semaine. Le traitement sera administré en fonction du poids des animaux.
Choix des espèces
Nous utiliserons des rats adultes jeunes et matures sexuellement (180-250g au début de l’étude). Ils pourront être étudiés pendant un maximum de 3 mois après la réalisation de la chirurgie. Cet âge a été choisi car les animaux sont suffisamment matures dans leur développement mais leur taille reste compatible avec les outils d’acquisition qui sont réalisés dans un espace restreint.
Validation d’une molécule ciblant un récepteur membranaire pour l’imagerie des tumeurs neuroendocrines 2/2
- Recherche appliquée
- Cancers
1 728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal subit des greffes tumorales, dont une par chirurgie intrasplénique après laparotomie, des anesthésies répétées et des injections, pour valider une molécule d'imagerie des tumeurs neuroendocrines. Toutes les souris sont mises à mort à l'issue de chaque procédure pour analyser les tumeurs et les organes. Le porteur affirme que le recours à "l'organisme entier" est "indispensable" pour évaluer la toxicité de la molécule.
Objectifs
Les Tumeurs NeuroEndocrines (TNE) sont des tumeurs rares et hétérogènes dans leur présentation anatomopathologique et clinique. Cela rend leur diagnostic, leur pronostic et la prise en charge thérapeutique particulièrement difficiles. L’approche théranostique (utilisation de l’imagerie pour cartographier les cellules cancéreuses et les traiter de manière ciblée) est particulièrement développée pour ce type de tumeurs. Celle-ci utilise en effet la présence d’une molécule particulière à la surface des cellules tumorales (le récepteur à la somatostatine). Cette stratégie thérapeutique est actuellement la plus efficace pour le traitement des TNE mais elle comporte quelques limites. En effet, le récepteur à la somatostatine n’est pas toujours présent, notamment dans les tumeurs les plus agressives. Nous savons qu’il existe un autre récepteur présent dans ces tumeurs, le récepteur X, et nous souhaitons l’utiliser pour développer une nouvelle approche théranostique. Cela nous permettrait de proposer un nouvel outil pour l’imagerie, et à plus long terme pour la thérapie. Cette stratégie pourrait s’avérer profitable dans d’autres pathologies tumorales puisque ce récepteur existe dans d’autres types de cancers. Dans ce projet, nous proposons de cibler le récepteur X grâce à une petite molécule appelée aptamère, qui est facile à produire. Notre agent ciblant le récepteur X sera dans un premier temps couplé à une molécule fluorescente, puis à un élément radioactif. Nous souhaitons démontrer que l’aptamère peut être utilisé en imagerie des TNE grâce à deux modèles murins de progression tumorale que nous maîtrisons au laboratoire.
Bénéfices attendus
En cas de réussite, ce projet appuiera la transition de notre stratégie de l’imagerie vers la thérapie. Pour cela, il suffira de modifier le couplage de l’aptamère en utilisant un composé radioactif adapté aux traitements anticancéreux. Cela constituera une stratégie thérapeutique complémentaire à celle déjà existante pour le traitement des TNE. Les retombées potentielles de ce projet pourront également concerner d’autres cancers. En effet, le récepteur X est présent dans de nombreux types de tumeurs.
Procédures
- Anesthésies répétées (pour chirurgie et imagerie) - Injections sous-cutanées - Injections intraveineuses - Procédure chirurgicale : greffe intrasplénique (10 minutes depuis le début de l’anesthésie jusqu’à la suture de la laparotomie) dans 3 procédures (2, 4 et 6) - Pousse tumorale limitée (taille inférieure à 1500mm3 pour le modèle sous-cutané, nodules hépatiques millimétriques dans le modèle intrasplénique)
Impact sur les animaux
La xénogreffe par injection sous-cutanée est réalisée sur animal vigile. Les tumeurs développées dans ce modèle sont de petite taille. Elles n’entraînent pas de gêne chez les animaux. Aucune métastase n’est observée. La xénogreffe par injection intrasplénique implique une petite chirurgie sous anesthésie générale avec un risque de douleur au réveil. L'imagerie implique également une petite anesthésie générale.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux à l’issue de chaque procédure pour analyse des tumeurs développées et des organes prélevés.
Remplacement
Notre projet vise à développer un nouvel outil permettant l’imagerie in vivo des tumeurs neuroendocrines grâce au récepteur X, puis de développer un agent thérapeutique. L’utilisation d’un organisme entier est donc indispensable car il faut évaluer la toxicité éventuelle de notre molécule au niveau des différents organes. La molécule a été au préalable testée sur des cultures de cellules tumorales afin de remplacer une partie des travaux chez la souris.
Réduction
Quatre aptamères différents ont été testés sur des cultures de cellules tumorales. Seuls deux de ces aptamères seront testés chez la souris. De plus, le nombre d'animaux par groupe a été réduit au minimum tout en générant des résultats valables sur le plan statistique. A chaque étape du projet, nous sélectionnerons la meilleure molécule et le meilleur modèle, ce qui permettra de réduire également le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés avec dômes et boules de coton dans les cages. Ils seront pesés deux fois par semaine. Si des signes de souffrance sont identifiés après la chirurgie (prostration, difficulté de déplacement), une analgésie pourra être maintenue (par exemple par ajout de Doliprane dans l’eau de boisson). Si une perte de poids supérieure à 20% du poids maximal (28g) survient, l’animal sera immédiatement mis à mort. La xenogreffe souscutanée est réalisée par le personnel de la plateforme qui maîtrise parfaitement le geste. Les animaux reçoivent des analgésiques (buprénorphine 0.05 mg/kg, et lidocaïne en crème 5% au niveau de la zone de la laparotomie) avant la chirurgie afin de prévenir toute souffrance. La petite laparotomie nécessaire à l’injection est suturée à l’aide de fil chirurgical résorbable, ce qui améliore considérablement le confort des animaux.
Choix des espèces
Pour acquérir les données nécessaires à la validation de nos séquences aptamères pour l’imagerie des TNE, nous avons besoin d’utiliser des modèles mimant au mieux la pathologie. Nos modèles de xénogreffes sur souris ont été validés lors d’études antérieures et sont bien caractérisés et maîtrisés. La souris est relativement proche de l’homme. De, plus l'utilisation de souris immunodéficientes facilite la prise tumorale. Toutes les xénogreffes seront réalisées sur des souris Athymic nude ou Swiss nude de 5 à 7 semaines, qui est l'âge optimal d'utilisation des souches de souris immunodéprimées et pour lequel nos modèles de xénogreffes ont été validés lors d'études antérieures.