Recherche appliquée

864 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une transplantation chirurgicale d'îlots pancréatiques sous la capsule rénale ou par voie intraportale et des injections répétées, après induction d'un diabète, pour tester une molécule censée améliorer la survie des greffons. Le porteur renvoie l'application clinique au conditionnel, les résultats devant "facilement" être transposés, tandis que les souris sont rendues diabétiques puis opérées. Il indique avoir mené des essais in vitro préliminaires mais affirme qu'"aucune méthode alternative" ne permet d'aller plus loin.

Objectifs

Notre projet porte sur l'application préclinique de nouveaux composés ciblant une voie innovante que nous avons identifiée chez les mammifères, et dont les inhibiteurs peuvent prévenir les lésions tissulaires induites par l'ischémie associées au processus de transplantation. Après avoir démontré leur efficacité dans un modèle préclinique de transplantation rénale et d'accident vasculaire cérébral, notre objectif est d'évaluer leur utilité dans la transplantation d'îlots pancréatiques, connue pour être une thérapie curative du diabète de type 1. Les applications cliniques ont clairement montré que cette procédure améliore le contrôle glycémique chez les patients mais elle présente certaines limites liées à la survie des Îlots.

Bénéfices attendus

L'objectif de cette étude est de déterminer l'efficacité de notre traitement pour améliorer le rendement, la survie et la fonctionnalité des îlots avant et après transplantation. Les résultats pourront ainsi être facilement transposés à la clinique.

Procédures

Les animaux receveurs seront soumis à une procédure chirurgicale de transplantation soit sous la capsule rénale (procédures 1 et, 2) soit par voie intraportale (procédure 3). Les actes chirurgicaux seront effectués une seul fois par animal et dureront le moins longtemps possible (20-30 minutes max). Les animaux bénéficieront d'un suivi journalier dans les premiers jours post-opération. Les animaux seront soumis à des injections IP (avec aiguille G25), selon la procédure, avec des produits (médicaux ou pharmacologiques) qui n’entrainent aucune souffrance physique.

Impact sur les animaux

Les souris diabétiques développeront l'hyperglycémie typique de cette pathologie qui sera monitorée par bandelettes. Le traitement pharmacologique préconisé dans les procédures utilise un produit déjà breveté qui ne cause aucune toxicité pour l'animal. Les animaux receveurs qui subiront une procédure chirurgicale seront attentivement suivis afin d'éviter toute complication post-opératoire (infection, inflammation et douleur).

Devenir

Les animaux seront tous euthanasie à la fin de chaque procedure ou lors qu'ils attaignent le point limite identifié.

Remplacement

Des études préliminaires sur lignée cellulaire (INS-1E) et îlots primaires isolés de souris nous ont permis 1) d'établir la concentration optimale du produit pour obtenir la meilleure survie et fonctionnalité des îlots pancréatiques et 2) de démontrer la capacité de notre composé à protéger les îlots en culture des phénomènes d’anoxie. Toutes ces étapes d'optimisation ont été effectuées in vitro avec un nombre très limité d'îlots par rapport aux expériences de transplantation. Néanmoins, aucune méthode alternative au modèle in vivo n’est disponible pour aller plus loin dans notre étude.

Réduction

Les études d'optimisation in vitro nous ont permis de réduire le nombre de souris nécessaire pour les procédures chirurgicales. En plus, selon les résultats obtenus dans les procédures 1 et 2, nous pourrons éventuellement choisir un seul type de préparation d'îlots avant transplantation (pré- ou per-conditionnement), en réduisant le nombre des souris nécessaires dans la procédure 3. Le nombre de souris utilisé dans l'étude est strictement calculé pour obtenir des résultats statistiquement concluants.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe et en milieu enrichi. Ils seront surveillés quotidiennement (comportement, apparence, signes cliniques) par le personnel animalier d'une part, et par les personnes en charge de l'expérimentation d'autre part. Toute apparition de signes de douleur tels que prostration, dos vouté, isolement et poil hérissé entrainera l’ouverture d’une fiche de score avec des points limites bien définis qui entraineront l'euthanasie de l‘animal par dislocation cervicale. Une attention particulière sera portée au point d’injection abdominal (rougeur) et à la zone de chirurgie pour les animaux transplantés.

Choix des espèces

Aucune méthode alternative ou modèle in vitro n’est disponible pour aller plus loin dans notre étude. En effet, la complexité des organes ne peut être récapitulée in vitro, ni le modèle d’ischémie et reperfusion. Les alternatives d’anoxie et d’hypoxie in vitro sont limitées dans leur mise œuvre et dans la pertinence des résultats obtenus. Les animaux seront utilisés entre 8 et 10 semaines post-natales qui est par expérience l’âge optimal pour la chirurgie.

9 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un traitement laser oculaire sous anesthésie puis des séances d'imagerie sur trois semaines, pour qu'une entreprise vérifie que son laser de traitement de la rétine ne provoque pas de cataracte avant un passage chez l'humain. Le porteur indique qu'une cataracte est possible, voire systématique dans le groupe le plus exposé, avec perte définitive de la vision de l'œil traité et stress pouvant entraîner une perte de poids. Il affirme que l'essai doit "obligatoirement" être mené in vivo et présente le lapin comme le seul animal à l'anatomie oculaire proche de l'humain.

Objectifs

Une société Suisse a développé un traitement laser (proche infrarouge) des maladies chroniques de la rétine (DMLA, glaucome, Rétinopathie diabétique) qui a pour but d’interagir avec le métabolisme cellulaire rétinien. Dans ce cadre, elle souhaite réaliser une expérimentation animale préliminaire pour vérifier que la technologie laser utilisée n’est pas cataractogène. L’apparition de cataracte est liée soit à un effet photothermal du laser (échauffement de tissus absorbant l’énergie laser comme l’iris) et/ou à un effet photo-chimique. Le traitement laser étudié n’étant pas ciblé sur l’iris et le cristallin étant optiquement transparent (absorption de l’énergie faible à nulle), il est supposé que l’effet photothermal du laser utilisé sera négligeable et non associé à un risque de cataractogenèse. Néanmoins, un effet photochimique (réaction chimique catalysée par la lumière) ne peut être exclu et est variable en fonction de l’intensité d’énergie utilisée. La présente étude propose ainsi d’évaluer l’absence de cataractogenèse liée au traitement laser étudié 1/à une énergie de travail qui serait utilisée chez l’Homme, 2/à une énergie seuil de référence (énergie maximale autorisée par législation par exemple), 3/ainsi qu’une énergie très supérieure à la dose maximale utilisée. Sera étudiée à court terme l’apparition d’une cataracte dans le cristallin de lapins après les tirs lasers.

Bénéfices attendus

Ce projet permetterait de connaître la sécurité pour le cristallin de l'utilisation d'un laser innovant ayant pour but de traiter des rétinopathies chroniques jusqu'ici très difficile à traiter voir impossible. Avec les résultats de ce projet, l'entreprise developpant ce dispositif pourra alors se tourner vers une étude clinique.

Procédures

Les 9 animaux recevront à j0 un traitement laser sans contact, sans docking et sous anesthésie générale qui a une durée théorique de 1 minute. Puis à J0 (postlaser immédiat), J1, J7, J14 et J21, la rétine et le cristallin des 2 yeux de l'animal seront observés par des techniques d'imageries sans contact (Lampe à fente, tomographie à cohrence optique et rétinographe) et sous anesthésie générale. Les observations ont une durée théorique de 30 minutes.

Impact sur les animaux

Une cataracte (opacification du cristallin) de l'oeil traité par le laser est possible pour les groupes 1 et 2 voir systématique pour le groupe 3. Cette atteinte du cristallin n'est pas douloureuse, mais est accompagné d'une perte de la capacité visuel définitive de l'oeil cataracté et par conséquent cela peut entrainer un stress pouvant se traduire par une perte de poids (supérieure ou égale à 10% en 3 jours) ; des perturbations comportementales graves et persistantes comme la piloérection, dos voûté, prostration, isolement, agressivité à l'ouverture de la cage et des perturbations graves et persistantes liées au système digestif (marqueur de stress chez le lapin) comme la constipation (absence de fèces), selles liquides. Les atteintes rétiniennes par un laser n'entraine aucune douleur et hémorragies. Le côté thermique du laser aura pour effet de cautériser les saignements. Le seul impact délétère pouvant être une atteinte de la capacité visuel de l'oeil traité. Si cela était le cas, le stress induit sera alors surveillé selon les mêmes critères que pour les atteintes du cristallin.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par surdose d'anesthésiant sous anesthésie générale.

Remplacement

Ce nombre doit OBLIGATOIREMENT ÊTRE MIS EN ŒUVRE IN VIVO avant de pouvoir utiliser pour la première fois le laser chez l’Humain. Aucun dispositif ex vivo ou in silico ne peut remplacer la complexité de l'organisation de l'oeil et de l'histologie du cristallin.

Réduction

Il a été jugé que le nombre minimum, mais suffisant d’animaux était de 3 lapins par groupe pour l’expérimentation pour prendre en compte les différences interindividuelles pour ce type de traitement laser indolore.

Raffinement

Les animaux arriveront au moins une semaine (7 jours) avant tout manipulation. Tout est mis en œuvre pour LIMITER AU MAXIMUM LE STRESS ET LA DOULEUR DE L’ANIMAL (anesthésie générale pendant le traitement laser et les observations). Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérer grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant/anesthésie). Par ailleurs, les lapins sont hébergés en cage règlementaire pouvant communiquer entre elles ; dans un environnement enrichi (jouet kong et autres jeux). Enfin, l'eau et la nourriture (granules et foin) sont mises à disposition "ad libitum" et de la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et atténuer les bruits environnementaux. Toutes les techniques d'imagerie et la technique laser se font sans contact avec l'oeil et sans docking. Le traitement est indolore. La mise à mort de l'animal est faite sous anesthésie générale

Choix des espèces

D'un point de vue éthique et pratique, les lapins sont les seuls animaux communément utilisés en expérimentation animale et présentant une anatomie oculaire proche de l'homme. Pour que le traitement soit représentatif de ce qu’il puisse être chez l’homme dans le futur, la chambre antérieure de l’œil de l’animal ne doit pas être trop petite. C’est pour cela que nous optons pour des lapins âgés d’environ 3 mois (12 semaines).

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent un régime enrichi en graisses pendant cinq semaines, reçoivent des injections quotidiennes pendant onze jours, un antibiotique dans l'eau puis un gavage de bactéries isolées de patients atteints de la maladie de Crohn, avant d'être tuées par dislocation cervicale pour prélèvement du tube digestif. Le porteur indique attendre une perte de poids et une inflammation intestinale légère à modérée, suivies au moyen d'une grille de souffrance notée sur quinze points. Il juge le recours à la souris "nécessaire" pour étudier l'infection dans un "organisme entier", à partir de résultats obtenus jusque-là in vitro.

Objectifs

La maladie de Crohn est une maladie inflammatoire chronique de l’intestin qui touche plus de 2,5 millions de personnes en Europe. Cette maladie digestive, pour laquelle aucun traitement curatif n’existe à ce jour, altère considérablement la qualité de vie des malades. Des facteurs génétiques, environnementaux et bactériens sont impliqués dans le développement de cette maladie. Notamment, des bactéries particulières sont anormalement retrouvées dans le tube digestif des patients. Les mécanismes menant à l’implantation des bactéries dans l’intestin des patients sont encore méconnus. Cependant, il semblerait que d’autres facteurs soient impliqués dans le développement de cette maladie tels que des facteurs épigénétiques. Aux vues de dérégulations épigénétiques observées chez les patients, nous avons émis l’hypothèse que certains acteurs épigénétiques (HDAC), dérégulées par un régime alimentaire enrichi en graisses, joueraient un rôle dans cette susceptibilité accrue des patients à être colonisés par les bactéries. Ainsi, ce projet a pour but de valider des résultats obtenus dans des modèles de cellules en culture dans un modèle in vivo de souris. Dans ce projet, des souris seront nourries avec un régime enrichi en graisses et infectées avec des bactéries provenant de patients afin de déterminer si ce type de régime dérégule les HDAC et de valider le rôle des HDAC lors de l’infection intestinale par les bactéries. Cette étude permettra également de tester des molécules potentiellement d’intérêt thérapeutique pour traiter les patients atteints de maladie de Crohn.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de confirmer les résultats obtenus in vitro dans des modèles de cellules en culture où il a été observé que les HDAC régulaient l’entrée des bactéries dans les cellules de l’hôte. Il est attendu que les résultats confirment le rôle majeur joué par ces HDAC au cours de l’infection et qu’ils permettent de déterminer si un facteur environnemental tel qu’un régime alimentaire enrichi en graisses peut déréguler ces HDAC. Ce protocole expérimental permettrait également de démontrer un potentiel bénéfice des molécules testées. À plus long terme, l’analyse des différents échantillons recueillis au cours du protocole permettrait de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu lors de l’infection dans un contexte de régime alimentaire enrichi en graisses ce qui pourrait mener à la découverte des nouvelles cibles d’intérêt thérapeutique pour les patients.

Procédures

Les animaux suivront un régime alimentaire enrichi en graisses tout au long du protocole soit 5 semaines. Ils seront également traités par injection intra-péritonéale avec les molécules à tester tous les jours durant 11 jours. Les souris recevront un antibiotique à faible dose via l’eau de boisson durant 2 jours et l ’infection des animaux avec les bactéries isolées de patients se fera par voie orale, via un unique gavage intragastrique (durée contention + gavage estimée < 1 min). Un prélèvement de sang au niveau du sinus rétro-orbital sera également réalisé, une seule fois, sur animaux anesthésiés (durée contention + prélèvement estimée < 2 min).

Impact sur les animaux

À partir des travaux antérieurs menés sur souris infectées par ces bactéries les effets indésirables attendus sont une perte de poids légère dans les jours suivant l’infection (environ 5%) et le développement d’une inflammation intestinale légère à modérée. Les symptômes liés à l’inflammation intestinale sont relativement légers mais une surveillance quotidienne (y compris dimanches et jours fériés) des animaux par un personnel formé sera réalisée dans le but de détecter tout comportement douloureux. La souffrance des animaux sera évaluée à partir d’une grille tenant compte de plusieurs critères comme l’apparence générale, l’expression faciale, le poids, les signes d’inflammation digestive et le comportement (score sur 15 points). En fonction du score individuel et de son évolution, un arbre décisionnel permettra d’adapter la surveillance ou le traitement de l’animal par des antalgiques. Si un animal dépasse le score limite, il sera immédiatement sorti du protocole et euthanasié.

Devenir

À l’issue de la procédure, tous les animaux seront anesthésiés par inhalation à l’isoflurane puis euthanasiés par dislocation cervicale car différentes sections du tube digestif seront prélevées et les bactéries associées aux muqueuses seront dénombrées. De cette manière, les bactéries adhérentes aux muqueuses seront quantifiées précisément et spécifiquement.

Remplacement

Les modèles de cellules en culture in vitro ne permettent de travailler que sur une ou deux lignées cellulaires à la fois. À l’inverse, un modèle de souris in vivo va permettre d’étudier l’interaction entre les bactéries et l’intestin dans un organisme entier, complexe composé du microbiote intestinal et du système immunitaire de l’hôte. Le recours à un modèle murin est donc nécessaire pour notre projet pour étudier l’impact d’un régime alimentaire enrichi en graisses associé à différentes molécules sur la colonisation intestinale par les bactéries et sur l’inflammation intestinale afin de pouvoir conclure pleinement sur le bénéfice des molécules testées pour une potentielle utilisation chez les patients atteints de maladie de Crohn.

Réduction

Le nombre de 7 animaux par lot a été déterminé lors de précédentes études d’infection avec les bactéries. Ce nombre d’animaux devrait permettre d’obtenir des résultats fiables, reproductibles et statistiquement significatifs. Les expériences ont été conçues de manière à ne pas démultiplier les lots témoins. Le nombre d’animaux pour ce projet a été réduit au minimum (140 animaux) sans compromettre les objectifs du projet. Le nombre de bactéries présentes dans les fèces des souris reflètent le nombre de bactéries associées à la paroi intestinale. Ainsi, la quantification des bactéries au cours du temps dans les fèces des animaux réduit le nombre d’animaux à euthanasier à différents temps post-infection pour comptabiliser les bactéries présentes dans l’intestin. Aussi, un maximum de prélèvement sera réalisé sur les animaux lors de l’euthanasie ce qui permet de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Afin d’éviter le surpeuplement qui est une source de stress, les souris de chaque lot seront séparées dans des cages de 530 cm² (3-4 animaux/cage), soit > 80 cm² pour des souris de 25-30 g. Elles auront un accès libre à la nourriture et à l’eau. Les conditions d’hébergement seront : température 20-24°C, hygrométrie 50 ± 10%, cycle 12h/12h, éclairage 350/450 lux. Un enrichissement leur sera proposé sous la forme de maison et tube en polycarbonate teinté rouge afin de diminuer le stress en stimulant l‘activité et en procurant un sentiment de sécurité à l‘animal. Les injections par voie intra-péritonéale, l’infection par voie orale ainsi que le prélèvement de sang seront réalisés par des personnels témoignant de la qualification nécessaire. Lors du prélèvement sanguin via le sinus rétro-orbital, les souris seront anesthésiées afin de réduire stress et douleur potentiellement générés par cet ace. Les animaux peuvent développer une inflammation intestinale légère à modérée lors de ce projet. Les animaux seront donc surveillés quotidiennement (y compris dimanches et jours fériés) par un personnel formé pour évaluer leur souffrance à partir d’une grille tenant compte de plusieurs critères comme l’apparence générale, l’expression faciale, le poids, les signes d’inflammation intestinale ou le comportement (sur 15 points). En fonction du score individuel et de son évolution, un arbre décisionnel permettra d’adapter la surveillance ou le traitement de l’animal par des antalgiques. Si un animal dépasse le score limite, il sera immédiatement sorti du protocole et euthanasié.

Choix des espèces

Le modèle d’étude choisi est la souris. Il s’agit d’un des modèles le plus utilisé et les expériences antérieures pour étudier l’infection intestinale par les AIEC ont été réalisées sur des modèles murins également. Cela permettra ainsi de comparer les résultats obtenus avec de précédentes études. L’étude sera réalisée sur des animaux de 8 à 10 semaines, âge auquel les études antérieures de colonisation par les AIEC sur modèle murin ont été réalisées.

1 350 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau ou dans la glande mammaire, par chirurgie sous anesthésie, puis des injections dans la tumeur, avec une croissance tumorale pouvant durer jusqu'à 75 jours, pour tester une thérapie reprogrammant les cellules cancéreuses. Le porteur décrit une possible perte de poids, une gêne au déplacement et une inflammation cutanée de la tumeur. Les animaux sont tués à l'atteinte des points limites ou pour analyse, les bénéfices pour les patients restant annoncés à moyen terme.

Objectifs

Ce projet vise à étudier l'efficacité antitumorale d'une thérapie innovante, combinée à des anticorps thérapeutiques, chez la souris. La thérapie d'intérêt reprogramme les cellules tumorales afin de les transformer en cellules immunitaires qui vont ainsi réveiller et armer le système immunitaire afin qu'il détruise les cellules tumorales non reprogrammées. Le projet proposé comportera 3 procédures qui serviront à tester l'efficacité antitumorale de la thérapie de reprogrammation en combinaison avec des anticorps thérapeutiques, sur des modèles tumoraux représentatifs d'indication oncologiques avec de forts besoins d'innovation thérapeutique. L’efficacité antitumorale sera étudiée sur le cancer colorectal, le mélanome, le fibrosarcome, le cancer de la vessie, cancer du sein. Les modèles tumoraux de cancer du sein seront implantés dans la glande mammaire des souris, les autres modèles seront implantés en sous-cutané au niveau du flanc des souris.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à moyen terme. Ce projet permettra de développer et de caractériser en phase préclinique une approche thérapeutique anticancéreuse très innovante, sur un large panel d’indications oncologiques. Cette approche thérapeutique permettra au mieux de guérir les patients atteints de ces cancers, au pire de ralentir la progression tumorale. La thérapie étudiée devra encore passer par une phase préclinique règlementaire avant une première administration chez l’homme.

Procédures

- Injection sous cutanée et orthotopique mammaire de cellules tumorales : quelques minutes -implantation par chirurgie et sous anesthésie de tumeurs sous cutanées, une 10aine de minute, administration d’antalgiques au préalable ; traitement si douleur post opératoire 20 minutes maximum - croissance de tumeurs sous cutanée sur le flanc, durée maximale 75 jours, durée moyenne 3 semaines -injection intrapéritonéale de composés thérapeutiques non toxiques, pour un maximum de 4 injections espacées de 7 jours ; quelques minutes - injection intratumorale de composés thérapeutiques à une dose tolérée pour un maximum de 2 injections espacées de 7 jours ; quelques minutes

Impact sur les animaux

1/Nuisances attendues : -Injection sous-cutanée de cellules : douleur à la piqure et l'injection; durée quelques secondes -Suite d’une chirurgie sous-cutanée sous anesthésie et anti-douleurs : douleur au réveil 20 minutes maximum ; gène cutanée à la cicatrisation 48h maximum -croissance d’une tumeur sur le flanc ou dans la glande mammaire : gène cutanée, gène au déplacement ; durée maximum 50 et 75 jours respectivement. -injections intrapéritonéales ou intratumorales : douleur de la piqure ; 5 secondes. 2/Nuisances potentielles : -perte de poids de moins de 20% du poids maximal : 4 jours maximum -inflammation de surface de la tumeur : douleur cutanée, démangeaisons ; maximum 48h

Devenir

Les animaux seront mis à mort soit pour prélèvement et analyse post mortem, soit parce qu'ils ont atteint un point limite tels que définis pour chaque procédure

Remplacement

Les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes lymphoïdes (la rate, les ganglions etc), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). Certaines caractéristiques individuelles seront étudiées in vitro/ex vivo dans le cadre du projet européen (modèles organoïdes, modèles bio-imprimés), l’impact et l’efficacité de la thérapie étudiée en combinaison avec des traitements immuno-stimulants approuvés ne peut être pleinement évaluées que dans un système complet.

Réduction

Les procédures seront faites sur le nombre minimal de souris nécessaires permettant de conclure de façon fiable statistiquement avec le test statistique approprié (comparaison de moyennes et analyse de courbes d’espérance de vie), à savoir 10 souris par groupe thérapeutique, pour un total 8 groupes. Ces 8 groupes thérapeutiques seront testés sur 12 modèles tumoraux représentatifs de cancers à fort besoin thérapeutique. Les tests statistiques utilisés seront un t test non paramétrique de Mann-Whitney, non apparié, bilatéral, pour la comparaison des volumes tumoraux. Et un test de Mantel-Cox pour la courbe d’espérance de vie. Dans notre expérience, les effectifs de 10 souris par groupe permettent de caractériser avec les tests cités des différences significatives supérieures à 25% de gain d’inhibition de croissance tumorale ou de 20% d’espérance de vie. Ces gains sont au minimum de l’intérêt thérapeutique. Tous les modèles tumoraux utilisés auront été préalablement testés in vitro pour leur bonne réponse à la thérapie étudiée. Pour chaque groupe thérapeutique, les tumeurs et les organes lymphoïdes (rate et ganglions) seront analysées post-mortem sur 5 souris indépendantes. Les paramètres étudiés seront les cellules immunitaires présentes dans ces organes, l’analyse statistique se fera par comparaison de moyennes (t test non paramétrique de Mann-Whitney, non apparié, bilatéral). Notre expérience de l’immunophénotypage a montré que ce test permet de mettre en évidence une différence biologiquement significative des populations immunitaires.

Raffinement

Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Toutes les précautions seront prises pour détecter et minimiser la souffrance, la douleur et le stress des animaux (observation quotidienne, pesée des animaux, traitement antalgique si besoin). Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas de perte de poids légère. Pour les modèles implantés dans la glande mammaire, connus pour développer des inflammations cutanées superficielles au niveau de la tumeur, les animaux seront stabulés sur une litière en cellulose moins agressive que la litière en copeaux. Des prélèvements en point final (tumeurs et organes) seront réalisés pour pouvoir obtenir le maximum d’informations des animaux utilisés. Pour les modèles implantés sous la peau par chirurgie, les animaux seront traités avec un antalgique avant la chirurgie qui se fera sous anesthésie.

Choix des espèces

Nous avons besoin d’animaux présentant un système immunitaire compétent, et de modèles tumoraux murins. La souris immunocompétente est un modèle de choix pour ce type d’étude car il existe un large panel de tumeurs murines représentatives de différentes indications oncologiques, ce qui n’est pas le cas chez les autres espèces de rongeurs de laboratoire. Par rapport aux rats, la souris permet également d’utiliser moins de composés pour obtenir une dose/poids. Nous avons choisi des souris âgées de 5 semaines, car la prise tumorale est meilleure sur les individus jeunes, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux à utiliser. Les modèles tumoraux prévus dans ce projet sont utilisés fréquemment sur des souris de cet âge, avec un taux de prise supérieur à 99%.

2 000 rongeurs, 1 000 souris et 1 000 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie gazeuse, ils subissent un prélèvement de sang au sinus rétro-orbital ou à la veine temporale, puis sont mis à mort, pour valider des kits de dosage de marqueurs sanguins jugés peu fiables. Le porteur précise employer des animaux issus de l'élevage des lignées et non utilisés par ailleurs. Il présente ainsi la mise à mort comme un usage d'animaux déjà destinés à être tués.

Objectifs

De très nombreux marqueurs sanguins circulants permettent d'évaluer chez l'homme l'existence de certaines pathologies et d'en suivre leur évolution. On peut citer par exemple la troponine qui est un marqueur d'infarctus du myocarde et permet son diagnostic et son suivi en clinique humaine. De même il existe des protéines ou marqueurs spécifiques de pathologie, rénales, musculaires, d'inflammation, de cancer,....... Certains modèles de rongeurs génétiquement modifiées, dont les lignées sont présentes dans l'animalerie de notre institut, reproduisent ces pathologies humaines et pourraient nous être utiles à la mise en place et la validation de ces marqueurs chez la Souris et/ou le Rat afin de pouvoir les suivre et les identifier lors d'études scientifiques à venir. Des kits de dosage spécifiques de ces espèces sont commercialisés mais nous avons constaté que beaucoup ne sont pas fiables ou pas spécifiques, c'est pourquoi nous voulons les valider avant de proposer les dosages de ces marqueurs. Pour cela nous envisageons de prélever du sang sur des animaux générés durant l'élevage des lignées, juste avant la mise à mort de ces animaux qui ne sont pas utilisés dans des protocoles expérimentaux. La présence de ces marqueurs dans le sang étant souvent labile, il est nécessaire que les animaux soient encore vivants au moment du prélèvement sanguin. Les lignées seront sélectionnées d'après des critères scientifiques afin d'être sûr que les modèles prélevés représentent des animaux susceptibles d'avoir une perturbation de l'un ou l'autre des marqueurs d'intérêt.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de nous permettre de valider des réactifs utilisés dans l'analyse de certains marqueurs sanguins. Ces réactifs sont censés cibler de manière spécifique des marqueurs d'intérêt, comme cela peut être fait lors d'une analyse sanguine humaine. Néanmoins, il apparait que la sensibilité, fiabilitié ou spécificité de ces kits n'est pas toujours garantie, rendant certaines analyses peu fiables. Nous souhaitons ainsi mettre en place une étape de validation afin de garantir que lors de leur utilisation dans un projet d'analyse scientifique, nous pourrons obtenir des informations valides et porteuses d'informations fiables sur lequel pourront s'appuyer les conclusions des chercheurs.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse à l'aide d'une boite à induction puis d'un masque. Ils s'endormiront et nous effectuerons le prélevement sanguin sur les animaux endormis. Pour cela, selon la préférence de l'expérimentateur, nous préleverons le sang à la veine temporale superficielle ou au sinus retro-orbital. Les animaux seront ensuite mis à mort à la fin de la procédure, dans la même anesthésie. La durée de l'anesthésie et du prélèvement sanguin est d'environ 3-4 minutes par animal

Impact sur les animaux

Les animaux subiront le stress de l'endormissement durant l'anesthésie générale. Par la suite, ils resteront endormis durant le prélevement sanguin puis leur mise à mort.

Devenir

Les animaux employés dans cette procédure sont des animaux générés durant l'élevage et le maintien des lignées. Ils ne seront pas employés dans des procédure expérimentales additionnelles et seront mis à mort.

Remplacement

Cette étude a pour but de mettre en place le dosage de marqueurs sanguins chez la Souris ou le Rat en vue d'etudes scientifiques futures et à venir visant à reproduire et étudier des pathologies humaines Etant donné que nous avons à disposition de nombreux modèles génétiquement modifés reproduisant des pathologies humaines ce modèle ne peut être substitué.

Réduction

Les lignées de Souris ou de Rat étant déjà existantes dans l'institut cette étude ne génèrera pas un supplément d'animaux utilisés. Nous utiliserons en effet des animaux générés durant les élevages de ces lignées mais non utilisés pour des procédures expérimentales. Si les fonds génétiques sont similaires, nous essaierons au mieux de rapprocher les prélevements et analyses pour mutualiser les groupes controles et réduire le nombre d'animaux utilisés. Etant donné la variabilité des analyses biochimiques, nous utilisons 10 animaux par condition expérimental soit 40 animaux par marqueur étudié (10 males controles, 10 males mutants, 10 femelles controles, 10 femelles mutantes). A raison de 5 lignées étudiées par années, durant 5 ans, cela représente 1000 animaux au maximum par espèce étudiée, soit un total de 2000 animaux (Souris et Rat). Nous utiliserons des analyses paramétriques de type analyse de variance à deux facteurs suivies d'analyses post-hoc pour pouvoir conclure sur la significativité des résultats obtenus.

Raffinement

Les animaux seront stabulés en groupes avec un enrichissement, accès à la nourriture et à l'eau sans restriction. Ils seront surveillés quotidiennement pour s'assurer de leur bon état général. Une anesthésie générale gazeuse sera effectuée avant le prélèvement sanguin des animaux afin d'empêcher toute souffrance. Les animaux seront ensuite mis à mort sans réveil.

Choix des espèces

Notre institut possède une animalerie de rongeur (Souris et Rat) et nos études portent sur l'étude de ces animaux génétiquement modifiées, c'est pourquoi nous avons choisi ces espèces Par ailleurs la souris représente un modèle de choix pour l'étude de pathologies humaines S'agissant de lignées en élevage dont la mise à mort est décidée par le chercheur en charge des animaux, l’âge va dépendre des projets Certains marqueurs évoluant avec l’âge il peut être intéressant de prélever des animaux d'âges différents. Des marqueurs de vieillissement pourront être évalués sur des animaux âgés dans le cas où cela se présenterait

2 980 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une mutation qui provoque une fibrose de la peau et un phénotype "dommageable" (posture voûtée, pelage hirsute, organes thoraciques plus gros), et subissent biopsies d'oreille, prises de sang et administrations d'un traitement pendant six semaines. Le porteur indique retenir la lignée selon le critère "requis par le client". Les animaux sont tués pour prélèvements, le remplacement étant écarté au motif qu'un "organisme entier" est nécessaire.

Objectifs

Le but de ce projet est de caractériser un modèle de souris atteintes de fibrose de peau et d’évaluer le profil d’élimination, la tolérance et l’efficacité d’un traitement sur ce modèle. Ces souris sont issues d’une mutation spontanée. Bien que le mécanisme ne soit pas clairement établi, cette mutation conduirait à une augmentation de la matrice extracellulaire et une fibrose des tissus concernés. Cette lignée mutante est utilisée en recherche pour étudier les pathologies humaines lourdes liées à la fibrose et ce projet permettra de sélectionner des molécules candidates d’intérêt pour des études cliniques.

Bénéfices attendus

Cette lignée mutante est utilisée en recherche pour étudier les pathologies humaines liées à la fibrose comme le syndrome de Marfan, la sclérodermie, l’emphysème pulmonaire ou la cardiomégalie. Ce sont des pathologies lourdes pouvant être très handicapantes, voire léthales et pour lesquelles aucune thérapie efficace n’existe. C’est pourquoi il est nécessaire de mieux comprendre les mécanismes impliqués et de développer de nouvelles thérapies. Ce projet permettra de sélectionner des molécules candidates d’intérêt pour des études pré-cliniques et cliniques.

Procédures

Prélèvements sur animaux vigiles : une biopsie d’oreille (durée environ 20s), sang (veine saphène ou submandibulaire ; maximum 1/sem pendant 6 semaines maximum; il faut compter environ 3 min pour un prelevement de sang). Un prélèvement terminal sur animaux anesthésiés : sang par voie retro-orbitaire (environ 3 min). Administration sur animaux vigiles : sous cutanée ou intra-péritonéale ou intra-veineuse ou orale pendant 6 semaines maximum (il faut compter environ 1 min par admnistration).

Impact sur les animaux

Les souris mutantes ont un phénotype dommageable et présentent une hyperplasie du tissu conjonctif, du cartilage et des os. En revanche, les tendons sont plus courts en comparaison à des souris contrôles. Aussi, les organes thoraciques (cœur, poumons) sont plus gros, mais les autres organes ne sont pas affectés par la mutation. Les mâles et femelles mutants sont fertiles mais leur performance de reproduction est légèrement inférieure à la normale. Selon la littérature, les animaux mutants sont reconnaissables dès 7 jours par la « rigidité » cutanée et à mesure que les souris vieillissent, les souris développement une posture voutée et un pelage hirsute. Il n’y a cependant à notre connaissance aucune donnée dans la littérature sur une mortalité prématurée des souris mutantes. Ces animaux seront surveillés quotidiennement et une grille d’observation a été établie afin de limiter les effets indésirables sur les animaux.

Devenir

Mise à mort. Des prelevements tissulaires pour analyse seront effectués sur les animaux.

Remplacement

Le but de ce projet est d’évaluer le profil d’élimination, la tolérance et l’efficacité d’une molécule à visée thérapeutique en développement pour une utilisation chez l’Homme. Pour cela un organisme entier est nécessaire. Il n’existe aucune méthode in vitro validée scientifiquement qui offrirait une alternative à l’expérimentation animale pour répondre aux questions adressées dans ce projet.

Réduction

La stratégie expérimentale permet de diminuer le nombre d’animaux utilisés puisque : - seules des molécules candidates optimisées in vitro seront testées sur l’animal - les deux sexes pourront être utilisés, - les souris mutante et contrôles seront issues de la même portée permettant ainsi d’utiliser des tests statistiques plus puissants avec un nombre d’animaux limités. Au cours de l'étape de validation du modèle des tests statistiques adaptés seront appliqués dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés : tests statistiques paramétriques de type Student’s t-test, pour comparer les groupes 2 à 2, ou ANOVA, pour comparer plusieurs groupes.

Raffinement

La stratégie expérimentale permet de réduire la souffrance et l’angoisse des animaux puisque le bien-être des animaux sera évalué quotidiennement par l’observation générale des signes cliniques (week-ends et jours fériés inclus). Les animaux présentant des signes de souffrance seront pesés et suivis quotidiennement selon une fiche d’observation/points limites. Les animaux ayant atteint les points limites seront mis à mort immédiatement.

Choix des espèces

La finalité de ce projet est d’évaluer une thérapie sur un modèle animal présentant une fibrose de peau. La lignée murine Tsk1 correspond au critère requis par notre client (phénotype, croissance rapide, données dans la littérature, ...), c’est pourquoi cette espèce est utilisée dans ce projet. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte pour le maintien de lignée et l’obtention de jeunes souris. Aucun animal n’est gardé au-delà de 10 mois, âge auquel la reproduction est moins efficace (Procédure 1). Dans les études, les animaux sont utilisés entre 5 et 12 semaines d’âge (Procédure 2). L’utilisation de ces souris nous permet de faire un parallèle avec l’Homme et de couvrir une période au cours de laquelle le traitement serait potentiellement utilisé.

2 090 rongeurs, 1 640 souris et 450 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées par de nombreuses voies, jusque dans le duodénum ou la trachée sous anesthésie, pendant jusqu'à 24 semaines, pour tester des molécules de thérapie génique contre des maladies génétiques. Le porteur mentionne des modèles génétiquement modifiés au phénotype "dommageable", les animaux étant tués avant l'apparition des symptômes. Il justifie le recours à deux espèces par les exigences des études réglementaires et qualifie le modèle animal d'"indispensable" pour un développement préclinique.

Objectifs

Notre équipe développe des outils moléculaires de transfert de gène et d’approches antisens dont l’objectif principal est l’identification d’un ou plusieurs candidats susceptibles d’être utilisés dans de futurs essais cliniques. Nos efforts se focalisent sur des pathologies génétiques essentiellement neuromusculaires. Le challenge est d’autant plus grand qu’il s’agit de maladies qui nécessitent un traitement sur corps entier. Ainsi, face à ces contraintes physiopathologiques nous focalisons nos efforts sur des stratégies, des technologies et des outils moléculaires capables de répondre efficacement à ce défi. Dans ce contexte, nous développons une approche innovante de modulation de l’épissage en interférerant avec la machinerie d’épissage des ARN pré-messagers. Il s’agit plus précisément de forcer la machinerie d’épissage à former et « libérer » des ARN messagers exempts de mutations et capables d’être traduits en protéines fonctionnelles. Pour cela nous développons de courtes séquences d’oligonucléotides antisens (AON) chimiquement modifiés qui gardent la capacité de se lier aux ARN par complémentarité de bases. Le deuxième outil est matérialisé sous la forme d’un petit ARN nucléaire, l’U7snRNA, modifié au niveau de sa séquence d’origine pour participer, au même titre que les AONs, à la modulation de l’épissage des ARN mutés. Les outils dérivés de l’U7snRNA sont délivrés par deux types de vecteurs. Les premiers sont des vecteurs dérivés des virus adéno-associés (AAV). Le deuxième type de vecteur que nous développons est matérialisé sous forme de molécule d’ADN nu dérivée du génome des AAV. Le recours aux AAV comme vecteurs de gènes est largement utilisé à travers le monde et des essais cliniques de thérapie génique sont autorisés par les instances règlementaires depuis de nombreuses années.Dans le cadre de cette approche envisagée, il s’agit de trouver la meilleure molécule et la meilleure voie d’administration pour la délivrance de nos outils thérapeutiques dans l’environnement in vivo.

Bénéfices attendus

L’objectif principal de notre projet est d’identifier une ou plusieurs molécules thérapeutiques susceptibles d’être utilisées dans de futurs essais cliniques pour le traitement de maladie génétiques. Les bénéfices attendus de ce projet sont donc de pouvoir sélectionner les molécules candidates présentant le plus fort potentiel thérapeutique ainsi que la voie d'administration la plus appropriée, permettant une amélioration significative chez les modèles animaux etudiés, et à plus long terme chez les patients traités.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections de molécules actives selon différentes voies (intramusculaire, intraveineuse, intra-péritonéale ou sous cutanée) afin d’évaluer les meilleures voies pour la biodistribution. Les injections se dérouleront sous anesthésie générale avec une durée maximum de 30 minutes entre l’anesthesie et le réveil, les injections intra péritonéale ou sous cutanée pourront être plus brèves de l’ordre de 1 à 2 minutes si elles sont réalisées sur animaux vigiles. Aucun animal ne recevra plus d’une injection par jour. En revanche, afin de permettre l’accumulation progressive et compte tenue de la demi-vie des molécules thérapeutiques dans la circulation, les injections systémiques pourront être répétées chaque semaine, sur une durée maximum de 24 semaines. Si nos molécules se révèlent efficace après analyse de la procédure 1, nous testerons des voies d’administration moins invasives chez le patient en vue d’un essai clinique, à savoir une administration orale (intra-stomachal ou intra dudodenum) et une administration pulmonaire (intra- nasale ou intra-tracheal). L’administration intra-duodenum sera réalisée uniquement sur un petit nombre d’animaux pour voir si la molécule passe le duodenum. Cette intervention durera 1h entre l’anesthesie et le réveil de l’animal et ne sera pas répétée. En revanche, pour l’administration intra stomachal, intra nasal et intra tracheal ; afin de permettre l’accumulation progressive et compte tenue de la demi-vie des molécules thérapeutiques dans la circulation, les administrations pourront être répétées 1 à 4 fois par semaine, sur une durée maximum de 12 semaines. Les administrations intra-stomachal et intra-nasale sont brèves, de lors de 1 à 2 minutes par animaux. Pour les administrations intra tracheal elles se dérouleront sous anesthésie générale avec une durée maximum de 30 minutes entre l’anesthesie et le réveil. Les animaux pourront également de façon optionnel être soumis à des prélèvements sanguins. Pour cela, les animaux recevront une anesthésie générale et le sang sera prélevé sur une veine superficielle (veine de la queue, sinus retro-orbital ou sous maxilaire). Un volume sanguin maximum de 10% du volume total sera recueilli et jamais plus de 15% sur une période de 28 jours selon les normes en vigueur. Les animaux pourront de même de facon optionnelle être placés en cage métabolique pendant 24h afin de récolter l’urine.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales de ce projet (anesthésies, administration de molécules, euthanasie) sont simples et peu ou pas douloureuses. Cependant les critères tels que l’activité générale, la prise de nourriture et d’eau, la présence de plaies seront évalués post-adminsitration jusqu’au sacrifice. Les animaux montrant un signe quelconque de détérioration de santé dûe à une potentielle toxicité de nos molécules seront sacrifiés immédiatement. Les autres nuisances qui pourraient être observées concernent surtout les animaux subissant la procédure d’administration intra-duodenum qui pourraient présenter des difficultés d’alimentation du fait du déplacement possible du duodenum lors de l’administation. Leurs états seront donc particulièrement surveillés avec ajout de nourriture en gelée si besoins. Concernant les modèles utilisés, il peut s’agir d’animaux altérés génétiquement classé « dommageable », car les gènes responsables des maladies génétiques étudiées sont invalidés. Ces modèles développent des phénotypes dommageables très légers et tardifs, et les animaux dans ce projet seront sacrifiés avant l’apparition des symptômes. Les points limites sont donc similaires à ceux définis pour des souris sauvages. Cependant en cas de protocole long allant jusqu’à 6 mois dans nos procédures, les animaux seront particulièrement surveillés afin d’être euthanasiés si les symptômes devaient apparaitre prématurément.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de toutes les procédures afin de collecter l’ensemble des tissus d’interet et de valider l’impact du traitement au niveau moléculaire (Analyse ARN, protéine, etc.)

Remplacement

Dans notre respect de la règle des 3R, nos molécules actives font systématiquement l’objet d’une évaluation in vitro afin de ne sélectionner que les meilleurs candidats thérapeutiques et d’éviter ainsi le recours systématique à des méthodes d’évaluation in vivo. Cependant, dans le cas d’un développement préclinique de ces molécules, l’utilisation de modèles animaux s’avère indispensable pour sélectionner les molécules les plus prometteuses d’un point de vue efficacité mais également présentant un profil toxicologique favorable. L’efficacité thérapeutique de nos molécules, seules ou en combinaison, est évaluée grâce à des modèles rongeurs appropriés.

Réduction

Toutes nos molécules sont préalablement testées in vitro afin de déterminer leurs potentiels thérapeutiques et leurs toxicités. Si ces molécules sont efficaces in vitro, et qu’elles ne sont pas toxiques sur cellules nous vérifions tout d’abord chez un petit nombre de rongeurs qu’elles présentent le même potentiel en injection locale (intra-musculaire). Les molécules ayant démontré une efficacité après injection locale en intramusculaire, seront évaluées par injection systémique pour évaluation moléculaire et tissulaire. Si et seulement si nos molécules sont efficaces par injection systémique, nous testerons les autres voies d’administrations (moins invasives pour le patient en vue d’un essai clinique) à savoir l’administration par voie orale ou pulmonaire. Les tests type student, fisher, ANOVA ou Bonferroni/Dunn seront effectués pour chaque lot afin d’obtenir une analyse statistique correcte en utilisant le moins d’animaux possibles suite au plan d’expérience préalablement défini.

Raffinement

LLors de leur arrivée, les rongeurs auront 5 jours d'acclimatation à leur nouvel environnement. Ils seront stabulés sur des portoirs ventilés avec un système d'abreuvement et de la nourriture à volonté. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (jour entre 6h et 18h). Le milieu est enrichi avec du coton compacté pour la nidification et des igloos en polypropylène sont disposés dans leur cage permettant les jeux et le repos des animaux. Une alimentation adaptée et enrichie est donnée à volonté et de l’alimentation en gelée pourra être disposés dans la cage pour des animaux jeunes ou ayant subi une procédure afin de faciliter l’accès. Concernant le phénotype de certains modèles pouvant être utilisés, il est classé « dommageable » car les gènes responsables des maladies génétiques sont invalidés. Cependant, ces modèles développent des phénotypes dommageables légers et tardifs, et les animaux seront sacrifiés avant l’apparition des symptômes. Les points limites sont donc similaires à ceux définis pour des souris sauvages. Cependant ces animaux au phénotype dommageable font tout de même l’objet d’une autorisation à part au sein de notre animalerie pour la procédure d’élevage.Tout au long du protocole, l’état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent afin de réduire tout inconfort ou douleur qui pourraient se développer. Nous avons plusieurs années de pratique de ces procédures et n’avons jamais observé de souffrance liée à sa pratique. Néanmoins, les rongeurs seront surveillés après la procédure pour vérifier leur réveil et le retour à un comportement normal.

Choix des espèces

Nous évaluerons l’efficacité et le profil toxicologique de nos molécules administrées sur modèle rongeurs, celui-ci étant le plus adapté (taille, disponibilité, lignée appropriée aux maladies génétiques étudiées) pour une évaluation thérapeutique pré-clinique. Nous travaillerons sur 2 espèces, à savoir sur les souris et les rats, cette condition de 2 espèces étant exigés dans les études réglementaires (notamment de toxicité chronique) de produits destinés à un traitement pharmaceutique La majorité des animaux utilisés seront des rongeurs d’âges adultes afin d’évaluer l’efficacité, ainsi que le profil toxicologique des molécules sur animaux adultes Cependant, afin d’évaluer l’efficacité d’un traitement précoce ayant pour objectif d’empêcher ou de retarder l’apparition d’un phénotype pathologique, nous évaluerons également les molécules thérapeutiques sur des rongeurs plus jeunes (allant du stade nouveaux-nés à 4 semaines). Enfin, un de nos objectifs consistera à vérifier la possibilité du passage de la barrière placentaire des médicaments, et nous traiterons pour cela des adultes gestantes.

54 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles courent sur un tapis roulant trois fois par semaine pendant six semaines, subissent un test d'endurance final et deux prélèvements de sang, pour évaluer l'effet d'un extrait de microalgue sur la performance sportive. Le porteur reconnaît que la course peut stresser les animaux et prévoit des séances d'habituation. L'objet du projet relève de la nutrition sportive, et les animaux sont tués pour recueillir du matériel biologique.

Objectifs

L'effort d'endurance mobilise de nombreuses ressources, notamment les nutriments issus de l'alimentation. Ces nutriments sont majoritairement utilisés au niveau musculaire afin de produire une contraction et une relaxation optimales, mais également afin que les muscles puissent récupérer correctement après l'effort. Toutefois, les sportifs qui s'entrainent avec une grande fréquence ont besoin d'une plus grande quantité de substrats afin de pouvoir soutenir un effort intense sur une base régulière, nécessaire pour progresser. Ce protocole est destiné à évaluer l'effet d'un extrait de microalgue dans ce contexte de nutrition sportive.

Bénéfices attendus

Les effets potentiels de la supplementation en microalgue seront évalués sur la performance des animaux suite au test d'endurance final. De plus, les modifications métaboliques seront identifiées par des dosages des marqeurs des voies du métabolisme énergétique et musculaire. Des marqueurs inflammatoires et du stress oxydant seront également recherchés.

Procédures

Les souris seront nourries ad libitum pendant 6 semaines avec un régime contrôle ou avec un régime supplémenté avec un extrait de microalgue (1 extrait, 4 doses). Les animaux courront sur un tapis de course adapté pendant ces 6 semaines tous les lundis, mercredis et vendredi pendant 1h. Lors de la dernière course, les souris seront soumises à un test d'endurance afin de mesurer leur performance. 2 prélévements de sang de 100µL sur animal vigile seront réalisés à 6 semaines d'intervalle.

Impact sur les animaux

La course sur tapis roulant peut engendrer un stress chez l'animal. Afin de limiter ce stress, les animaux suivront des séances d'habituation lors des premières séances de course. Lors de ces séances, les souris seront tout d’abord laissées libres d’exploration sur le tapis d’exercice éteint. L’appareil sera ensuite allumé pour que les animaux s’habituent au bruit du moteur puis le tapis roulant sera mis en marche pendant 5 min à la vitesse de 9 m/min, avec une pente de +5 degré.

Devenir

A l'issu de la procédure, tous les animaux mis à mort pour recueil du materiel biologique nécessaire aux analyses.

Remplacement

L'étude des relations entre alimentation et activité physique ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Aucun modèle in vitro n’a la capacité d’intégrer cette complexité ni de mesurer les niveaux d'endurance à l'effort physique.

Réduction

Le nombre d'animaux est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre les groupes. Des études du même type portent sur 8 à 10 animaux, du fait de la forte variabilité entre animaux au niveau de la performance sportive. Nous avons choisi de travailler avec 9 animaux afin que le nombre d'animaux par cage soit homogène (3 souris par cage). Nous chercherons à mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre les groupes à l'aide de tests statistiques.

Raffinement

Les animaux sont hébergés par cage de 3, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique et de matériel de nidification (bandelettes de papier kraft). Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. La course sur tapis roulant peut engendrer un stress chez l'animal. Afin de limiter ce stress, les animaux suivront des séances d'habituation lors des premières séances de course. Lors de ces séances, les souris seront tout d’abord laissées libres d’exploration sur le tapis d’exercice éteint. L’appareil sera ensuite allumé pour que les animaux s’habituent au bruit du moteur puis le tapis roulant sera mis en marche pendant 5 min à la vitesse de 9 m/min, avec une pente de +5 degré. Les animaux seront observés hebdomadairement afin de détecter des comportements agressifs de certains animaux, si tel est le cas l'animal agressif sera isolé de ses congénères dans une cage individuelle. Si un animal est blessé, il sera soigné par badigeonnage de bétadine sur la zone lésée, il sera également isolé le temps de la cicatrisation de ses blessures. Dans tous les cas, les animaux isolés resteront en contact visuel, olfactifs et auditifs avec leurs congénères. Pour chaque procédure, des points limites spécifiques et des points d'arrêt ont été prévus.

Choix des espèces

La souris est un modèle classiquement utilisé dans les études concernant la mobilisation des ressources énergétiques, notamment au cours d’un exercice imposé. Le modèle C57Bl/6J est une souche reconnue pour ce type d'expérimentation. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondant tels que le vieillissement.