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Etude pré-clinique de l’efficacité de la radiothérapie à faible dose associée à l’immunothérapie
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les souris reçoivent sous la peau une greffe de cellules tumorales, puis une ou deux séances d'irradiation à faible dose sur la tumeur et quatre injections dans l'abdomen, sur neuf jours, d'une immunothérapie anti-PD-L1 ou d'anticorps témoins. 800 souris immunocompétentes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tumeurs. Le projet cherche le meilleur schéma d'irradiation à associer à l'immunothérapie, une association qui "pourrait à terme bénéficier aux patients réfractaires à l'immunothérapie" selon le porteur. Parmi les effets indésirables, il ne cite que ceux des injections et de l'irradiation, sans un mot sur la croissance des tumeurs, et annonce un "volume tumoral limite" sans en donner la valeur.
Objectifs
Il y a deux objetifs. 1) Evaluer l'efficacité anti-tumorale de la radiothérapie délivrée à faible dose en combinaison avec une immunothérapie en utilisant un modèle préclinique de lignée tumorale murine greffée chez des souris immunocompétentes. 2) Etudier les mécanismes par lesquels la radiothérapie à faible-dose est capable d'induire une réponse immunitaire anti-tumorale potentialisée par l'immunothérapie et ainsi expliquer l'effet synergique du traitement associant radiothérapie à faible dose et immunothérapie.
Bénéfices attendus
Malgré une amélioration sans précédent du pronostic de nombreux cancers grace à l'immunothérapie, de trop nombreux patients présentent une réponse insuffisante à ces nouvelles thérapies. L'optimisation et la compréhension des traitements combinés associant une radiothérapie à faible dose et une immunothérapie pourrait à terme bénéficier aux patients réfractaires à l'immunothérapie et présentant un cancer à un stade avancé inaccessible à une radiothérapie standard qui serait trop toxique pour les organes et tissus sains adjacents. Dans ce cadre, la mise au point du meilleur schéma de radiothérapie faible dose à utiliser en combinaison à l'immunothérapie, ainsi que la compréhension des mécanismes à l'origine de l'efficacité d'une telle association doivent être recherchés sur modèle animal préclinique avant une transposition au patient.
Procédures
Irradiation sur la tumeur uniquement : 1 à 2 séances d'environ 1 minute chacune. Injections sous-cutanées de cellules tumorales: 1 seule injection, 1 minute. Injections intra-péritonéales d'immunothérapie ou d'IgG contrôle : 1 injection d'une minute tous les 3 jours pendant un total de 9 jours, soit 4 injections au total.
Impact sur les animaux
Ils sont liées aux injections en intrapéritonéales ou sous-cutanées sous anesthésie locale et aux séances d'irradiations localisées. Les séances d'irradiation seront effectuées sur la tumeur uniquement grace à des caches adaptés, le risque de dommages aux tissus et organes sains adjacents est donc très limité. Aucun effet indésirables de ces irradiations localisées n'est donc à prévoir.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir procéder à des analyses de laboratoire sur les tumeurs prélevées.
Remplacement
Le cancer est aujourd’hui la 1ère cause de décès chez l’homme et la 2ème chez la femme en France. Malgré la révolution thérapeutique que constitue l’immunothérapie, seul un nombre limité de patients présente une réponse tumorale significative aux inhibiteurs de checkpoints immunitaires utilisés seuls. Un nombre croissant de données suggère que de faibles doses de radiothérapie délivrées sur la tumeur pourraient augmenter la réponse anti-tumorale induite par l’immunothérapie, le tout avec un excellent profil de tolérance. La compréhension des mécanismes soutenant cette stratégie d’association est source d’espoirs pour de nombreux patients atteints de cancers métastatiques présentant une réponse insuffisante à l’immunothérapie et un pronostic réservé. Le recours à un modèle animal est nécessaire car les interactions entre radiothérapie, immunothérapie, tumeur et système immunitaire de l'hôte font appel à des processus cellulaires et moléculaires complexes impossibles à reproduire de façon fiable sur des modèles alternatifs. De plus, l’étude de l’efficacité de l’association entre radiothérapie à faible dose et immunothérapie sur une tumeur constituée ne peut se vérifier que sur un modèle in-vivo.
Réduction
Nous allons tester plusieurs schémas d’irradiation à faible dose délivrés en 1 ou 2 séances, associés ou non à une immunothérapie anti PD-L1. Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux nécessaire, nous avons réalisé une analyse statistique à priori à l’aide du logiciel GPower, version 3.1. Afin de calculer le nombre d’animaux nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives, nous avons choisi le test ANOVA avec les paramètres suivants : effect size f = 0.25 ; puissance = 0.9 ; risque d’erreur α = 0.05. En considérant un total de 32 lots, nous avons besoin de 25 souris par lot, soit 800 souris au total. 1) Efficacité de la radiothérapie faible-dose délivrée en 1 fraction associée à l’immunothérapie anti PD-L1 : 16 lots, 25 souris/lot soit 400 souris. Dans le détail : 1 lot non-irradié avec IgG contrôle (groupe contrôle), 1 lot non-irradié avec immunothérapie anti PD-L1 (groupe anti PD-L1 seul), 7 lots avec IgG contrôle + des doses croissantes d’irradiation délivrées en une séance (monofractionnée), 7 lots avec anti PD-L1 + des doses croissantes d’irradiation délivrées en une séance (monofractionnée). 2) Efficacité de la radiothérapie faible-dose délivrée en 2 fractions associée à l’immunothérapie anti PD-L1 : 16 lots, 25 souris/lot soit 400 souris au total. Dans le détail : 1 lot non-irradié avec IgG contrôle (groupe contrôle), 1 lot non-irradié avec immunothérapie anti PD-L1 (groupe anti PD-L1 seul), 7 lots avec IgG contrôle + des doses croissantes d’irradiation délivrées en 2 séances (bifractionnée), 7 lots avec anti PD-L1 + des doses croissantes d’irradiation délivrées en 2 séances (bifractionnée). Dans le but d’utiliser le moins d’animaux possible, une analyse statistique a été effectuée a priori. Celle-ci a estimé le nombre de souris nécessaire à 800.
Raffinement
Des stratégies d’expérimentation et d’observation visant à réduire au minimum la souffrance des animaux seront mises en oeuvre. Dans ce cadre, les administrations d’immunothérapies s’effectueront sous anesthésie locale pour réduire le risque de stress et de douleur. Par ailleurs, les souris seront hébergées en groupe, avec nourriture et eau ad libitum, ainsi qu’un environnement enrichi en coton et nids en carton pour respecter leur bien-être. Une surveillance du poids et du volume tumoral sera effectuée régulièrement. Le respect des points limites et d’un volume tumoral limite seront strictement observés.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie, utilisée dans la quasi-totalité des études dans ce domaine. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues, ce qui facilite le transfert en clinique des résultats acquis lors des expérimentations précliniques dans cette espèce. Les animaux seront utilisés entre l’âge de 8 et 10 semaines bien après sevrage, âge à partir duquel les souris peuvent supporter les rayonnements ionisants.
Elaboration d’un système de monitorage multimodal de la moelle épinière en per-opératoire d’une chirurgie rachidienne
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Écartement des muscles du dos, laminectomie possible, c'est-à-dire l'ablation d'une partie de l'arc de la vertèbre, puis trois heures de mesures : chaque cochon passe environ quatre heures sous anesthésie pour qu'une sonde soit posée sur ses vertèbres. 10 cochons d'une quarantaine de kilos vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, pour mettre au point un dispositif de surveillance de la moelle épinière pendant la chirurgie du rachis. Le porteur qualifie pourtant la sonde de "non invasive" et juge les effets indésirables "inexistants, mise à part l'opération chirurgicale en elle-même", puisque chaque cochon est tué à la fin. La mise à mort sans réveil sert, selon lui, à éviter les douleurs post-opératoires et des soins "source de nuisances pour l'animal".
Objectifs
La moelle épinière (ME) représente l’entrée des informations sensorielles et la sortie des commandes motrices des membres et du tronc. Son atteinte par des traumatismes ou par des pathologies de nature inflammatoire ou neurodégénérative entraîne des conséquences sensorielles et motrices majeures qui affectent la qualité et l’espérance de vie des patients. La prise en charge des pathologies de la colonne vertébrale et de la ME nécessitent fréquemment de recourir à des interventions chirurgicales. Dans ce cas, le placement d’implants métalliques au plus proche de la ME, la correction de l’anatomie de la colonne vertébrale ou la chirurgie directe de la ME comportent un risque significatif de complications neurologiques et de paralysie transitoire ou définitive des membres. A ce jour, le monitoring des Potentiels Évoqués (PE) somesthésiques est la seule technique per-opératoire disponible qui permet d’avoir des informations indirectes sur l’état fonctionnel de la ME et donc la stabilité de sa fonction. Cependant, cette méthode ne permet pas toujours d’identifier un dysfonctionnement métabolique précoce, notamment liées à des phénomènes vasculaires, avant que les fonctions neurologiques ne soient affectées. Dans ce contexte, le projet dans lequel s’intègre la présente demande, a pour objet la conception et l’expérimentation d’un nouveau dispositif médical pour le suivi métabolique de la ME en période per-opératoire lors d’une chirurgie rachidienne. Comme spécifié auparavant, le chirurgien ne dispose, à l’heure actuelle, que d’une information indirecte et retardée sur la vitalité de la ME durant l’opération.
Bénéfices attendus
Le développement d’un outil de monitorage per-opératoire de la moelle épinière (ME) renforcera les moyens disponibles pour la communauté médicale et chirurgicale, nécessaire à identifier précisément les zones fonctionnellement à risque durant l’acte opératoire, mais aussi les zones atteintes après une lésion de la ME ou pour suivre leur évolution afin de mesurer l’effet de nouvelles approches thérapeutiques (chirurgicales, pharmacologiques ou de rééducation). A terme, un tel outil permettrait pour le chirurgien de disposer d’une cartographie de la perfusion sanguine de la moelle épinière et donc de définir ou de modifier en per-opératoire la stratégie chirurgicale (zones de « moindre danger »).
Procédures
Les animaux sont soumis à une intervention chirurgicale réalisée en bloc opératoire sur champ stérile sous anesthésie générale et antalgie adaptée pendant toute la durée de la procédure, avec un recueil de données avec une sonde non invasive placée sur les vertèbres. L’ensemble de l’acte chirurgical et des mesures seront réalisés sur une période d’une journée, avec un temps d’anesthésie estimé à 4 heures : l’abord chirurgical est estimé à 1 heure et le recueil des mesures à 3 h sur animal vivant anesthésié. L'animal est mis à mort en fin de procédure, sans réveil d'anesthésie.
Impact sur les animaux
Etant donné la mise à mort de l’animal à la fin de l’expérimentation, les nuisances ou effets indésirables attendus sont inexistants, mise à part l’opération chirurgicale en elle-même qui sera encadrée par un protocole d’anesthésie et d’antalgie adapté permettant, comme chez l’homme, de réaliser un acte chirurgical dans des conditions adaptées et non délétères pour l’animal. Une possible réaction allergique à l’une des substances chimiques (anesthésie, stimulation) est toutefois toujours envisageable et conduire à une euthanasie anticipée.
Devenir
Tous les animaux inclus dans l'étude sont mis à mort sans réveil, directement à la fin de la procédure pour éviter les douleurs post-opératoires. De plus, l’abord chirurgical avec l’écartement des muscles vertébraux et la réalisation d’une potentielle laminectomie nécessiteraient des soins post-opératoires conséquents et source de nuisances pour l’animal.
Remplacement
Le principe de 3R est au cœur de ce projet de recherche. L’un des objectifs d’une thèse réalisée par un doctorant du laboratoire, préalable à ce travail, est de proposer aux concepteurs de dispositifs médicaux des outils pour aider à la réduction du nombre d’expérimentations, grâce au prototypage virtuel. Pour le moment, le remplacement est malheureusement encore une perspective lointaine. En effet, aucun protocole in-vitro ou ex-vivo ne permet de reproduire fidèlement les conditions rencontrées au bloc opératoire, en particulier concernant la nature des tissus vivants et des flux sanguins. De plus, le bruit physiologique et l’ensemble de signaux parasites de l’environnement sont à considérer, sans oublier l’effet que peut avoir l’emploi des substances pharmacologiques, etc. Une première phase de test in-vitro sur banc d’essai est en cours et ramène des informations incomplètes, bien que précieuses. Des tests sur animaux sont donc inéluctables, afin notamment de calibrer nos modèles. En effet, différents biais (dans les propriétés optiques, notamment) sont présents dans ces modèles par rapport à la réalité de tests sur animaux (coagulation du sang, changement des propriétés des os suite à son retrait post-mortem, etc.). Sans expérimentation in-vivo, la validation du prototype de la sonde ne pourra être réalisée de manière certaine et son application chez l’homme ne pourra pas être entreprise. Le cochon représente le modèle animal le plus proche de l’homme en termes d’anatomie vertébrale et concernant son système cardiovasculaire.
Réduction
Nous avons d’ores-et-déjà réalisé une validation expérimentale informatique de la sonde à l’aide de logiciels/programmes développés au sein de notre laboratoire. De plus, nous avons réalisé des mesures préliminaires sur banc in-vitro. Enfin, des outils statistiques ont permis de s’assurer de la validation statistique de notre recueil futur. La validation du prototype est donc réalisée à ce jour 1) de manière informatique expérimentale et 2) in-vitro sur banc d’essai et 3) de manière statistique permettant d’envisager des résultats concluants in-vivo. Afin de limiter le nombre d’animaux, nous envisageons seulement deux (2) expérimentations pour la première phase de test du prototype de la sonde. Cela nous permettra, en premier lieu, de valider l’usage de la sonde en condition in-vivo par l’acquisition de valeurs de bases de monitorage de la ME, puis de s’assurer de la reproductibilité des mesures en comparant les jeux de données et de la viabilité en conditions in-vivo du prototype. Dans un deuxième temps, si la première phase in-vivo est concluante, une nouvelle série d’expérimentations sur un lot de de huit (8) animaux sera effectuée, sur une période de trois (3) ans, pour répondre notamment au caractère statistique et envisager le passage à l’homme.
Raffinement
Avant expérimentation, les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour assurer les meilleures conditions de confort adaptées à leur espèce, dans des boxes avec des copeaux de bois au sol et enrichis avec des jouets en plastique et quelques friandises (e.g. morceaux de pommes). Durant toutes les expérimentations, les animaux seront maintenus sous anesthésie générale, avec administration d’antalgiques puissants (fentanyl IV), tout au long de la procédure et mis à mort sans réveil. Pendant toute la procédure, les principaux paramètres vitaux (température corporelle, fréquence cardiaque, pression télé-expiratoire en oxygène, etc.) seront monitorés par un appareillage conventionnel. La survenue de marqueurs d'une dégradation majeure de la condition de l'animal amènera à une euthanasie anticipée. Celle-ci n’est pas attendue compte tenu de la surveillance de l’animal par un vétérinaire anesthésiste étant en capacité de réagir si besoin.
Choix des espèces
L’objectif de cette expérimentation chez le gros animal est de confirmer le principe de fonctionnement et la pertinence du dispositif développé pour une utilisation future sur l’humain. Certaines mesures avec le dispositif sont fortement contraintes par l’épaisseur des os et les dimensions des vertèbres. Elles doivent donc absolument être confrontées à des conditions proches de celles observées chez l'humain, que l’on retrouve chez le porc spécifiquement vis-à-vis de l’anatomie de ses vertèbres. De plus, le porc possède un système cardio-vasculaire proche de l’humain, avec une cartographie des artères responsables de l’alimentation sanguine de la ME analogue. Nous visons de jeunes animaux, adultes, d'une quarantaine de kilogrammes. L'objectif est d'avoir une ME anatomiquement proche de celle de l'homme. L'âge effectif des animaux est sans importance.
Allergie alimentaire
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Toutes tuées à l'issue lors d'un prélèvement terminal, 2 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour provoquer chez elles une allergie alimentaire. Elles sont d'abord sensibilisées à un allergène, "généralement" une fois par semaine pendant plusieurs semaines, puis exposées de nouveau à cet allergène, avec des prises de sang à la veine sous-mandibulaire, sans anesthésie. Le porteur ne nomme ni les allergènes ni la voie d'administration, et décrit "une souffrance plus ou moins intense" dans des procédures "classées de légère à sévère", alors que la totalité de l'effectif est déclarée au niveau sévère. Il revendique un double usage, tester des médicaments contre l'allergie et évaluer l'allergénicité de "nouvelles préparations alimentaires", et affirme que l'effet des médicaments testés sur la réponse allergique des rongeurs est "prédictif de leur efficacité en clinique".
Objectifs
L’allergie alimentaire constitue une préoccupation importante en allergologie du fait de l’augmentation de son incidence au cours des dernières décennies. Les manifestations provoquées par une allergie alimentaire sont nombreuses et surviennent en général quelques secondes à quelques heures après avoir ingéré l'aliment responsable. Elles peuvent provoquer des manifestations modérées et exceptionnellement provoquer des manifestations sévères telles que l’œdème de Quincke ou le choc anaphylactique. La meilleure des solutions pour éviter une allergie alimentaire consiste à supprimer tout contact avec l’allergène. Cette éviction est relativement facile à mettre en œuvre lorsque le produit est peu utilisé dans l'alimentation quotidienne, mais plus difficile quand l'aliment est présent dans de nombreuses préparations, notamment industrielles. A ce jour, aucune thérapie n’a réellement montré son efficacité dans le domaine de l’allergie à l’arachide, contrairement à d’autres types d’allergie, excepté l’administration immédiate d’épinéphrine ou la totale éviction de l’aliment allergisant. Le développement de modèles murins précliniques à des allergènes cliniquement pertinents est donc prometteur pour évaluer non seulement de potentiels traitements pharmacologiques mais également pour tester de nouvelles préparations alimentaires.
Bénéfices attendus
Une allergie alimentaire est une réaction d'hypersensibilité immédiate qui se déroule en deux étapes : une phase de sensibilisation (premier contact de l'organisme avec l'allergène) et une phase de déclenchement (deuxième contact avec le même allergène). L'objectif est double: - mimer l'allergie et rechercher à diminuer la réponse allergique à l'aide d'agents pharmacologiques - évaluer l’allergénicité de certains aliments/formulations Après sensibilisation pendant plusieurs semaines, les souris subissent un test de provocation avec l’allergène sensibilisant. Les médiateurs de la réaction allergique précoce et tardive sont alors quantifiés. La majorité des signes cliniques observés chez l’homme sont mis en évidence chez la souris : bronchoconstriction, production locale de cytokines impliquées dans la réaction allergique,…
Procédures
Lors de la première phase, les animaux seront sensibilisés (généralement une administration par semaine) puis seront challengés avec l'allergène. Au cours de l'étude, les animaux resteront hébergés en groupe. A différents temps définis par le protocole d'étude, des prélèvements de sang seront réalisés au niveau de la veine sub-mandibulaire chez l'animal vigile. En fin d’expérience, tous les prélèvements nécessaires (histologie, prélèvement sang etc…) sont réalisés de façon à pouvoir effectuer l’ensemble des analyses nécessaires sur les mêmes lots. Cela permet de réduire significativement le nombre d’études, d’éviter d’avoir à dupliquer des expériences ou d’inclure des animaux satellites pour la vérification de paramètres complémentaires. Pour les besoins des études, les animaux peuvent être euthanasiés pour le prélèvement des organes cibles d'intérêt (cerveau, rein, …).
Impact sur les animaux
Lors de l'évaluation de l’allergénicité de certains aliments, il est attendu de voir la potentielle apparition de signes cliniques plus ou moins marqués. L’anticipation de ces effets sert à écarter des aliments pouvant provoquer de sévères réactions. Quand on cherche à moduler la réponse allergique à l'aide d'agents pharmacologiques, il est possible d'établir la balance « bénéfice/risque » pour permettre un bon emploi des médicaments de demain. Les expérimentations animales occupent aujourd’hui une place centrale dans les démonstrations. Ces études ont pour objectif de renseigner les effets secondaires ou l’efficacité des substances testées, les doses ayant induit ces effets et la vraisemblance biologique d’un effet suspecté chez l’homme. Selon la durée et la fréquence de ces événements, ces procédures engendrent une souffrance plus ou moins intense et sont donc classées de légère à sévère. Un effectif minimum de 10 souris est inclus dans les expériences pour mettre en évidence un effet suffisamment robuste. Il est donc difficile de diminuer l'effectif en fonction de la sévérité de la procédure.
Devenir
Pour les 2 procédures décrites dans ce projet, tous les animaux sont soumis à un prélèvement terminal et sont donc euthanasiés.
Remplacement
Les tests/modèles que nous souhaitons développer et valider dans ce projet ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur la réaction allergique.
Réduction
Dans le contexte de l'évaluation de composés potentiellement allergisants, la stratégie expérimentale consiste à comparer, les groupes recevant l'allergène à un groupe contrôle non-sensibilisé, l'objectif étant de réduire la réaction allergique induite par l'allergisant. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet ou plusieurs agents en comparaison par rapport à un groupe contrôle non sensibilisé. Cherchant à réverser/diminuer la réaction allergique, nous pouvons observer une variabilité inter-individuelle de réponse pouvant être liée à l’agent allergisant utilisé et à la substance d’essai évaluée. Compte-tenu de la variabilité de réponse connue d'un individu à une autre, 10 souris minimum sont nécessaires pour disposer de la puissance statistique suffisante et nécessaire pour comparer les différents groupes expérimentaux.
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites permettant d'euthanasier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs et suivis par le vétérinaire.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur la réponse allergique des rongeurs est prédictif de leur efficacité en clinique. Principalement rongeurs sevrés, âge variant entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques, à la bibliographie scientifique.
Mise au point et caractérisation de greffes de cellules tumorales dans l’hypophyse de souris pour la mise en place de nouveaux modèles d’études précliniques
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie de trente minutes sous anesthésie pour l'injection de cellules tumorales dans l'hypophyse, puis des prélèvements sanguins hebdomadaires et un prélèvement terminal. Le porteur indique que les tumeurs peuvent, comme chez l'humain, provoquer une compression intracrânienne, des maux de tête et une pression sur les nerfs optiques altérant la vision, mais estime que le suivi hormonal évitera ces stades avancés. Il affirme ne pas pouvoir remplacer le modèle murin par des approches in vitro et présente cette greffe intra-hypophysaire comme plus représentative que la greffe sous-cutanée.
Objectifs
Les tumeurs hypophysaires humaines ont une incidence élevée (1 personne/1500). Ces tumeurs bien que bénignes provoquent des maux de tête, des troubles visuels et peuvent être invasives dans certains cas. Elles répondent mal aux traitements thérapeutiques, il est donc indispensable de trouver de nouvelles molécules pouvant limiter leur développement. Malgré leur fréquence importante chez l’homme, il existe peu d’outils d’étude pour caractériser le comportement de ces tumeurs, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et tester de nouveaux traitements cliniques. Leur étude est donc tributaire de modèles précliniques qui soient représentatifs des tumeurs hypophysaires humaines. Bien que le nombre de lignées tumorales soit limité et la mise en culture de cellules dérivées de tumeur soit délicate, la greffe de ces différents modèles sous la peau des souris constitue actuellement la seule possibilité de modèle préclinique pour mettre au point et valider de nouveaux traitements thérapeutiques. Les greffes sous-cutanées sont toutefois peu représentatives du contexte intracrânien dans lequel se développent et évoluent ces lésions tumorales chez l’Homme. Notre projet vise donc à tester la faisabilité et à développer un modèle expérimental de greffe de cellules tumorales dans l’hypophyse de souris pour disposer de modèles précliniques relevant qui permettront : i) d’étudier le comportement et la biologie de différentes lignées et cellules tumorales hypophysaires dans leur environnement naturel de développement et ii) de valider de nouveaux modèles précliniques pour évaluer l’effet de drogues thérapeutiques qui sont actuellement uniquement testées in vitro. La mise en place et la validation de ces nouveaux modèles de greffes intra-hypophysaires seront réalisées par le biais d’une micro-injection automatisée dans l’hypophyse de souris sur des animaux profondément endormis. Nous avons identifié les coordonnées d’injection dans l’hypophyse sur une cohortes d’animaux de réforme déjà morts. Notre projet visera à confirmer que ces coordonnées sont adaptées et ne varient pas si elles sont utilisées pour des injections sur animaux anesthésiés. Nous testerons ensuite l’efficacité de prise de greffe des 5 lignées tumorales hypophysaires de rongeurs disponible mais également de 20 suspensions cellulaires issues de tumeurs humaines issues de 2 sous types tumoraux. Les tumeurs seront collectées pour étude et mises en culture pour établir de nouveaux outils cellulaires
Bénéfices attendus
Notre projet vise à développer de nouveaux modèles précliniques pour l’étude biologique et le développement d’outils thérapeutiques dédiés aux atteintes tumorales de la glande hypophysaire. Il devrait permettre de mieux comprendre la complexité de ces tumeurs particulièrement fréquentes dans la population (1 cas / 1500) et mieux saisir l’impact de leur niche environnementale naturelle (i.e. l’hypophyse antérieure) sur leur comportement et leur évolution. Notre projet devrait également permettre d’engendrer de nouvelles lignées tumorales humaines qui font actuellement défaut dans le champ de recherche et ainsi limiter à long terme l’usage de modèles animaux.
Procédures
Lors de l’injection des cellules tumorales dans leur hypophyse, les animaux subiront une chirurgie de 30 minutes maximum sous anesthésie générale et sous analgésie. Cette acte n’aura lieu qu’une fois. Un prélèvement de sang sera ensuite réalisé sur ces animaux chaque semaine afin d’identifier toute augmentation d’hormone qui pourrait suggérer un développement tumoral. Une variation trop importante (supérieur à 35% ) des concentrations circulantes d’hormones mesurées avant la greffe conduirait alors à un arrêt immédiat de l’expérimentation. Un prélèvement terminal de sang sera réalisé à la fin de chaque procédure, il sera cependant réalisé sous anesthésie profonde avant leur mise à mort finale.
Impact sur les animaux
Un acte chirurgical sera réalisé sous anesthésie pour injecter les cellules dans l’hypophyse. La greffe de cellules tumorales dans l’hypophyse entrainera le développement de lésions tumorales intracrânienne. Ces lésions pourront comme chez l’homme entrainer une compression intracrânienne, conduisant à des maux de têtes et une pression sur les nerfs optiques altérant la vision. Grâce au suivi des hormones produites par ces tumeurs, les souris ne devraient toutefois jamais atteindre ces stades tumoraux avancés qui sont fréquemment retrouvés chez l’homme et sont déclencheurs d’une chirurgie. Après injection, un prélèvement sanguin de 50 à 100uL sera également réalisé chaque semaine par une ponction à la veine caudale sous contention chez les animaux greffés afin d’assurer le suivi de la progression tumorale par un dosage hormonal. L’utilisation d’un ciment biologique pour colmater le site d’injection ne devrait pas entrainer de gêne.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procedures experiemntales réalisées. Nous procéderons à un prélèvement sanguin final qui servira à réaliser des dosages d’hormones et de molécules secrétées par les lésions cancéreuses. Nous procéderons également à de nombreuses analyses sur les tumeurs collectées post-mortem, Des analyses histologiques et moléculaires complémentaires permettront d’exploiter au mieux nos résultats. Les tumeurs collectées derivé de patients seront également mise en culture pour générer de nouveaux outils cellulaires qui nous permettront de travailler in vitro et limiter ainsi nos besoins d’expérimentation sur l’animal.
Remplacement
Les modèles de greffes tumorales dans les tissus où se développent naturellement les tumeurs greffées représentent actuellement les modèles précliniques les plus convaincants, car ils permettent d’étudier le comportement des cellules tumorales (pousse tumorale, remodelage du microenvironnement, réponse à certains traitements, …) dans leur environnement cellulaire natif. En raison de la nature complexe de la recherche proposée, qui vise à évaluer la prise de greffe et l’impact de l’environnement hypophysaire sain sur la progression tumorale de cellules injectées, nous ne pouvons malheureusement pas remplacer l’utilisation de modèles murins par des outils cellulaires ou des approches in vitro.
Réduction
Afin de nous conformer à la règle de réduction, le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre le taux de succès de nos greffes et l’obtention d’un nombre suffisant de tumeurs dont nous pourrions étudier les caractéristiques moléculaires. Afin de limiter l’utilisation d’animaux, nous avons au préalable mis au point toute notre procédure d’injections sur des animaux morts de réforme. Dans le cadre des travaux proposés, 9 souris par sexe devraient nous permettre d’aboutir à l’obtention de 7 tumeurs dont les traits moléculaires pourront être étudiés et comparés entre eux. Nous ne réaliserons pas de répétition expérimentale ni de test statistique, notre procédure se limitant à la mise au point d’un nouveau modèle préclinique. La greffe de 400 souris au maximum sur 5 ans nous permettra de confirmer la faisabilité et la reproductibilité de nos modèles de greffes de lignées cellulaires et étudier la prise éventuelle de plusieurs greffes humaines parmi les injections des cellules issues des 20 tumeurs humaines qui seront utilisées.
Raffinement
Nous mettrons en place une surveillance adaptée et individuelle des animaux afin d’assurer que les animaux expérimentaux ne subissent aucune souffrance inutile. Ce suivi individuel permettra d’identifier l’apparition de signes évocateurs de mal-être ou de souffrance (prostration, comportement erratique, altération des constantes hormonales, …). L’identification de ces signes entrainerait alors une fin d’expérimentation immédiate et une mise à mort des animaux concernés. Le suivi individuel des animaux permettra également de mieux saisir : i) la reproductibilité des greffes réalisées et ii) d’évaluer le nombre d’animaux statistiquement nécessaires qui devront être étudiés en cas de test de molécules thérapeutiques à venir. Les analyses post-mortem que nous réaliserons sur le matériel biologique collecté nous permettrons de valider l’intérêt de ce modèle en comparaison des greffes sous-cutanées et de dériver d’éventuels nouveaux modèles cellulaires de lignées tumorales humaines qui font actuellement défaut dans le champ de recherche.
Choix des espèces
Le modèle de souris Rag2KO, possède un système immunitaire appauvri. Il s’agit d’un modèle indispensable pour greffer du tissu humain ou des lignées rongeurs de fonds génétiques mixtes afin qu'il n'y ait pas de rejet du greffon. Le modèle Rag2KO est de plus un modèle réceptif aux lignées choisies et aux tumeurs humaines hypophysaires que nous avons déjà pu greffer avec succès en sous-cutané. Nous y avons mis au point les coordonnées stéréotaxiques pour cibler l’hypophyse. Il est donc idéal pour les greffes dans l’hypophyse que nous souhaitons faire et il nous permettra également l’étude du microenvironnement et de l’interaction entre la tumeur et son environnement. Les protocoles d’injection seront réalisés sur des souris âgées de 12 à 16 semaines. Ce sont à ces âges que nous avons validé nos 70% d’efficacité d’injection avec les coordonnées définies.
Etudes de tolérance à de nouvelles molécules avant études d’efficacité.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
1 200 souris saines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des composés par injection ou gavage, jusqu'à dix-huit administrations sur six semaines, afin de déterminer la dose maximale tolérée avant de futures études d'efficacité. Le porteur précise que les dommages attendus tiennent à une toxicité que les tests in vitro n'auraient pas détectée et que les animaux atteignant un point limite seront tués. Il affirme qu'il n'est pas possible d'étudier la tolérance d'un composé sans animaux, les approches in vitro et in silico ne tenant pas compte de l'"organisme entier".
Objectifs
Notre laboratoire travaille avec des laboratoires qui développent des composés à visée thérapeutique. Ces laboratoires nous sollicitent ensuite afin de réaliser par imagerie In Vivo des études d’efficacité sur des modèles animaux de pathologie ; classiquement il s’agit de modèles de cancer. Avant de pouvoir réaliser ces études d’efficacité, il est nécessaire d'évaluer la dose maximale tolérée qui pourra être utilisée. Les expériences menées dans ce projet sont donc des études préliminaires de tolérance menées chez l'animal sain. L’objectif est également de cibler au mieux les doses à utiliser afin de limiter le nombre de lots expérimentaux dans les projets futurs d'efficacité menés sur l'animal porteur d'une pathologie. Avant de recevoir les composés et d’envisager l’administration à des souris, le client aura réalisé une analyse de la littérature afin de vérifier si des études ont déjà été faites sur des composés de même classe et qu’ils ne possèdent pas de toxicité avérée. Le client aura également réalisé des tests in vitro pour déterminer la dose efficace 50% du composé. A partir de cette dose, la dose efficace équivalente chez la souris est déterminée par des calculs prenant en compte différents facteurs tel que le volume sanguin. C’est à partir de cette dose théorique que les doses à tester sont déterminées. Notre laboratoire n’a pas la capacité de tester des marqueurs biochimiques ou des marqueurs de tolérabilité et/ou l’obtenir des données de pharmacocinétiques. Ces analyses nécessiteraient en outre l’utilisation d’un grand nombre de souris supplémentaires. De plus, ce projet ne s’inscrit pas dans le cadre des études réglementaires de toxicité. Le déroulement des études prévues permettra de limiter au maximum du nombre de souris. Si la dose administrée est tolérée, une dose supérieure pourra être administrée au lot de souris suivant et ainsi de suite jusqu'à l'observation d'effets indésirables. (perte de poids, diarrhée, urine foncée, altération du comportement…). Dans ce cas, la dose supérieure ne sera pas administrée et si l'un des points limites est atteint, l'animal sera mis à mort. La dose sélectionnée sera la dose précédant celle qui a induit des effets indésirables.
Bénéfices attendus
Les expériences menées dans cette saisine ne s'inscrivent pas dans les études réglementaires de toxicité mais en tant qu'études préliminaires menées chez l'animal sain, avant des essais menés sur l'animal porteur d'une pathologie. Ce projet permet de cibler les doses qui seront utilisées pour de futures études d'efficacités évalué par imagerie. Lors de ces études, le nombre de lots utilisés sera donc réduit.
Procédures
- Pour le projet" Détermination de la dose maximale tolérée pour une injection unique": Pour chaque souris, administration du composé par voie IP (100µL/10g souris) ou par voie iv (sous 100-150µL) ou par gavage (200µL) en fonction du poids de l'animal. Les administrations seront réalisées sur animal vigile par du personnel qualifié. Nous pourrons être amenés à prélever du sang sur animal vigile au niveau sous mandibulaire: Sur chaque souris, au maximum 3 prélèvements de 100µl avec au minimum 1 semaine d'intervalle entre chaque prélèvement. - Pour le projet" Détermination de la dose maximale tolérée pour des injections répétées": Pour chaque souris,administration du composé par voie IP (100µL/10g souris) ou par voie iv (sous 100-150µL) ou par gavage (200µL) en fonction du poids de l'animal. Les administrations seront réalisées sur animal vigile par du personnel qualifié. La dose sera administrée à plusieurs occasions, avec un maximum de 18 administrations sur 6 semaines maximum et au maximum 1 administration 1 fois/jour. Nous pourrons être amenés à prélever du sang sur animal vigile au niveau sous mandibulaire. Sur chaque souris,au maximum 7 prélèvements de 100µL avec au minimum 1 semaine d'intervalle entre chaque prélèvement.
Impact sur les animaux
Les dommages attendus sont liés à une toxicité in vivo qui n'aurait pas pu être détectée in vitro. Une observation méticuleuse de l'état général des animaux tout au long des expériences ainsi que la définition de points limites pertinents permettra d'anticiper toute douleur ou souffrance chez les animaux.
Devenir
Toutes les souris seront mise à mort à l'issue de chaque procédure car elles ne peuvent pas être réutilisées pour la procédure suivante ou une autre étude.
Remplacement
Dans le cadre du développement de futurs médicaments, il est nécessaire d'évaluer leur toxicité potentielle en fonction de la dose administrée. Pour ce type de développements, les études sont classiquement réalisées in vitro, in silico ou avec des modèles animaux. Les études in vitro et in silico ne tiennent pas compte de la complexité d'un organisme entier (variété des tissus, communications inter organes etc...) et il n'est pas possible à l'heure actuelle d'étudier la tolérance d'un composé sans utiliser d'animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux sera réduit au minimum permettant d'obtenir des résultats pertinents soit 2 souris par doses. Il n’y a pas de test statistiques prévu. Les doses testées seront administrées de la dose la plus faible à la dose la plus forte, en décalé dans le temps sur des souris différentes (24h minimum ou plus entre 2 doses, en fonction de la cinétique d'élimination du composé, estimée par le client) ainsi si des effets indésirables sont observés sur 1 des 2 souris d’une dose, la dose inférieure sera retenue comme étant la dose maximale tolérée et les autres souris ne seront pas injectées avec les doses supérieures.
Raffinement
Les souris sont hébergées dans des cages en portoir ventilé avec un accès à l’eau et la nourriture ad libitum, un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation et des objets d'enrichissement du milieu (celluron). Les animaux sont observés scrupuleusement quotidiennement afin de respecter leur bien-être et de déceler tout signes d’apparition d’effets indésirables (perte de poids, diarrhée, urine foncée, altération du comportement, douleurs…). Nous avons mis en place une grille de scoring et des points limites.
Choix des espèces
Ces études sont menées chez la souris saine car elles se situent en amont d'essais qui seront ensuite réalisés sur des animaux modèles de pathologie expérimentale.(modèles animaux de cancer par implantation orthotopique ou sous-cutanée de cellules tumorales par exemple) La taille de l'animal est compatible avec l'administration de composés parfois difficiles à produire par les chimistes en grande quantité et la petite taille de la souris (nécessitant donc peu de composés) en fait un animal souvent utilisé pour les premières études réalisées in vivo. C'est chez la souris qu'il existe le plus grand nombre de modèles de pathologies. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, entre 6 et 12 semaines en fonction de la demande du chercheur. En effet, par la suite, les études d’efficacité se feront sur des modèles pathologiques de souris. Les modèles cancéreux sont induits sur des souris de 6 semaines minimum. Les traitements peuvent commencer immédiatement et jusqu’à 6 semaines après l’induction d'où le choix de l'utilisation d'animaux agés de 6 à 12 semaines.
Evaluation ex vivo des effets pharmacologiques de molécules sur un modèle de stress induit par une contention forcée sur souris.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections jusqu'à deux fois par jour pendant un à trois mois, puis subissent une fois une contention forcée d'une à trois heures destinée à provoquer le stress que le projet cherche à étudier, avant d'être décapitées ou perfusées sous anesthésie. Le porteur indique que les souris génétiquement modifiées ne peuvent pas échapper à leur phénotype dommageable et que la mise à mort peut entraîner un stress pré-mortem important. Le projet répond à des demandes de laboratoires clients pour évaluer, avant les essais réglementaires, des molécules liées au stress.
Objectifs
Les grands groupes pharmaceutiques et les sociétés biotechnologiques souhaitent avoir de plus en plus tôt (phases de Recherche et Développement) des informations pharmacologiques fonctionnelles sur leurs molécules en développement pour traiter des maladies du système nerveux central ou pour identifier des molécules anti-stress. Pour une meilleure appréhension (ou prédictibilité) d’éventuels effets secondaires, les agences réglementaires exigent une connaissance complète des cibles et des mécanismes d’action associés à ces nouvelles molécules qui sont soumises à une demande d’autorisation de mise sur le marché. En phase de Recherche et Développement (avant les phases précliniques réglementaires), il n’est pas possible de tester les effets des molécules sur de grande quantité d’animaux, à la fois pour des questions de quantité disponible des molécules (quelques milligrammes le plus souvent) et pour des questions éthiques (aucune idée sur les effets éventuels qui pourraient être observés). A l’importance de mise au point de nouvelle molécule, il faut ajouter le développement de modèle rongeur génétiquement modifié (GM). Ces modèles permettent de mimer des pathologies humaines, leur utilisation est alors un avantage certain pour l’évaluation de l’efficacité de molécule d’intérêt. Il faut pour cela que ceux-ci soit électrophysiologiquement caractérisés. L'utilisation de tranches et/ou de cellules isolées de système nerveux central (SNC) de rongeurs permet une étude sur l'activité du composé dans le SNC et une information sur ses mécanismes d’action dans le modèle rongeur GM. Pour se faire, nos laboratoires utilisent deux types de technique le Multi-Electrode Array (MEA) = enregistrements extracellulaires multipoints avec « array » d’électrodes (circuit imprimé) et le Patch-clamp = un enregistrement à l'échelle du neurone. Le projet vise à déterminer, ex vivo, les effets pharmacologiques et/ou toxiques de nouvelles entités chimiques en développement préclinique afin de permettre à nos clients d’évaluer les propriétés de leur(s) molécule(s) - et/ou les propriétés d’une famille de molécule dans les mécanismes de stress induit par une contention forcée. Le cas échéant, ils pourront ainsi déterminer si une molécule à des propriétés suffisamment pertinentes pour entrer ou non en développement préclinique réglementaire.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de mieux caractériser, évaluer et comprendre les effets de futurs candidats médicaments pour traiter les pathologies du système nerveux central liées au stress. Nos techniques mises en œuvre dans ce projet, pour l’évaluation ex vivo des effets pharmacologiques fonctionnels et/ou toxiques sur des explants de tissus vivants, exposés de façon chronique ou de façon aiguë, constitue la meilleure approche car elle permet: - de limiter le nombre d’animaux à tester par l’utilisation de tissus (mesures multipoints sur le même tissu séparé en petits échantillons), - de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de disponibilité dans le système nerveux central et dans la circulation sanguine. Ce projet permet ainsi d’affiner la sélection et l’orientation du développement de futurs médicaments avant de lancer les premières étapes précliniques coûteuses de leur mise sur le marché.
Procédures
Les animaux vigiles seront injectés deux fois par jour, au maximum, pour assurer une exposition in vivo de la molécule à tester. Le protocole est en moyenne d’un mois mais peut durer jusqu’à trois mois. Les contentions répétées nécessaires à ces injections répétées génèrent du stress. Ces animaux traités au préalable peuvent subir ces injections soit par voie orale, soit cutanée, soit intrapéritonéale ou soit intramusculaire. Si les animaux sont génétiquement modifiés, ils ne peuvent pas par définition échapper à leur phénotype dommageable. Nous travaillerons uniquement sur des animaux asymptomatiques. Nos critères de surveillance seront ceux associés aux animaux symptomatiques. Ils seront, pour les groupes subissant le stress, exposés, une seule fois entre une et trois heures maximum, à une contention qui a pour but de générer du stress que nous cherchons à étudier. Tous les animaux seront mis à mort par deux techniques, en fonction de leur âge, par décapitation rapide ou par perfusion intracardiaque sous anesthésie gazeuse juste après l’induction de ce stress.
Impact sur les animaux
Notre procédure amène des effets indésirables: *-la manipulation régulière d’un animal, générer du stress. *-l’injection régulière, provoquer des effets indésirables au site d’injection. ; *-la nature des animaux génétiquement modifiés, créer des douleurs auxquelles les animaux ne peuvent s’échapper ; *-*- Ce projet a pour but de déclencher du stress par une contention forcée de une à trois heures, nous permettant l’étude des mécanismes du stress ; *- La mise à mort par perfusion intracardiaque sous anesthésie gazeuse et la décapitation rapide peuvent amener un stress pre-mortem important.
Devenir
A l’issue de la procédure, tous les animaux seront mis à mort car nous utiliserons les organes pour nos mesures.
Remplacement
Nos évaluations ou caractérisations nécessitent de pouvoir réaliser des observations sur des réseaux neuronaux natifs et connectés, « donc les plus physiologiques possibles ». Il n’est pas envisageable de réaliser sur l’Homme les tests que nous proposons. Nous devrons, en effet, tester des molécules avec des effets potentiellement inconnus, en les administrant à un organisme vivant. De plus, nous utilisons des tissus fraichement prélevés, car il n’est pas possible, in silico, de reproduire la complexité de ces connexions et/ou la particularité d’un neurone spécialisé.
Réduction
Notre capacité à utiliser un même animal pour plusieurs mesures et plusieurs conditions d’exposition diminue le besoin en nombre d’animaux et nous permet de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et des problèmes de pharmacocinétique. Grâce à notre expérience sur les projets antérieurs, nous avons déterminé que 6 animaux contrôles et 6 animaux d’intérêt nous permettent de valider 24-30 neurones ou 18-30 tranches. Compte tenu des variations inter-individus de réponses à l’inflammation dans ce projet, nous devons augmenter à 10 animaux maximum par groupe. Après la première étape, nous pourrons évaluer la significativité statistique. Si celle-ci est présente, l’étape suivante pourra donc être menée en poursuivant l’étape par quatre conditions différentes maximum. Si elle est absente, l’étude sera suspendue
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe sociaux (4 souris adultes/cage). Ils bénéficieront d’enrichissement adapté, deux types différents par cage (système permettant la création de nid soit tunnel ou soit pièce de bois à ronger par exemple). Cet enrichissement est validé par le fournisseur ou le partenaire. Les animaux utilisés seront habitués aux différentes contentions utiles pour les voies d’administration des composés à tester. Nous diminuerons les futurs stress dus à ces manipulations. Ces administrations seront réalisées par du personnel compétent et formé en respectant les recommandations vétérinaires. Les solutions injectées seront contrôlées pour s’assurer de leur innocuité. Les animaux seront surveillés deux fois par jour et pesés. Les animaux génétiquement modifiés auront une semaine d’acclimatation et un mois d’hébergement maximum avant d’entrer dans le projet. Il se fera en groupes sociaux de 4 animaux en mélangeant les génotypes pour assurer la meilleure expression de phénotypes normaux. Chaque lignée modifiée aura une documentation de suivi spécifique répertoriant les symptômes possibles. Les animaux seront asymptomatiques. Les points limites seront tout de même adaptés aux symptômes possibles et nous adapterons notre surveillance. Toute perte de poids en deçà de la limite préétablie entrainera une sortie du test et des soins en accord avec le responsable de projet et le vétérinaire. Grâce à notre expérience et nos connaissances scientifiques sur des tests que nous maitrisons, nous avons pu établir un nombre d’animaux par condition d’étude soit 10 animaux contrôles et 10 animaux d’intérêt, nous permettant d’obtenir une bonne significativité, réduisant considérablement le besoin en animaux.
Choix des espèces
La grande quantité d’informations scientifiques disponible sur le fonctionnement du système nerveux central des rongeurs, ajoutée à la maîtrise de leur élevage, de leur génétique, de leur relative petite taille et au développement de technique d’enregistrements électrophysiologiques sur explants vivants font de cette espèce un modèle de choix pour l’évaluation pharmacologique de molécules. Ponctuellement, nous utilisons d’autres lignées de cette espèce, après discussion de la pertinence du modèle espèce-lignée-lignée génétiquement modifiée-protocole avec notre client. Toute demande de caractérisation de lignée modifiée fera l’objet d’une analyse bibliographique et circonstanciée en amont. L’impact du phénotype devra être décrit. Nous ne travaillerons qu’avec des animaux asymptomatiques. Toutefois, les symptômes ayant des impacts possibles sur le bien-être de l’animal, cela entrainera la mise en place de conditions d’hébergement spécifiques et une validation des points limites modifiés pour pallier des symptômes qui ne devraient pas apparaitre dans ce projet. L’âge des animaux testés est déterminé en fonction du type de test et d’une analyse bibliographique. Nous travaillerons avec des animaux adultes ou âgés en fonction des cibles fonctionnelles à observer et de l’évolution de la pathologie considérée liée au stress. Les choix de l’espèce, de la lignée et de l’âge sont validés en collaboration avec le client. En effet, l’expression phénotypique de la pathologie et/ou d’un déficit et/ou d’une lésion est souvent déterminante pour le choix de l’âge d’utilisation des animaux.
Tests de polyculture en circuit fermé pour valider une méthode in silico de combinaisons d’espèces piscicoles
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Tests réglementaires
795 poissons de six espèces vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, sédatés à répétition pour le suivi de croissance et anesthésiés pour des prélèvements sanguins. Le porteur indique que 186 d'entre eux seront tués pour évaluer leur stress et leur statut immunitaire, les 609 restants devant être réhabilités dans la mesure du possible. L'objectif affiché est de valider un modèle informatique de combinaisons d'espèces pour la pisciculture, présenté comme un outil visant à réduire le recours aux animaux. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'autre alternative que des données expérimentales pour valider ce modèle.
Objectifs
Ce projet est dans la continuité d'un précédent travail expérimental. L'objectif est de valider une méthode in silico en vue d'établir des combinaisons d'espèces de poissons pouvant être élevés ensemble.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à valider expérimentalement une méthode in silico, c’est-à-dire un modèle définissant des combinaisons d’espèces piscicoles compatibles (voire complémentaires) dans l'exploitation de ressources en système d'élevage. Le travail de modélisation vise clairement à diminuer le recours à des animaux avec des approches de type essai-erreur. Toutefois, pour valider le modèle, il n’existe pas d’autre alternative que le recours à des données expérimentales. A terme, ce modèle doit être un outil d’aide à la décision pour les pisciculteurs voulant développer la polyculture de poissons, que ce soit en circuit fermé hors sol ou en étang. Le projet prévoit par ailleurs l'analyse de différents paramètres qui permettront de développer plusieurs descripteurs de bien-être animal, spécifiques aux poissons et si possible, moins invasifs. L’agrégation de ces descripteurs permettrait ensuite de construire un indicateur du bien-être du poisson en élevage, intégrateur, incluant les dimensions à la fois zootechniques, physiologiques et comportementales.
Procédures
Les animaux seront soumis à des manipulations pour le suivi de croissance et seront à ce titre sédatés. Cela concerne tous les poissons (N = 795). Ce suivi sera réalisé à J0 et tous les 20 jours jusqu'à J60. Pour les prélèvements de sang, les poissons seront anesthésiés (à J60). Cela concerne 93 poissons pour la série 1 (30 carpes, 30 tanches et 33 black-bass) et 93 autres poissons pour la série 2 (33 perches, 30 tilapias et 30 clarias). Les poissons seront anesthésiés pour réaliser ces prélèvements.
Impact sur les animaux
Le projet est construit de façon à minimiser les nuisances et les effets indésirables sur les poissons, quelle que soit l'espèce. Toutefois le projet prévoit l'application de sédation et d'anesthésie des poissons, impliquant par là-même une manipulation et une émersion temporaire des poissons. Précisons cependant que nous plaçons les poissons dans des conditions expérimentales proches de celles en élevage, mis à part la densité, qui est relativement faible dans nos unités expérimentales comparativement à ce qui peut être pratiqué en élevage. Les conditions expérimentales sont établies de façon à satisfaire au mieux les exigences comportementales et physiologiques des différentes espèces de poissons.
Devenir
Procédure 1 : Evaluation de l'état de stress et du statut immunitaire : 186 poissons concernés par cette procédure, avec dans le détail 30 carpes, 30 tanches et 33 black-bass pour la série 1 et à 33 perches, 30 tilapias et 30 clarias pour la série 2. Ils seront mis à mort. Procédure 2 : Suivi de croissance et enregistrement du comportement. Cela concerne 795 poissons, à savoir dans le détail, 130 carpes, 65 tanches et 265 black-bass, soit un total de 460 poissons pour la série 1 ainsi que 140 perches, 130 tilapias et 65 clarias, soit un total de 335 poissons pour la série 2. Sur ces 795 poissons, 186 seront mis à mort (cf. procédure 1). Les poissons restants, soit 609 en l'absence de mortalité durant les deux séries de tests, seront dans la mesure du possible réhabilités (placement dans des structures d'hébergement ou d'élevage).
Remplacement
Le remplacement n'est pas envisageable dans le cadre du présent projet. En effet, rappelons que notre objectif est de produire un outil (modèle prédictif) visant à réduire (ou dans le meilleur des cas, à s'affranchir) de l'expérimentation animale. Pour développer cet outil, nous utilisons des données de la littérature scientifique pour construire le modèle, mais nous avons aussi besoin d'un jeu de données externes pour valider celui-ci. Aussi est-ce la nécessité de disposer de données externes qui nous amènent à envisager ce projet expérimental.
Réduction
Le projet prévoit d'utiliser un nombre suffisant mais réduit de poissons : de 10 à 35 poissons / aquarium selon les modatlités avec prélèvement de 3 individus par espèce et par aquarium pour les prélèvements sanguins, de cerveaux et d’écailles. Les mêmes individus seront utilisés pour les prélèvements de ces trois matrices. Le nombre total de poissons (795) nous permet d’avoir une robustesse suffisante d’un point de vue statistique. Les espèces sont grégaires au stade de vie juvénile (comme c'est le cas ici) et c'est la raison pour laquelle il est prévu une biomasse initiale de 1 kg/aquarium. Cette valeur intègre la volonté de réduction du nombre de poissons, les exigences biologiques des espèces utilisées dans le projet et la capacité de traitement de l'eau des aquariums durant les deux mois d’expérimentations de chaque série.
Raffinement
Le stress des poissons est limité autant que possible durant toutes les étapes du projet en les plaçant toujours dans une eau de bonne qualité (suivi régulier des paramètres et corrections si nécessaire), en évitant le bruit et les gestes brusques et en appliquant de façon progressive tout changement lumineux (application d'une aube et d'un crépuscule). Pour les suivis de croissance, les poissons doivent être sortis de l'eau ; aussi pour cette étape, nous prenons soin de leur appliquer une légère sédation, avec respect d'un jeûn la veille du contrôle de croissance, sur la base d'un protocole visé par le vétérinaire référent.
Choix des espèces
Black-bass (Micropterus salmoides), tanche (Tinca tinca) et carpe commune (Cyprinus carpio) sont les trois espèces à mobiliser pour la première expérimentation. Perce commune (Perca fluviatilis), Tilapia (Oreochromis mossambicus) et Clarias (Clarias gariepinus) sont les autres espèces pour la seconde expérimentaion. Ces deux groupes d'espèces ont été choisis pour produire des données permettant de valider expérimentalement la méthode prospective in silico (prédiction d'indices de compatibilité et de complémentarité d'espèces de poissons en polyculture). Ces 2 x3 espèces ont été retenues en particulier car elles ont les mêmes exigences quant aux caractéristiques du milieu d'élevage (paramètres physico-chimiques) mais des réponses physiologiques (vitesse de croissance) et comportementales (occupation de la colonne d'eau, prise alimentaire) différentes. Ces expérimentations doivent produire un set de réponses utile pour valider la méthode in silico. Tous les poissons utilisés dans ce projet seront au stade juvénile.
TL EVOTEC IMMUNO Mise au point de solutions thérapeutiques modulant le système immunitaire dans les domaines de l’inflammation de l’immuno-oncologie et de la vaccination
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Rats : 700
Lapins : 500
55 000 animaux non-humains vont être utilisés, en majorité des souris avec 700 rats et 500 lapins, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent des composés-tests, des prélèvements sanguins répétés et des immunisations, certaines souris étant irradiées puis greffées de cellules immunitaires humaines, pour sélectionner des candidats médicaments destinés aux dossiers réglementaires. Le porteur indique que les hébergements longs, les doses mal tolérées et l'injection de cellules humaines peuvent provoquer perte de poids et difficultés de déplacement. Il affirme qu'aucun modèle in silico ou in vitro ne reproduit la complexité du système immunitaire.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux composés modulant le développement et la fonction du système immunitaire dans différents modèles de pathologies sur le rongeur. Les informations générées seront indispensables pour permettre la progression du médicament au travers des futures étapes de développement et inclus l’identification des doses minimales produisant une efficacité, détermination de la pharmacocinétique et pharmacodynamie essentielle pour mettre en place les schémas de traitement appropriés et enfin les études d’efficacités. Ces données pré-cliniques sont un préalable aux essais cliniques et à l’enregistrement de molécules candidates et figureront dans les différents dossiers réglementaires.
Bénéfices attendus
Sélectionner de nouvelles entités thérapeutiques innovantes pour des pathologies dont les besoins médicaux et la prise en charge de patients sont non satisfaits aujourd'hui.
Procédures
Administration unique ou répétée (plusieurs fois par jour sans dépasser 3 fois) de composés-tests à des doses pharmacologiquement actives. Prélèvements de sang sériés sur un même animal sans dépasser 7.5% du volume total du sang sur une semaine. Administration d'un antigène afin d'immuniser un animal sous anesthésie. Irradiation non létale de souris hautement immunodéfiscientes afin d'éliminer les cellules immunitaires murines avant de greffer des cellules immunitaires humaines.
Impact sur les animaux
Ces modèles sont de longue durée (1 à 40 semaines) pour se mettre en place. Cela signifie un impact négatif relatif à un hébergement de longues durées en groupe sociaux sur le bien-être des animaux bien que tous les moyens disponibles sont utilisés pour minimiser cet aspect. Les effets indésirables peuvent provenir de niveaux de doses administrées mal tolérées pour obtenir un effet pharmacologique ou d’un effet adverse de l’injection de cellules humaines dans un environnement murin. Les signes en seraient alors une perte de poids, des difficultés à se déplacer. Des administrations de composés à des doses sub-toxiques durant plusieurs jours, des prélèvements de sang sériés pour évaluer l'exposition à un composé peuvent nuire au confort des animaux, peut générer du stress.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour réaliser des prélèvements de sang terminaux ou des collectes d'organes pour mesurer certains paramètres ou la concentration des composés-test adminsitrés. Les animaux dits "contrôle" sont mis à mort également pour des prélèvements de sangs ou d'organes afin de disposer d'échantillons contrôles au niveau des analyses faites ultérieurement.
Remplacement
A notre connaissance il n’existe pas de modèles in silico ou in vitro qui reproduisent l’extrême complexité du rôle du système immunitaire dans le développement des réponses immunitaires anti-tumorales et l’activation du système immunitaire à des fins vaccinales. Les actions du système immunitaire impliquent de nombreux tissus et organes avec des mécanismes sous-jacent encore largement inexpliqués. Le modèle animal est également nécessaire pour recueillir des données pertinentes sur les mécanismes d’action du système immunitaire suite à l’administration d’un composé afin de développer des solutions thérapeutiques innovantes.
Réduction
Les composés passeront des filtres pour réduire le nombre des études in vivo et la quantité d’animaux utilisés dans ce projet. Ces filtres comprennent des tests in vitro et des études pharmacocinétiques chez le rongeur. Seuls les produits à forts potentiels seront testés dans les études d’efficacité in vivo. Les modèles animaux utilisés suivront les protocoles décrits dans la littérature. Nous confirmerons la taille des groupes qui permettrait de détecter un effet statistiquement significatif pour une différence entre les gropes controles et traités de 40% en considérant une puissance de 80% et un risque alpha de 5%.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des locaux conformes aux standards règlementaires. Les procédures générant douleur, inconfort ou stress se feront sous anesthésie. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Des consignes spécifiques seront mises en place pour définir les procédures à suivre en cas de complications. Les animaux affectés recevront des soins adaptés, par ou sous autorité du vétérinaire ou seront euthanasiés
Choix des espèces
Le modèle animal utilisé est sélectionné en fonction des antigènes évalués, du type de réponse immune analysé et des données de la littérature ou des connaissances scientifiques. Plusieurs critères entrent en ligne de compte pour le choix de l’espèce, voire de la souche : • Espèce développant une maladie identique à celle touchant l’homme (par exemple, la rage) (Souris) • Espèce sensible à l’infection (par exemple l’Herpès Simplex) (Souris, lapin) • Espèce développant une réponse immunitaire similaire à l’homme (par exemple CMV) (Souris, Rat) • Type d’antigènes (protéines, polysaccharides, germes atténués…) ou d’adjuvants D’autres aspects techniques sont aussi à prendre en compte : taille des animaux (voie ou volume des administrations, volume de prélèvement), disponibilité des outils immunologiques adaptés à l’espèce (cytokines, marqueurs cellulaires…). Les souris mutantes ou transgéniques constituent une opportunité unique pour étudier les mécanismes d’actions et les voies associées à la réponse immunitaire. Dans la plupart des procédures, les rongeurs et les lapins sont tous utilisés après sevrage au stade adulte pour que leur système immunitaire soit mature. Pour des demandes particulières, des animaux âgés peuvent être utilisés pour étudier les phénomènes d’immunosénescence et l’évaluation de candidats vaccins pour les personnes âgées. De même, pour l’évaluation de candidats vaccins pédiatriques des modèles d’animaux juvéniles peuvent être utilisés (souriceaux, ratons ; etc…).
Etude des paramètres biologiques en fonction des stratégies nutritionnelles chez la vache laitière
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
150 vaches laitières vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis gardées vivantes pour poursuivre leur lactation. Elles font l'objet de prélèvements sanguins, urinaires et fécaux, réalisés en majorité par méthode naturelle et avec peu de contention, pour évaluer des stratégies nutritionnelles. Le porteur mentionne des risques de bagarres, de glissades et de boiteries lors des déplacements, et un recours au sondage urinaire ou à l'exploration rectale en cas d'échec de la méthode naturelle. Il justifie la démarche par des enjeux financiers, écologiques et de bien-être des animaux non-humains, et affirme qu'aucune méthode in vitro ne remplace ces prélèvements.
Objectifs
L’intérêt scientifique de ce projet est d’évaluer les besoins nutritionnels des vaches laitières, ainsi que d’étudier l’intérêt de nouveaux additifs ou matières premières dans leur alimentation. Avant de généraliser un programme alimentaire à un grand nombre d’élevages, il est nécessaire d’évaluer précisément ses impacts sur le bien-être et les performances des animaux. Les enjeux sont non seulement financiers (coût de formulation, performances des vaches laitières), mais aussi écologiques (émissions de gaz à effet de serre), et indirectement sociétaux puisque l’alimentation participe au bien-être des animaux. Au cours de ce projet, les mesures sont principalement d’ordre zootechnique : consommation d’aliments, production laitière, évolution du poids et suivi sanitaire. Cependant afin de mieux comprendre les besoins des vaches laitières, des prélèvements sanguins, urinaires et fécaux peuvent être réalisés pour évaluer l’impact de la nutrition sur plusieurs métabolismes (reproduction, santé, immunité, efficacité du métabolisme protéique,…). L’objectif de ce projet est d’évaluer les besoins nutritionnels des vaches laitières, ainsi que d’étudier l’intérêt de nouveaux additifs ou matières premières dans leur alimentation. Ce projet est mis au point par des scientifiques et validé par la direction du site.
Bénéfices attendus
Ces essais s’inscrivent dans la cadre de la recherche agricole, car les effets recherchés ciblent des problématiques d’élevage : amélioration de la valorisation ailmentaire des animaux, solutions nutritionnelles pour amléiorer et préserver le bien-être des animaux, solutions nutritionnelles visant à réduire l'impact environnementales des élevages bonvins lait. Afin d’apprécier l’effet des aliments testés, il est nécessaire d’élever les vaches laitières dans des conditions représentatives des conditions d’élevage.
Procédures
Pour ce projet trois procédures classe légère peuvent être réalisées : •Prélèvements sanguins: le volume prélevé est très faible pour les vaches (
Impact sur les animaux
Les effets indésirables ou nuisances attendues sont décrits dans les points limites. On peut mentionner les nuisances suivantes : bagarres/glissades lors des déplacements pouvant provoquer des boiteries, perte de sang/hémorragie au moment du prélèvement de sang (n'est jamais arrivé). Les prélèvements sanguins sont réalisés au niveau de la veine caudale. Les prélèvements urinaires et fécaux pourront être majoritairement réalisés par méthode naturelle non invasive. Si cette dernière échoue, les prélèvements urinaires sont réalisés par sondage urinaire et les prélèvements fécaux par exploration rectale, par contrôle d’une personne qualifiée. Les prélèvements sont réalisés par le personnel de l’établissement ayant reçu la formation expérimentale de niveau 2 : applicateur de procédures expérimentales. Par ailleurs, en plus de cette formation, le personnel maîtrise ces actes d’élevages grâce à leur formation initiale et à leur formation continue apportée par notre vétérinaire-conseil. Pour les 3 procédures, il n’y a pas ou très peu de contention des animaux, et seules 3 tentatives peuvent être réalisées. Durant les prélèvements, en présence de signes cliniques notables, les prélèvements sont arrêtés, le protocole de soins est appliqué et l’animal peut être sorti de l’essai et placé en zone de repos. Le bâtiment des vaches laitières est découpée en 4 zones de vies pouvant accueillir maximum 30 vaches. Chacune de ces zones de vie est dotée d’une zone de repos permettant d’y loger les vaches malades ou affaiblies, ou celles ayant besoin d’un suivi de reproduction particulier par exemple (surveillance après vêlage, IA, etc.). Les vaches connaissent bien cette zone et y sont habituées. Chaque zone de repos est équipée d’une zone de couchage libre (pas de logettes) confortable (matelas + sciure)..
Devenir
Tous les animaux utilisés dans ces procédures sont gardés en vie et poursuivent leur lactation comme en élevage classique.
Remplacement
Les méthodes in-vitro actuelles ne sont aujourd'hui pas suffisantes pour caractériser les interactions complexes entre les métabolismes, les variabilités individuelles ou encore l’environnement. C’est pourquoi il n’existent pas de méthodes alternatives aux trois procédures décrites dans ce projet (prélèvements sanguins, urinaire et fécaux).
Réduction
A la fin de chaque essai, les vaches laitières continuent leur cycle d’élevage et de production classique. Ainsi les animaux peuvent participer à plusieurs essais nutritionnels faisant parti de ce projet de recherche. Aussi, le nombre de vache par essai est étudié pour limiter le nombre d’animaux tout en permettant une puissance statistique suffisante.
Raffinement
Les conditions de contention sont identiques à celles utilisées pour l’élevage, voir meilleures. Les animaux sont élevés en groupe dans des aires dotées de zones de couchages adaptées avec matelas souples, présence de brosse automatique, aucune compétition pour l’accès à l’eau et à l’alimentation. Les prises de sang sont des actes reconnus d’élevage et sont réalisées par un personnel qualifié et préalablement formé à la contention et manipulation des animaux, ainsi qu’aux prélèvements selon une procédure interne. Les animaux sont déplacées en groupe de 12 au moins dans des zones de contention jouxtant leur zone de vie, donc dans leur environnement familier dans le but de limiter leur stress. Cette zone de contention est inspirée d’une salle de traite par l’arrière, c’est-à-dire que les animaux sont alignés et contenues par l'avant, ce qui permet une sortie plus rapide. Les opérateurs se situent derrière les animaux. Cette zone de contention est également utilisée pour d’autre manipulation d’élevage (parage, suivi reproduction), les animaux ne l’associent pas seulement aux mesures expérimentales. Si au bout de trois tentatives, le prélèvement de sang échoue, le prélèvement est abandonné sans remplacement de l’animal. Cependant, 100% des prélèvements réussissent à minima dès la seconde tentative et la grande majorité dès la première. Cas de plusieurs prélèvements (bouses + sang + urine) à réaliser sur un même animal : Les prélèvements sont réalisés «en une seule fois » afin de ne pas déplacer plusieurs fois les animaux limitant ainsi le stress lié au déplacement. On profite aussi de la mise en zone de contention des animaux pour récolter les bouses faites pendant le déplacement des animaux. On débute par la prise de sang, en même temps un opérateur se charge de récolter les bouses faites naturellement ainsi que l’urine. On termine lorsqu’il y a besoin par les prélèvements par exploration rectale et sondage urinaire. Des points limites sont également définis à la fois pendant la réalisation du prélèvements mais aussi dans les jours qui suivent le prélèvement afin de s'assurer du bon état de santé des animaux prélevés.
Choix des espèces
Il s’agit de l’espèce cible. Les vaches étudiées seront en phase de lactation, afin de produire du lait, donc adulte, puisqu’il s’agit de la phase cible.
Etude de la fonction lièe au microtubule de WDR47 dans le développement cortical
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 60 femelles gestantes subissent une laparotomie et l'électroporation de chaque embryon in utero par un capillaire de verre, et leurs souriceaux reçoivent des injections cérébrales et sous-cutanées avant d'être tués, certains par décapitation, pour étudier le rôle d'un gène dans le développement du cortex. Le porteur indique que la plaie abdominale peut s'infecter, entraînant l'euthanasie de la mère. Il affirme que la complexité de l'environnement cortical rend l'étude impossible in vitro.
Objectifs
Notre recherche est orientée vers l’étude de la physiopathologie des maladies neuro-développementales d’origine génétique. Un grand nombre de gènes y ont été reliés. Notre objectif est de comprendre les rôles de ces gènes dans les cellules du système nerveux central et les mécanismes physiopathologiques impliqués dans ces maladies. Nous avons identifié des mutations chez plusieurs patients (7 familles) avec des troubles du neurodéveloppement. Tous ont des anomalies de développement du corps calleux, jonction entre hémisphères droit et gauche, formée par les axones des neurones corticaux callosaux. Nous avons fait une étude fonctionnelle chez une souris qui porte une mutation qui nous permet d'invalider le gène étudié. Lorsque les neurones de cette souris n'ont pas ce gène (ni la protéine), leur développement n'est pas modifié, mais ils ont des difficulté à former des jonctions avec les neurones de l'autre hémisphère du cerveau. La partie du cerveau touchée s'appelle le corps calleux. La protéine que nous étudions étant impliquée dans la régulation de la dynamique du réseau de microtubules, nous voulons tester si son rôle sur les microtubules est déterminant pour la survie des neurones callosaux. Nous proposons ici de réaliser des expériences de sauvetage qui consistent à injecter un agent stabilisateur des microtubules, Epothilone B, disponible sur le marché. Les étapes majeures de la formation du corps calleux étant l’initiation (P2) et la phase terminale (P4) et l’invasion (P8) par les axones du cortex contralatéral et le branchement des axones à P21, nous prévoyons 4 stades d’étude.
Bénéfices attendus
Notre étude permettra de comprendre la fonction d’une protéine impliquée dans le neurodéveloppement et les mécanismes par lesquelles la déplétion de cette protéine conduit à des troubles du neurodéveloppement. Ce projet aura des retombées directes pour le patient. En effet, si les résultats sont ceux atendus, c’est-à-dire le sauvetage du phénotpe de neurodégénérescence par l’Epothilone B, ceci va ouvrir des perpectives de traitement pour les patients portant une mutation dans le gène étudié mais aussi toutes autres maladies lièes à des perturbations du réseau de microtubules.
Procédures
Les 60 femelles gestantes vont subir une chirurgie abdominale (laparotomie) et leur utérus va être exposé et transpercé par un capillaire en verre très fin à plusieurs reprises (une fois pour chaque embryon, durée 1 à 10 sec). Cette chirugie dure moins de 45 min. Elles seront par la suite placées dans des cages isolées avec leur portée jusquà la mise à mort des souriceaux. Les souriceaux vont subir une injection de 1 à 10 sec dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin au stade embryonnaire (E15.5). A leur naissance ils seront injectés en sous cutané avec une solution saline contenant ou non la molécule à tester une fois à P0 pour ceux étudiés à P2 et P4, une fois à P0 et une fois à P7 ceux étudiés à P8, une fois à P0, une fois à P7 et enfin une à P14 ceux étudiés à P21 . Chaque injection sous cutanée dure 1 à 5 sec. Les souriceaux étudiés à P2, P4 et P8 seront mis à mort par décapitation, ceux étudiés à P21 recevront une injetion intra-péritonéale d’anesthésique (5 sec) puis seront perfusés au PBS puis PFA sous anesthésie profonde
Impact sur les animaux
Les femelles gestantes vont subir une chirurgie abdominale (laparotomie) et leur utérus va être exposé et transpercé par un capillaire en verre très fin à plusieurs reprises (une fois pour chaque embryon, durée 1 à 10 sec).Elles seront par la suite placées dans des cages isolées. La plaie abdominale est susceptible de s'infecter, elle sera surveillée et la souris euthanasiée en cas d'infection. Les souriceaux vont subir une injectionde 1 à 10 sec dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin au stade embryonnaire (E15.5). A leur naissance ils seront injectés en sous cutané avec une solution saline contenant ou non la molécule à tester une fois à P0 pour ceux étudiés à P2 et P4, une fois à P0 et une fois à P7 ceux étudiés à P8, une fois à P0, une fois à P7 et enfin une à P14 ceux étudiés à P21 .Chaque injection sous cutanée dure 1 à 5 sec. Le site d'injection sera surveillé pour détecter tout signe d'infection. Les souriceaux étudiés à P2, P4 et P8 seront mis à mort par décapitation, ceux étudiés à P21 recevront une injetion intra-péritonéale d’anesthésique ( 5sec)puis seront perfusés au PBS puis PFA sous anesthésie profonde.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet. Après la PE1, les femelles gestantes sont herbergées jusqu’au sacrifice des nouveau-nés. Après la PE2, les nouveaux-nés sont herbergés entre 2 et 8 jours en ce qui concerne les stades P2, P4 et P8, puis sacrifiés par decapitation. Pour le stade P21, une perfusion intracardiaque, procédure classée sans réveil, est prévue.
Remplacement
L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement cortical qui ne peut pas être recréé par des approches in vitro. Le développement du cerveau est très bien caractérisé chez la souris, ce qui nous permet de déterminer efficacement les effets de l’altération du gène étudié sur le développement embryonnaire cortical. Il s’agit ici de réaliser des expériences de sauvetage du phénotype de neurodégénérescence que nous avons caractérisé précédemment dans le cadre d'un projet antérieur . Par ailleurs, de telles expériences ont été réalisées par un autre groupe français, justifiant la pertinence de notre approche et la faisabilité dans le modèle souris.
Réduction
La bonne maitrise de cette chirurgie acquise par l’équipe tout au long de ces dernière années permet d’avoir un temps de chirurgie de moins de 30 minutes et un bon taux de survie des embryons (70-80%) ce qui limite fortement le nombre de femelles gestantes manipulées. Nous garderons à l’esprit notre responsabilité de diminuer au maximum le nombre d’animaux expérimentés tout en atteignant la significativité statistique. Pour minimiser le nombre d’animaux utilisés, aucune nouvelle expérience ne sera effectuée avant qu’une analyse complète des précédentes ne soit réalisée. Nous envisageons d’utiliser le test statistique de Student afin d’évaluer la survie cellulaire et la santé des neurones invalidés pour le gène étudié entre condition contrôle et traitées Epothilone B en analysant la croissance axonale (36 animaux P2) le corps calleux (36 animaux P4) ; les branchements ipsilatéraux (36 animaux P8) et les branchements controlatéraux (36 animaux P21). Afin de réduire le nombre total d’animaux utilisés et d’éviter le cannibalisme des souris de fond bl6, nous avons adapté nos croisements et croisons des mâles hétérozygotes bl6 avec des souris F1 hétérozygotes 129Sv/Fas (50% 129Sv/Pas – 50% C57bl6). Ce type de croisement est utilisé en routine pour ces expériences sur le corps calleux et a montré une baisse notable du cannibalisme.
Raffinement
Nous prendrons en compte avec la plus grande attention le bien être de nos animaux. L’élevage et la reproduction de nos animaux se font dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress pour l’animal. Durant l’expérimentation les femelles gestantes sont anesthésiées par voie gazeuse et leurs yeux sont protégés de la deshydrartation par de l’ocrygel. Nous limitons le temps de manipulation à 45 minutes sur l’animal anesthésié. Le réveil est immédiat une fois l’arrêt de l’isoflurane. Un anti-inflammatoire non-stéroïdien, la metacam, est injecté avant l’opération par voie sous-cutanée. La metacam est également ajoutée au biberon jusqu’à la mise bas (6mg/L dans l’eau de boisson). L’animal se réveille dans une cage chauffée à 37°C et est surveillé régulièrement. Nous vérifions que les animaux mangent et s’abreuvent normalement. Les jours suivants, les animaux sont surveillés deux fois par jour pour voir notamment si la plaie a besoin de soins et pour détecter d’éventuelles infections postchirurgicales ou autres complications. L’objectif est de prévenir toute douleur ou détresse. En cas d’infections importantes ou de douleur manifeste, les animaux sont euthanasiés immédiatement par dislocation cervicale et les embryons sortis de leur sac et décapités.
Choix des espèces
La technique d’électroporation dans le cerveau a été mise au point chez la souris. Cet animal de petite taille avec environ 8 embryons par animal rend cette méthode efficace. Les étapes du développement du cerveau sont très bien caractérisées chez la souris ce qui nous permet de voir les effets des mutations dans des gènes impliqués dans les maladies neuro-développementales chez l’homme. Femelles adultes gestantes de 15,5 jours, stade auquel les neurones d’intérêt (neurones callosaux) sont générés. L’electroporation des embryons à ce stade permettra d’invalider WDR47 uniquement dans ces neurones et de suivre leur développement grâce à un marqueur fluorescent. Etant donné que les étapes majeures de la formation du corps calleux sont la croissance des axones, le passage dans l’autre hémisphère et la phase terminale de l’invasion par les axones du cortex contralatéral à P2, P4 et à P8 respectivement et le branchement des axones à P21, nous prévoyons 4 stades afin d’évaluer comment le traitement EpothiloneB protège les neurones contre la perte de la fonction de WDR47
Etude de l’efficacité de nouvelles thérapies combinatoires utilisant des anticorps bloquants anti-PD-1 chez la souris PD-1 humanisée.
- Recherche appliquée
- Cancers
1 380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des souris génétiquement humanisées pour le récepteur PD-1 reçoivent une inoculation de tumeur par voie sous-cutanée, intraveineuse ou chirurgicale, puis des injections répétées de traitement, pour évaluer de nouvelles combinaisons d'anticorps anti-PD-1 contre le cancer. Le porteur indique que les modèles orthotopiques, notamment pulmonaire, sont sévères et peuvent provoquer douleur, perte de poids et mobilité réduite. Il affirme que ces modèles permettent de valider l'effet des traitements à l'échelle de l'organisme avant un essai clinique.
Objectifs
Dans le but d’échapper au système immunitaire, les cellules tumorales créent un microenvironnement suppresseur pour inhiber la réponse des lymphocytes T via la voie PD-1/PD-L1. La molécule PD-L1 exprimée à la surface des cellules tumorales interagit avec son récepteur PD-1 exprimé à la surface des lymphocytes T et bloque leur capacité anti-tumorale. Pour réactiver la réponse immunitaire antitumorale, des anticorps thérapeutiques bloquants PD-1 (Pembrolizumab, Nivolumab) ou PD-L1 (Avelumab) ont été développés. Ces anticorps ont démontré une efficacité clinique impressionnante chez les patients atteints de mélanome ou de cancer du poumon et sont aujourd’hui utilisés comme première ligne de traitement. Malgré le succès de cette thérapie, seulement des sous-groupes de patients sont répondeurs. Il est donc nécessaire de tester de nouvelles cibles thérapeutiques et de les combiner avec des anti-PD-1/PD-L1 pour induire une réponse immunitaire anti-tumorale efficace. Au laboratoire, nous avons identifié des cibles capables d’améliorer l’effet des anticorps anti-PD1 sur la réponse immunitaire anti-tumorale. Pour simultanément cibler le récepteur PD-1 et les cibles que nous avons identifiées, nous avons généré de nouveaux formats d’anticorps dit « bispécifiques » en fusionnant un anticorps anti-PD-1 à ces cibles. L’objectif du projet est d’étudier l’effet thérapeutique de ces anticorps bispécifiques dans des modèles tumoraux murins : leucémie, cancer du pancréas, cancer du poumon et mélanome.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet en complément du projet pourrait permettre de développer et valider des traitements innovants efficaces contre le cancer humain afin de répondre à des besoins cliniques importants. Durant toute ces évaluations pré-cliniques, de nouvelles découvertes pourront être faites, notamment durant l’étude de la mécanistique du produit sur le système immunitaire en mettant en lumière des populations cellulaires antitumorales.
Procédures
Les animaux seront soumis à une inoculation de tumeur murine via injection en sous-cutanée, intraveineuse ou via intervention chirurgicale sous anesthésie (un modèle par animal). Pour le suivi de chaque modèle, les animaux seront également soumis à des injections en intrapéritonéale pour les traitements (environ 3 fois par semaine) sur animaux vigiles et, si besoin, pour l’injection de luciférine lors du suivi de la croissance tumorale en bioluminescence (1 à 2 fois par semaine). Dans le cadre de l’étape #3 du projet, un prélèvement de sang en intracardiaque des animaux pourra être effectuée sous anesthésie (intervention sans réveil).
Impact sur les animaux
L’induction des modèles tumoraux décrits dans cette saisine ont plusieurs effets indésirables en fonction du modèle. Pour les modèles orthotopiques : -cancer du poumon : altération de la respiration (point-limite). Tous ces modèles (or les modèles sous-cutanées) peuvent induire de la douleur, une perte de poids chez la souris, une diminution de la mobilité, un stress notamment dû à la chirurgie associée et un comportement altéré provoqué par ses différents effets indésirables. Tous ces modèles sont considérés comme sévères et une attention particulière sera apportée régulièrement aux souris (quotidiennement aux points les plus critiques). Les modèles tumoraux sous-cutanées peuvent provoquer de la douleur si l'état de la tumeur se détériorent (points-limites). La tumeur ne devant pas provoquer de gêne pour la mobilité de l’animal, celui-ci sera mis à mort si la tumeur atteint 1500mm3 (soit moins de 10% de la masse corporelle). Aucun autre effet indésirable n’a été remarqué sur ce type de modèle au laboratoire. Les modèles tumoraux sous-cutanées sont considérés comme des procédures modérés. La durée de ces effets est dépendant du type d’expérimentation : - évaluation de l’effet thérapeutique du traitement (étape #2) : étude de la survie de la souris. Les effets indésirables seront présents jusqu’à la mise à mort de l’animal. Celle-ci intervient lors de l’accumulation de ses effets ou l’apparition d’un effet considéré grave (points-limites). - évaluation mécanistique des traitements (étape #3) : mis à mort de l’animal avant l’apparition de points limites (à la fin de la séquence thérapeutique) afin d’étudier l’impact des traitements sur le système immunitaire.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des organes d’intérêts pourront être récupérés pour compléter les analyses.
Remplacement
Les traitements évalués lors de ce projet ont déjà démontré des résultats prometteurs in vitro chez l’homme sur de nombreux tests comme des évaluations à partir de lignées cellulaires, PBMC humains frais ou de tumeurs isolées de patients. Les modèles tumoraux chez la souris humanisée pour le récepteur PD-1 nous permettent de valider l’effet thérapeutique de nos traitements à l’échelle d’un organisme ainsi que d’évaluer leur potentiel effet toxique avant d’envisager un essai clinique chez l’homme.
Réduction
Ce projet nécessitera 1380 animaux au maximum. Ceci est une estimation haute qui sera surement réduite en fonction des résultats. Ce nombre d’animaux comprend la mise en place de six modèles au sein de notre laboratoire, ce qui est essentiel pour la suite des études et permet de générer à long terme un savoir-faire pour tous nos projets présents et futurs en cancérologie. Pas de tests statistiques seront nécessaires durant l’étape #0 et #1 du projet, le nombre d’animaux est donc réduit à 4 par condition. Idéalement, l’entrainement à la chirurgie du modèle du cancer du Pancréas (étape #0) sera effectué sur des souris recyclées de l’animalerie issue d’élevage (animaux surnuméraires ou issu du tri génétique ; pas de réutilisation d’animaux) afin de maitriser le geste. Autrement, les entrainements seront effectués sur des souris C57BL6 issues d’un élevage commercial. Au total, 156 animaux maximum sont estimés pour ces étapes de mise au point. Pour l’étape #2, le nombre total d’animaux pour cette étape a été estimé à 960 animaux en considérant que six modèles tumoraux seront utilisés pour étudier les 4 types d’anticorps bispécifiques. En réalité, nous pensons avoir besoin que de 1 à 4 modèles. Pour l’étape #3, le nombre total d’animaux pour cette étape a été estimé à 264 animaux, en considérant que maximum quatre modèles tumoraux seront utilisés pour étudier les 4 types d’anticorps bispécifiques. Cette étude sera menée si et seulement si un effet thérapeutique a été observé à l’étape #2. Les étapes #2 et #3, un nombre de 5 souris sera utilisé pour le groupe contrôle et 7 souris seront utilisées pour les traitements. Ces étapes nécessitent des résultats statistiques pour démontrer l’efficacité du produit thérapeutique. Ce nombre d’animaux a été estimé par des tests statistiques d’échantillonnage. Dû à la variabilité de la prise tumorale et de l’effet de thérapeutique interindividuelle, ce nombre est nécessaire pour avoir une bonne reproductibilité et obtenir des résultats statistiquement fiables. L’étude statistique choisie est le test de Mann-Whitney (ou Wilcoxon si le nombre de groupes à comparer est de 2) qui repose sur l’analyse de données non paramétriques déterminée quand le nombre de sujet est inférieur à 30. Ce test nous permet d’analyser nos données en combinant un test statistique fiable et un nombre d’animaux réduit.
Raffinement
Une étape d’acclimatation de 3 jours minimum pour les souris issues de l’élevage sur site et de 5 jours minimum pour les souris commerciales sera respectée avant inclusion dans des protocoles expérimentaux. Pour limiter le stress et l’inconfort, les animaux sont maintenus dans des cages ventilées dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté ainsi qu’un nombre maximum de 5 animaux/cage et un enrichissement frisottis pour s’enfouir et se cacher. Un enrichissement supplémentaire sera ajouté chez les mâles (dôme ou tunnel) afin de prévenir de potentielles agressions. Si un mâle se retrouve dominant et attaque ses congénères, il sera isolé dans une cage individuelle avec deux enrichissements (frisottis + dôme/tunnel). Nous avons aussi mis en place une procédure non invasive pour visualiser par imagerie de bioluminescence la croissance de la tumeur. Cette technique nous permet d’exploiter au mieux les résultats et ce, sans souffrance pour l’animal. Le suivi des animaux sera quotidien une fois que le protocole est considéré comme sévère et la gestion de la douleur maîtrisée le plus adéquatement possible afin d’apporter les soins nécessaires le plus rapidement aux animaux. Comme décrit dans les paragraphes des procédures expérimentales ci-dessous, des analgésiques seront utilisés avant et après chirurgie. Pour limiter l’inconfort de l’anesthésie, les animaux seront anesthésiés dans une boîte à induction placée sur tapis chauffant. Enfin des points limites ont été mis en place afin de réagir rapidement en cas d’inefficacité des traitements ou de souffrance animale.
Choix des espèces
Nous travaillerons avec la lignée de souris PD-1 humain Knock In (hPD-1KI) dont le fond génétique C57BL/6 est une référence pour la recherche fondamentale/préclinique et pour lequel plusieurs modèles tumoraux ont été établi au sein du laboratoire (APAFIS15700) ou par la communauté scientifique. Ces souris hPD1KI exprimant la version humaine du gène PD-1 se développent normalement et présentent les mêmes fonctions immunitaires que les souris sauvages C57BL/6. Ce modèle est donc très relevant d’un point de vue clinique car nous pouvons tester directement les effets thérapeutiques et biologiques de nos traitements anti-PD-1 bispécifique humain dans des modèles de tumeurs sans passer par un anticorps substitutif ciblant la molécule PD-1 de souris. Des souris C57BL/6 pourront être utilisées pour mettre en place certains modèles tumoraux et maitriser la chirurgie associée. Des adultes de 6 à 10 semaines seront utilisés, car la prise tumorale est homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse anti-tumorale, et donc un stade tumoral différent.
Evaluation de l’efficacité de la Fraction vasculaire stromale du tissu adipeux sur la fibrose pulmonaire et cutanée induite par l’acide hypochloreux chez le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
87 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une sclérodermie est induite par des injections intra-dermiques d'acide hypochloreux cinq jours sur sept pendant six semaines, avec imageries et injection d'une fraction du tissu adipeux, pour évaluer une nouvelle approche thérapeutique. Le porteur indique que les injections répétées causent stress et douleur et peuvent provoquer des ulcérations cutanées susceptibles de s'infecter. Il affirme que cette recherche est réglementairement impossible chez l'humain sans modèle animal préalable.
Objectifs
Il est urgent de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour les formes cutanées diffuses et l’atteinte pulmonaire fibrosante de la sclérodermie systémique (ScS). Compte-tenu de la complexité de la ScS, le choix du modèle préclinique de la maladie est crucial, devant refléter les différentes facettes de la maladie. Nous avons ainsi choisi le modèle induit par des injections d'acide hypochlroreux (HOCl) à la fois pour son caractère inductible sur une courte période, une atteinte cutanée diffuse, des lésions de fibrose pulmonaire et la production d’anticorps spécifiques. Il est donc très proche des conditions physiopathologiques observées chez les malades et apparaît pertinent pour l’évaluation d’une nouvelle approche thérapeutique, visant à cibler la fibrose pulmonaire et cutanée. L’équipe travaille sur la Fraction vasculaire stromale (FVS) du tissu adipeux. Nos travaux ont démontré l’effet anti-fibrosant et pro-angiogénique de la FVS. Le modèle chez la souris rendant difficile le recueil d’une quantité suffisante de FVS pour une utilisation en autologue, il a été décidé de transposer le modèle chez le rat. Le recours à la voie intra-veineuse s’impose également dans l’optique d’une thérapeutique systémique visant l’amélioration à la fois de la fibrose pulmonaire et cutanée. Nous avons choisi pour cette étude de « preuve de concept » de transposer le modèle de ScS induite par l’HOCl décrit chez la souris chez le rat pour y évaluer l’effet thérapeutique d’une injection intra-veineuse de FVS. Objectifs et moyens : 1/ Mettre en place le modèle ScS-HOCl chez le rat au laboratoire, 2/ Caractériser la fibrogénèse cutanée et pulmonaire induite par l’injection répétée d’HOCl chez le rat, 3/ Comparer les caractéristiques de la FVS des rats sclérodermiques et sains, 4/ Tester la faisabilité et la sécurité de l’injection IV de la FVS, 5/ Etudier les effets d’une injection IV de FVS hétérologue (rats sains) et autologue sur les lésions induites de fibrose pulmonaire et cutanée, 6/ Comparer les différentes doses de FVS utilisées à la recherche d’un effet dose et évaluer l’effet de la FVS déplétée de la fraction leucocytaire CD45+
Bénéfices attendus
Développement d'un modèle de sclérodermie systémique présentant les différents aspects systémiques de la maladie, complémentaire du modèle de sclérodermie cutanée induite par la bléomycine déjà utlisé antérieurement par l'équipe. Evaluation de l'effet systémique de la FVS injectée par voie IV. La faisabilité de l'injection IV de FVS chez le rat a déjà été démontrée dans la littérature dans des modèles de pathologies ischémiques cardiaques. Perspectives : pouvoir évaluer l'effet d'autres thérapies cellulaires ou d'autres traitements sur une espèce animale différente de la souris.
Procédures
Procédure 1 / 15 rats induction du modèle (+/- 12 animaux supplémentaires pour recherche dose optimale), + 6 animaux pour valider la reproductibilité de l'induction une fois la dose optimale trouvée). L’induction se fait par injection intra-dermique d’HOCl à 2 endroits de part et d’autre de la colonne avec une aiguille de 27G. Ces injections seront répétées 5 jours/7 pendant 6 semaines. Les injections se feront 30 minutes après application de crème anesthésiante et sous anesthésie à l’isoflurane (induction 5%, maintien 1,5%,durée 5min). Les animaux feront l’objet de 3 imageries (J0, J21 et 41). Les animaux sont endormis une première fois (isoflurane induction à 5% puis maintien à 1.5% sous mélange air/oxygène 30% à raison d'1L/min) afin de cathétériser une veine caudale pour injecter le radiotraceur en solution isotonique stérile (volume maximum 500µl). Une heure après l'injection du radiotraceur, les animaux sont de nouveau anesthésiés pour le passage sous les caméras (durée 30min). Procédure 2 / Induction de la fibrose (cf procédure 1) chez 27 rats. La FVS obtenue à partir de la graisse de rats sains (hors saisine) (lots 2,3 et 4) ou une solution de Ringer Lactate (lot 1) sera injectée aux rats par voie IV au niveau d’une des veines caudales sous courte anesthésie (5minutes) (isoflurane induction à 5% et maintien à 1.5% sous mélange air/oxygène 30% à raison d'1L/min). Les rats feront l’objet de 4 imageries sur la période (J0, J21 et 41 et J63) protocole identique procédure 1. Les animaux sont ensuite remis dans leur cage et gardés jusqu’à la fin du protocole où ils seront mis à mort. Procédure 3 / Induction de la fibrose (cf procédure 1) et imageries (cf procédure 2) chez 27 rats. Prélèvement de la graisse : 30 minutes avant le début de l’anesthésie les rats reçoivent une injection s.c de Buprénorphine. Les rats sont ensuite pré-anesthésiés dans une chambre spécialisée par administration de Isoflurane à 5% sous mélange air/oxygène 30% à raison d'1L/min, puis maintenus sous anesthésie générale en ventilation spontanée au masque par administration de Isoflurane 2% environ sous mélange air/oxygène 30% à raison d'1L/min. L’abord chirurgical sera fermé sur 2 plans. Injection de ropivacaine au niveau de la cicatrice. Réveil des animaux. Prévention des douleurs par injection s.c de buprénorphine pendant 48-72h. La FVS ou le ringer lactate sont ensuite réinjectés (cf procédure 2). Les animaux sont gardés jusqu’à la fin du protocole où ils seront mis à mort.
Impact sur les animaux
Fort de l'expérience sur les expérimentations antérieures, la répétition des injections génère un stress pour les animaux du fait de leur contention nécessaire et est source de douleurs. Afin de limiter ses souffrances, nous avons décidé après évaluation de la bonne tolérance lors des expérimentations antérieures, de réaliser les injections sous courte anesthésie gazeuse et d'administrer systématiquement aux rats dans les suites des injections du paracétamol. Des ulcérations cutanées peuvent apparaitre suite aux injections répétées d'HOCl. Malgré les mesures d'aseptie prises, il y a un risque de surinfection de ces lésions possible qu'il faudra surveiller et traiter si cela arrive. De part l'objectif visé, le développement de la fibrose cutanée pourrait entraver les mouvements du rat et limiter sa mobilité. L'apparition de cette fibrose est par contre indolore. Il faudra veiller à adapter la localisation de la nourriture et de l'eau si les rats venaient à presenter des difficultés à se mobiliser afin qu'il ne perde pas de poids ni se déshydrate. Avec le développement d'une fibrose pulmonaire, nous pouvons envisager l'apparition de difficultés respiratoires qui pourraient retentir sur l'activité du rat (difficultés respiratoires à l'effort tout d'abord) voir sur son état général ensuite (difficultés respiratoires au repos, fatigue, difficultés à manger). En ce qui concerne les rats de la procédure 3 qui auront un prélèvement de leur graisse péri-épididymaire, il est attendu des douleurs post-opératoires au niveau sus-pubien et testiculaire éventuellement qui seront prises en compte et traitées. Il y a un risque d'infectieux potentiel et possiblement un risque d'iléus réflexe avec rétention d'urines et constipation à surveiller.
Devenir
A l'issue de l'ensemble des procédures 1, 2 et 3, les animaux seront mis à mort. Procédure 1 : Au bout des 6 semaines, tous les rats seront mis à mort pour caractériser la fibrogénèse en récupérant les poumons et de la peau pour analyses histologiques, immunohistochimiques et moléculaires. Procédure 2 : A J63 les 27 rats induits puis traités seront mis à mort pour évaluer l'efficacité de l'injection de FVS saine. Procédure 3 : A J63, les 27 rats induits puis traités seront mis à mort pour évaluer l'efficacité de l'injection de FVS autologue.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale se justifie par l’impossibilité réglementaire de conduire ce type de recherche chez l’homme sans un modèle animal avant pour évaluer l’efficacité et les risques. Le modèle de fibrose induite par l’acide hypochloreux chez la souris est bien connu pour l’étude des mécanismes impliqués dans le développement de la ScS et pour tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le modèle HOCl reproduit des caractéristiques proches d’une forme diffuse de ScS avec une fibrose cutanée et pulmonaire et la production d’anticorps spécifiques. Il est ainsi très proche des conditions physiologiques observées chez l’homme. Bien qu’il ne soit pas parfait surtout pour une maladie aussi complexe que la ScS, le modèle HOCl chez le rongeur apparait pertinent pour l’évaluation d’une nouvelle approche thérapeutique visant la fibrose pulmonaire et cutanée. Vue la complexité de la pathologie, il n'est pas possible non plus de la modéliser in vitro ni in silico.
Réduction
Un maximum de 87 rats wistar est envisagé pour ce projet en espérant pouvoir se limiter à 75 rats. Le nombre de rats prévus est minimum mais suffisant pour chaque étape pour espérer obtenir des résultats significatifs. Pour la mise au point du modèle, suite aux résultats préliminaires, nous avons décidé de tester 3 concentrations d’acide hypochloreux d’emblée afin de limiter le nombre de rats témoins nécessaires et nous espérons ne pas avoir à tester 4 autres doses avec 12 rats supplémentaires. N=3 est suffisant à cette étape car l’induction de la fibrose ne doit pas induire de décès, que les animaux sont suivis longitudinalement par imagerie et que le résultat attendu est présence ou non de fibrose. Nous avons prévu 6 rats pour s'assurer de la reproductibilité d'induction du modèle avec la dose optimale trouvée. Pour l’étude de l’efficacité de la FVS, nous avons aussi prévu l’évaluation de 2 doses différentes de FVS + d'une dose de FVS déleucocytée dans le même temps afin de limiter le nombre de rats témoins également. Le nombre d’animaux (n=6 ou 7 / lot) a été déterminé en fonction des études sur l’injection IV de cellules souches mésenchymateuses sur le modèle murin de fibrose induite par l’acide hypochloreux et en tenant compte du risque de décès des animaux à la hauteur de 5-10%. L’évaluation de la FVS autologue permettra si les résultats avec la FVS hétérologue issue de rats sains sont comparables de ne plus avoir à utiliser des rats uniquement pour le recueil de la FVS à l’avenir et chez les patients seule la FVS autologue est envisageable. Le suivi de l’apparition et de la régression de la fibrose par imagerie permet également de limiter le nombre de rats puisque tous les rats seront mis à mort uniquement à la fin de l'expérimentaton et non à chaque point d'évaluation. Les paramètres quantitatifs seront comparés à l’aide du test t ou du test non paramétrique de Mann-Whitney. Une ANOVA sera utilisée lorsque l’analyse inclura plus que 2 groupes. Le seuil de significativité est fixé à 5%.
Raffinement
Les rats seront hébergés par 2 en armoire ventilée durant la période d’acclimatation puis d’expérimentation pour diminuer leur stress. Nous habituerons les animaux durant la période d'acclimation à être manipuler afin de limiter leur stress par la suite. Chaque cage sera agrémentée de tunnel rouge afin d'amener un enrichissement aux rats et les stimuler dans la réalisation de leur propre nid au sein de la cage. Ils auront à disposition nourriture et eau, le cycle jour nuit sera respecté et la température ambiante sera de 22°C. Une petite balle en plastique sera mise dans la cage afin qu’ils puissent se divertir le temps où nous ne sommes pas présents. Toutes les manipulations seront réalisées par du personnel formé afin d’optimiser le bien-être des rats et l’obtention de résultats positifs. Les injections id pour l'induction de la maladie seront réalisées après l’application d’une crème anesthésiante et avec l’administration orale en systématique de paracétamol dans les suites. Des soins locaux cutanés seront réalisés en cas de lésions cutanées induites par les injections id. Afin de limiter le stress important des animaux lié à la contention nécessaire aux injections, les injections seront réalisées sous une courte sédation gazeuse. Cela a été réalisé lors des expérimentations préalables avec succès et une très bonne tolérance. En cas de difficultés des rats à se mobiliser du fait du développement de la fibrose cutanée et/ou pulmonaire avec gêne respiratoire, nous leur mettrons à disposition dans la cage eau et nourriture afin d'éviter toute perte de poids. En cas de difficultés respiratoires, nous adopterons la concentration d'isoflurane et pourront ajouter de l'oxygène. Le recueil du tissu adipeux se fera sous anesthésie générale avec une analgésie péri-opératoire. Nous serons vigilants si difficultés respiratoires au réveil de l'anesthésie et à la tolérance des injections de buprémorphine. Une injection de ropivacaine au niveau de la cicatrice permettra de limiter le recours à la buprémorphine en post-opératoire immédiat. L'injection de la FVS et les imageries prévues seront réalisées sous anesthésie également. La même attention sera portée aux anesthésies pour ces gestes. De plus, la douleur et le bien-être des rats seront évalués quotidiennement tout au long de l’expérimentation afin d’adapter leur prise en charge en fonction. Si une souffrance sévère irréversible était objectivée, une mise à mort du rongeur sera réalisée sans délai.
Choix des espèces
Nous avons choisi de mener notre expérimentation chez le rat pour différentes raisons : -La faisabilité du prélèvement de tissu adipeux pour pouvoir obtenir une quantité suffisante de FVS et pouvoir travailler en autologue. Nous nous sommes notamment inspirés des études dans l’infarctus du myocarde. -La caractérisation de la FVS chez le rat déjà publiée validant un recueil uniquement de la graisse péri-épididymaire pour obtenir une quantité de FVS suffisante pour les objectifs cellulaires souhaités. -La faisabilité de l’injection intra-veineuse de FVS Nous utiliserons des rats wistar de 200-225 grammes afin d'avoir un poids des rats au bout des 8 semaines d'expérimentation (Acclimation + induction) suffisant pour obtenir une quantité de graisse péri-épidydimaire permettant l'obtention de FVS (3ml de graisse nécessaire). Le recueil de la graisse péri-épidydimaire a été choisi compte tenu des données de la littérature et cela permet de se limiter à une incision sus-pubienne et d'être moins invasif que si de la graisse abdominale doit être prélevée. Les suites opératoires en seront facilitées avec notamment moins de douleurs et un risque infectieux diminués.