Recherche appliquée

230 furets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une instillation nasale de variants du SARS-CoV-2 sous anesthésie, puis des lavages nasaux quotidiens et des prises de sang, pour comparer gravité, réplication et transmission entre furets naïfs, vaccinés ou convalescents. Le porteur décrit une infection peu symptomatique, avec au plus une toux faible et une apathie transitoire, et garde certains animaux jusqu'à quatre mois comme convalescents avant de les tuer. Il affirme que l'excrétion virale et la transmission entre individus ne peuvent être reproduites in vitro.

Objectifs

La gestion de l'épidémie de COVID19 est compliquée par l'émergence régulière de nouveaux variants de SARS-CoV-2 dont les mutations génétiques influencent la capacité du virus à se transmettre entre individus infectés, la gravité de l’infection et l’efficacité protectrice issue d’une vaccination ou d’une infection préalable. Le présent projet a pour objectif d’évaluer ces caractéristiques pour 5 variants en faisant appel à des études in-vitro et in-vivo. Pour les études in-vivo, le furet est un bon modèle de l’infection humaine de l’appareil respiratoire supérieur. Ce projet vise donc à évaluer pour chaque variant testé 1/ la gravité de l’infection 2/ sa vitesse de réplication chez le furet 3/ sa transmission entre furets. Pour chaque variant testé, cette évaluation se fait par comparaison avec un variant pour lequel la gravité de l’infection, la vitesse de réplication et la transmissibilité sont connues. L’autre partie du projet vise pour chaque nouveau variant à mesurer l’efficacité vaccinale ou la protection conférée par une infection préalable à SARS-CoV2. Les mêmes caractéristiques de gravité de l’infection, de vitesse de réplication et de transmissibilité seront ainsi évaluées chez des furets vaccinés ou convalescents d’une infection préalable. Les furets seront gardés en groupes sociaux de trois animaux à six animaux dans des cages de dimensions répondant à celles requises par la réglementation. Un enrichissement composé de tunnels, de coins de repos, d’espaces de jeux et d’exploration sera assuré. Tous les prélèvements seront effectués sous anesthésie générale. Le suivi des animaux sera réalisé quotidiennement, puis deux fois par jours dès apparition des symptômes. Le nombre d’animaux utilisé par variant est de 46 furets pour obtenir les données requises pour caractériser un nouveau variant, pour évaluer la protection vaccinale et la protection conférée par une infection préalable. Le projet est prévu pour l’étude de l’émergence de 5 nouveaux variants.

Bénéfices attendus

La caractérisation des nouveaux variants d’intérêt, l’évaluation de la protection vaccinale et la protection conférée par une infection préalable est une aide aux pouvoirs publiques dans l’anticipation et la gestion des nouveaux variants.

Procédures

Les inoculations expérimentales seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse pour un furet par lot (virus instillé dans les narines). Des lavages nasaux seront réalisés quotidiennement sous anesthésie générale gazeuse (500µl d’une solution saline instillés à l'entrée de chaque narine, le liquide de lavage étant recueilli sous l'animal par gravité) (1minute). Des prises de sang seront réalisées à J4 et J8 sous anesthésie générale gazeuse dans la veine cave antérieure (3minutes).

Impact sur les animaux

L’infection à SARS-CoV-2 chez les furets est peu symptomatique: pas ou peu de perte de poids, peu d'hyperthermie. Une faible toux a été remarquée chez certains animaux et une apathie transitoire vers le 7ème- 8ème jour d’infection avec le variant alpha. L’inflammation locale des voie aériennes supérieures reste modeste et courte. L'inoculation virale intranasale et les lavages nasaux sont peu invasifs. Les furets étant des animaux sociaux, ils seront hébergés par groupes d’au moins 3 animaux avec des contacts permanents 6 heures après l’inoculation expérimentale des donneurs.

Devenir

Certains animaux issus de la procédure 1 seront gardés en vie jusqu'à 4 mois maximum après la fin de la procédure en tant que convalescents immunisés pour la procédure 2. Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure 2.

Remplacement

Les objectifs de ce projet requièrent une excrétion physiologique virale, de la transmission inter individus par la pénétration du virus dans des tissus des volutes nasales et le développement de réponses immunitaires locales et périphériques qu'il n'est pas possible de reproduire in-vitro. Le modèle animal reste donc nécessaire pour étudier la capacité réplicative de variants et son impact après infection chez des animaux immunisés ou non.

Réduction

Les nombres de furets par lot sont réduits. Certains lots pourront être supprimés. Ainsi, pour la procédure 1, les 2 lots utilisés pour le variant de référence pourront être supprimés s’il est conservé pour plusieurs variants à tester. Les lots sacrifiés à J8 des procédures 2 et 3 pourront s’avérer inutiles s’il est démontré par les résultats des essais préliminaires que la meilleure date pour avoir un maximum de titre viral est J4 (voir procédures 2 et 3). Aucune approche statistique n'a été réalisée, car les comparaisons entre variant seront qualitatives ou semi-quantitative.

Raffinement

Les furets sont anesthésiés pour tout prélèvement (prise de sang, lavage nasal) et pour les inoculations. Les furets seront gardés en groupes sociaux de trois à six animaux dans des cages de dimensions répondant à celles requises par la réglementation. Un enrichissement composé de tunnels, de coins de repos, d’espaces de jeux et d’exploration sera assuré. Tous les prélèvements seront effectués sous anesthésie générale. Le suivi des animaux sera réalisé quotidiennement, puis deux fois par jours dès apparition des symptômes.

Choix des espèces

Les furets constituent un modèle expérimental reproduisant la pathogénicité généralement peu marquée et courte de l’appareil respiratoire supérieur, ce qui est aussi observé lors de COVID-19. Les animaux auront plus de 18 semaines, car il est nécessaire que les animaux aient un système immunitaire mature afin que le modèle animal soit le plus proche possible de l’infection adulte humaine.

105 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie cérébrale sous anesthésie pour injecter un virus et implanter une fibre optique, puis un test de reconnaissance d'objet avec enregistrement de l'activité neuronale, avant une perfusion intracardiaque terminale. Le porteur décrit des souris invalidées pour un gène lié à l'autisme et à la déficience intellectuelle, et indique que la chirurgie peut causer œdème et douleur post-opératoire. Il affirme que ces procédures sont "essentielles" et qu'aucun modèle informatique des comportements complexes n'existe encore.

Objectifs

Le but de notre projet est d'étudier la contribution d'un gène muté dans le trouble du spectre autistique. Nous explorerons son rôle dans l'apprentissage et la mémoire. Nous analyserons l'activité des circuits neuronaux du cortex préfrontal par photométrie par fibre lors d'un test de reconnaissance d'objet chez des souris invalidées pour le gène d'intérêt comparées aux souris sauvages. Nous étudierons l'activité de différentes sous-populations neuronales impliquées dans la neurotransmission excitatrice et inhibitrice.

Bénéfices attendus

Ces expériences devraient permettre de déterminer le rôle du gène d'intérêt dans l'activité des circuits corticaux préfrontaux lors de la mémoire de reconnaissance, contribuant ainsi à mieux comprendre son implication dans l'autisme et la déficience intellectuelle. L'étude dans des modèles murins des conséquences neurobiologiques de l'absence des gènes mutés dans l'autisme et autres troubles neurodéveloppementaux est une étape clé dans la compréhension des mécanismes impliqués dans la pathogénèse de ces maladies, afin de permettre à terme de développer des approches thérapeutiques adaptés.

Procédures

Une procédure chirurgicale est effectuée sous anesthésie générale pour injecter dans le cerveau un virus exprimant un marqueur calcique fluorescent et implanter la fibre optique pour la photométrie par fibre. La durée de la chirurgie est de 30-40 min. Aucun phénotype dommageable n’est prévu suite à la procédure. Après une période de récupération de 3 semaines, les souris sont habituées pendant 3 jours (10 min, 2 fois par jour) à un champ ouvert où sera effectué le test de reconnaissance d'objet. Le jour du test, l'activité neuronale est enregistrée par photométrie par fibre pendant 15-20 min en état basal, puis pendant 10 min lorsque l'animal explore 2 objets identiques. L'animal est ensuite replacé dans sa cage et au but de 10 min, il est réintroduit dans le champ et l'activité neuronale est enregistrée pendant 10 min lorsqu'il explore un objet familier et un objet nouveau. Au total, la procédure dure 45-50 min. Après 2 jours de repos, les souris sont enregistrées à nouveau lors d'un deuxième test de reconnaissance d'objet (45-50 min). A la fin des expériences, les animaux subiront une perfusion intracardiaque avec un agent fixateur pendant 3 min, sous anesthésie profonde, afin de prélever le cerveau pour des analyses histologiques. Au total, la procédure de perfusion dure 10-15 min.

Impact sur les animaux

La chirurgie pour injecter le virus dans le cerveau et implanter la fibre optique peut causer un œdème localisé associé à une douleur post-opératoire passagère. Il existe un risque faible d'infection suite à la chirurgie et l'implantation de la fibre optique. La manipulation par l'expérimentateur et l'exposition à un environnement nouveau lors du test comportemental peuvent engendrer un léger stress chez les souris. Les souris mâles logées dans la même cage peuvent parfois se battre et être blessées.

Devenir

Tous les animaux injectés avec le virus et utilisés dans les expériences de photométrie par fibre (n=105) seront perfusés avec un agent fixateur à la fin des expériences, afin de prélever le cerveau pour des analyses histologiques.

Remplacement

Nos travaux nécessitent l’utilisation de rongeurs puisque nous étudions des mécanismes pathologiques complexes associés à l’autisme et la déficience intellectuelle tels que des déficits cognitifs et l'activité des circuits neuronaux intacts. Les procédures d’expérimentation animale décrites ici sont donc essentielles pour mieux comprendre les conséquences de l'inactivation du gène d'intérêt dans le cerveau. La nature expérimentale de notre recherche nécessite l’utilisation de modèles animaux plutôt que des sujets humains. De plus, il n’existe pas encore de modèle computationnel des comportements complexes animaux.

Réduction

Nous utiliserons au maximum 105 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux au strict nécessaire afin d’obtenir des résultats robustes statistiquement dans ce type d'expériences. Pour cela, le nombre d’animaux doit se situer entre 12-15 par condition étudiée. En effet, la variabilité interindividuelle élevée observée lors des tests comportementaux, y compris le test de reconnaissance d'objet, nécessite de groupes de taille relativement élevée. La taille des groupes est déterminée sur la base de la littérature scientifique et notre propre expérience dans ce type d'analyses. Les données seront analysées à l'aide de tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Dans le cadre du raffinement de l’expérimentation animale, les protocoles utilisés ont été optimisés pour exposer les animaux au minimum de douleur possible. L’injection stéréotaxique de virus et la pose de fibres optiques sont réalisées sous anesthésie totale et locale pendant la chirurgie et un analgésique est administré en péri-opératoire. Les animaux sont observés quotidiennement par une personne compétente. Toute souris qui montre des signes de mauvaise santé engendrant une souffrance selon des points limites préétablis, est exclue du protocole et euthanasiée. Les souris sont hébergées à raison de 4 animaux par cage dans une animalerie de stabulation (température 19–21°C, cycle jour–nuit 12h–12h), avec accès libre à l’eau et aux croquettes. La stratégie d’enrichissement consiste à ajouter un nid des lanières de papier Kraft. La litière est changée tous les 7 jours pour éviter le stress. Une semaine avant le test de reconnaissance d'objet, les souris sont manipulés quotidiennement par l'expérimentateur pendant 5 min afin de les habituer et réduire le stress. De plus, les souris sont exposées au champ ouvert plusieurs fois avant le test de reconnaissance d'objet, d'abord en groupe et ensuite individuellement, afin de réduire le stress engendré par l'environnement nouveau. 48 h de repos sont réservées entre les procédures comportementales.

Choix des espèces

Le système nerveux de la souris présente des analogies avec celui de l’être humain. De plus, ce rongeur constitue un modèle de choix bien caractérisé pour les études neurobiologiques et comportementales en rapport avec l'autisme et autres troubles neurodéveloppementaux. Enfin, on a accès à des souris transgéniques afin d’étudier le rôle des gènes d’intérêt, ce qui permet d’aborder leur fonction dans le cerveau de manière intégrée, dans l’organisme vivant. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (2-6 mois). L'autisme étant un trouble qui persiste toute la vie, nous avons choisi d'étudier les conséquences de la perte du gène chez l'adulte, une fois que l'ensemble du système nerveux est développé.

96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées pendant 115 jours au dioxyde de titane, additif alimentaire E171, avec gavages et prélèvements de fèces réguliers, pour évaluer ses effets sur l'intestin et le métabolisme. Le porteur affirme attendre un léger surpoids, une perméabilité et une inflammation intestinales, et présente le recours à l'animal comme "difficilement remplaçable" pour reproduire les échanges entre organes sur une longue durée. Il indique que les résultats doivent aider industriels et autorités à décider du maintien de l'autorisation du E171.

Objectifs

Les particules minérales manufacturées sont abondantes dans les produits de la vie quotidienne (cosmétiques, textiles, matériaux de construction), dont l’alimentation. Parmi ces particules, le dioxyde de titane (TiO2) est un additif alimentaire utilisé comme colorant/opacifiant et agent de brillance dans les confiseries, les aliments transformés, les sauces et le glaçage. En Europe, l'utilisation du TiO2 alimentaire (référencé E171) est autorisée sans établissement d'une dose journalière acceptable. L'autorité européenne de sécurité sanitaire des aliments (EFSA) a estimé les niveaux d'exposition journalière au E171 entre 0,9 et 10,4 mg/kg de poids corporel (p.c)/jour chez l’enfant et entre 0,3 et 6,8 mg/kg p.c/j chez l’adulte. Face à ces niveaux élevés de consommation, les conséquences pour l’homme d'une exposition chronique aux particules de TiO2 soulèvent des questions de santé publique. Les craintes vis-à-vis de cet additif composée de particules micro- et nanométriques reposent sur des effets génotoxiques, de stress oxydant et inflammatoires des nanoparticules de TiO2 observés sur cellules intestinales. Cependant, la toxicité orale du TiO2 est encore peu étudiée et les autorités sanitaires ont conclu à la nécessité de tests pour évaluer les risques pour la santé des additifs alimentaires contenant des nanoparticules, particulièrement avec le E171. Dans les pays occidentaux, l'augmentation de la prévalence de l'obésité associée à des désordres métaboliques suggère des facteurs de risque liés au mode de vie. Parmi ces facteurs, l'ingestion chronique de particules inorganiques a été proposée. Le but de ce projet est d'étudier le lien entre l'exposition orale chronique au E171 et l'apparition et/ou l'aggravation de désordres métaboliques et intestinaux.

Bénéfices attendus

Outre l'apport de données inédites sur les effets d'une ingestion de TiO2 alimentaire sur le développement de désordres intestinaux et métaboliques, ce projet aidera les parties prenantes et les industriels dans leur décision de maintenir ou non l'autorisation et l'utilisation du E171 dans les aliments. Ce projet pourrait également permettre d'établir un lien potentiel entre facteurs environnementaux (ici ingestion d'additif alimentaire) et augmentation exponentielle dans les pays occidentaux de désordres métaboliques. En conclusion, ce projet fournira des données précieuses pour l'évaluation des risques chez l'Homme d'une exposition au TiO2 alimentaire.

Procédures

Les animaux seront soumis à un gavage avec du Dextran-FITC à J94 pour évaluer la perméabilité intestinale et à un gavage avec du glucose à J108 pour réaliser le test de tolérance au glucose. Des prélèvements de fèces seront réalisés tout au long de l'expérimentation (1 fois toutes les deux semaines).

Impact sur les animaux

Il est attendu que les animaux exposés au E171 développent un léger surpoids accompagné d'une perméabilité inestinale, d'une inflammation intestinale a bas bruit ainsi que d'une intolérance au glucose. Toutefois ces désordres intestinaux et métaboliques devraient être d'une intensité inférieure a celle observé lors d'un traitement des animaux avec un régime riche en graisse. Nos données préliminaires n'indiquent aucune altération de comportement et de prise alimentaire chez les animaux exposés au E171 incorporé aux croquettes à la dose testé dans cette étude.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de réasliser différents prélèvements de tissus sur l'animal en fin d'expérience.

Remplacement

Le projet étudie les effets du E171 (nanomatérieux alimentaires) après une période d'exposition chronique de 115 jours. De plus, l'étude portera sur les impacts sur l'axe microbiote-intestin-foie. Aucun modèle alternatif ne permet de recréer tous les dialogues inter-organes sur une période aussi longue. Le recours à l'animal est donc nécessaire et difficilement remplaçable par des modèles in vitro ou ex-vivo.

Réduction

Les régulations attendues, principalement concernant les tests de tolérance au glucose peuvent être assez fines. Ainsi, chaque groupe expérimental sera donc constitué de 12 souris pour que les résultats soient statistiquement exploitable, après analyse avec des tests statistiques adaptés. De plus, les procédures de notre projet seront réalisées 2 fois pour pouvoir générer suffisamment d'échantillons pour nos différents end points.

Raffinement

Pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l'angoisse infligées aux animaux, la coupure effectuée au niveau des queues de souris nécessaire pour la mesure de perméabilité intestinale et le test de tolérance au glucose seront réalisé sous analgésie locale. De plus, de l'enrichissement sera disposé dans les cages, sous la forme d'une maisonnette et de dispositif de nidification. Le bien-être des animaux sera assuré par une observation quotidienne et également par un suivi de poids et prise alimentaire hebdomadaire.

Choix des espèces

La souris est un modèle reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier le microbiote et l’intestin. Les souris utilisées seront âgées de 5 semaines afin de faire des observations sur des souris adultes et matures.

30 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales humaines puis des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant quatre semaines, pour tester des inhibiteurs d'EZH2 contre le carcinome à cellules de Merkel. Le porteur indique qu'aucune analgésie ne sera administrée afin de ne pas interférer avec les traitements, et qu'une perte de poids, une tumeur de plus d'un centimètre cube ou une ulcération déclenchent la mise à mort par élongation cervicale. Il affirme que le recours au modèle murin est "obligatoire" pour développer ces tumeurs.

Objectifs

Le carcinome a cellules de Merkel (CCM) est un cancer cutané rare et agressif survenant principalement chez le sujet âge de plus de 65 ans et le patient immunodéprimé (hémopathies, greffe d’organe, infection par le VIH). Son incidence, estimée à 1/100 000 par an, est en constante augmentation. La survie a 5 ans est estimée à 40%. Dans 80% des cas, le génome du Polyomavirus à cellules de Merkel (MCPyV) est intégré dans celui des cellules tumorales induisant alors l’expression de deux oncoprotéines virales (antigène grand T ; LT et antigène petit t ; st). Dans ce contexte, une étude récente menée au sein du laboratoire a permis de mettre en évidence l’induction de l’expression d’EZH2 (Enhancer of zest homolog 2), une histone méthyltransférase, par les oncoprotéines virales. Cette enzyme est impliquée dans l’agressivité et la prolifération tumorale d’autres cancers. De plus, une forte expression d’EZH2 a pu être confirmée au sein d’une cohorte de 96 patients présentant un CCM avec un niveau d’expression plus important dans les tumeurs MCPyV positives. L’effet des inhibiteurs d’EZH2 à déjà été démontré sur d’autre tumeurs solides. Dans ce contexte la cytotoxicité de deux de ces drogues a pu être démontrée au sein de notre laboratoire, in vitro sur des lignées cellulaires humaines de CCM. L’objectif de cette étude est d’évaluer in vivo, l'effet inhibiteur sur la croissance tumorale du GSK343 et du DZNeP dans un modèle murin de xénogreffe, maîtrisé dans le laboratoire, utilisant la lignée WaGa.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de valider dans un modèle pré-clinique l'utilisation d'inhibiteur d'EZH2 dans l'indication du carcinome à cellules de Merkel. Ces molécules pourraient potentiellement être utilisées chez l'Homme en complément de l'immunothérapie ciblant PDL1.

Procédures

Les souris recevront par voie sous-cutanée des cellules WaGa afin d'établir le modèle tumoral. Suite à leur inclusion, elles recevront quotidiennement par voie intrapéritonéale les deux molécules évaluées ou le véhicule pendant 4 semaines.

Impact sur les animaux

Chez l’Homme, le carcinome à cellules de Merkel est décrit comme non douloureux, néanmoins, toute dégradation de l’état de santé des animaux limites (aspect « piqué » du pelage, perte de poids de 20% et prostration des animaux, volume tumorale supérieur à 1cm3 ou apparition d’ulcération), conduira à leur mise à mort par élongation cervicale.

Devenir

L'évaluation de la masse finale des tumeurs impose la mise à mort de l'ensemble des souris.

Remplacement

Afin d’étudier l’impact du traitement sur la croissance tumorale, le test sur modèle murin est obligatoire

Réduction

Une seule dose de chaque traitement sera testée sur la base des résultats de cytotoxicité in vitro préalablement obtenus au laboratoire ainsi que des données de la littérature réduisant ainsi le nombre de souris utilisées. De plus, un test de Wilcoxon a permis de déterminer le nombre d'animaux nécéssaires.

Raffinement

Les souris seront hébergées avec un enrichissement social (5 souris de même sexe / cage) dans des cages enrichies avec des maisonnettes en plexiglas et du papier absorbant. Du fait du statut immunodéficient des souris, l’ensemble du matériel d’enrichissement, ainsi que l’aliment et l’eau de boisson seront stérilisés. Après les injections intra-péritonéales, les souris recevront sous forme de récompense des friandises (cacahuètes en coque, catalogue PLEXX). Aucun traitement d'analgésique ne sera administré afin d'éviter toute interférence avec les traitements testés.

Choix des espèces

Le seul modèle disponible de CCM étant des lignées humaines, l’utilisation d’un modèle murin immunodéficient est obligatoire afin de permettre le développement de tumeurs chez la souris. Les NOD/SCID sont un modèle de référence pour les xénogreffes de cellules humaines . 7 semaines incluant la semaine d’acclimatation d'une semaine. Stade physiologique : croissance

300 souris vont être utilisées, tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intraveineuses déclenchant une colite chronique puis des injections de traitement, la maladie pouvant provoquer douleurs abdominales, isolement et perte de poids. Le porteur indique qu'un score clinique atteignant 8 sur deux jours consécutifs déclenche l'euthanasie, et que des souris sont tuées à différents temps pour analyser la réponse immunitaire. Il affirme qu'aucune méthode ne remplace un système immunitaire complet, ce qui rend selon lui l'animal "indispensable".

Objectifs

De nombreux mécanismes sont impliqués dans l’arrêt du processus inflammatoire engendré par le système immunitaire lors de la reconnaissance d’antigènes qu’ils soient étrangers (pathogènes extérieurs) ou propres à l’organisme (le soi). Les cellules myéloïdes qui sont une population du système immunitaire jouent un rôle très important dans ces mécanismes. Elles permettent pour certaines d’éteindre ce processus inflammatoire en phagocytant les cellules effectrices devenues alors inutiles sans créer d’inflammation elles-mêmes. Lors d’une inflammation chronique, il y a un déséquilibre entre l’activité des cellules effectrices et l’élimination de ces cellules par les cellules myéloïdes. Nous souhaitons examiner le potentiel de molécules sous la forme d’anticorps monoclonaux anti-protéine A ou anti-protéine B ciblant spécifiquement ces cellules myéloïdes à inhiber la réponse inflammatoire, qui diminuent notamment la sécrétion d’IL-12 et augmente la sécrétion d’IL-10 par les macrophages in vitro, et ce dans plusieurs maladies inflammatoires qui ne mettent pas en jeu les mêmes cellules effectrices.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre dévaluer le potentiel thérapeutique d'une toute nouvelle molécule ciblant un processus immunitaire découvert récemment. Il sera comparé à des traitements standards dans le but d'évaluer le bénéfice d'une telle stratégie et de bien caractériser les mécanismes mis en jeu dans les phénomènes biologiques liés à l'activité de la molécule.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections intraveineuses (pour induire la pathologie) dans tous les cas, à des injections intrapéritonéales pour les traitements. Il y aura éventuellement des prélèvements sanguins sur animaux anesthésiés. La durée de l'acte en tant que tel ne durera pas plus de 5min et s'étalera sur 3 semaines comme indiqué dans le schéma protocolaire.

Impact sur les animaux

La colite chronique entraîne parfois des douleurs abdominales et un isolement des animaux concernés ainsi qu'une perte de poids. Un score clinique + un score pathologique lié à la colite seront réalisés pour maîtriser au mieux ces paramètres.

Devenir

Les animaux recevant des injections intrapéritonéales ou intraveineuses seront alors remis dans leur cage. A l'issu de certains axes, les animaux seront euthanasiés poru évaluer biologiquement la réponse immunitaire.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode ne peut remplacer un système immunitaire complet et donc rend indispensable l’utilisation d’animaux. Des études préliminaires sur des cellules ex vivo ont permis d’identifier une activité biologique du médicament et donc ont orienté les paramètres à évaluer lors de l’étude in vivo de la molécule.

Réduction

L’ensemble des animaux prévus ne sera pas utilisé selon les résultats observés sur un traitement curatif ou prophylactique. Seulement dans le cas de l’observation d’un effet, nous réaliserons ensuite des études pour déterminer les mécanismes mis en œuvre, notamment en euthanasiant des souris avant d’atteindre le point limite à différents temps après l’initiation de la pathologie. Enoutre, dans le but d'utiliser un nombre d'animaux cohérent avec une pertinence statistique, nous avons défini le nombre d'animaux par groupe de 10 animaux pour l’ensemble des groupes ainsi que l’ensemble des axes, ce qui permet d'interpréter de manière objective les résultats tout en utilisant un nombre réduit d'animaux.

Raffinement

Nous chercherons à obtenir dans un premier temps des différences significatives et reproductibles sur l’inflammation observée entre les groupes de souris. La douleur sera dans la mesure du possible évitée en euthanasiant les animaux si leur score clinique global atteint 8 sur deux jours consécutifs tel que décrit dans le tableau de score clinique général ou par injection d’analgésique dans le cas de morsure par exemple. Seulement dans le cas de l’observation d’un effet, nous réaliserons ensuite des études pour déterminer les mécanismes mis en œuvre, notamment en euthanasiant des souris avant d’atteindre le point limite à différents temps après l’initiation de la pathologie.

Choix des espèces

Nous travaillerons avec la souris qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. Il s’agit en effet d’un modèle animal pour lequel de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Les modèles d’inflammation dans ces souris autorisent une relevance pathologique satisfaisante en comparaison avec la réalité clinique. Adulte-8-10 semaines, car l’inflammation générée par le transfert de cellules pathogéniques est le plus homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse inflammatoire.

360 truites arc-en-ciel vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 48 tuées à l'issue et 312 remises dans un circuit d'élevage. Chaque femelle reçoit une marque électronique dans le muscle dorsal et subit jusqu'à six prélèvements de sang sur dix mois, pour définir le ratio en acides gras de l'alimentation des reproductrices. Le porteur présente l'objectif comme la mise au point d'aliments aquacoles durables sans farine ni huile de poisson, à visée agronomique et commerciale. Il affirme que l'étude portant sur la reproduction ne peut être menée ni sur lignée cellulaire ni par modélisation.

Objectifs

Le développement durable de l’aquaculture en France, mais aussi dans le monde, pourrait rapidement être remis en question par la disponibilité de plus en plus limitée de la farine et de l'huile de poisson qui sont les ingrédients traditionnels des aliments pour poissons. Les résultats de la recherche dans le domaine de la nutrition des poissons ont permis de fortement diminuer la part de farine et d’huile de poissons dans les aliments aquacoles au profit d’ingrédients végétaux aujourd’hui majoritaires dans les régimes de toutes les espèces aquacoles. Toutefois, des taux de substitution très élevés restent critiques et ont des effets délétères sur la croissance, la robustesse et les performances de reproduction des poissons. L’une des causes repose sur la forte diminution des aliments en acides gras polyinsaturés habituellement apportés par la farine et l’huile de poissons. Il faut donc poursuivre l’effort d’optimisation des apports alimentaires et de l’utilisation des nutriments pour la croissance et la reproduction des poissons pour le développement durable de l’aquaculture. Dans ce contexte, il est nécessaire de déterminer les ratios optimums en acides gras polyinsaturés dans l’aliment et optimiser des formulations alimentaires pour accroitre la robustesse des génitrices ainsi que la qualité des œufs et des descendants. L’objectif est de créer des aliments plus performants et adaptés aux différents stades physiologiques de la truite reproductrice en restant dans une optique d’aquaculture durable.

Bénéfices attendus

Cette expérimentation permettra de définir le ratio optimal en acide gras essentiel dans l’aliment à destination des reproductrices de truite arc en ciel pour accroitre leur robustesse, leurs performances de reproduction et la qualité de leurs œufs. Elle permettra d’établir le lien entre la physiologie de la nutrition (stockage, mobilisation et transfert des acides gras, la physiologie de la reproduction (évolution des hormones de reproduction) ainsi que des paramètres liés à la santé de l’animal (eicosanoides) au cours du cycle de vitellogénèse. Cette expérimentation servira de base pour la définition de formules alimentaires durables (sans huile et farine de poisson) adaptées le plus possibles aux besoins nutritionnels des génitrices de truite.

Procédures

Chaque procédure sera réalisée sous anesthésie (MS222). Un pit tag, pour permettre l'indentification individuelle des femelles de truite, sera injecté en début d'expérimentation dans le muscle supérieur dorsal. Des prélèvements de sang seront réalisés une fois tous les 2 mois (6 prélèvements maximum par individu) sur une durée d'expérimentation de 10 mois. La quantité de sang prélevée sera de 2ml sur des femelles adultes d'environ 1kg.

Impact sur les animaux

L'élevage ne créera aucune nuisance ou effet indésirable sur les animaux car c'est un protocole classique d'élevage avec des aliments qui répondent aux besoins nutritionnels des poissons. Les prises de sang seront réalisées une fois tous les 2 mois sur les animaux. L'injection du pit tag et les prélèvements de sang (2ml) seront réalisés sur des poissons de grandes tailles (environ 1kg) préalablement anesthésiés (MS222). Le pit Tag une fois injectée créera une petite blessure au niveau de la piqure, le poissons devraient cicatriser et récupérer en quelques jours (le taux d'infection avec ce type de procédure reste très faible). La prise de sang ne posera aucun effet indésirable car les vaisseaux sanguins de la truite sont d'accès facile et leur volume sanguin important. La fréquence de prélèvement (une fois tous les 2 mois) ne créera pas non plus d'effets indésirables car la capacité de l'organisme à remplacer le volume sanguin prélevé ne sera pas impactée. Au moment de la ponte, 6 poissons par traitement (total = 48 poissons) seront euthanasiés et des prélèvements de tissus seront réalisés en vue d’analyses biologiques.

Devenir

48 poissons seront euthanasiés en fin d'expérimentation pour permettre les prélèvements de tissus en vue d'analyses biologiques. Les 312 poissons non mis à mort repartiront dans un circuit classique d'élevage.

Remplacement

L'étude porte sur l'impact d'une stratégie alimentaire sur la reproduction des animaux, elle ne peut donc pas être appréhendée sur lignée cellulaire ou par modélisation.

Réduction

Nous avons prévu une densité optimale d’animaux par bassin permettant d’éviter les comportements agressifs qui peuvent survenir avec un petit groupe de poissons (relation dominant/dominé). Ainsi pour une espèce comme la truite, il est nécessaire d’avoir une densité minimale d’élevage pour optimiser le bien-être de l’animal et limiter les comportements agressifs. La densité d'élevage utilisée au cours de cette expérimentation correspond à celle préconisée en aquaculture biologique. Nous avons choisi de baser nos analyses biologiques sur du sang pour réduire le nombre de poissons euthanasiés pour des prélèvements biologiques. De plus, nous identifions les femelles par des pit tags pour avoir comme unité statitique un animal et non un bassin, ce qui nécessiterait beaucoup plus d 'animaux mis en élevage. Ceci nous permet ainsi de fortement réduire le nombre d'animaux mis en expérimentation tout en s'assurant d'une puissance statistique suffisante dans le traitement de nos résultats. En effet, des précedentes études présentant le même schéma expérimental ont permis de valider ce nombre minimal de poisson mis en élevage pour obtenir des résultats statistiques viables. Les animaux après leur reproduction repartiront dans un circuit classique d’élevage.

Raffinement

Les conditions d’élevage seront optimisées. Le comportement et les mortalités seront contrôlés 2 fois par jour lors de l’alimentation des animaux. Si une perte de poids anormale ou un comportement atypique étaient observés (comportement de fuite anormal pendant l’alimentation, léthargie, hyperactivité locomotrice, perte d’intégrité physique suite à un cannibalisme ou à des comportements agressifs), les animaux concernés seraient euthanasiés. La personne qui injectera le pit tag et effectuera les prélèvements de sang est familiarisée avec l’espèce animale et la technique choisie. Les animaux seront manipulés avec ménagement et calme. Une faible quantité de sang sera prélevé (2mL sur des animaux de 2kg) ce qui ne provoquera pas d'effets notables sur le volume d'éjection cardiaque ou sur la pression artérielle.

Choix des espèces

La truite arc-en-ciel, espèce de salmonidé, est une espèce d'un grand intérêt agronomique.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale de cellules cancéreuses puis un gel associé à une chimiothérapie, avec un suivi tumoral par bioluminescence sous anesthésie jusqu'à douze séances, avant une ponction cardiaque terminale. Le porteur affirme observer rarement l'atteinte d'un point limite et décrit une maladie bien supportée, tout en surveillant la perte de poids qui déclenche une mise à mort sous 24 heures. Sur le remplacement, il indique que les essais in vitro ne reproduisent pas la complexité d'un "organisme vivant" et conclut à l'impossibilité de se passer de la souris.

Objectifs

La carcinose péritonéale est une situation médicale où le péritoine, qui est l’enveloppe qui entoure les organes de l’abdomen, se trouve recouvert de nodules de tumeur cancéreuse. Cette situation est un processus métastatique qui va conduire au décès du patient. La carcinose péritonéale est associée à un mauvais pronostic avec une survie médiane sans traitement de 5 mois. Le traitement à visée curative de la carcinose péritonéale repose sur la chirurgie de réduction tumorale qui a pour but de retirer toute la maladie macroscopique suivie de la chimiothérapie hyperthermique intrapéritonéale CHIP (c’est-à-dire le traitement d’une chimiothérapie chauffée à 43°C directement dans l’abdomen qui a pour but d’agir sur les nodules microscopiques). Ce traitement est très efficace, le taux de survie à 5 ans est alors de 45- 51%, avec une médiane de survie de 41 mois. Cependant, ce protocole comporte un risque important de mortalité et de morbidité. C’est pour cela que notre unité a choisi de s’intéresser à une alternative à ce traitement. Nous nous sommes intéressés à un gel associé à une chimiothérapie de contact pouvant être appliqué en postopératoire, qui aurait la capacité d’inhiber l’adhésion des cellules cancéreuses disséminées suite à de la résection de la tumeur primitive ou suite à n’importe quelle chirurgie abdominale. L’objectif de cette recherche est d’évaluer l’apport thérapeutique, soit pour une carcinose déjà présente, soit pour éviter (prophylaxie) qu’une carcinose ne se développe, de ce gel thermosensible qui va se gélifier à température de l’animal (il est liquide a température ambiante) et laisser diffuser sur quelques jours la chimiothérapie qui a été incluse avec celui-ci.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus seraient de trouver une alternative au traitement classique de la carcinose péritonéale et également l'utilisation de ce gel en prévention, donc avant l'apparition de la carcinose péritonéale.

Procédures

Les souris vigiles seront soumis à une injection de cellules cancéreuses en intrapéritonéale (1 fois 30 secondes) qui sera associée deux heure après à une injection en intrapéritonéale également de gel associé à une chimiothérapie (1 fois 30 secondes). Puis sous anesthésie, ils auront un suivi non invasif par bioluminescence pour suivre l'évolution tumorale (3 fois 20 minutes pour les bal/c; 12 fois 20 minutes pour les C57BL/6). A la fin de l'expérience elles auront une injection sous-cutanée de buprénorphine (1 fois 30 secondes) puis 30 minutes après elles seront sous anesthésie générale (isoflurane à 30%) pour réaliser un prélèvement intracardiaque de sang qui permettra une analyse post-mortem.

Impact sur les animaux

Les souris vont développer une carcinose péritonéale après une injection intrapéritonéale de cellules cancéreuses murines ovarienne ou colique. Nous avons une bonne expérience de nos modèles. Il est très rare d’observer une souris qui atteint un point limite. Les souris supportent très bien la maladie et la fin de l’expérience arrive avant que la maladie ne se développe de trop. De plus, le suivi par bioluminescence nous permet d’arrêter l’expérience avant que la progression tumorale soit trop importante. Les points limites observés sont souvent corrélés ensemble avec une perte de poids de l’animal. Si cela devait se produire, l’animal serait mis à mort dans les 24h. Aussi, nous devons confirmer si ce gel pourrait induire une toxicité. Aussi, les doses de chimiothérapie ne seront pas toxiques non plus; la chimiothérapie étant au contact du gel.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à J14 ou à 12 semaines post-injection des cellules CT26-luc ou ID8-luc respectivement par ponction cardiaque puis dislocation cervicale sous anesthésie générale. Ce sera un prélèvement total de sang pour des analyses post mortem; mais aussi de tissus sains pour être analysés par le service d’anatomopathologie.

Remplacement

Nous ne pouvons remplacer le modèle murin car pour tester un éventuel traitement (gel) les expérimentations in vitro ne permettent pas de représenter la complexité d’un organisme vivant.

Réduction

En dessous de 7 animaux par groupe, du fait des variations de nos modèles, en nombre de nodules ou vitesse de propagation de la maladie il y a trop peu de données pour avoir un résultat solide. Compte tenu de notre expérience sur le modèle et de la variabilité observée, un nombre minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire. En cas de groupe contrôle régulier nous nous autorisons à diminuer le nombre à 5 en acceptant pour faire les analyses scientifiques de pooler deux groupes contrôles. Ce sont des règles de bonne pratique pour toutes expériences en oncologie sur l’animal, utilisant des xenogreffes. Aussi, nous allons utiliser un seul groupe de souris contrôle pour 3 groupes de traitement. Cela permettra de diminuer le nombre d'animaux.

Raffinement

Le projet n’inclut pas d'interventions douloureuses et les animaux seront observés quotidiennement. Lors du suivi de la croissance tumorale par bioluminescence, les animaux seront sous anesthésie générale gazeuse (isoflurane à 1%) et avant l'intervention finale (ponction cardiaque) les animaux recevront une injection d'analgésie (Buprénorphine - 0,1mg/kg) et seront ensuite sous anesthésie générale (isoflurane à 3%). Différents points limites seront particulièrement surveillés tels que la perte de poids, le comportement (yeux fermés, dos voûté, isolement), l’apparence physique (automutilation, plaies) et la gêne pour se déplacer qui seront notifiés dans un cahier de suivi des animaux 2 fois par semaine. De plus, le suivi par bioluminescence nous permet d’arrêter l’expérience avant que la progression tumorale soit trop importante. Les souris seront hébergées en portoir ventilé avec alimentation standard classique Harlan 20.16) et eau stérile ad libitum. Cycle nycthéméral 12h jour/12h nuit Température : 22°C Aussi, les souris disposeront d’enrichissement tels que maison rouge, nids en papier kraft ou buchette de bois à ronger pour leur permettre d’exprimer tout le comportement social normal d’une souris et ainsi améliorer leurs conditions d’hébergements. En cas d’atteinte des points limites, ils seront alors exclus de l'expérience dans les 24heures.

Choix des espèces

Il s’agit de souris femelles immunocompétentes (BALB/c ou C57BL6). Ces types de souris sont utilisés largement dans la recherche en cancérologie pour sa capacité d’incrémenter l’incidence tumorale après injection des cellules cancéreuses. Les souris seront utilisées à l’âge de 7-8 semaines pour ne pas interagir avec les processus de vieillissement et pour qu’elles ne soient pas trop jeunes pour supporter la chimiothérapie.