Recherche appliquée

16 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de vecteurs viraux puis des injections quotidiennes d'immunosuppresseurs pouvant s'étaler sur seize semaines, avec des prélèvements de sang répétés, l'immunosuppression pouvant provoquer des infections opportunistes et une perte de poids. Ce criblage sert à préparer une thérapie génique destinée à des enfants atteints d'une maladie osseuse rare. Le porteur décrit la souris comme une "espèce inférieure" servant à trier vecteurs et traitements avant des essais sur primates, qu'il présente comme le "modèle de prédilection".

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un programme plus large qui inclut un projet déjà en cours dans le même établissement utilisateur. L’objectif du programme est de développer des traitements pour différents types de dysplasies du squelette, notamment la dysplasie spondyloépiphysaire congénitale (SEDc), la collagénopathie de type 2 la plus fréquente. La SEDc est une dysplasie osseuse génétique qui cause une forme rare de nanisme chez l'être humain (1 naissance sur 100 000). Elle est caractérisée phénotypiquement par une petite taille avec un raccourcissement du tronc et du cou, induisant un risque important d'instabilité au niveau des vertèbres cervicales pouvant provoquer une paralysie. Les patients souffrent également d'anomalies au niveau de la rétine et d’une perte d'audition. Cette pathologie est due à des mutations perte de fonction dans le gène du collagène de type 2. L’objectif de ce projet est d’identifier un traitement immunosuppresseur pouvant être utilisé en combinaison avec un traitement de thérapie génique pour différents types de dysplasies squelettiques. Les traitements de thérapie génique basés sur l’utilisation de vecteurs viraux peuvent induire des réponses immunitaires pouvant réduire l’efficacité du traitement (diminution du niveau d’expression du gène d’intérêt ou élimination des cellules transduites) et empêcher la ré-administration efficace de ce dernier (réponse mémoire dirigée contre le vecteur viral). Il est donc nécessaire d’inhiber de façon transitoire les mécanismes impliqués dans les réponses immunitaires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à la fois d’identifier la ou les constructions de vecteurs viraux les moins immunogènes, et la stratégie d’immunosuppression la plus efficace entrainant le moins de complications. Ces résultats, combinés à ceux d’un autre projet en cours permettront d’identifier, chez la souris, la combinaison vecteur viral / immunosuppression la plus efficace et la moins toxique. Ces étapes de pré-sélection chez la souris permettront de diminuer le nombre de sujets dans les futures études sur animaux supérieurs (type primates) aux caractéristiques plus proches de celles de l’Homme. Le bénéfice final du projet est de développer des traitements (combinaison thérapie génique / Immunosuppression) pour différents types de dysplasies du squelette, notamment la dysplasie spondyloépiphysaire congénitale (SEDc), la collagénopathie de type 2 la plus fréquente.

Procédures

Les animaux seront soumis à une ou deux injections de vecteurs viraux par voie intraveineuse ou intrapéritonéale, et de multiples injections d’immunosuppresseurs par voie intrapéritonéale. Ces dernières se feront sur une durée maximum de 16 semaines (injections IP quotidiennes sur un maximum de 21 jours consécutifs ou injections hebdomadaires sur un maximum de 16 semaines). Les animaux seront également soumis à des prélèvements répétés de sang (toutes les semaines, ou toutes les deux semaines sur une durée maximale de 16 semaines) dans la mesure du possible (effectués sur des animaux d’un mois minimum). Ces prélèvements s’effectueront sous anesthésie au niveau de la veine mandibullaire en alternant chaque côté. Des prélèvements de sang terminaux seront également effectués sous anesthésie sur tous les animaux par la voie rétro-orbitale.

Impact sur les animaux

Aucun effet indésirable n’est attendu suite à l’injection de vecteurs viraux (résultats obtenus dans le cadre d’un précédent projet). Les souris sous immunosuppresseurs présenteront un système immunitaire éteint. Elles seront ainsi plus sujettes à des infections opportunistes et aux complications qui pourraient en découler. En cas d’infection, les souris pourraient être sujettes à des pertes de poids ou des signes d’inactivité.

Devenir

Toutes les souris utilisées au sein de ce projet seront mises à mort par dislocation cervicale, asphyxie au CO2 ou injection intrapéritonéale d’une dose létale de pentobarbital sodique (de type Euthasol 140 mg/kg ou Euthoxin 500 mg/kg). La mise à mort est nécessaire afin de récupérer un ensemble d’organes (rate, foie, moelle osseuse, plaques de croissance…) pour évaluer à la fois la biodistribution des vecteurs viraux testés, mais aussi l’effet du traitement (vecteur viral et immunosuppresseur) sur la réponse immunitaire cellulaire.

Remplacement

Globalement, la construction des vecteurs viraux et l’optimisation de ces derniers se sont faites et continuent à se faire en se basant sur des publications scientifiques, et sur un certain nombre de tests in vitro réalisés. Les différents vecteurs viraux produits sont précédemment testés in vitro afin de valider leur capacité à transduire efficacement des cellules modèle (HEK293). Si la transduction n’est pas efficace, le vecteur ne sera pas sélectionné pour les études in vivo. Une importante recherche bibliographique a été effectuée afin d’identifier des traitements immunosuppresseurs d’intérêt, d’autant plus sachant que la patientèle sera constituée en totalité d’enfants. Il est très difficile de valider une stratégie d’immunosuppression par des tests in vitro sachant que cela nécessite la présence d’un système immunitaire complet et fonctionnel. Certains immunosuppresseurs seront tout de même évalués à l’aide des tests in vitro mentionnés précédemment afin de confirmer qu’ils n’impactent pas la capacité des vecteurs à transduire efficacement les cellules modèles.

Réduction

Le juste nombre d’animaux a été calculé de manière à réduire le nombre minimum d’animaux par lot, tout en produisant des résultats statistiquement significatifs et robustes. De manière à répondre aux exigences de réduction, nous allons utiliser des groupes contrôles en commun chaque fois que cela est possible. Globalement, un ensemble de 8 animaux par groupe sera suffisant pour comparer de manière significative les niveaux d’anticorps et les réponses cellulaire induites. En effet, l’utilisation d’outils statistiques (calcul de puissance de test et de taille d’échantillons, https://biostatgv.sentiweb.fr/?module=etudes/sujets#) permet de définir un nombre minimal d’animaux de 8 par groupe, en considérant un seuil de significativité (p

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe à maximum 5 par cage et par sexe dans une pièce à température et hygrométrie contrôlées avec un cycle jour/nuit de 12h. Chaque cage sera soumise à un enrichissement du milieu de type tige en papier, un igloo et une buchette de peuplier afin de satisfaire l’instinct naturel des souris à ronger et éviter les malocclusions des incisives. Les souris sous immunosuppresseurs présenteront un système immunitaire éteint. Elles seront ainsi plus sujettes à des infections opportunistes et aux complications qui pourraient en découler. L’hébergement des animaux en zone SPF (Specific Pathogen Free) dans des cages ventilées, l’utilisation de hottes de change, ou de hotte à flux laminaire pour les expérimentations, et l’apport d’aliments irradiés, permettront de réduire ces risques au minimum. Le suivi quotidien (weekends et jours fériés inclus) des animaux par le personnel de l’établissement utilisateur et les visites régulières des expérimentateurs (à minima deux fois par semaine) nous permettront de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. En cas d'altération de l'état de l'animal, la surveillance sera rapprochée (observation et pesée quotidienne) et les animaux seront soignés en fonction de la sévérité de la douleur observée. Les procédures mises en place dans ce projet ne nécessitent aucune analgésie particulière. En cas d'apparition d'une souffrance ou toxicité inattendue, les animaux seront exclus de l'étude et mis à mort dans les 24 heures avec l’accord du directeur d’étude et/ou d’un vétérinaire

Choix des espèces

Afin d’identifier une combinaison vecteur / immunosuppression applicable en clinique chez l’homme, il est important de la valider au préalable au sein d’un modèle animal. En effet le système immunitaire fonctionne au travers de mécanismes complexes qu’il est impossible de reproduire fidèlement en dehors d’un organisme vivant. Les primates non humains représentent le modèle de prédilection de par son anatomie proche de celle de l’Homme. Il est cependant impossible de cribler autant de paramètres différents (vecteur, dose, immunosuppresseur, dose, fréquence) chez cette espèce. Nous allons avoir besoin d’une espèce inférieure, i.e. la souris, pour cribler les vecteurs mais aussi les traitements immunosuppresseurs pertinents. Étant donné que les destinataires finaux du traitement seront des enfants, l’efficacité du traitement combinatoire thérapie génique + Immunosuppresseur devra être confirmé chez un modèle de souris d’âge similaire, soit des souris juvéniles (1 à 22 jours). Les études qui consistent à évaluer la cinétique de la réponse immunitaire (Procédure n°1), cribler les différents traitements immunosuppresseurs (Procédure n°2) et évaluer l’efficacité d’une seconde injection de vecteur viral (Procédure 3) seront réalisées sur des animaux adultes âgés de 5 à 8 semaines. Étant donné que les destinataires finaux du traitement seront des enfants, l’efficacité du traitement combinatoire thérapie génique + Immunosuppresseur devra être confirmé chez un modèle de souris d’âge similaire, soit des souris juvéniles avec des traitements allant de la naissance jusqu’à un âge de 4 mois maximum (procédures n°4 et 5).

16 270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent un modèle d'une maladie osseuse rare avec atteinte rénale, reçoivent des injections de vecteurs lentiviraux, des prélèvements de sang et d'urine et une biopsie d'oreille, puis sont toutes tuées pour analyse des organes, pour une preuve de concept thérapeutique. Le porteur annonce un bénéfice "certain à long terme" pour les patients, formulé au conditionnel, face à ce nombre très élevé d'animaux mobilisés d'emblée. Il affirme le recours au modèle animal "inévitable" malgré des tests menés in vitro et une recherche bibliographique.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer une nouvelle approche thérapeutique pour une maladie osseuse avec troubles renaux associés. En effet, il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement curatif pour cette maladie. Les seules approches thérapeutiques actuellement utilisées sont des approches palliatives et seulement pour certains symptômes de la maladie notamment les problèmes rénaux associés.

Bénéfices attendus

Ce projet va nous permettre de faire la preuve de concept chez l’animal d’une approche thérapeutique pour cette maladie. Il s’agit d’une maladie rare sévère pour laquelle à l’heure actuelle il n’existe aucune approche thérapeutique. Dans le cas où cette approche fonctionnerait cela nous permettrait de continuer le développement dans le but d’apporter un jour un traitement efficace pour les patients. Il s’agit donc d’un bénéfice certains à long terme pour ces patients.

Procédures

Les animaux sont soumis à des injections de vecteurs lentiviraux (30 secondes), ainsi que des prélevements de sangs (5 minutes) et d'urine (30 minutes). Les prélèvements de sang sont sur animal anesthésié et un animal aura maximum de 3 prélèvements dans sa vie. Les prélèvements d'urine se font sur animal non anesthésié et un maximum de 6 prélèvements sera fait Les animaux auront également une biopsie d'oreille pour savoir s'ils sont porteur de la maladie (20 secondes).

Impact sur les animaux

Le modèle de souris utilisé dans ce projet présente les signes cliniques caractéristiques de la maladie. En effet, ces animaux sont de plus petite taille et présentent un poids inférieur par rapport aux souris non malades de même âge. Cependant les chercheurs ayant générés ce modèle ne rapportent aucun problème pour ces animaux à se mouvoir ou à s’alimenter. Les souris ont également une altération de la fonction rénale et une ostéoporose associée à une destruction partielle des os des pattes chez la souris malade. Toutes ces altérations sont caractéristiques de la pathologie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. En effet, le projet nécessite d'étudier la structure des organes afin de vérifier l'efficacité du traitement testé et cela ne peut se faire que sur animal euthanasiés.

Remplacement

Globalement, la production du traitement et l’optimisation se fait et continue à se faire en se basant sur des publications scientifiques, et sur un certain nombre de tests in vitro réalisés sur cellules. Une importante recherche bibliographique a été effectuée afin d’identifier les cellules atteintes lors de la pathologie et ainsi développer un traitement le plus ciblé possible. Cependant l’utilisation du modèle animal de la maladie est inévitable afin de déterminer le bénéfice thérapeutique ainsi que d’évaluer les potentiels effets toxiques du traitement.

Réduction

Le juste nombre d’animaux a été calculé de manière à réduire le nombre minimum d’animaux par lot, tout en produisant des résultats statistiquement significatifs et robustes. De manière à répondre aux exigences de réduction, nous allons utiliser des groupes contrôles en commun chaque fois que cela est possible. Globalement, un ensemble de 10-12 animaux par groupe sera suffisant pour valider l’efficacité d’un traitement. Ce modèle étant un nouveau modèle de souris, il est possible que ce nombre soit amené à changer au cours des études et des différents résultats obtenus. Ce nombre est basé sur nos expériences passées avec différents modèles animaux de maladies osseuses.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe à maximum 5 par cage. Chaque cage contient une tige en papier, un igloo et une buchette de peuplier afin de satisfaire l’instinct naturel des souris à ronger et éviter les malocclusions des incisives. Le suivi quotidien (weekends et jours fériés inclus) des animaux par le personnel de l’établissement utilisateur et les visites régulières des expérimentateurs (à minima trois fois par semaine) nous permettront de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. En cas d'altération de l'état de l'animal, la surveillance sera rapprochée et les animaux seront soignés en fonction de la sévérité de la douleur observée. Les procédures mises en place dans ce projet ne nécessitent aucune analgésie particulière. En cas d'apparition d'une souffrance ou toxicité inattendue, les animaux seront exclus de l'étude et euthanasiés dans les 24 heures.

Choix des espèces

Ce projet ne peut pas se faire sans modèle animal car avant de pouvoir envisager un traitement, et de commencer une étude clinique sur les patients souffrant de la maladie, il est nécessaire de démontrer que les molécules choisies ont l'effet attendu au niveau du modèle animal de la maladie, et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs. Ce modèle de souris est pertinent car il a été construit pour mimer la pathologie et en effet, les auteurs du papier original démontrent bien que les principales caractéristiques de la pathologie sont retrouvées. Les animaux seront utilisés de la naissance jusqu’à environ 52 semaines maximum afin de pouvoir caractériser chacune des étapes du développement de la pathologie.

500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur mammaire ou une injection de cellules tumorales dans la veine caudale, une chimiothérapie et jusqu'à six cycles de thérapies dites innovantes, avant une exsanguination terminale par ponction intracardiaque, pour étudier la réponse immunitaire au cancer du sein après traitement. Le porteur décrit une tumeur à croissance rapide pouvant provoquer nécrose, ulcérations cutanées et hémorragies douloureuses. Il juge une étape in vivo "nécessaire" pour se rapprocher de la clinique humaine.

Objectifs

L’objectif du projet est d'évaluer l'impact de la chimiothérapie conventionnelle sur la réponse antitumorale, particulièrement la réponse du système immunitaire sur des tumeurs mammaires murines implantées chez des souris, au niveau du site primaire et des métastases, afin de caractériser des acteurs moléculaires pertinents pouvant être cibler par une thérapie innovante. Le projet global consiste à étudier la réponse du carcinome mammaire et de son environnement immunitaire après chimiothérapie dans un modèle syngénique murin immunocompétent comparé un modèle immunodéficient afin de définir : 1. L’efficacité de la chimiothérapie sur la tumeur initiale et le développement autonome des métastases incluant la caractérisation du programme de mort déclenchée dans les cellules tumorales sensibles et notamment la voie cGAS/STING 2. le remaniement du microenvironnement tumoral qu’il induit, particulièrement au niveau immunitaire (immunité innée et adaptative) locale (tumeur primaire) et systémique (métastases, ganglion de drainage, sang) 3. la nature des clones tumoraux qui résisteront au traitement 4. la réponse immunosuppressive locale qui a permis l’établissement des métastases 5. les stratégies thérapeutiques ciblant les acteurs de mort cellulaire et de réponse anti-tumorale immunitaire pouvant amplifier les effets de la chimiothérapie en diminuant les cellules lui échappant

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est de participer au rétablissement d’une réponse immunitaire antitumorale locale et/ou systémique efficace grâce à la caractérisation et au ciblage des voies de signalisation participant à l’échappement tumoral entre la tumeur et son microenvironnement immunitaire. L’évasion immunitaire dont bénéficie la tumeur repose sur des processus intrinsèques à la tumeur ou sur sa capacité à corrompre l’environnement tissulaire dans lequel elle évolue et l’effet cytotoxique direct d’une chimiothérapie efficace modifie l’équilibre initial. A court et moyen terme, il va donc être important de déterminer le type de mort que les cellules tumorales vont déclencher sous l’effet de la chimiothérapie, et la nature des signaux d’alarme libérés dans l’espace tumoral ainsi que leur cinétique de sécrétion. Ces signaux de nature variée (incluant métabolites, cytokines, acides nucléiques, vésicules, organites...) influent sur les autres cellules tumorales ou immunitaires au niveau local ou systémique, contribuant à l’adaptation de la tumeur, du système immunitaire et finalement à la récidive de la maladie. Ceci va permettre de générer des données biologiques intégrant le caractère inflammatoire et/ou immunomodulateur de la mort cellulaire induite par le traitement anticancéreux au niveau de la tumeur primitive (ou sa maladie résiduelle quand une exérèse a été pratiquée) ou des métastases associées. A moyen et long terme, ceci permettra d’identifier les processus cytotoxiques qui seront capables de favoriser une réaction immunitaire antitumorale locale et systémique, en l’associant éventuellement avec les approches d’immunothérapie actuellement en cours de développement.

Procédures

Chaque animal de l’étude recevra : • une allogreffe tumorale au niveau 4e coussinet mammaire après incision cutanée et sous anesthésie générale (durée : 20 minutes) avec exérèse tumorale chirurgicale sous anesthésie générale 1é jours plus tard (durée : 20 minutes) o u une injection intraveineuse de cellules tumorale dans la veine caudale sans allogreffe associée (durée : 5 minutes) • 3 injections de chimiothérapie par voie intra-péritonéale sur animal vigile (durée : 2 minutes) • Administration d’une ou de plusieurs thérapies innovantes (jusqu’à 6 cycles par animal) par voie intra-péritonéale ou per os/gavage sur animal vigile ou sous anesthésie générale (durée : 2-5 minutes) • 5 séances de bioluminescence après anesthésie générale et injection intra-péritonéale de Luciférine (durée : 30 minutes) • Une exsanguination terminale par ponction intra-cardiaque sous anesthésie générale injectable juste avant la mise à mort (durée : 15 minutes)

Impact sur les animaux

Le modèle 4T1 est un modèle de cancer mammaire montrant une croissance tumorale rapide et une extension métastatique précoce notamment au niveau du poumon dans les premiers stades puis au niveau de divers organes ensuite (foie, os, rate, cerveau). La croissance de la tumeur et des ses métastases peut provoquer des effets indésirables sur les animaux recevant cette lignée. Tout d’abord au niveau local d’implantion de la tumeur primaire (dans le coussinet mammaire de la 4e mamelle), l’animal peut subir une nuisance mécanique de la tumeur par son volume pouvant compliquer sa mobilité et son activité. La tumeur primaire, par sa croissance rapide, peut montrer une nécrose centrale par hypoxie, associée à des remaniements cutanés ulcératifs et hémorragiques entraînant une douleur pour l’animal. Ces nuisances au niveau du site local seront réduites par l’exérèse précoce (J12) de la tumeur et seront absentes dans le modèle métastatique par injection de cellules tumorales dans veine cave caudale. Au niveau des différents sites métastatiques, on peut observer des difficultés fonctionnelles de(s) différent(s) appareil(s). Notamment au niveau du poumon, une dyspnée peut être observée, due à la présence mécanique des métastases et/ou à la présence d’un hydrothorax ainsi qu’au niveau de la moelle osseuse avec des fractures spontanées par présence mécanique de la masse dans le fût osseux. De manière plus générale, l’animal peut être touché par des signes plus généraux de mauvais état général comme la perte de poids et d’appétit ainsi qu’une hypothermie persistente. Des observations et examens cliniques seront réalisés très régulièrement afin de mettre en lumière les animaux montrant des signes cliniques atteignant des points limites pour leur administrer un analgésique en cas de signes de douleur (opioïdes) ou procéder à une mise à mort anticipée.

Devenir

Dans le cas d’une allogreffe tumorale (Procédure 1), la tumeur sera analysée par une séance de Bioluminescence puis sera traitée par une séance de chimiothérapie -avec ou sans traitement innovant- avant l’exérèse de sa tumeur. Dans le cas d’une injection intraveineuse de cellules tumorales (Procédure 2), l’animal subira seulement une injection dans la veine caudale des cellules 4T1 sans chimiothérapie néo-adjuvante ni exérèse tumorale. Ensuite, dans tous les cas (Procédures 1 et 2), les animaux recevront 4 séances d’analyse par bioluminescence et 3 séances de chimiothérapie -avec ou sans traitement innovant-. A la suite de la dernière séance d’analyse par bioluminescence, l’animal sera laissé endormi pour une exsanguination précédent la mise à mort.

Remplacement

Le projet s’intéresse à la caractérisation des mécanismes d’échappement tumoral au système immunitaire, notamment dans la niche métastatique. Il est très compliqué de mimer in vitro une implantation métastatique ectopique complexe dans un terrain pulmonaire riche en divers éléments micro-environnementaux comme notamment les acteurs locaux de l’immunité innée et acquise. Une étape in vivo est donc nécessaire afin de se rapprocher au plus près des conditions de clinique humaine, afin d’observer finement les mécanismes d’action des cellules tumorales et immunitaires dans la niche tumorale. Toutefois, avant implantation in vivo dans la souris, la lignée 4T1-Luc2 sera étudiée in vitro dans sa réponse aux traitements et dans les caractéristiques de résistance à ce dernier. Les prélèvements obtenus par l’expérience in vivo seront analysés ex vivo afin d’en tirer des acteurs moléculaires pertinents qui seront validés, in vitro, sur cultures cellulaires ou organoïdes, puis ciblés par des molécules afin de retourner au modèle in vivo murin dans un dernier temps.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombres d’animaux utilisés, le personnel est formé aux outils statistiques appliqués à l'expérimentation animale (planification, randomisation et analyse) par l’utilisation de traitements statistiques des données (ANOVA, Bartlett,…). Les protocoles d’injection et d’exérèse du modèle 4T1, issus de la bibliographie, sont validés et robustes permettant une prise tumorale optimale sur l’ensemble des individus de la cohorte, limitant l’utilisation d’animaux dont les prélèvements se révèlent non analysables. L’ensemble du protocole expérimental sera précisément défini en amont afin de limiter les biais de non homogénéité entre lots de souris. L’expression par la lignée 4T1 de la luciférase facilite une quantification précise de la croissance tumorale et de l’extension métastatique, réduisant donc le nombre d’animaux pour atteindre des résultats statistiquement significatifs. Elle permet aussi un suivi cinétique non invasif des masses et donc sans sacrifice à différents temps de lots d’animaux. Le personnel collaborera avec d’autres équipes, notamment dans le partage des animaux (les animaux disponibles devenus trop âgés pour la greffe ou de sexe masculin) et dans le partage des données notamment par la mise en commun des données et des expertises analytiques.

Raffinement

Le bien-être des animaux de l’étude sera particulièrement porté à l’attention du personnel qui veillera aux meilleures conditions d’hébergement possible, notamment via un maintien des groupes sociaux (3-4 animaux par cage) et l’enrichissement de l'habitat (frisottis de papier ajoutés aux cages). La gestion du stress des animaux sera maximisée, par une contention la plus rapide et la moins fréquente possibles. Différents lieux accueilleront les animaux pour un distanciation maximale entre les lieux d’hébergement, de soins et de sacrifice. Enfin, la douleur des animaux utilisés sera fréquemment monitorée par un examen clinique des animaux tous les 2-3 jours (et tous les jours en fin d’expérimentation) afin de déterminer le plus précocément possible les points critiques chez un animal et d’adapter le protocole d’analgésie (c.f. Annexe 5).

Choix des espèces

La souris est l’espèce de choix pour ces essais : - modèle 4T1 de cancer du sein décrit précisément dans la bibliographie pour les souris immunocompétentes Balb/c - concordance du modèle 4T1 murin avec les observations cliniques chez les patientes femmes atteints d'un carcinome mammaire et sur son évolution métastatique - Similitudes de la physiologie et de la taille du génome entre la souris et l'homme - l'organisme murin évolue rapidement (courte durée de vie) et permet des analyses compatibles avec les impératifs de progrès thérapeutiques à apporter en clinique humaine -certaines souches sont génétiquement modifiées, permettant la création de modèles tumoraux particuliers (absence du système immunitaire pour mettre en lumière le rôle de ce dernier dans l’échappement au traitement des cellules tumorales). Les animaux utilisés ont un âge qui varie entre 6-8 semaines à leur inclusion dans le protocole. En effet, la prise tumorale est dépendante de l'imprégnation hormonale : plus elle est précoce et prolongée, plus le taux de prise de greffe est important. Dans le cas des modèles 4T1, elle est estimée à proche de 100% dans ses conditions chez les souris immunocompétentes d'après la bibliographie existante. De plus, le temps de latence estimé avant prise tumorale est de 2-3 semaines et les métastases sont détectables à partir de 4-5 semaines : les souris auront atteint l'âge adulte, un âge où elles pourront supporter le développement de la tumeur.

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à une course de deux heures sur tapis roulant en pente descendante, destinée à provoquer des microtraumatismes musculaires, avec prélèvements de sang et de fèces, puis tuées pour recueil de matériel biologique, afin de tester un extrait de microalgue censé accélérer la récupération. Le porteur situe l'objectif du côté des stratégies nutritionnelles pour sportifs, tandis que les lésions musculaires sont provoquées volontairement. Il affirme que l'étude des relations entre alimentation et activité physique ne peut s'envisager que chez l'animal.

Objectifs

La principale conséquence de lésions musculaires induites par l'exercice pour l'athlète est la perte de la fonction musculaire squelettique et la douleur. C'est pourquoi de nombreux nutriments et aliments fonctionnels ont été étudiés pour leur capacité à atténuer les effets de ces lésions et à accélérer la récupération, ce qui est l'objectif de nombreuses stratégies nutritionnelles pour les athlètes. Dans cette étude, nous cherchons à évaluer l'effet d'un extrait de microalgue sur la récupération musculaire suite à un test de blessure provoquée par un exercice physique.

Bénéfices attendus

Dans cette étude, nous évaluerons la capacité d'un extrait de microalgue à atténuer les effets de lésions musculaires et à accélérer la récupération suite à un exercice physique. Des modifications métaboliques seront identifiées par des dosages des marqueurs des voies du métabolisme énergétique et musculaire. Des marqueurs inflammatoires et du stress oxydant seront également recherchés.

Procédures

Un prélèvement de sang sur animal vigile sera réalisé au début de l'étude. Deux recueils de fèces seront effectués à 4 semaines d'intervalle (isolement en cage individuelle pendant 1h au maximum). Une course de 2h (+20 min d'habituation/échauffement) sur tapis roulant aura lieu en fin de protocole.

Impact sur les animaux

La course sur tapis roulant peut engendrer un stress chez l'animal. Au lieu d'une période d'acclimatation typique qui dure de quelques jours à plusieurs semaines, une brève période d'acclimatation au début de la séance d'exercice sera réalisée. Les souris seront placées sur un tapis roulant stationnaire pendant quelques minutes pour leur permettre de se familiariser avec l'environnement de course avant une augmentation progressive de la vitesse et de la pente pendant 20 minutes. Cette période a pour but de réduire le stress provoqué par un environnement nouveau tout en prévenant toute adaptation au protocole de course qui est connu pour atténuer de manière significative les effets nocifs sur les muscles . Les blessures causées par ce type de course en pente descendante sont de l'ordre de microtraumatismes musculaires et courbatures.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront mis à mort pour recueil du materiel biologique nécessaire aux analyses.

Remplacement

L'étude des relations entre alimentation et activité physique ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Aucun modèle in vitro n’a pour l'instant la capacité d’intégrer cette complexité multifactorielle.

Réduction

Le nombre d'animaux est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre les groupes. Des études du même type portent sur 8 à 10 animaux, du fait de la forte variabilité entre animaux au niveau de la performance sportive. Nous travaillerons avec 9 animaux par groupe afin que le nombre d'animaux par cage soit homogène (3 souris par cage). Nous chercherons à mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre 3 groupes ou plus à l'aide de tests statistiques non paramétriques de Kruskall-Wallis. Dans le cadre de comparaisons entre 2 groupes, un test statistique de Mann-Whitney sera appliqué.

Raffinement

Les animaux sont hébergés par groupe de 3 animaux par cage. L'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique et de matériel de nidification (bandelettes de papier kraft). Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Les animaux seront observés hebdomadairement afin de détecter des comportements agressifs de certains animaux, si tel est le cas l'animal agressif sera isolé de ses congénères dans une cage individuelle. Si un animal est blessé, il sera soigné par badigeonnage de bétadine sur la zone lésée, il sera également isolé le temps de la cicatrisation de ses blessures. Dans tous les cas, les animaux isolés resteront en contact visuel, olfactifs et auditifs avec leurs congénères. La course sur tapis roulant pouvant engendrer un stress chez l'animal, afin de limiter ce stress, chaque souris sera placée sur le tapis roulant fixe pendant quelques minutes afin de se familiariser avec l'environnement. Pendant les 20 premières minutes d'exercice, les animaux seront familiarisés avec le tapis roulant à une vitesse lente et régulière, qui sera progressivement augmentée. Au cours des phases d’exercice sur tapis, les animaux bénéficieront d’une surveillance constante. Si un animal venait à se blesser pendant la course (contusion), ils seraient alors immédiatement pris en charge selon les recommandations du vétérinaire référant. Pour chaque procédure, des points limites spécifiques et des points d'arrêt ont été définis.

Choix des espèces

La souris est un modèle classiquement utilisé dans les études concernant la mobilisation des ressources énergétiques, notamment au cours d’un exercice imposé. Le modèle C57Bl/6J est une souche reconnue pour ce type d'expérimentation. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondant tels que le vieillissement.