Recherche appliquée

Sous anesthésie, chaque rat reçoit dans le cerveau une injection de vecteurs viraux qui lui fait surproduire de la neuromélanine et développer peu à peu un syndrome parkinsonien. 56 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec jusqu'à cinq séances d'IRM de deux heures trente sous anesthésie, la tête fixée dans un cadre stéréotaxique, et une observation de cinq minutes dans une cage propre en guise de test comportemental. Le porteur affirme que leur phénotype "n'est pas considéré comme dommageable dans la limite d'âge attendue", puis que le syndrome pourrait "mener à terme à une perte de poids due à une apathie et inactivité des rats". Tous sont tués pour prélever leur cerveau et analyser les neurones de la substance noire.

Objectifs

La neuromélanine, qui joue un rôle dans le développement de la maladie de Parkinson, est principalement contenue dans une structure cérébrale appelée substance noire qui est fortement impactée dans la maladie. L’imagerie par résonance magnétique permet de mesurer in vivo le volume de certaines structures cérébrales, incluant la substance noire, ainsi que de mesurer la présence de neuromélanine. L’objectif du projet est de mesurer le niveau de neuromélanine par imagerie par résonance magnétique dans un modèle rat de la maladie de Parkinson afin de mieux comprendre le lien entre cette molécule et le développement de la maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet participera à la recherche contre la maladie de Parkinson avec de nombreux bénéfices à court et long-terme. Dans un premier temps, les résultats de la première étude permettront de mieux comprendre le développement de maladie de Parkinson en étudiant la corrélation entre les niveaux de neuromélanine dans la substance noire, les symptômes moteurs et les caractéristiques histopathologiques des neurones dopaminergiques. Selon notre hypothèse, un seuil de neuromélanine pathologique sera établi à la suite de cette étude. Dans un second temps, notre projet permettra le développement et l’évaluation in vivo du traitement par ultrasons transcrâniens focalisés sur un modèle pertinent. Nous attendons de ce traitement qu’il ralentisse l’apparition du syndrome parkinsonsien chez les rats. Nos données présentant plusieurs fenêtres thérapeutiques seront alors une base solide pour la conception d’un essai clinique. En supplément de ces bénéfices directs, le projet permettra une meilleure caractérisation du modèle rat utilisé. Ces résultats, qui pourront être valorisés à travers des publications dans des revues scientifiques, seront utiles à toute la communauté scientifique travaillant sur ces problématiques. Par ailleurs, les images acquises en imagerie par résonance magnétique et les échantillons cérébraux issus de rats modèles de la maladie de Parkinson à différents âges, pourront par la suite être réutilisés dans de futurs projets.

Procédures

Le projet inclut les interventions suivantes : - Injection intracérébrale de vecteurs viraux induisant la surproduction de neuromélanine : 56 rats (tous les animaux). Sera pratiqué une seule fois par animal, sous anesthésie générale pour une durée de 30 min. - Imagerie par résonance magnétique sensible à la neuromélanine : Sera pratiqué sur 56 rats entre 1 et 5 fois par rat en fonction des groupes expérimentaux (temps de maintien plus long), avec un minimum d'1 mois entre deux sessions. Pratiqué sous anesthésie générale pour une durée de 2h30. - Test comportemental (observation du rat dans une cage propre) : Sera pratiqué entre 1 et 5 fois par rat en fonction des groupes expérimentaux (temps de maintien plus long), avec un minimum d'1 mois entre deux sessions. Pratiqué sur animaux vigiles pour une durée de 5 min.

Impact sur les animaux

Les rats recevront une injection stéréotaxique de vecteurs viraux AAV-hTyr. Suite à cet acte, les rats sont susceptibles de montrer des signes de douleur et une perte de poids qui devrait durer une semaine maximum. Les sessions d’imagerie ne nécessitent pas de chirurgie et aucune nuisance n’est attendue après réveil. Enfin, les tests comportementaux prévus (observation d’un rat dans une cage propre pendant 5 min) seront réalisés sur des rats vigiles. Ces tests pourraient générer un léger stress qui devrait s’estomper rapidement après retour du rat dans sa cage d’hébergement. Le phénotype des rats AAV-hTyr n’est pas considéré comme dommageable dans la limite d’âge attendue. Le développement du syndrome Parkinsonien chez les rats AAV-hTyr, très progressif, pourrait cependant mener à terme à une perte de poids due à une apathie et inactivité des rats.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir prélever leurs tissus cérébraux et d’analyser les neurones dopaminergiques de la substance noire. Ces données nous permettront de mieux comprendre les liens entre le niveau de NM, les troubles moteurs, et la dégénérescence neuronale dans ce modèle de la maladie de Parkinson.

Remplacement

Il n’existe à ce jour aucun moyen de modéliser in vitro ou in silico la complexité du cerveau nécessaire à l’étude des mécanismes à l’origine de la maladie de Parkinson.

Réduction

Un calcul de puissance statistique d’après nos précédents résultats a montré un nombre minimal de 8 rats nécessaires dans chaque groupe expérimental pour pouvoir répondre à la question scientifique posée. Afin de garantir que la perte d’un animal pour une quelconque raison ne puisse pas compromettre les analyses statistiques de l’étude, ce nombre a été porté à 10 rats par temps d’observation (5 temps x 10 rats = 50 rats). La conception de l'étude permet de réduire le nombre d’animaux utilisés en effectuant un suivi longitudinal plutôt que l’établissement d’une nouvelle cohorte pour chaque âge étudié. De plus, afin de garantir le bon déroulement de l’étude principale , celle-ci sera précédée d’une étude préliminaire permettant d’optimiser les protocoles d’injection et d’imagerie. Un nombre de 6 rats est prévu dans cette procédure pour pouvoir ajuster notre protocole avant le lancement de l’étude comportant un nombre important d’animaux, dans le cas où le protocole initial ne serait pas satisfaisant pour répondre à la question scientifique. Au total un nombre de 56 rats sont donc inclus dans les procédues expérimentales.

Raffinement

Les rats seront hébergés par 2 en portoir ventilé, dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne-nocturne de 12h. L’eau et la nourriture seront fournies ad libitum. Un environnement enrichi par un système de nidification périssable renouvelé lors du change hebdomadaire sera fourni aux animaux. Une période d’acclimatation d’une semaine est prévue avant toute manipulation des animaux lors de leur arrivée. Les animaux seront ensuite examinés quotidiennement par le responsable du projet. Une surveillance et une fréquence de pesée accrues seront mises en place en cas d’approche d’un point limite, en particulier en cas de perte de poids corporel constatée lors du suivi hebdomadaire. Lors des injections intracérébrales, les rats âgés de deux mois seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane et recevront une analgésie par dérivé d'opioïde (injection sous-cutanée par aiguille 25G) 20 minutes avant l’injection intracérébrale. La température corporelle des animaux sera maintenue avec un tapis d’eau chaude circulante thermo-régulée. Un gel oculaire sera placé sur les yeux pour éviter tout dessèchement. Une crème analgésique sera également appliquée au niveau des points de contact du cadre stéréotaxique. Suite aux actes chirurgicaux,une analgésie par dérivé d'opioïde (injection sous-cutanée par aiguille 25G) sera réalisée pour la prise en charge aigüe, puis des analgésiques seront mélangés à la boisson pendant 24h. Le suivi hebdomadaire du poids corporel des rats nous permettra d’instaurer un point limite de nuisance au bien-être des animaux. Suite aux actes chirurgicaux, ou en cas de perte de poids des animaux, une surveillance accrue sera mise en place avec un suivi renforcé à trois fois par semaine. La plaie sera surveillée. En cas d’infection, la plaie sera nettoyée et une pommade cicatrisante sera appliquée quotidiennement. Lors des examens d'imagerie, les rats seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane et fixés par un cadre stéréotaxique au lit de l'imageur par résonance magnétique 11,7T rongeurs. Un anesthésique local sera appliqué sous forme de gel au niveau des oreilles pour minimiser la douleur induite par le cadre stéréotaxique. Des points limite seront mis en place entraînant la mise à mort de l'animal (perte de poids supérieure à 10% lors du suivi hebdomadaire, hémorragie, accident d'anesthésie entraînant un arrêt respiratoire).

Choix des espèces

Les rats sont de bons modèles pour l’étude du cerveau par imagerie par résonance magnétique, car leur taille permet de les examiner dans des imageurs à résonance magnétique à haute performance, avec de nombreux modèles pathologiques disponibles. De plus, de nombreux tests comportementaux permettent d’évaluer les altérations cognitives et motrices dans ces modèles. En particulier, le modèle utilisé permet de reproduire de nombreux aspects de la maladie de Parkinson. Les animaux seront utilisés dès leur arrivée à l’âge de deux mois, au début de l’âge adulte, idéal pour l’injection des vecteurs viraux et passage à l’imagerie par résonance magnétique.

1000 souris et 1000 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, un millier d'entre eux réutilisés et les autres tués à l'issue. Ils subissent selon les cas une ligature d'un uretère, l'ablation des deux tiers puis de la totalité d'un rein ou des protocoles de diurèse, avec des prélèvements sanguins et une insuffisance rénale attendue, pour tester des candidats médicaments de firmes pharmaceutiques. Le porteur indique que les animaux des procédures chirurgicales sont euthanasiés pour prélever les reins, ceux d'une procédure pouvant être gardés vivants sauf si un prélèvement incompatible avec la survie est requis. Il reconnaît que des cultures cellulaires apportent des données préliminaires mais affirme qu'elles ne peuvent "entièrement suppléer" le modèle animal, faute d'environnement immunologique intact.

Objectifs

Le vieillissement de la population et l’augmentation du nombre de patients atteints de diabète ou d’hypertension artérielle entraînent une forte accélération de l’incidence des néphropathies menant à l’insuffisance rénale chronique. L’insuffisance rénale aiguë, qu’elle soit par exemple d’origine obstructive (obstruction des voies urinaires dont la cause peut-être la présence de calculs ou d’un adénome prostatique) ou toxique (intoxication médicamenteuse), est également une situation clinique fréquente. Si elle n’est pas prise en charge, une insuffisance aiguë peut rapidement évaluer en insuffisance chronique. Quelle qu’en soit l’origine, la majorité des atteintes rénales chroniques, aboutissent au développement d’une fibrose tubulo-interstitielle dont la présence signe l’évolution vers la perte de la fonction rénale. L’insuffisance rénale chronique est un enjeu majeur en santé publique. La fibrose rénale représente le trait histologique commun des néphropathies associées à une insuffisance rénale chronique évolutive. Elle se caractérise par une accumulation de protéines de la matrice extracellulaire conduisant à la destruction progressive du parenchyme rénal. L’insuffisance rénale peut rapidement détériorer l’état de santé des patients (exemples : anémie, fatigue, confusion mentale, troubles psychiques, hypertension, troubles du rythme cardiaque) ou mettre en jeu le pronostic vital (exemples : œdème aigu du poumon, coma, accident vasculaire cérébral, les infarctus du myocarde). Comprendre et lutter contre le développement de l’insuffisance rénale et de l’apparition de la fibrose représente ainsi un enjeu scientifique et médical de la plus grande importance. Les tests décrits dans ce projet ciblent l'évaluation des effets de substances dans le cadre de développement préclinique de produits pharmaceutiques. Ces modèles sont mis en place et utilisés afin de tester l'efficacité de médicaments, ou de s'assurer qu'ils ne modifient pas la fonction rénale ou n'induisent pas eux-mêmes une insuffisance rénale.

Bénéfices attendus

Ces différents modèles sont nécessaires à la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments sûrs et efficaces pour traiter l'insuffisance renale aiguë ou chronique. Par exemple, il n’existe pas, pour l’instant, de traitements médicamenteux établis pour traiter la fibrose rénale. Jusqu’à présent, la dialyse ou la greffe restent les seules stratégies appropriées.

Procédures

Dans les procédures chez la souris (fibrose par ligature d’un uretère, diurèse), un prélèvement sanguin terminal (sans réveil) sous anesthésie gazeuse (isoflurane) peut être réalisé. Dans les procédures chez le rat, un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse (isoflurane) est réalisé juste avant l'euthanasie. Selon les besoins de l'étude (rat/souris), des prélèvements sanguins supplémentaires (fréquence selon les besoins de l'étude) peuvent être réalisés (sous anesthésie avec retour à l'état conscient). Dans ce cas, le volume prélevé sera inférieur ou égal à 15% de la volémie sanguine et ne sera répété que toutes les 2 semaines au minimum. Dans la procédure de ligature d’un uretère, une phase de chirurgie est nécessaire. Les animaux sont anesthésiés (isoflurane) et reçoivent une administration d'un antalgique. Une laparotomie médiane est pratiquée en condition d'asepsie. Un uretère est ligaturé. Les plans musculaires et cutanés sont suturés et l'animal est placé près d'un dispositif chauffant jusqu'au réveil. Pendant la phase de récupération post-chirurgicale, les animaux reçoivent un antalgique. Un groupe d'animaux servant de contrôle (groupe Sham) subit la même procédure chirurgicale à l'exception de la ligature de l’uretère. Dans la procédure de 5/6 néphrectomie, deux phases de chirurgie sont nécessaires. Pour chaque phase (espacée d’une semaine), les animaux sont anesthésiés (anesthésie gazeuse isoflurane) et reçoivent une administration d'un antalgique. Une petite laparotomie latérale est pratiquée en condition d'asepsie. Dans la première phase, le rein gauche est exposé et les 2/3 du rein sont excisés. Dans la seconde phase, le rein droit est entièrement excisé. Après chaque phase de chirurgie, les plans musculaires et cutanés sont suturés et l'animal est placé près d'un dispositif chauffant jusqu'au réveil. Un groupe d'animaux servant de contrôle (groupe Sham) subit la même procédure chirurgicale à l'exception de la 5/6 néphrectomie. Dans les 3 procédures, les animaux sont traités avec la substance d’essai en une plusieurs occasions, la voie et la durée du traitement étant adaptés aux besoins de l’étude. Le traitement est généralement effectué en une occasion (procédure de diurèse) ou pendant plusieurs semaines (4 ou 12 semaines maximum après la ligature d’un uretère ou la 5/6 néphrectomie).

Impact sur les animaux

Dans ce type de procédures, il est attendu une insuffisance rénale. Dans les modèles nécessitant une intervention chirurgicale (réduction de la masse rénale, ligature unilatérale d'un uretère), les animaux doivent être hébergés en cage individuelle (avec enrichissement) pendant la période de récupération post-chirurgicale (quelques jours). Pendant les périodes de récolte de l'urine (24 heures maximum), l'isolement des animaux est nécessaire et peut aller jusqu'à 24 heures (pour la détermination de la filtration glomérulaire, les urines doivent impérativement être collectées individuellement pendant 24 heures). Après la procédure de ligature d'un l'uretère, la rétention de l'urine ou hydronéphrose peut être accompagnée de douleurs lombaires. Les stades d'œdème aigu du poumon, coma, accident vasculaire cérébral ou infarctus du myocarde, observés chez l'homme à un stade avancé de l'insuffisance rénale nécessitant le plus souvent une greffe (d'œdème aigu du poumon, coma, accident vasculaire cérébral ou infarctus du myocarde) ne sont pas atteints dans les procédures décrites dans ce projet (les animaux étant euthanasiés avant ce stade). A ce stade du développement du médicament, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Il n’est donc pas attendu de sévérité forte liée aux molécules testées.

Devenir

Dans la procédure 1, les animaux peuvent être gardés en vie et réutilisés, sauf si, pour les besoins de l’étude, un volume de sang (et/ou un prélèvement d'organe) non-compatible avec la survie est nécessaire. Dans les procédures 2 et 3, les animaux sont euthanasiés, le prélèvement des reins (pour analyses) ne permettant pas le réveil et le maintien en vie.

Remplacement

En amont des tests in vivo sur des modèles d’insuffisance rénale, des tests in vitro (exemple: culture cellulaire 3D de fibroblastes) peuvent être envisagés. Cependant, même si ces tests peuvent apporter des données préliminaires ou complémentaires (mort cellulaire, prolifération des fibroblastes, modification de la matrice extracellulaire), ils ne peuvent entièrement suppléer les modèles animaux car ils ne permettent pas d’évaluer les pathologies dans un environnement biologique et immunologique intact comme cela est possible chez l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif. Nos analyses statistiques (Student'st test) indiquent qu’un effectif de 6-12 animaux par groupe selon la procédure (nombre de groupes variable en fonction du nombre de doses et de produits à tester) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Lorsque celà est possible, des prélèvements sanguins intermédiaires (autre que terminal) peuvent être envisagés sur un même animal, permettant ainsi de générer de données sur la cinétiques d'action de la molécule testés sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.

Raffinement

Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général et un suivi de poids). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs et suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets.

Choix des espèces

L’impact de substances pharmacologiques sur le système renal du rat et de la souris dans les modèles décrits, sont prédictifs de leur efficacité en clinique. Rongeurs sevrés, âge variant entre 3 semaines et et 6 mois, conformément aux données historiques.

240 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 160 étant tués à l'issue et 80 réutilisés dans d'autres études. Ils sont vaccinés par diverses voies puis infectés par le SARS-CoV-2 par voie nasale, trachéale ou en aérosol, et subissent des prélèvements de sang jusqu'à cinq fois par semaine, des lavages des poumons, des biopsies pulmonaires, intestinales, de moelle et de peau, ainsi que des ponctions lombaires. Le porteur affirme n'avoir détecté aucune souffrance liée à l'infection après un an et demi d'expérience, tout en reconnaissant des risques de pneumothorax ou de saignements lors des biopsies. Il teste des candidats vaccins présentés comme un "enjeu international majeur" et justifie le macaque par la proximité de sa réponse immunitaire avec celle de l'humain.

Objectifs

Le projet a pour objectif d’évaluer la capacité à provoquer une réponse immunitaire et l’efficacité de différents candidats vaccins innovants contre le virus SARS-CoV2, dans un contexte où les vaccins actuels ne sont que partiellement efficaces pour lutter contre la pandémie de Covid-19 que nous connaissons maintenant depuis deux ans. Plusieurs vaccins contre le SARS-CoV2 sont disponibles chez l’humain depuis 1 an environ, toutefois leur efficacité à long-terme est aujourd’hui remise en cause. En effet, la réponse immunitaire induite semble s’estomper au bout de quelques mois, ce qui nécessite l’administration de doses de rappel régulières. De plus, l’émergence de variant diminue l’efficacité de ces vaccins, qui devront certainement être modifiés pour rester suffisamment efficaces. En outre, les vaccins actuellement disponibles ne bloquent pas totalement la dissémination du virus. Il ne faut donc pas que les candidats vaccins moins avancés dans leur développement soient précocement abandonnés alors qu’ils pourraient suppléer à d’éventuels points faibles des vaccins déjà établis. Dans ce contexte, nous testerons dans un modèle animal de Covid-19 différents types de vaccins tels que de nouveaux vaccins à base d’ARN messager, des vaccins à base de séquences d’ADN, de virus atténués ou inactivés ainsi que des vaccins plus classiques de type protéique. Ces derniers pourraient représenter une alternative efficace pour stimuler la réponse immunitaire suite aux vaccins à ARN messager actuellement utilisés. Nos recherches précliniques actuelles devraient permettre de rentrer rapidement en phase d’essai clinique et nous faisons en sorte de pouvoir répondre aux exigences des critères d’entrée en essai clinique. Certaines études sont même des demandes explicites des agences.

Bénéfices attendus

La recherche d’un vaccin efficace contre le SARS-CoV2 est un enjeu de santé publique, dans la mesure où cette pandémie continue d’affecter notre société, en créant un afflux de malade dans les hôpitaux malgré les vaccins actuellement disponibles. La limite des vaccins actuels face aux nouveaux variant émergents nous encourage à trouver des moyens de lutte plus efficaces. En effet, ces vaccins voient leur efficacité décroître au bout de quelques mois et des rappels réguliers sont nécessaires pour maintenir une immunité efficace contre le virus. De plus, ces vaccins n’empêchent ni la dissémination du virus, ni même l’apparition de symptômes chez les personnes vaccinées. Aujourd’hui, de nouvelles stratégies vaccinales à l’aide de vaccins candidats de type protéique ou à ARN/ADN doivent être développées pour protéger plus efficacement de l’infection par le SARS-CoV2 et réduire sa propagation La pandémie perdure depuis 2 ans, elle a causé la mort de millions de personnes et impacte fortement la société, trouver un vaccin pour l’endiguer définitivement et y mettre fin est un enjeu international majeur.

Procédures

L’ensemble des procédures seront effectués sur des animaux anesthésiés pour éviter toute souffrance. L’immunisation des PNHs sera effectuée par voies (intramusculaire, intranasale et autres voies muqueuses, sous-cutanée, intradermique, délivrance par endoscopie): mise à part l’endoscopie le temps de l’intervention est inférieur à 30 minutes. Immunisation par voie intestinale ou gastrique peut prendre jusqu’à 1h30. Nous effectuerons le challenge viral par voie nasale et trachéale ou par voie aérosol et cela durera 30 minutes. Des puces de température pourront être implantés pour suivre la température corporelle en continu (intervention 45 minutes) Afin de caractériser nos candidats vaccins et l’infection SARS-CoV2, nous effectuerons des prélèvements de sang au maximum 5 fois par semaine par voie veineuse en limitant la quantité prélevée à 7.5% de la volémie sanguine totale/semaine. Ceci nécessitera un temps d’anesthésie de 20 minutes. Pour suivre l’évolution de la charge virale, nous effectuerons des prélèvements ou lavages aux/des sites infectieux et muqueuses (tractus respiratoire) au maximum 5 fois par semaine (10 minutes). Pour accéder au tractus respiratoire inférieur, nous effectuons des lavages broncho-alvéolaires (LBA) avec 4 jours d’intervalle minimum entre chacun des lavages (30 minutes). Différents types de biopsie pourront être réalisés en fonction des besoins de l’étude, comme des prélèvements de ganglions lymphatiques avec deux semaines d’intervalle minimum (45 minutes). Nous pourrions avoir besoin d’effectuer des biopsies pulmonaires pour évaluer la réponse locale ainsi que des biopsies de moelle osseuse et des biopsies intestinales par endoscopie (90 minutes d’intervention maximum). Des ponctions lombaires pour accéder au liquide cérébrospinal (1 fois par semaine au maximum) et des biopsies de peau pourraient être envisager (20 min d’intervention). Nous utiliserons aussi des méthodes non invasives pour l’analyse de nos candidats vaccins en utilisant l’imagerie CT et PET-CT avec injection de Fluor 18 (90 minutes maximum). Dans des cas très particuliers, nous pourrions effectuer une plasmaphérèse pour éliminer des anticorps spécifiques (1 fois par mois, 4 heures). De l’urine pourrait être aussi récupérée par sondage, pour mesurer la concentration urinaire du vaccin (20 minutes pour les 2 semaines). Enfin, des empreintes conjonctivales pourraient permettre d’accéder aux cellules immunitaires (1 fois/semaine pendant 20 minutes)

Impact sur les animaux

Après plus d’un an et demi d’expérience, nous n’avons pas détecté de souffrance suite à une infection par le SARS-CoV2 de notre modèle de PNH et cela quel que soit le variant utilisé (Wuhan/Beta/Delta…). Toutefois, l’hébergement individuel lors des phases de challenge pourrait entrainer un stress qui sera compensé par un programme défini par la cellule « bien-être animal » de l’établissement pour l’enrichissement de leur milieu de vie. Au niveau des procédures expérimentales, peu d’effets indésirables sont attendus. Dans de très rares cas, un pneumothorax (présence anormale d'air dans la cavité pleurale) ou un hémothorax (épanchement de sang dans la cavité pleurale) sont possibles à la suite des biopsies pulmonaires et seront observables en direct lors de l’endoscopie. Les animaux seront suivis sur des paramètres cliniques comme l’oxymétrie et la fréquence cardiaque pendant et après l’intervention pour s’assurer de l’absence de lésion. Les biopsies digestives par endoscopie sont parfois associées à des saignements digestifs. Lors de la réalisation de l’endoscopie, le site biopsié sera observé pour identifier et traiter tout saignement. Il est possible que les biopsies entrainent des inflammations et plaies locales qui seront surveillées quotidiennement jusqu’à la récupération complète de l’animal.

Devenir

Certains animaux vaccinés et non infectés par le SARS-CoV2, suite à l’inefficacité de l’immunisation, pourront être euthanasiés pour prélever différents tissus et procéder à des analyses de biodistribution, par exemple. Toutefois, dans la majorité des cas, les animaux ayant subi une immunisation inefficace pourront être réutilisés dans différentes études au sein du département afin de limiter le nombre total d’animaux utilisé. Les animaux infectés pourront être euthanasiés pour accéder aux tissus et mesurer par exemple la charge virale dans les poumons et d’autres tissus cibles ou encore pour caractériser les lésions pulmonaires par analyses histologiques (charge virale, lésions pulmonaires…) L’autre partie des animaux infectés par le SARS-CoV2 sera conservée pour servir de modèle de réinfection ou d’animaux convalescents.

Remplacement

L’évaluation de vaccins contre le SARS-CoV-2 nécessite un modèle expérimental permettant d’étudier les différentes composantes des réponses immunitaires (humorales, cellulaires) et les changements induits suite à l’immunisation et à l’infection virale. A ce jour, ces différents éléments ne peuvent pas être étudiés à l'aide de simulations informatiques ou dans des modèles in vitro. L'utilisation d'un modèle animal est nécessaire pour reproduire les symptômes et réponses immunitaires induits pas un virus respiratoire. Le primate non humain est choisi comme modèle animal dans cette étude, car il présente une réponse immunitaire et vaccinale semblable à celle de l’humain pour la plupart des infections respiratoires. De plus, les outils nécessaires sont disponibles et maitrisés chez cette espèce.

Réduction

Nous recevons de nombreuses demandes de partenaires pour tester des candidats vaccins. Notre expérience nous a montré que pour le développement d’un type de vaccin, les différentes phases de développement nécessitent plusieurs études pour ajuster la dose et la composition du vaccin, et dans ce cas précis la séquence ADN, dans un contexte d’émergence continuelle de variant. Nous considérons que nous aurons au moins besoin de 5 protocoles par candidat vaccin et nous anticipons 6 études à venir rapidement au cours de l’année 2022/2023. La majorité des candidats-vaccins sont d'abord évalués dans des modèles animaux murins, afin de réduire au maximum l'utilisation de primates non-humains. Ainsi nous anticipons 30 protocoles avec un maximum de 6 primates non-humains par groupe. Ce chiffre, qui permettra une analyse statistique fiable des résultats, représente le nombre maximum de primates non-humains par groupe. Dans certains cas, il pourra être réduit pour des phases pilotes comparant des doses ou des voies d’administration par exemple. Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, nous limiterons le nombre d’animaux contrôle non vaccinés en incluant des contrôles historiques au sein des études.

Raffinement

Tous les animaux sont des animaux d’élevage de seconde génération toutes les procédures seront effectuées sur des animaux anesthésiés. De plus, des protocoles d’analgésie ont été définis et validés par l’équipe vétérinaire afin de minimiser la douleur à chaque intervention en fonction de l’espèce utilisée. Les hébergements en individuel sont limités au maximum. ils seront hébergés en individuel contigus uniquement après la phase d’infection. Cet hébergement individuel contigu permet des interactions sociales (conservation du contact physique par le haut de la cage et sensoriel par la mise en place de plaques translucides entre les cages latérales, et cages face à face séparées d’environ 2m). L’enrichissement sera augmenté (distribution 2 fois par semaine d’enrichissements destructibles au lieu d’1). Les interventions par chirurgie mini-invasive, ciblant des organes et tissus préalablement identifiés par imagerie médicale seront privilégiées afin de raffiner les méthodes expérimentales employées et ainsi réduire la douleur postopératoire. Grâce à l’utilisation de différentes techniques d’endoscopie (bronchoscopie) les tissus cibles seront prélevés avec précision en un nombre réduit d’incisions. Les volumes de sang prélevés seront réduits au minimum nécessaire. En cas d’apparition de signes locaux suites aux prélèvements, un traitement symptomatique local pourra être instauré après examen par le vétérinaire. Pour les prélèvements des fluides bronchiques une attention sera portée aux animaux lors de ce geste. Un anesthésique local sera utilisé lors de l’intubation et les animaux seront étroitement surveillés jusqu’à leur réveil. Lors des séances d’imagerie in vivo, l’animal sera placé sur un matelas chauffant avec un maintien hydrique et ses constantes biologiques seront surveillées. Si l’animal présente des signes cliniques (difficultés respiratoires, vomissement, tachycardie, arythmie, hypoglycémie) avant ou lors de la séance d’imagerie, la session sera interrompue. Si l’animal montre des signes de douleur trop importante, un traitement symptomatique pourra être mis en place par le vétérinaire responsable. Si l’état général de l’animal ne s’améliorait pas malgré la prise de mesures, alors l’euthanasie de l’animal serait envisagée.

Choix des espèces

Les espèces de primates non-humains retenues pour cette étude ont été sélectionnées pour deux raisons : - elles représentent le seul modèle réunissant les éléments nécessaires à l’évaluation de vaccins : les réponses immunitaire et vaccinale sont similaires à celles de l’humain, et les techniques et outils d’exploration de la réponse immunitaire et de la réponse vaccinale sont disponibles et maitrisés chez ces espèces, contrairement à d’autres modèles d’infections respiratoires régulièrement utilisées comme le furet. - elles ont déjà fait l’objet de publications scientifiques en tant que modèles d’infection par le SARS-CoV2, et présentent des symptômes semblables à ceux observés chez l’Homme. Les espèces choisies présentent un système immunitaire et une physiopathologie de l’infection par le SARS-CoV2 très proches. Le système immunitaire et la réponse vaccinale évoluent en fonction du stade de développement et de l’âge des individus. Les candidats vaccins étudiés étant susceptibles de faire l’objet d’essais cliniques chez l’adulte, il est donc nécessaire de réaliser ces études chez un animal au système immunitaire « mature », soit de plus de 2 ans.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'implantation de cellules tumorales dans le pancréas durant jusqu'à une heure, un suivi par échographie sous anesthésie une à deux fois par semaine, puis un prélèvement de sang et de tumeur avant mise à mort par dislocation cervicale. Le porteur fixe des points limites, une tumeur atteignant 2000 mm³ ou une perte de 20 % du poids déclenchant la mise à mort, sans que ces seuils soient forcément atteints. Le projet vise à mettre au point une technique de greffe présentée comme "plus prédictive" que la greffe sous la peau, et il affirme qu'aucune méthode in vitro ne reconstitue la tumeur et son environnement.

Objectifs

Le pancréas est un organe qui contient 2 types de cellules : les cellules exocrines dont la fonction est de libérer des enzymes et des sucs participant à la digestion et les cellules endocrines qui produisent des hormones notamment impliquées dans l’homéostasie glucidique. Avec 14000 nouveaux cas de cancers diagnostiqués par an, le cancer du pancréas est le 6e cancer le plus fréquent en France. L’adénocarcinome canalaire pancréatique (ACP) qui représente 90-95% des cancers du pancréas, se développe dans le compartiment exocrine et est très agressif et létal, avec un pourcentage de survie des patients à 5 ans inférieur à 10% (seuls 20% des patients souffrant d’ACP survivent plus d’un an). Les prévisions suggèrent que le nombre de cas d’ACP et de décès associés à ce cancer seront multipliés par 2 d’ici 2030. Cette augmentation est associée non seulement au vieillissement des populations, mais aussi à l’augmentation de la prévalence de l’obésité et du diabète dans le monde. Parmi les autres facteurs de risque pour ce cancer, on trouve le tabagisme, l’abus d’alcool et des prédispositions génétiques (

Bénéfices attendus

Actuellement, les études pharmacologiques dans le cadre du cancer canalaire pancréatique sont effectuées sur des modèles de xénogreffes de cellules tumorales humaines sous la peau de souris (greffe ectopique ou hétérotopique). Mais ces modèles ne récapitulent pas toutes les caractéristiques spécifiques associées à l’ACP et notamment le microenvironnement tumoral. La greffe de cellules tumorales pancréatiques dans le pancréas permet de retrouver ce microenvironnement tumoral et est donc considérée plus pertinente pour l’évaluation de nouveaux traitements anti-tumoraux. Ainsi les bénéfices de ce projet seraient de mettre au point un modèle plus prédictif de la pathologie humaine et ainsi de mieux prédire l’efficacité de candidats médicaments chez l’homme.

Procédures

-Puçage : un dispositif sous cutané est implanté à chaque animal quelques jours avant l’étude par trocart afin d’être identifié -Chirurgie pour l’implantation des cellules tumorales dans le pancréas : cette chirurgie durera de 30 min à 1 heure et sera réalisée une seule fois sur chaque animal avec mise en œuvre des bonnes pratiques chirurgicales (asepsie, protocole analgésique pré-post opératoire, surveillance et réveil en enceinte chauffée etc). -Mesure du volume tumoral par échographie sous anesthésie gazeuse. Réalisé une fois avant la greffe puis après rétablissement complet de l’animal suite à la chirurgie (7 à 10 j), à raison de 1-2 mesures échographiques par semaine (8 semaines maximum). La durée d’une mesure est déterminée à environ 30 minutes par souris. -Prélèvement de sang en fin d'étude, sur animal anesthésié et sans réveil consécutif, par ponction à la veine cave ou par ponction cardiaque. -Prélèvement terminal de tumeur : pour tous les animaux en fin d’étude, la tumeur sera prélevée sur les animaux préalablement profondément anesthésiés à l’Isoflurane et euthanasiés par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Tumeur pancréatique limitée à 2000 mm3 ; perte de poids limitée à 20% du poids maximal ; Signes cliniques rares : Abdomen gonflé ou apparition de métastases.

Devenir

Lorsque le volume tumoral est proche de 2000 mm3, ceci constitue un point limite et l’animal concerné est alors euthanasié. A la fin de chaque étude, tous les animaux sont euthanasiés pour réaliser des prélèvements de sang, de tumeur et/ou d’autres organes. Ces prélèvements seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…).

Remplacement

Ce projet a pour but de mettre au point un modèle de greffe orthotopique de cellules tumorales d’origine pancréatique. L’implantation des cellules dans le pancréas permet ainsi à la tumeur de se développer dans le microenvironnement d’origine d’un cancer du pancréas, permettant ainsi de se placer dans des conditions le plus proche possible de la pathologie humaine. Il est impossible à l’heure actuelle de reconstituer in vitro une tumeur et ses interactions avec le microenvironnement, et donc il n’y a pas de méthodes substitutives.

Réduction

-Un accompagnement par le service biostatistique sera réalisé pour estimer la variabilité de la pousse de la tumeur pour chaque lignée cellulaire étudiée dans le cadre de ce projet. Cette étape permettra d'établir le nombre d'animaux nécessaires par groupe pour les études futures d'efficacité de traitement et de pharmacodynamie. -Lorsque les souris seront euthanasiées, des prélèvements de tumeurs seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…). Cette approche permet donc d’optimiser les études et de réduire le nombre d’animaux en évitant de refaire des études pour obtenir des échantillons

Raffinement

- Les souris sont maintenues en groupes sociaux tout au long de l’étude. L’habitat des souris est enrichi de matériel adapté pour leur permettre d’exprimer leurs instincts naturels comme ronger ou nidifier (tube ou dôme, cocoon, sizzle dry) et de l’aliment est distribué dans la cage pour favoriser le comportement de fouissage. -Les animaux font l’objet d’une observation clinique tout au long de l’étude par les expérimentateurs et par les zootechniciens pour s’assurer de leur rétablissement, de leur bien-être et de l’absence de signe clinique. En cas de signe clinique, les recommandations de la SBEA et les points limites seront appliqués. -La procédure de greffe orthotopique est réalisée selon les bonnes pratiques de chirurgie, avec : odes espaces séparés pour la préparation des animaux et pour la chirurgie oune anesthésie et une analgésie adaptées à la chirurgie oune asepsie maintenue pendant toute la chirurgie -L’analgésie péri-opératoire pourra être adaptée en termes de traitement administré et de durée en fonction des signes de douleurs observés et en concertation avec le vétérinaire. -Le suivi de la croissance tumorale par échographie est une méthode non invasive pour l’animal et sans douleur. Cette mesure est réalisée sous anesthésie gazeuse. Les tumeurs sont mesurées par échographie 1 à 2 fois par semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais aussi pour limiter la souffrance et appliquer les points limites. En cas de volume tumoral s’approchant des 2000 mm3 lors d’une lecture, les souris seront euthanasiées. -Une palpation de l’abdomen est faite 2 à 3 fois par semaine pour suivre la progression de la tumeur. Elle est faite le jour du suivi échographique pour corréler la palpation à la mesure du volume tumoral, puis entre chaque mesure échographique. Cette palpation permet aussi de détecter un gonflement de l’abdomen en cas d’apparition d’ascite.

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans la littérature pour la recherche pré-clinique. De plus, la greffe orthotopique de cellules tumorales dans le pancréas chez la souris est couramment utilisée dans les études précliniques d’oncologie. Ainsi la souris est le modèle de choix. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 7 semaines. Il s’agit de l’âge d’utilisation classique des souris dans les protocoles d’efficacité et de pharmacodynamie en oncologie.

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales humaines sur chaque flanc, des injections et des prélèvements sanguins répétés au niveau du sinus rétro-orbital sous anesthésie, avant une mise à mort pour analyser la tumeur, le sang et la rate. Le porteur indique que les tumeurs peuvent s'ulcérer et fixe ce point comme limite, et utilise des souris immunodéprimées pour qu'elles acceptent les cellules humaines. Le bénéfice attendu se réduit à une "preuve de concept" d'un système de globules blancs modifiés, et il affirme qu'on ne peut s'affranchir du modèle murin.

Objectifs

Les cancers représentent un problème de santé publique majeur causant environ 10 millions de décès par an. Les traitements disponibles présentent de nombreux effets secondaires et nécessitent souvent de multiples interventions, d’où la nécessité de nouvelles alternatives thérapeutiques plus efficaces, plus spécifiques, voir ciblées, et ce, sur le long terme. L'un des principaux problèmes expliquant la progression du cancer est l'incapacité du système immunitaire à éliminer les cellules tumorales, car l’environnement tumorale diminue les fonctions des cellules immunitaires. Récemment, des stratégies d'immunothérapie modulant le système immunitaire du patient pour augmenter son efficacité ont suscitées un fort intérêt. L’objectif du projet est d’améliorer le système immunitaire du patient, en modifiant un sous type de globules blancs, afin qu’il discrimine et détruise spécifiquement les cellules cancéreuses. Une protéine sera ajoutée à la surface des globules blancs pour détecter des marqueurs tumoraux et cette détection conduira à la sécrétion localement des molécules médicaments par le globule blanc modifié. L'objectif de ce système est donc d'apporter une solution thérapeutique durable et spécifique aux cancers en : 1) éliminant les cellules tumorales, 2) favorisant les réponses immunitaires anti-tumorales, et enfin 3) prévenant les rechutes grâce à la persistance des globules blancs modifiés et à leur réactivation en cas de nouvelles poussées de la maladie.

Bénéfices attendus

L’observation d’une diminution de la croissance tumorale dans notre projet, nous permettra d’obtenir une preuve de concept de notre circuit synthétique comme solution thérapeutique durable et spécifique aux cancers.

Procédures

- Greffe sous anesthésie : Injection sous-cutanée de cellules tumorales humaines sur chaque flanc (15 min/animaux). - Co injection de lymphocytes B et T par voie intraveineuse au sinus retro-orbitale sous anesthésie (2 min maximum en prenant en compte l'anesthésie et l'injection, le réveil est quasi immédiat) - Prélèvement sanguin au sinus rétro orbital sous anesthésie locale, toutes les deux semaines en prenant soin d’alterner l’œil prélevé (moins d'1 minute). -Injection IP (moins d'1 minute en prenant en compte la contention et l'injection). Pendant 3 semaines 1 fois par semaine -Prélèvement sanguin au sinus rétro orbital, 1 fois sous anesthésie générale (moins d'1 minute). - Les animaux seront pesés une fois par semaine (environ 1 minute) pendant 30 ou 40 jours en fonction de la procédure. - Les tumeurs seront mesurées au pied à coulisse 2 fois par semaine (environ 2 minutes) pendant 30 ou 40 jours en fonction de la procédure.

Impact sur les animaux

Suite à la greffe de cellules tumorales en sous cutanée, une tumeur va se développer et peut induire des distensions et ulcérations des tissus cutanées. Dans notre cas les durées d’expérimentation ne sont pas suffisamment longues pour permettre l’installation de distension des tissus, le point limite le plus critique est l’apparition d’ulcération des tissus cutanés qui peuvent apparaître chez certains animaux avant la fin de l’expérimentation. Le phénotype des animaux est non dommageable car ils sont élevés dans les conditions appropriées (conditions d’hébergement et d’expériences). Aucune douleur n’est attendue suite aux injections et prélèvements en ip et en iv sous anesthésie gazeuse et locale. De même, la pesée et la mesure des tumeurs ne devraient pas générer de douleur.

Devenir

A l'issue des procédure 1 à 3, les animaux seront mis à mort afin d'évaluer l'efficacité anti tumorale des cellules B modifiées en analysant la croissance tumorale ainsi que l’état d’activation du système immunitaire (cellules, cytokines, anticorps) dans le sang, la rate et la tumeur seront suivies.

Remplacement

Des expériences préliminaires ont été réalisées in vitro. Cependant, on ne peut pas s’affranchir du modèle murin. Après leur injection dans le sang, les cellules B modifiées, migrent efficacement et gagnent les organes périphériques secondaires où s’effectueront les étapes de maturation dépendantes de l’antigène : ganglions lymphatiques, rate... L’architecture et l’interaction avec d’autres composants cellulaires, au niveau du centre germinatif de ces organes, vont permettre leur prolifération et leur différenciation en cellules productrices d’anticorps et en cellules mémoires. C’est alors in vivo que nous pourrons observer d’une part la circulation et l’activation de nos cellules B modifiées et par la suite l’effet anti tumoral de ces cellules.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe a été défini après discussion avec des statisticiens, ainsi que sur la littérature scientifique pour estimer les effets attendus et a été réduit au minimum sans mettre en péril une interprétation statistique des résultats. La greffe des différentes cellules tumorales sur une même souris a permis de réduire de moitié le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. Le nombre d’animaux par groupe (n=8) a été déterminé en prenant en compte le pourcentage de prise de greffe (80%).

Raffinement

Les manipulations des souris NSG immunodéficientes seront effectuées sous un poste de sécurité microbiologique de type II, ce qui leur permettent d’être dans un environnement complétement stérile garantissant ainsi un phénotype non dommageable. Tout au long des expériences, nous veillerons au bien-être des animaux, à réduire au maximum la souffrance et l'angoisse des souris grâce à la mise en place d’une grille de score clinique. Une période d’une semaine d’acclimatation sera mise en place avant le début du protocole et les animaux seront maintenus en groupes sociaux. Si un animal venait à se retrouver seul, une maisonnette en carton sera mise en place dans la cage. La greffe des cellules tumorales ainsi que le suivi de la bioluminescence seront réalisées sous anesthésie isoflurane afin d’éviter toute méthode de contention prolongée. La Co-injection des cellules B reprogrammées et des lymphocytes T CD4+ par voie intraveineuse au sinus retro-orbitale sous anesthésie isoflurane avec au préalable une anesthésie locale. Les prélèvements sanguins au sinus rétro orbital seront effectués sous anesthésie locale. Un prélèvement de sang total sera réalisé à la fin de l’expérimentation, sous anesthésie profonde au sinus retro-orbital ou intra cardiaque.

Choix des espèces

La souris NSG (NOD SCID-/- gammaC-/-) (absence de lymphocytes B, T et NK) a été choisie pour son immunodéficience sévère permettant la xénogreffe de cellules humaines. D’après notre expérience les souris NSG âgées d’environ 6 semaines permettent une meilleure prise de greffe.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont la moitié vigiles au moment de la mise à mort, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris transgéniques modèles de la maladie d'Alzheimer, elles subissent une chirurgie pour implanter une pompe délivrant le traitement, des tests comportementaux, puis sont tuées pour analyser le cerveau. Les souris perdant plus de 15 % de leur poids ou montrant prostration ou agressivité sont mises à mort. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de modèles alternatifs validés" et que l'euthanasie est "incontournable".

Objectifs

La maladie d’Alzheimer sous sa forme sporadique est le résultat d’interactions fortes entre des facteurs génétiques et environnementaux. La cause primaire et les mécanismes sous-jacents restent à ce jour inconnus, mais un lien important semble exister entre la maladie d'Alzheimer et le stress. Cependant, le rôle du stress dans cette maladie est très mal connu. Il nous a donc semblé important de caractériser de façon précise l’implication des hormones du stress (les glucocorticoïdes) dans la maladie d'Alzheimer et d’évaluer le potentiel thérapeutique des glucocorticoïdes, grâce à l’utilisation de nouveaux modulateurs sélectifs de leurs récepteurs (sGRm), dans un modèle préclinique de la maladie d’Alzheimer, la souris transgénique J20. Ce projet comprend 2 objectifs principaux: Déterminer l’impact d’un traitement chronique (4 semaines) avec un modulateur sélectif des récepteurs aux glucocorticoïdes sur l’évolution de la pathologie Alzheimer chez des souris J20 ; et d’évaluer l'efficacité de ce traitement chronique à long terme.

Bénéfices attendus

La maladie d’Alzheimer est le résultat d’interactions fortes entre des facteurs génétiques et environnementaux. La cause primaire et les mécanismes sous-jacents au développement de la maladie d'Alzheimer restent à ce jour inconnus, mais un lien important semble exister entre la maladie d'Alzheimer et l’hypersécrétion précoce des hormones du stress ou glucocorticoïdes. Cependant, le rôle de ces hormones, ainsi que leur potentiel thérapeutique dans la maladie d'Alzheimer reste très méconnu. L’objectif de cette étude sera donc d’évaluer le potentiel thérapeutique d’une nouvelle famille de molécules très sélectives modulant l’activité des récepteurs aux glucocorticoïdes. Si l’efficacité de ces modulateurs sélectifs est démontrée, une étude clinique chez des patients atteints de la maladie d'Alzheimer pourra être envisagée très rapidement, dans la mesure où les tests de toxicité chez l’homme ont été validés sur cette famille de composés et que l’une de ces molécules est déjà en clinique (Phase II) dans le cadre d’une autre pathologie associée aux stress.

Procédures

L’ensemble des animaux (160 animaux) seront soumis à une procédure chirurgicale pour la mise en place de la pompe osmotique (durée 5 minutes sous anesthésie gazeuse), à des tests comportementaux et enfin seront mis à mort pour l’analyse des tissus cérébraux. Mise à mort sur animaux anesthésiés (80 animaux) ou vigiles (80 animaux). Les animaux seront suivis entre 4 (80 animaux) et 8 semaines (80 animaux).

Impact sur les animaux

L’incision nécessaire à l’introduction de la pompe osmotique délivrant le traitement peut entrainer un inconfort temporaire (dans les 24h suivant la chirurgie), et induire un grattage plus important au niveau de la cicatrice. Afin d'éviter au maximum cet effet lié à la cicatrisation, l’incision est réalisée au niveau de la nuque de l’animal, une zone moins accessible au grattage.

Devenir

Dans la mesure où il sera nécessaire d’étudier l’impact des différents traitements sur le cerveau, l’euthanasie des souris est incontournable.

Remplacement

De manière très générale, il est aujourd’hui très difficile en neurosciences d’étudier le fonctionnement du cerveaux sur des modèles simplifiés et donc de remplacer l’étude sur l’animal dans sa globalité. En effet, il n'existe pas de modèles alternatifs validés pour étudier la neurodégénérescence et le déclin cognitif dans la maladie d’Alzheimer.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé pour ne pas compromettre les objectifs du projet. Le nombre d'animaux est basé sur une connaissance approfondie des modèles et de l'expérience acquise par notre équipe. Le nombre d'animaux a été déterminé par un logiciel de statistique.

Raffinement

Afin de minimiser les effets du stress, mais également de contrôler l’état général des animaux, l’animalier, et/ou l’expérimentateur, manipuleront quotidiennement les animaux et observeront le comportement général de l’animal, ainsi que leur apparence. Toute observation anormale (comportement, poids, pelage, plaie,…) sera transmise à l’expérimentateur afin d’être traitée dans les plus brefs délais et sera noté dans un tableau de suivi expérimental. Un animal sera euthanasié s’il présente, une perte de poids > 15%, une attitude inhabituelle traduisant un mal être (prostration, agressivité...), ou l’apparition de toute altération de l’état général (altération du pelage, tumeur, excroissance, prolapsus…).

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix au niveau international pour l’étude de la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer. Ces études chez l’animal vigile sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements potentiels. De plus, l'utilisation d'animaux transgéniques (modèle de la maladie d’Alzheimer) justifie également le choix de cette espèce. Nous allons réaliser le traitement chronique sur le modèle souris Alzheimer entre 6 et 9 mois. C’est-à-dire à un âge où ces souris présentent des déficits comportementaux, et une augmentation des différents marqueurs biochimiques associés à la physiopathologie Alzheimer, mais aussi une hyperactivité de l’axe du stress (augmentation des taux sanguins en glucocorticoïdes).