Recherche appliquée

410 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses de tumeurs du côlon spontanées, elles reçoivent un anticancéreux par voie orale pendant 25 jours et huit injections, avec imageries sous anesthésie, et sont mises à mort à -20 % de poids ou en cas d'atteinte grave. Le porteur indique des effets secondaires de type infections, diarrhée et hypothermie, et revendique la "première étude au monde" d'une approche mécanopharmacologique du cancer du côlon. Il affirme qu'aucun modèle de laboratoire ne remplace la souris pour reproduire la croissance tumorale in vivo.

Objectifs

L'objectif de cette étude est de déterminer l'efficacité clinique d’un anti-cancéreux en tant que thérapie adjuvante aux protocoles actuels de traitement du cancer du côlon. Cet anti-cancéreux est déjà autorisé comme chimiothérapie unique pour le cancer de la thyroïde et agit en inhibant l'action de certains récepteurs exprimés à la surface des cellules pour réduire la croissance tumorale et supprimer les métastases. Pour déterminer l'efficacité thérapeutique des thérapies adjuvantes, il faut tenir compte du moment où les médicaments sont administrés dans le schéma du protocole (soit en même temps, soit indépendamment). Dans le cadre de ce projet, les médicaments seront administrés indépendamment, l’anti-cancéreux étant d'abord administré pendant 13 jours avant le début des traitements standard, afin de vérifier l'efficacité thérapeutique des protocoles standard sur la croissance tumorale, les métastases et l'activation des cellules souches cancéreuses.

Bénéfices attendus

Cette étude préclinique utilise une nouvelle approche mécanopharmacologique de la chimiothérapie qui délivre d'abord un premier traitement aux souris afin d’inhiber la progression tumorale métastatique et la résistance aux traitements avant application des traitements classiques. Nous proposons qu'en modifiant les délais d'administration du médicament qui ont été testés précédemment, nous parviendrons à démontrer une diminution de la charge tumorale, une suppression de l'activation des cellules souches cancéreuses et une réduction de l'incidence de la résistance au traitement lorsque l’anti-cancéreux est administré avant les traitements standard et non en même temps. Ce projet vise ainsi à identifier les effets à court terme (phase ) et à long terme (phase ) des nouvelles stratégies de traitement mécanopharmacologique, et constitue la première étude au monde à mettre en œuvre une approche mécanopharmacologique de la chimiothérapie du cancer du côlon. Dans l'ensemble, cette étude permet non seulement de prendre en compte les calendriers administratifs des médicaments lors de la conception des protocoles chimiothérapeutiques du cancer du côlon, mais elle met également en évidence un nouveau rôle des forces mécaniques intrinsèques de la pression de croissance tumorale dans la promotion et la régulation de la progression métastatique et de la résistance aux chimiothérapies

Procédures

Les animaux seront imagés sous anesthésie générale au maximum 6 fois pendant les 70 jours de l'expérience. Durée de l'anesthésie : 20 minutes Les animaux recevront un traitement quotidien par voie orale pendant 25 jours et recevront 8 injections de traitements (voie intrapéritonéale). Administration de molécules réalisée sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les effets secondaires courants des traitements standard utilisés comprennent un risque accru d'infection (dû à la réduction du nombre de globules blancs), la diarrhée, la perte d'appétit et l'hypothermie.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Il n'existe actuellement aucun modèle de laboratoire de remplacement qui imite avec précision la croissance tumorale in vivo, notamment les pressions de croissance mécaniques associées qui provoquent l'activation des cellules souches cancéreuses, en dehors des modèles de souris. De plus, l'administration de chimiothérapies par voie orale nécessite souvent un métabolisme , ce qui signifie que le médicament doit d'abord subir une étape métabolique préliminaire pour devenir actif – c’est notamment le cas de notre molécule d’intérêt qui doit d'abord être métabolisée par le foie avant de pouvoir être considérée comme un chimiothérapeutique actif. Ainsi, pour reproduire complètement le contexte clinique, un système multi-organes (un animal) est nécessaire. Bien qu’il existe des systèmes de corps sur puce microfluidiques qui incorporent plusieurs lignées cellulaires et reproduise cet environnement multi-organes, l'interaction spécifique des protocoles testés sur l'activation des cellules souches cancéreuses ne peut être étudiée dans ce contexte.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux requis pour atteindre la signification statistique, la formation de protocoles non invasifs spécifiques sera effectuée par des experts de l'équipe et des techniques d'imagerie in vivo seront utilisées tout au long de ce projet afin de réduire le nombre d'animaux requis pour atteindre la signification statistique.

Raffinement

Toutes les souris seront surveillées quotidiennement tout au long de la phase de traitement du protocole afin de garantir leur bien-être. Toutes les expériences d'imagerie seront menées de manière à minimiser et à prévenir la douleur. Une grille de notation sera appliquée pour contrôler le bien-être des animaux tout au long du projet proposé. Les critères mentionnés dans la grille de notation seront appliqués. Les évaluations cliniques des saignements, de l'hypothermie, de la diarrhée ou des changements comportementaux grossiers (échelle des grimaces de souris) seront surveillées et enregistrées. Comme mentionné précédemment, la déshydratation, la diarrhée et l'hypothermie seront surveillées de près tout au long de la phase de traitement, et le bien-être général des souris sera étroitement surveillé tout au long de la partie observation et survie de l'étude. Toute souris présentant des comportements débilitants qui ne peuvent être traités par des stratégies de gestion de la douleur ou soignés, sera euthanasiée. Les souris seront pesées deux fois par semaine et si une perte de 20% ou plus est déterminée, la souris sera euthanasiée. Toutes les souris recevront les anesthésiques appropriés afin de garantir que les souris soient maintenues dans un état de santé optimal et que le nombre minimum de souris soit utilisé tout au long du protocole. Pour analyser la croissance tumorale in vivo, des analyses d'imagerie in vivo seront effectuées. Toutes les expériences d’imagerie seront réalisées sous anesthésie et seront effectuées par une équipe de 2 personnes si nécessaire et ne dureront pas plus de 20 minutes par animal. Pour toutes les techniques d'imagerie, un gel oculaire et des tapis et/ou lampes chauffants seront utilisés pour minimiser l'inconfort et l'hypothermie.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les expériences sur la cancérogenèse et pour les essais thérapeutiques sur le cancer, car les médicaments sont métabolisés de la même manière que chez l'homme, ce qui rend obsolète l'utilisation de lignées cellulaires ou d'autres animaux comme les poissons. La souche de souris choisie contient une mutation génétique importante connue pour jouer un rôle dans le développement du cancer du côlon chez l'homme. Elle est donc depuis longtemps reconnue comme le modèle de choix pour le développement spontané de tumeurs intestinales et coliques lorsque les souris atteignent l'âge de 12 à 16 mois et et sont donc communément appelées "vieilles souris" ou "souris âgées". Les souris porteuses de la mutation développent spontanément des tumeurs intestinales et coliques et la formation d'ACF entre l'âge de 12 et 16 mois. Comme ce projet vise à déterminer l'efficacité thérapeutique des protocoles standard sur les tumeurs endogènes, toutes les souris utilisées dans cette étude seront âgées de 12 à 16 mois, les expériences commenceront sur des souris âgées de 14 mois au maximum, afin de garantir le bien-être optimal de la souris pendant les trois phases de l'expérience (phase d'observation avant traitement, phase de traitement et phase de survie). Il est important de noter que les expériences commenceront indépendamment de la formation d'une tumeur détectable, car le fond génétique garantit la formation d'ACF (le précurseur du cancer du côlon).

2 370 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Génétiquement modifiées pour exprimer le récepteur ACE2 humain, elles sont infectées par le SARS-CoV-2 dans un modèle décrit comme létal, avec une perte de poids pouvant atteindre 30 % et une survie moyenne de cinq jours, puis reçoivent en moyenne cinq injections et des prélèvements sanguins, une fraction subissant une chirurgie thoracique sous anesthésie sans réveil. Le porteur vise à tester vaccins, anticorps et antiviraux avant un passage chez l'humain. Il affirme que l'étude de la réponse immunitaire rend le recours à la souris "indispensable" et qu'il est "impossible" de la remplacer par un modèle "ne représentant que partiellement un organisme".

Objectifs

Depuis la fin de l'année 2019, la pandémie de COVID-19 s'est propagée dans le monde entier, causant plus de six millions de décès et affectant plusieurs centaines de millions de personnes. Cette maladie, causée par la transmission du virus SARS-CoV-2, se manifeste par différents symptômes. Les formes légères se caractérisent principalement par de la fièvre, de la toux, de la fatigue, des pertes de goût et d'odorat. Les formes les plus graves sont associées à un syndrome de détresse respiratoire aiguë, et une défaillance de plusieurs organes de très mauvais pronostic. Des recherches intensives ont permis des progrès importants dans la compréhension des mécanismes sous-tendant les manifestations cliniques. Cependant, il n’existe toujours pas de traitement totalement efficace contre la COVID-19. Le récepteur ACE2, nécessaire à l’entrée du virus SARS-CoV‑2 dans les cellules de l’hôte, est une protéine clé dans les mécanismes à l’origine de la maladie. Parmi les différents modèles d’étude précliniques utilisés dans la recherche de vaccins et molécules thérapeutiques, les modèles de souris génétiquement modifiées pour l’expression du récepteur ACE2 humain sont sensibles à l’infection par le virus SARS-CoV-2, et permettent une analyse expérimentale du comportement du virus dans l'organisme. Certains de ces modèles dits ‘sévères’ développent après infection une forme létale de la maladie causée notamment par une réponse hyper-inflammatoire hors de contrôle. D’autres, dits ‘modérés’, développent une forme légère de la maladie. L’objectif de ce projet vise à la mise en place de modèles souris d’infection (sévère et modérée) au SARS-Cov-2 pour permettre d’étudier l’infection d’une part, et d’évaluer d’autre part une large gamme de stratégies de prévention et de traitements potentiels (vaccins, anticorps, anti-viraux, anti-inflammatoires) avant passage en phase clinique chez l’humain. Ce modèle, génétiquement modifié pour exprimer le récepteur ACE2 humain, permettra le suivi des paramètres immunologiques de l’infection, y compris avec des variants d’intérêt récents du virus. Du fait de sa petite taille de l’accessibilité facilitée à des modèles génétiquement modifiés, le modèle murin permet d’évaluer une large gamme de candidats médicaments pour traiter la cause (l’infection par le virus SARS-CoV-2) et les symptômes de la maladie induite après infection. Il permet donc en première intention, d’éviter le recours à des modèles plus complexes à mettre en œuvre.

Bénéfices attendus

Dans le contexte actuel de la pandémie COVID-19, il est urgent de pouvoir procéder à l’évaluation de traitements contre le virus lui-même ou contre les atteintes conséquentes à l’infection (respiratoires, vasculaires, neurologiques, cardiaques, inflammatoires). En permettant d’accroitre la capacité d’accès à plusieurs modèles pertinents de la maladie induite par l’infection au SARS-CoV-2, ce projet permettra d’augmenter significativement les options d’évaluation de nouvelles stratégies de traitement variées et adaptées à des situations cliniques (modérées et sévères) diverses. Dans le cadre de ce projet, nous mènerons à bien les campagne d’évaluation de composés candidats, avec l’objectif de permettre l’identification rapide de nouveaux produits efficaces contre SARS-CoV-2. A plus long terme, et ce, dans le cadre du projet collaboratif entre les différents partenaires du projet, de nouvelles approches technologiques en imagerie seront établies, permettant d’accroitre nos connaissances sur la réponse immunitaire mise en œuvre chez la souris dans le cadre d’infections causées par des pathogènes aéroportés.

Procédures

Les animaux de chaque étude seront soumis à un campagne de traitement pouvant représenter plusieurs inoculations de composés tests, et ce, via diverses routes d’inoculation (moyenne de 5 injections avec des candidats médicaments et 2 injections avec des candidats vaccins ; durée des interventions

Impact sur les animaux

Deux types de modèles murins de l’infection au SARS-CoV-2 (sévère et modérée) seront établis. Tous les modèles seront suivis cliniquement de la même manière pour permettre une comparaison des critères d’évaluation. La grande majorité des études fera appel à un modèle d’infection sévère. Dans les modèles sévères, l’infection au SARS-CoV-2 induit une pathologie létale (aboutissant à la mort) qui s’accompagne d’une perte d’activité et de poids (jusqu’à 30%), avec une survie moyenne de 5 jours. Un traitement efficace devra permettre une amélioration significative des atteintes cliniques et de la survie au-delà de 5 jours post-infection. Dans les modèles modérés (moins bien décrits dans la littérature scientifique), l’infection au SARS-CoV-2 induit une pathologie limitée qui se résout d’elle-même en 1-2 semaines, sans signe clinique macroscopique particulier chez les jeunes animaux. Une perte de poids transitoire (de l’ordre de 10% à 3 jours post-infection) a été rapportée chez les animaux plus âgés (30 semaines). De plus, des effets indésirables peuvent être observés suite à des traitements (inflammation ou nécrose au site d’inoculation, intolérance et toxicité des traitements).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, afin de procéder à la collecte d’échantillons biologiques d’intérêt (notamment des tissues des voies aériennes).

Remplacement

L’utilisation des modèles de souris COVID-19, organismes vivant complexes à même de reproduire différents aspects de la maladie humaine, est indispensable pour faire progresser le programme d’évaluation de candidats thérapeutiques dans un contexte où la balance bénéfice/risque de nombreuses molécules peut se révéler négative in vivo malgré des résultats prometteurs obtenus in vitro. Le projet portant sur l’étude de la réponse immunitaire de l’organisme et l’évaluation de traitements, il est impossible de remplacer l’animal par un modèle ne représentant que partiellement un organisme. L’utilisation de ces modèles intervient en seconde ligne après l’évaluation des candidats médicaments in vitro dans plusieurs systèmes expérimentaux (biochimie, culture de lignées cellulaires, avec utilisation de plusieurs variants d’intérêt du SARS-CoV-2). En l’absence d’une efficacité auparavant démontrée in vitro, les candidats médicaments ne seront pas testés in vivo. La sélection préalable des candidats in vitro permet de réduire drastiquement le nombre de produits à tester in vivo.

Réduction

En nous basant sur nos études antérieures sur le modèle hamster COVID d’une part, et sur les études effectuées par nos collaborateurs académiques sur un modèle murin sévère d’infection d’autre part, nous avons établi des effectifs de lots de 15 animaux pour pouvoir observer des différences statistiques entre groupes. Dans chaque lot, une fraction des animaux sera utilisée pour évaluer la charge virale pulmonaire et des paramètres de réponse immunitaire, et une autre fraction sera utilisé pour évaluer la survie à long terme (2 semaines) prodiguée par le traitement en cours d’évaluation. Les comparaisons des données des différents groupes d’animaux seront réalisées au travers d’analyses statistiques adéquates.

Raffinement

L’hébergement des animaux sera réalisé dans des portoirs ventilés permettant l’hébergement maximal simultané de 405 animaux par portoir (5 souris par cage). Suivant nos observations, nous pourrons augmenter l’enrichissement des cages (deux cylindres au lieu d’un) ou diminuer le nombre d’animaux par cage (tout en évitant les individus seuls). Aucune anesthésie n’est prévue pour les inoculations par voie per os (risques de fausse route), sous-cutanée ou intrapéritonéale (allongement considérable de la durée de la procédure induisant plus de stress). Un suivi clinique quotidien (a minima sur les 7 premiers jours de l’infection) des animaux avec pesée & évaluation des paramètres cliniques permet de s’assurer de l’évolution des signes cliniques de l’infection. Une grille de score clinique sera mise en œuvre, en nous basant sur les observations et pratiques déjà établies par d’autres collaborateurs académiques. Les critères suivis incluent l’apparence physique, la perte de poids, la mobilité et le comportement et permettent de déterminer un score clinique non dommageable, léger, modéré ou sévère. Une euthanasie préventive sera effectuée pour éviter des souffrances inutiles si les animaux présentent une forte perte poids ou un score clinique sévère. En cas de perte de poids intermédiaire, la nourriture et de l’eau gélifiée seront disposées en fond de cage. Une réhydratation par injection sous-cutanée quotidienne sera effectuée à partir d’une perte de poids intermédiaire.

Choix des espèces

Les souris génétiquement modifiées pour l’expression du récepteur ACE2 humain permettent d’accéder à une gamme de modèles expérimentaux reproduisant une pathologie soit sévère, soit modérée, après infection au SARS-CoV-2. Elles présentent l’avantage de pouvoir être explorées expérimentalement grâce à de très nombreux outils de biologie cellulaire et moléculaire, ce qui n’est pas le cas du modèle hamster syrien doré. Du fait de sa petite taille, de son coût réduit et de l’accessibilité facilitée via des éleveurs agréés, le modèle permet, en première intention, d’éviter le recours à des modèles plus complexes à mettre en œuvre, comme les primates non-humains. Il est à noter que les modèles chez lesquels une pathologie sévère est obtenue n’ont pas d’équivalent dans d’autres espèces animales, et représentent donc une opportunité unique pour étudier une pathologie de type COVID. Ces lignées d’animaux ne présentent pas d’atteintes physiques et/ou de comportement sévère (phénotype dommageable) dans les conditions normales d’hébergement, et, dans le cadre de ce projet, ne montreront un phénotype dommageable que suite à une infection par le virus SARS-CoV-2. Les animaux utilisés pour ce projet seront âgés de 8 à 12 semaines (stade adulte), comme décrit jusqu’à maintenant dans la littérature scientifique disponible sur le sujet. Dans certains cas, il pourra être envisagé d’utiliser des animaux plus jeunes ou plus âgés, pour potentiellement reproduire des aspects de la maladie spécifiquement observés chez des individus humains jeunes ou âgés, respectivement.