Recherche appliquée

40 brebis vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes rendues ensuite à la production. Le porteur soumet des brebis venant de mettre bas à deux jours de paille de faible valeur nutritive, puis leur prélève du sang huit fois en dix-neuf jours, pour étudier leur adaptation à un manque alimentaire lié au changement climatique. Il indique qu'une perte de poids et une mobilisation des réserves corporelles sont possibles, sans danger annoncé. Il affirme qu'aucun remplacement n'est possible car l'étude porte sur une race ovine précise.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un programme européen. Des expérimentations similaires sont en train de se dérouler dans d'autres installations expérimentales, avec d'autres races ovines et une autre espèce, les caprins, dans les pays membres du consortium (Egypte, Espagne et Tunisie). L’objectif global est d’étudier les réponses des petits ruminants face aux effets du changement climatique, plus particulièrement les effets des challenges nutritionnels en faisant varier quantité et qualité de l’offre alimentaire. L'objectif du projet est d'évaluer, d'une part, les capacités adaptatives des brebis de race Romane face à un challenge nutritionnel sévère après la mise bas. D'autre part d'étudier, pour le caractère efficacité alimentaire, les effets de la lignée génétique (une lignée de brebis efficaces et une lignée de brebis inefficaces) sur la réponse au challenge nutritionnel et de décrypter les mécanismes de l'organisme qui sont reponsables de cette réponse. Ainsi une meilleure compréhension de la réponse des animaux aux stress alimentaires nous permettra de proposer aux éleveurs des pratiques de conduites ciblées pour des catégories ou types d’animaux spécifiques et de maintenir la performance productive des brebis dans des situations extrêmes par exemple imposées par le changement climatique où l’offre de ressources est variable ou limitée et/ou la qualité (valeur nutritionnelle des fourrages) est dégradée.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d'étudier comment des brebis de race Romane qui appartiennent à une lignées génétique divergente, pour le caractère efficacité alimentaire, font face à un challenge nutritionnel pendant la période critique de la mise-bas. Il permettra également de déterminer la variabilité individuelle des brebis.

Procédures

Prélevements sanguins pour dosage des métabolites et hormones métaboliques. La prise de sang se fera au niveau des jugulaires en alternant gauche/droite. Cela 8 fois durant les 19 jours de mesures.

Impact sur les animaux

Il n’y a pas d'effets indésirables attendus avec le déroulement de ce projet. Néanmoins, un minimum d’effet est prévu concernant l’impact instantanée sur le bilan énergétique des brebis soumises à un challenge nutritionnel pendant deux jours avec de la paille de faible valeur nutritionnelle. Donc des effets « cascade » à court terme sur le métabolisme, avec une perte éventuelle de poids vifs et d'état corporel (mobilisation des réserves corporelles) seront envisageable, sans représenter un danger pour les brebis.

Devenir

Tous les animaux retourneront en production dans leur environnement naturel.

Remplacement

Il s'agit d'un projet qui cherche à développer de la connaissance fondamentale pour l'espèce ovine, plus particulièrement, pour la race Romane (ancien INRA401) et les deux lignées divergentes développées pour l'éfficacité alimentaire. Donc, pas de remplacement possible avec d'autres animaux ou méthodes alternatives.

Réduction

Le nombre d'animaux prévus a été calculé avec la formule statistique : n=(2SD/p)² avec N = nombre d’animaux, SD=écart type, P=la précision souhaitée pour l’analyse. Au final, nous avons 10 brebis par lignée, par parité, il s'agit du minimum d'observations possibles pour arriver à une puissance statistique minimale pour les interprétations à prévoir dans ce projet.

Raffinement

Les animaux sont en groupe sur aire paillée. Pendant toute la durée de l'expérimentation, le personnel qualifié observera quotidiennement les brebis et leurs agneaux lors des 2 distributions de l'alimentation ainsi que lors de son passage dans la matinée et l'après-midi. Les brebis seront dressées au fonctionnement des portillons électroniques pendant quelques jours au milieu de la gestation, pour éviter la phase critique de la fin de gestation. Le milieu sera enrichi, pour les brebis, par des objets (chaine ou disque) accrochés qui seront alternés au cours de la semaine . Lors du paillage la paille sera mise en tas et ce sont les brebis qui l'étaleront. Pour les agneaux une table, de petite taille dont les pieds ont été ajustés à leur hauteur, sera mise à disposition. Le matériel de contention pour les prélèvements est adapté aux ovins et les animaux y sont habitués.

Choix des espèces

Il s'agit d'un projet destiné à la filière des petits ruminants, notamment les ovins. Les brebis seront utilisées après la mise bas et au début de la lactation. A ce stade physiologique la brebis démarre sa lactation qui permettra d'assurer la croissance des agneaux. En élevage selon les périodes d'agnelage des déficits nutritionnels (quantité et/ou qualité) peuvent avoir lieu pendant cette période. L'objectif est d'évaluer les capacités adaptatives des petits brebis.

16 chevaux vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, les adultes réutilisés ensuite et les seniors rendus à la fondation qui les héberge. Le porteur compare des chevaux de plus de 26 ans à des chevaux plus jeunes, au moyen de quatre prélèvements de sang et de fèces répartis sur un mois. Il indique qu'un léger inconfort passager peut survenir au moment des prélèvements, sans douleur attendue. Il affirme qu'aucun modèle ne reproduit la complexité de l'écosystème digestif du cheval et qu'il n'est "pas possible" de remplacer l'animal vivant.

Objectifs

Le statut du cheval et la médecine vétérinaire ayant évolué, on constate que la population d’équidés de plus de 20 ans est grandissante depuis les années 2000 et ce, dans de nombreux pays. Le bien-vieillir de cette catégorie est donc une thématique récente et au centre de l’attention des détenteurs. Le premier objectif de ce projet est d’évaluer la capacité de l’écosystème digestif à dégrader les fibres qui représentent la plus grande part de l'alimentation des chevaux, le cheval sénior versus le cheval adulte. Le second objectif est d’étudier la relation entre composition et activité de l’écosystème digestif, paramètres digestifs, et paramètres sanguins et/ou fécaux de l’inflammation de bas grade lié à l’âge. Le troisième objectif est de comparer l’impact d’un stress, causé par l’administration d’un vermifuge sur ces paramètres. Enfin, ce projet permettra d’identifier les marqueurs les plus pertinents et utilisables sur le terrain pour monitorer ces modifications liées à l’âge.

Bénéfices attendus

La population d’équidés de plus de 20 ans étant grandissante depuis les années 2000, ce projet permettra de mieux comprendre les modifications liées à l’âge afin d’adapter les pratiques alimentaires pour promouvoir un vieillissement en bonne santé et pour favoriser l’état de bien-être des équidés séniors. En outre, il permettra d'obtenir des marqueurs utilisable sur le terrain pour suivre les modifications liées à l'âge.

Procédures

Au cours du projet, les chevaux seront soumis à quatre prélèvements de fèces et de sang répartis sur une durée d'un mois. Ces prélèvements s'effectuent sur animal vigile et ne durent que quelques minutes.

Impact sur les animaux

Un lèger inconfort passager pourra être ressenti par les chevaux au moment des prélèvements, mais aucune douleur n'est attendue dans ce projet. De l'huile de paraffine est utilisée pour faciliter les prélèvements de fèces.

Devenir

Il n'est pas attendu de dommage pour les animaux impliqués dans ce projet. Les chevaux du groupe adulte pourront donc être réutilisés sans effet cumulatif. Les chevaux du groupe sénior étant placés dans l'établissement utilisateur pour la durée du projet, ils retourneront sous la garde de la fondation dont ils dépendent à la fin de celui-ci. Un examen vétérinaire sera pratiqué à leur arrivée et avant leur départ de l'établissement utilisateur.

Remplacement

Il n’existe actuellement pas de modèle permettant de reproduire la complexité des interactions entre composition et activité de l’écosystème digestif, paramètres digestifs, et paramètres sanguins et/ou fécaux de l’inflammation, ni de modèle permettant de mimer les phénomènes d’immunosénescence chez le cheval. Il n’est donc pas possible de remplacer l’utilisation d’animaux vivants dans cette étude.

Réduction

Les chevaux sont conduits en conditions contrôlées et uniformes afin de minimiser les variations liées à l’environnement. Une étude statistique a permis de déterminer le plus petit nombre d'animaux a inclure dans chaque groupe tout en assurant la fiabilité des résultats. Une analyse statistique sera appliquée sur les résultats obtenus.

Raffinement

Les prélèvements ont lieu dans un travail adapté à la contention des chevaux pour éviter tout risque de blessure. De plus, de l’huile de paraffine est appliquée pour les prélèvements de fèces afin de limiter l'incofort éventuel. Les chevaux étant des animaux grégaires, ils sont sortis tous les jours au paddock en groupe. Ceci permet de respecter leur bien-être. Ils sont hébergés dans des boxes séparés par des barreaux leur permettant de se voir et de se sentir. De plus, au quotidien, le personnel animalier observe le comportement de chaque cheval matin, midi et soir au moment de la distribution des repas afin de repérer les signes de mal-être ou de souffrance.

Choix des espèces

L’essai doit nécessairement être conduit avec des chevaux car il s’agit de l’espèce cible de l'étude. La moitié des chevaux inclus dans l'étude ont 26 ans ou plus, ils sont considérés comme des séniors, car il s'agit de la population cible de l'étude. En effet, un essai mené au sein de l'entreprise en 2020, a permis de mettre en évidence une modification des paramètres physico-chimiques de l'écosystème fécal des équidés de plus de 26 ans par rapport à des chevaux adultes plus jeunes. L'autre moitié des chevaux a entre 7 et 9 ans, ils sont considérés comme adultes et sont utilisés pour comparer les différents paramètres évalués chez les séniors.

2 700 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, destinées à d'autres protocoles selon leur phénotype, celles n'ayant pas le profil recherché étant tuées. Le porteur croise deux lignées génétiquement modifiées pour obtenir des souris exprimant une molécule d'étude sur leurs lymphocytes T. Chaque petit est identifié par une boucle d'oreille sous anesthésie, puis phénotypé par prise de sang à la mâchoire ou au sinus rétro-orbitaire. Il affirme que ce passage in vivo est une étape "indispensable" avant le recours aux gros animaux puis à l'homme.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer le rôle d'une molécule spécifique sur la biologie des Lymphocytes T in vivo. CEtte molécule n’est pas exprimée chez les rongeurs, nous avons donc fait modifier génétiquement des souris de fond C56BL/6 afin que l’expression son expression soit sous le control du promoteur du CD3e, ainsi tous les Lymphocytes T exprimeront la molécule d'étude. Son ligand, est une molécule ubiquitaire, présent chez la souris mais la protéine étant légèrement différente, nous avons choisi de faire développer des souris hybrides exprimant la portion extracellulaire de la version humain du ligand tout en gardant la portion intracellulaire de la version murine de cette molécule. Cette souris « hybride » a également été créée sur un fond C56BL/6. Nous souhaitons désormais croiser ces 2 lignées pour obtenir des souris Hybrid pour le ligand exprimant également la molécule d'étude.

Bénéfices attendus

Une fois obtenues, ces souris seront incluses dans des projets ou le système immunitaire sera chalengé et le rôle de notre molécule d'intérêt sera évalué grâce au développement d’Ac bloquant spécifiquement l’interaction de la molécule à son ligand (version extra cellulaire humaine et intracellulaire murine) et déjà validés in vitro.

Procédures

Lors du sevrage, les souriceaux seront identifiés par la mise en place d'une boucle d'oreille numérotée. Pour cette mise en place l'animal reçoit une dose de charge d’Isoflurane. En fonction du caractère récessif ou dominant des modifications génétiques, et du génotype des parents les petits seront ou non phénotypés par analyse des cellules sanguine. Cette prise de sang sera réalisée soit, sur des animaux vigiles au niveau mandibulaire ou sur des animaux anesthésiés au niveau du sinus rétro-orbitaire sur animal anesthésié et ayant reçu une goutte de Tétracaine 1% .

Impact sur les animaux

Ce nouveau phénotype ne devrait pas engendrer d’effet nuisible pour les souris

Devenir

Les souris issues de l’élevage seront incluses dans des expériences en fonction de leur phénotype ou bien sacrifiées si le phénotype escompté n’est pas obtenu.

Remplacement

Des données préliminaires in vitro ont été obtenues mais le rôle exact de la molécule que nous étudions n’a pas encore été totalement clarifié. Un passage à l’in vivo dans des souris génétiquement modifiées pour exprimer les molécules d’intérêts permettra de mieux comprendre le rôle de ces molécules et les conséquences de leur blocage spécifique. Il s’agit d’une étape indispensable avant le passage aux gros animaux puis à l’homme.

Réduction

L’élevage sera dimensionné en fonction des expérimentations prévues.

Raffinement

Les couples seront hébergés dans des cages contenant des frisottis papiers et du coton leur permettant la nidification. Une fois sevrées, les souris seront hébergées dans des cages contenant des frisottis papiers. Une surveillance journalière par les animaliers nous permettra de surveiller que les souris n’ont pas de phénotype dommageable. La prise de sang pour phénotyper les souris sera réalisée sous anesthésie gazeuse (isoflurane 4%/air comprimé) en ayant préalablement déposé une goutte de Tétracaïne 1% collyre.

Choix des espèces

Les souris issues de cette nouvelle lignée seront ensuite incluses dans des protocoles que nous maitrisons pour questionner le système immunitaire. La molécule d’intérêt pourra ou non être bloquée à l’aide d’Ac spécifiques pour questionner son rôle dans différentes situations expérimentales mettant en jeux le système immunitaire. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5-6 semaines pour maintenir l’élevage

24 chevaux vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis renvoyés à leurs activités au centre équestre. Ils reçoivent pendant trente jours un complément alimentaire probiotique déjà commercialisé, avec pesées hebdomadaires, prélèvements de crottins et deux prises de sang, pour vérifier sa tolérance à la dose recommandée et à une dose plus forte. Le porteur indique que l'effet indésirable le plus probable est un refus du produit et qu'aucun dommage n'est attendu. Il justifie le recours aux chevaux par les "contraintes réglementaires" des études de tolérance, qui doivent porter sur l'espèce cible.

Objectifs

L'objectif du projet est d'étudier la tolérance de FlorEquilibre CVX lors d'une administration conjointe à l'aliment chez le cheval. Cet objectif se découpe en deux sous-objectifs: 1. L'étude des effets de FlorEquilibre CVX sur la performance des chevaux (évolution du poids, mesure de la prise alimentaire, paramètres biochimiques et hématologiques) et la tolérance du complément alimentaire à la dose recommandée, 2. La vérification de l'absence d'effet indésirable quand la dose est augmentée et l'établissement d'une marge de sécurité si le complément alimentaire est consommé à des doses plus hautes que recommandées.

Bénéfices attendus

Les chevaux sont particulièrement fragiles sur le plan digestif et de nombreux facteurs (changement de lieu de vie, d'activité, de régime alimentaire, le stress, l'utilisation de médicaments) peuvent entrainer de lourdes pathologies comme les fourbures par exemple. La gestion de la flore digestive chez le cheval est alors un enjeu majeur. L'ajout de probiotiques à la ration alimentaire peut apporter de grands bénéfices pour le rééquilibrage du microbiote intestinal du cheval avec une mise en oeuvre très simple pour les propriétaires.

Procédures

1. Traitement avec un complément alimentaire pour les deux groupes traités, 1 fois par jour pendant 30 jours avec l'alimentation (environ 15 minutes), 2. Examen clinique quotidien efffectué par un vétérinaire, 1 fois par jour pendant 30 jours (environ 15 minutes), 3. Pesée une fois par semaine (environ 10 minutes), 4. Prélèvement de crottins tous les 15 jours soit 3 prélèvements, le temps dépend de la disponibilité de l'échantillon, 5. Prélèvements de sang en début et fin d'expérimentation (environ 30 secondes).

Impact sur les animaux

Les animaux ne recevant pas de traitement ne subiront que deux prises de sang et des prélèvements de crottins, il n'y a donc aucune nuisance particulière infligée à ces animaux. Le probiotique étant déjà disponible sur le marché, il est également très peu probable qu'il y ait des effets indésirables à la "faible dose". Enfin, l'effet indésirable le plus probable pour le groupe "forte dose" est un problème de non appétence du traitement. S'il s'avérait également que le traitement à la forte dose était mal toléré, le traitement sera immédiatement interrompu.

Devenir

Les animaux auront subi une procédure légère tout en conservant leur activité au sein de Centre Equestre de l'Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse. Sauf avis contraire du vétérinaire en charge des examens cliniques quotidiens et/ou du vétérinaire référent de l'Etablissement Utilisateur et/ou d'un des vétérinaires de la clinique équine de l'Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse, les animaux continueront leurs activités classiques au sein du Centre Equestre après cette étude.

Remplacement

Il est nécessaire pour déterminer l'efficacité d'un probiotique de déterminer son effet sur le microbiote intestinal, un mélange complexe de micro-organismes qui peut difficilement être reproduit en totalité in vitro. De plus, les interactions avec l'organisme, la matrice alimentaire lors de l'administration conjointe à l'aliment, la variabilité interindividuelle, ne pourraient pas être prises en compte. Enfin, les études de tolérance de l'animal au traitement doivent nécessairement être menées sur l'animal ne serait-ce que pour des contraintes réglementaires. Il n'est donc pas possible de se passer d'animaux pour ce projet. En revanche, vu que le probiotique est déjà mis sur le marché et qu'il y a peu de risques d'effets indésirables avec un tel traitement, les chevaux utilisés seront des chevaux d'un Centre Equestre et non des animaux dédiés spécifiquement à l'expérimentation animale.

Réduction

Pour déterminer le nombre d'animaux par groupe, un calcul de puissance a été effectué à partir de données de la littérature sur l'effet d'une supplémentation en levures sur la digestibilité et le microbiote intestinal chez le cheval. Le nombre de groupe (un groupe contrôle, un groupe traité avec la dose recommandée, et un groupe traité avec une plus forte dose) est défini par la réglementation pour les études de tolérance des compléments alimentaires chez l'animal.

Raffinement

Les chevaux utilisés pour ce projet seront des chevaux d'un Centre Equestre. Ils vivent en groupe et continueront leur activité sportive tout au long de l'étude. Ils seront suivis quotidiennement pas un vétérinaire. En cas d'intolérance au complément alimentaire, l'expérimentation sera arrêtée pour l'animal concerné et des soins appropriés seront effectués.

Choix des espèces

L'espèce choisie est l'espèce cible pour laquelle le probiotique est mis sur le marché. Les animaux seront des animaux adultes. Les poulains et les animaux âgés seront exclus de l'étude car, même si le probiotique peut également être utilisé pour ces animaux, il est préférable de mener des études de tolérance sur des animaux qui se remettront plus rapidement d'éventuels effets secondaires même s'ils sont peu probables.

552 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur décrit des injections intraveineuses de vecteurs viraux dans le sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, suivies de prélèvements sanguins au même endroit sous anesthésie locale, puis d'une mise à mort par dislocation cervicale. Il indique surveiller l'apparition de fièvre et de lésions oculaires, un œil infecté ou dégradé entraînant la mise à mort. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode alternative n'apporte le même niveau d'information sur l'expression des molécules in vivo.

Objectifs

Nous nous intéressons au développement de molécules agissant sur le système immunitaire exprimées par des vecteurs viraux notamment pour traiter l’immunosuppression post-sepsis. De nombreuses molécules existent sous forme de protéines recombinantes dont certaines d’entre elles sont déjà en développement clinique dans le traitement de l’immunosuppression post-sepsis. L’expression d’une ou plusieurs de ces molécules via un vecteur viral pourrait permettre une expression prolongée, une distribution différente dans l’organisme, voire engendrer une activité biologique différente de celle de la forme soluble et ainsi avoir une efficacité accrue. Des études précédentes ont permis d’obtenir une preuve de concept pour un candidat basé sur un vecteur viral codant pour une molecule agissant sur l’immunité adaptative, administré par voie intraveineuse. Dans le but d’optimiser ce 1er candidat, nous voulons évaluer dans une étude préclinique exploratoire, la possibilité de co-exprimer dans ce vecteur, une molécule agissant sur l’immunité innée avec la molécule agissant sur l’immunité adaptative déjà validée, chez la souris naïve puis dans un modèle murin de souris spécifique de l’immunosuppression induite par le sepsis. Agir à la fois sur la réponse immunitaire innée et adaptative pourrait permettre une meilleure restauration du système immunitaire et ainsi diminuer le temps d’hospitalisation, le taux d’infection secondaire et in fine le taux de mortalité post-première infection et/ou seconde infection. Plusieurs candidats ont été développés : un pour chacune des molécules seules et un pour les deux ensembles. L’objectif final est de démonter l’intérêt de co-exprimer deux molécules agissant sur les deux pans du système immunitaire pour traiter l’immunosuppression induite par le sepsis, dans un même vecteur. Cependant, le modèle murin de sepsis utilisé étant classé sévère, il est primordial de vérifier l’efficacité des produits dans des souris naïves au préalable. En effet, si le(s) produit(s) n’avai(en)t pas l’effet escompté sur le système immunitaire, ou que l’ajout de la seconde cytokine s’avérait délétère pour l’activité déjà connue du produit, il ne serait alors pas testé dans le modèle sepsis.

Bénéfices attendus

Ce projet rentre dans une thématique de recherche plus large dont l’objectif global est de développer de nouveaux traitements pour traiter l’immunosuppression induite par le sepsis en restaurant le système immunitaire (réponse innée et réponse adaptative) des patients septiques et ainsi prévenir les infections secondaires pouvant leur être fatales. L’objectif à court terme de ce projet de recherche est de monter la pertinence de vectoriser deux molécules dans un même vecteur en prouvant que la molécule agissant sur la réponse immunitaire innée et la molécule ciblant la réponse immunitaire adaptative sont capables de booster le système immunitaire de souris saines. En cas d’obtention de ce résultat, ce candidat sera alors évalué dans le modèle qui mime les deux phases clées du sepsis. Si ce candidat permet de restaurer l’immunosuppression induite chez la souris, il pourrait faire l’objet d’un développement clinique afin d’espérer obtenir une autorisation de mise sur le marché afin de soigner l’immunosuppression chez l’homme dans l’indication du sepsis.

Procédures

1) Préhensions des animaux vigiles (transfert de la cage hébergement à la boite d’anesthésie puis de la boite d’anesthésie sur le plateau de la hotte) : 3 fois/souris (540 animaux et 15 secondes /souris) -2) Injections des produits en intraveineuse au niveau du sinus rétro orbitale sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane sur tous les animaux : 540 Souris (1 fois/souris et 2 à 3 min/animaux) -3) Application de l’anesthésique en locale : 1 contention pour 432 souris et 2 contentions pour 108 souris (15 secondes/souris/contention) -4) Prélèvements sanguins au niveau du sinus rétro-orbitale sur animaux vigiles en contention sous anesthésie locale. 456 souris seront prélevées une fois avec 1 contention (1 à 2 min/souris) 96 animaux seront prélevés deux fois soit deux contentions (2 fois 1 à 2min/souris/contension). -5) Contention de l’animal vigile puis mise à mort des animaux par dislocation cervicale 540 animaux et 30 secondes/souris

Impact sur les animaux

Nos candidats ne devraient pas avoir d’effet delétère sur l’état géneral des animaux. Néanmoins, les animaux seront observés 2 fois après injection des candidats (à 2h et 6h post injection). Si les souris sont prostrées dans la cage et ne réagissent pas à une stimulation, une prise de température sera effectuée. Si une fièvre supérieure à 39°C pendant deux jours malgré un traitement au doliprane persiste pouvant traduire une souffrance, les souris seraient alors mises à mort. les animaux subiront en plus de l'injection du candidat des prélèvements sanguins au niveau du sinus rétroorbital après anesthésie locale à la tétracaïne.Les animaux subiront en plus de l’injection du candidat des prélèvements sanguins après anesthésie locale. Les yeux seront donc surveillés tout le long de la procédure, en cas d’apparition de lésion, les yeux seront nettoyés au serum physiologique afin de mieux évaluer les dommages. Si à l’observation, une infection bactérienne ou/et une dégradation de l’œil sont observées, l’animal sera mis à mort.Les animaux subiront en plus de l’injection du candidat des prélèvements sanguins après anesthésie locale. Les yeux seront donc surveillés tout le long de la procédure, en cas d’apparition de lésion, les yeux seront nettoyés au serum physiologique afin de mieux évaluer les dommages. Si à l’observation, une infection bactérienne ou/et une dégradation de l’œil sont observées, l’animal sera mis à mort.

Devenir

Tous les animaux inclus dans les procédures sont mis à mort puis le sang et/ou organes sont prélevés nous permettant d’évaluer l’efficacité de notre produit d’immunothérapie. Aucune souris restante à la fin des deux procédures.

Remplacement

Les objectifs de ce projet sont d’évaluer la durée et le taux d’expression des molécules 1 et 2 seules ou co-exprimées par les candidats in vivo et de mesurer les activités immunologiques sur différents types cellulaire provenant de différents organes. Il n’existe pas de méthode alternative à l’utilisation d’animaux vivants et susceptible d’apporter le même niveau d’information pour répondre à ces objectifs.

Réduction

Tout au long du projet, nous essayerons de réduire le nombre de souris sans toutefois compromettre la fiabilité des résultats. Le sang de 3 souris/groupe/temps sera prélevé pour suivre le taux des differentes molécules (nombre d’animaux suffisant, basé sur les résultats des procédures précédemment réalisées dans le cadre du projet global), pour limiter le nombre d’animaux. Six souris/groupe sont prévues pour couvrir l’éventuelle variabilité des tests immunologiques (variabilité plus importante pour ces tests immunologiques déjà observée au préalable) et permettre l’analyse statistique (tests non-paramétriques). Ce type d’expérience ayant déjà été réalisé au cours du projet global, le nombre d’animaux proposé ici pour chacun des types de tests est le minimum requis pour obtenir un résultat fiable. Dans la procédure 1, l’activité biologique sera évaluée à différents temps afin de pouvoir déterminer le(s) temps d’analyse permettant de voir l’effet biologique optimal de notre candidat. Grâce à cette procédure, nous réduirons le nombre de temps d’analyse pour la suite du projet et donc le nombre de souris utilisées. Si toutefois, le nouveau candidat ne donnait pas les résultats escomptés, le projet serait arrêté (pas de procédure 2). Dans ce projet, pour chaque procédure nous prélèverons post morterm la plupart des organes cibles de notre candidat afin de répondre à un maximum de question dans un seul protocole.

Raffinement

Mise en place du raffinement dans nos procédure : L’injection intraveineuse de nos candidats est réalisée sur animaux sous anesthésie générale gazeuse. Les prélèvements sanguins à l’œil se font sur animaux après application d’un anesthésique local quelques minutes avant. Tout au long des procédures nos animaux sont surveillés au moins 5 fois par semaine avec une observation accrue après injection de nos candidats (2h et 6h post injection) même s’il n’est pas attendu d’effet délétère de nos produits sur l’état général des animaux. Néanmoins, en cas d’apparition de signes cliniques (pelage ébouriffé, terne), une surveillance accrue avec suivi de la température sera effectuée. En cas de fièvre (température > 39°C), du doliprane sera donné dans l’eau de boisson. Si persistance de la fièvre (> 2 jours) ou de tout autre signe clinique (immobilité, prostration, apathie) pouvant traduire une douleur/détérioration de l’état général, ce sera un critère de point limite et il y aura mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

La souris est un bon modèle animal pour étudier la réponse immunitaire car le système immunitaire de la souris est bien décrit et les réactifs nécessaires sont largement disponibles. De plus ces études précliniques nécessitent un grand nombre d’animaux, il ne serait donc pas envisageable de les réaliser dans le modèle de primate non humain pour des raisons éthiques. D’autre part, ayant déjà validé l’efficacité d’un des candidats dans ce modèle murin, il nous semble pertinent de valider le candidat exprimant la molmécule-1 et le candidat coexprimant les 2 molécules dans le même modèle. Ces produits d’immunothérapies sont développés pour être utilisés chez l’homme et ils devraient cibler des patients adultes. Pour rester au plus proche de ce qui sera fait chez l’homme, nous utiliserons des souris d’au moins sept semaines (ayant un système immunitaire suffisamment mature) pour ces études précliniques.