Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Evaluation in vivo d’un nouvel agent immunothérapeutique dans les cancers de la vessie
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
610 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent chaque semaine, jusqu'à six semaines, une injection intra-uréthrale sous anesthésie et des prélèvements d'urine, pour tester un agent immunothérapeutique contre le cancer de la vessie. Le porteur indique que le développement tumoral peut provoquer une inflammation urinaire et un affaiblissement de l'état général. Il affirme que le recours à l'animal est "irremplaçable", aucun autre modèle n'évaluant les effets à l'échelle de l'organisme.
Objectifs
Le cancer de la vessie se classe au 10e rang des cancers les plus courants selon le Centre international de recherche sur le cancer. Les malades sont traités via une approche multidisciplinaire (chirurgie avec radiothérapie, chimiothérapie ou immunothérapie). En particulier, l’immunothérapie par instillation intravésicale du Bacillus Calmette-Guerin (BCG), initiallement utilisée pour la vaccination contre la tuberculose, est fréquente. Elle a des effets prouvés sur la réduction des récurrences et de progression de la tumeur. Ces effets du BCG résultent d'une interaction entre les effets directs sur les cellules tumorales du BCG et de la réponse immunitaire de l'hôte conduisant à la production de cytokines et à la destruction des cellules tumorales. Néanmoins, ce traitement a encore des effets cliniques insatisfaisants, justifiant le développement de nouvelles thérapies. Ainsi, ce projet de recherche vise à établir une preuve de concept pour une stratégie immunothérapeutique anticancéreuse à partir de vésicules de membranes externes (ou VME en abrégé) naturellement produites par des souches d’E. coli. Des expériences ont été menées dans des lignées cellulaires modèles humaines de cancer de la vessie et dans une lignée cellulaire contrôle de vessie peu transformée afin de mesurer l'impact du traitement par les VME sur la prolifération et la survie cellulaire. Il est maintenant indispensable de vérifier l'innocuité et l'efficacité des VME par des expériences in vivo dans un modèle murin car les expériences sur cultures cellulaires ne prennent pas en compte toute la complexité d’un organisme intégré. Nous évaluerons l’innocuité du traitement en instillant des VME dans la vessie de souris saines (même protocole que pour le BCG, cette technique est maitrisée par notre équipe). Si ce traitement s’avérait toxique (ce qui est peu probable au vu des résultats obtenus avec le BCG et étant donné que le traitement est purement local), nous pourrions alors utiliser une souche bactérienne beaucoup moins toxique et disponible au laboratoire. Cette dernière souche est à réserver en dernier recours, car étant moins toxique, elle est aussi bien moins immunostimulante et est donc moins susceptible d'être efficace contre les tumeurs. Puis, en utilisant deux modèles de cancer de la vessie (induits soit par l'ingestion d'un agent carcinogène soit par une infection par un agent uropathogène), nous évaluerons l'impact d'un traitement par les VME sur les cancers de la vessie.
Bénéfices attendus
Ces résultats devraient permettre d'établir une preuve de concept concernant l’efficacité d’un traitement par des VME sur les cancers de la vessie en évaluant d'une part leur inocuité sur l'animal sain et d'autre part leur(s) effet(s) sur le développement de lésions cancéreuses peu évoluées et sur la régression de tumeurs établies.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés une fois par semaine par anesthésie injectable (Ketamine-100mg/kg/Xylazine- 10mg/kg, i.p., 10ml/kg) ou anesthésie gazeuse (4% isoflurane), pendant au maximum 6 semaines, afin de réaliser l'injection de VME ou de produits contrôles (liquide physiologique, etc...) par voie intra-uréthrale via un catheter adapté. Chaque injection durera 1 à 2 minutes. Des prélèvements d’urine par miction spontanée (quelques gouttes recueillies dans un tube eppendorf) seront réalisés une fois par semaine pendant au maximum 6 semaines.
Impact sur les animaux
Certaines procédures expérimentales prévues génèrent chez la souris un développement tumoral pouvant entraîner une souffrance chez l'animal avec des effets locaux (inflammation au niveau de l'appareil urinaire par exemple) et des effets systémiques (affaiblissement de l'état général par exemple).
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure afin de réaliser des prélèvements de tissus pour évaluer les lésions éventuelles, notamment au niveau de la vessie (réalisation de scores macro- et microscopiques)
Remplacement
Nous avons déjà réalisé de nombreuses validations in vitro et in cellulo de manière à garantir la qualité des VME utilisées à des fins de stratégie anti-cancéreuses. Nous allons continuer à étudier leur effet sur des lignées cellulaires modèles. Le recours à l’animal est cependant irremplaçable car aucun autre modèle ne permet d’évaluer les répercussions d’un tel traitement à l’échelle d’un organisme (évaluation de l’éventuelle toxicité systémique – non attendue-, et de l’efficacité sur la régression tumorale). Une veille scientifique sera mise en oeuvre pour identifier toute méthode scientifique alternative à l’expérimentation animale dans le domaine.
Réduction
Des expériences préalablement réalisées avec ce modèle permettent d'estimer de manière optimale le nombre d'animaux requis. Ce projet nécessite l’utilisation de 610 souris âgées de 6 semaines car il est indispensable de réiterer les expériences 3 fois de manière indépendante pour garantir la robustesse des résultats. Plusieurs paramètres seront analysés chez chaque animal (poids, prélèvements d’urine, de tissus et de sang lors du sacrifice) et une méthode non invasive d'échographie sera appliquée pour suivre la progression tumorale au cours du temps et ainsi réduire le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
L’environnement des animaux assurera des conditions d’hygrométrie et de température constantes. Les cages possèdent des cabanes dans lesquelles les animaux peuvent se cacher et exprimer un comportement propre à leur espèce. Les cages sont teintées de manière à apaiser les animaux. Le change de la litière sera effectué toutes les semaines. La surveillance quotidienne permettra de s'assurer que les animaux ne présentent pas des douleurs ou détresses dépassant les points limites ou nécessitant le recours à un traitement antalgique. L'hydratation et l'alimentation seront disponibles ad libitum. Le protocole d’expérimentation sera adapté afin de minimiser la morbidité et la douleur.
Choix des espèces
La souris est le mammifère le plus facilement manipulable et le modèle plus décrit pour l’étude du cancer de la vessie. En particulier, les lésions néoplasiques liées aux cancers de la vessis développées dans cette espèce animale sont très similaires à celles développées chez l'homme, ce qui rend ce modèle particulièrement intéressant pour l'étude de cette maladie. Nous utilierons des souris de 7 à 8 semaines. Dans la littérature, les souris soumises au carcinogène (BNN) sont classiquement âgées de 5 à 6 semaines, âge auquel elles sont considérées adultes. Nous prenons une marge de deux semaines pour permettre l’acclimatation.
Rôle d’une protéine de réponse au stress oxydatif de Pseudomonas aeruginosa dans l’infection pulmonaire aiguë chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
102 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par la bactérie Pseudomonas aeruginosa par instillation intra-nasale sous anesthésie, puis mises à mort 24 heures après pour analyser leurs poumons, afin d'étudier une protéine bactérienne comme cible thérapeutique. Le porteur indique des signes d'infection respiratoire, dyspnée et poil hérissé, et une surmortalité possible de 20 % lors de l'instillation. Il affirme qu'un modèle in vitro d'épithélium humain reste "très limité" et ne rend pas compte de la réponse immunitaire globale.
Objectifs
Pseudomonas aeruginosa est une bactérie de l’environnement induisant des infections respiratoires chez les sujets fragilisés comme ceux se trouvant en réanimation, ceux atteints de broncho-pneumopathie chronique obstructive ou encore ceux atteints de mucoviscidose. L’émergence de souches de P. aeruginosa de plus en plus résistantes aux antibiotiques est observée partout dans le monde. La resistance aux antibiotiques est un problème car cela risque d’entrainer des impasses thérapeutiques pour les patients. L’objectif est d’étudier si une proteine protégeant P. aeruginosa contre la défense de l’hôte peut servir de cible thérapeutique alternative ou adjuvante aux antibiotiques pour traiter les infections à P. aeruginosa résistant aux antibiotiques : ce projet scientifique a pour objectif (i) de déterminant les charges bactériennes dans les poumons infectés par les bactéries hyperexprimant ou non la proteine, (ii) d’étudier l’impact de l’infection sur la destruction de l’architecture du poumon et sur la réaction inflammatoire et immunitaire.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet nous permettra de caractériser plus précisement la virulence accrue au niveau pulmonaire induite par la proteine d’intérêt chez la bactérie P. aeruginosa résistante aux antibiotiques utilisés couramment en médecine humaine. Cette caractérisation histologique et bactérienne est indispensable pour affirmer l’implication de cette protéine dans la différence de survie observée chez les souris dans nos travaux précédents et elle est nécessaire pour expliquer le mécanisme global de la virulence augmentée de ces souches. Cette protéine participe à la virulence à la bactérie. Elle constitue donc une cible potentielle pour le développement à plus long terme de nouvelles stratégies thérapeutiques dans les infections pulmonaires à P. aeruginosa résistants à de nombreux antibiotiques. Le développement d’inhibiteurs de cette proteine peut être envisagé pour constituer une thérapeutique alternative et adjuvante aux antibiotiques en médecine humaine. Son inhibition pendant l’infection respiratoire permettrait de limiter la prolifération de P. aeruginosa en le rendant sensible à la réponse de l’hôte.
Procédures
Pour chaque animal, il sera réalisé : - Une infection respiratoire par instillation intra-nasale : geste réalisé sous anesthésie générale. - Une administration d’un antalgique de palier III par injection intrapéritonéale à 6h post infection. - L’euthanasie à 24h post infection pour prélévement et analyse des poumons (études bactérienne, histologique et cytologique)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sont ceux résultants de l’infection pulmonaire bactérienne. Il pourra être observé des signes d’infections respiratoires : dyspnée, mobilité réduite, dos vouté et poil hirissé. Une sur-mortalité possible de 20% lors de l’instillation intranasale est également attendue.
Devenir
Les animaux de la procédure seront mis à mort 24h après l’infection afin de réaliser le dénombrement de la charge bactérienne pulmonaire, les analyses d’histologie/immunomarquage sur poumons et les analyses cytologiques sur LBA
Remplacement
Ce projet requérant un modèle murin a été considéré après une étude in vitro préalable. En effet, la première partie de notre projet, qui a permis la mise en évidence de la virulence augmentée de la souche résistante aux antibiotique et le rôle d’une protéine d’intérêt, a été réalisée sur un modèle in vitro d’épithélium respiratoire humain. Cependant, malgré son utilité, ce modèle reste très limité car il ne permet pas d’étudier la virulence bactérienne à l’échelle du poumon dans son ensemble et il ne prend pas en compte la réponse immunitaire globale de l’hôte vis-à-vis de P. aeruginosa. Seule une partie de la réponse immunitaire innée est assurée mais la réponse immunitaire innée médiée par les phagocytes (polynucléaires, macrophages, …) ainsi que la réponse immunitaire adaptative (humorale et cellulaire) est absente dans ce modèle. Au contraire, dans le modèle murin de pneumonie aiguë, la réponse globale de l’hôte au niveau pulmonaire est assurée et cette étape in vivo est essentielle à la validation du rôle la protéine d’intérêt dans l’infection à P. aeruginosa résistant aux antibiotiques
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été déterminé pour répondre à l’objectif scientifique selon le nombre d’expériences prévues, les besoins en données selon les analyses statistiques envisagées et les données de la litterature. Pour comparer les résultats de charges bactériennes, des tests non paramétriques de Mann-Whitney seront appliqués, ces tests non paramétriques étant adaptés à notre étude comprenant un faible nombre d’individu. Une réflexion biostastistique (utilisant le logiciel G-Power) a été réalisée afin d’éviter qu’une réduction trop drastique ne nuise à la fiabilité des résultats du projet. Nous avons également pris en compte le risque de surmortalités, c’est-à-dire la sortie précoce d’animaux avant la fin de la procédure (mortalité lors de l’instillation nasale, atteinte des points limites avant 24h, …), selon les données de la littérature et notre expérience acquise lors de précédentes manipulations. Les groupes ont donc été réduits à la taille minimum nécessaire à l’interprétation des résultats. Pour essayer de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous allons exploiter le plus possible les organes prélèvés, en essayant par exemple de mettre au point l’immunomarquage de P. aeruginosa sur les coupes en paraffine utilisées pour l’étude histologique classique. Si le marquage fonctionne, l’expérimentation (infection 4) prévue pour la cryoconservation/immunomarquage ne sera finalement pas utilisée, permettant de diminuer le nombre d’animaux (16 animaux en moins).
Raffinement
Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien être de l’animal, plusieurs mesures seront réalisées : - l’anesthésie par injection intrapéritonéale de Kétamine (50 mg/Kg) / Xylazine (5 mg/Kg) lors de l’instillation intra-nasale de l’inoculum bacterien, avec l’utilisation d’un dispositif chauffant lors de l’anesthésie des souris pour éviter l’hypothermie. - une surveillance rapprochée pendant la procédure (toutes les 2 à 4 heures en journée (8h à 18h) et une visite nocturne). Cette surveillance permet le suivi des animaux et la vérification des points limites, requérant l’euthanasie. - l’administration d’un antalgique de palier III (Buprénorphine, 50µg/kg) en intra péritonéal à 6h post-infection pour limiter la douleur et la dyspnée chez l’animal. - un enrichissement des cages et le regroupement des souris dans les cages pour préserver les interactions sociales
Choix des espèces
La souris est une espèce pour laquelle de nombreux protocoles de pneumonie aiguë d’étiologie bactérienne ont été optimisés et validés. Le modèle murin utilise des souris âgées de 6 à 8 semaines et permet d’étudier la pathogénicité bactérienne lors de l’infection pulmonaire aiguë (i) en établissant les courbes de survie (se basant sur l’atteinte des points limites), (ii) en réalisant des coupes histologiques pulmonaires et (iii) en déterminant la charge bactérienne infectante dans les poumons.
Etude des mécanismes d’invasivité des adénomes hypophysaires chez le rat et évaluation de l’efficacité thérapeutique d’un médicament candidat
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
32 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection de cellules tumorales dans l'hypophyse, puis trois séances d'IRM sous anesthésie et des prélèvements sanguins, pour étudier la propagation d'un adénome hypophysaire et tester un médicament candidat. Le porteur indique que la croissance tumorale peut entraîner une perte de poids et une altération de l'état général. Il affirme que le recours au modèle animal est "indispensable", des cultures cellulaires ayant servi en amont sans pouvoir le remplacer.
Objectifs
L’objectif de notre projet est double. Il d’agit d’une part de suivre l’évolution de ces tumeurs afin de les caractériser et de comprendre les mécanismes de propagations dans les tissus cérébraux. D’autre part, nous évaluerons également l’efficacité thérapeutique d’un médicament candidat (la Sitagliptine) sur la base de la taille de la tumeur mesurée de façon non invasive par IRM. En effet, parmi toutes les modalités d'imagerie permettant d'étudier de manière non invasive les tissus, l'IRM (Imagerie par Résonance Magnétique) est l'une des plus prometteuses : elle est capable de fournir des images à haute résolution du cerveau, qui permettent ainsi une mesure précise des altérations des structures cérébrales et des tumeurs en elles-mêmes. Dans ce projet, un suivi longitudinal sera effectué par IRM, ce qui permettra de caractériser la vitesse de propagation des cellules tumorales à travers les tissus environnants et d’évaluer la sensibilité des différentes structures péri-hypophysaires. Afin d’étudier les mécanismes moléculaires à l’origine de la tumorigenèse hypophysaire et ceux à l’origine de l’invasion des structures cérébrales adjacentes par des cellules hypophysaires, nous souhaitons étudier le comportement de cellules hypophysaires sur-exprimant les gènes d’intérêt in vivo. L’utilisation de modèles animaux dans l’étude des mécanismes de dissémination tumorale est nécessaire pour reproduire au mieux le microenvironnement tumoral humain.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes à l’origine de la survenue d’une tumeur hypophysaire et ceux à l’origine de sa propagation vers les structures cérébrales adjacentes. En plus des connaissances fondamentales sur la croissance tumorale de ce type de tumeurs, un des bénéfices majeurs du projet est l’évaluation de l’effet thérapeutique d’un médicament candidat. La substance active du médicament évalué ici est la Sitagliptine qui est déjà connue et commercialisée : elle est administrée à l'homme depuis longtemps sans effet secondaire significatif ainsi qu’à l’animal. A court terme, les résultats pourront être valorisés sous forme de publication scientifique qui bénéficieront à l’ensemble de la communauté scientifique travaillant sur ce type de tumeurs cérébrales. A plus long terme, les connaissances acquises, en particulier sur le candidat médicament, permettront d’envisager son utilisation dans des études cliniques.
Procédures
Injection intra-hypophysaire de cellules tumorales (durée) Ce geste sera réalisé dans le laboratoire de l’équipe partenaire pour lequel une saisine a déjà été validée. Tous les animaux impliqués dans cette procédure ne subiront qu’une seule chirurgie au cours de leur vie. Caractérisation par IRM 14 jours après l’injection des cellules tumorales, les animaux seront imagés par IRM. Les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane (3%) dans une boite à induction afin d’être positionnés dans le cadre stéréotaxique compatible avec l’IRM. Une fois positionné dans le cadre stéréotaxique, l’animal sera positionné dans l’aimant pour réaliser l’acquisition des images. 3 sessions d’IRM seront réalisées à J+14, J+28 et J+49 après injection des cellules tumorales. La durée totale de l’examen IRM est de 30min. Prélèvements à la veine saphène Les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane pour effectuer le prélèvement de sang (durée) à la veine saphène. 3 sessions de prélèvements seront réalisées à J+10, J+35 et J+56 après injection des cellules tumorales. Traitement médicamenteux La moitié des animaux sera traitée par un médicament candidat luttant contre la propagation tumorale. Ce traitement sera administré quotidiennement par ajout dans l’eau de boisson et ce durant toute la durée de l’hébergement. Perfusion intracardiaque L’euthanasie interviendra à J+56 après injection des cellules tumorales ou du PBS (durée). Juste après le dernier examen IRM, et avant leur réveil, les animaux seront euthanasiés par administration de pentobarbital (Exagon 1ml/kg, soit 400mg/kg de pentobarbital) afin de préparer les tissus en vue d’utilisation pour des analyses post-mortem.
Impact sur les animaux
La nuisance principale attendue dans ce projet est liée à la croissance tumorale. En effet, la croissance des tumeurs hypophysaires est susceptible d’entrainer une perte de poids des animaux et une altération de l’état général. Pour prendre cela en compte, l’état des animaux sera surveillé quotidiennement et l’ensemble des signes associés au développement tumoral attendu chez les animaux sera surveillé de manière hebdomadaire. Concernant l’administration du médicament, nous n’attendons pas d’effet secondaire particulier car la substance active est déjà bien connue et a déjà été administrée à l’homme comme à l’animal sans effet secondaire notoire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure
Remplacement
L’utilisation de modèles animaux pour l’étude du développement tumoral et pour l’étude d’un inhibiteur pharmacologique est indispensable. - Des cultures cellulaires ont également déjà été utilisées en parallèle pour étudier la migration et l’invasion des cellules traitées ou non par les inhibiteurs pharmacologiques ce qui permet de limiter le nombre d’animaux. Seules les cibles ayant déjà prouvées leur efficacité sur des cultures cellulaires sont étudiées in vivo. - Seule l’utilisation de modèles animaux in vivo mimant le plus fidèlement le microenvironnement tumoral permettra d’étudier de manière spécifique le rôle des voix de signalisation étudiées dans la croissance tumorale et dans la migration des cellules tumorales vers les structures cérébrales adjacentes. - Seule l’utilisation de modèles animaux vivant permettra de confirmer le rôle inhibiteur des molécules sur la croissance tumorale et de mimer la maladie tumorale humaine.
Réduction
Dans une première étude, nous avons utilisé des groupes de 6 animaux par condition expérimentale. Nous avions estimé que c’était un nombre raisonnable au vue de la reproductibilité du modèle tumoral mis en place. Le nombre d’animaux par groupe avait été déterminé en utilisant un calcul de puissance statistique. Pour comparer les 2 groupes de rats (traités vs non-traités), nous avons utilisé un test non-paramétrique de Mann-Whitney. Dans le cas des mesures répétées (comparaison de la croissance tumorale ou du poids corporel dans le temps), des ANOVA à mesures répétées suivies des tests post-hoc adéquats ont été utilisés. Rétrospectivement, nous pouvons utiliser la différence observée lors de la première étude (N=6) pour améliorer le calcul de puissance statistique (logiciel G-Power et la formule de Cohen d = (M2 - M1) ⁄ SD, avec M1 et M2 les moyennes des volumes tumoraux des deux groupes et SD la déviation standard). Les études précédentes ont déterminé une moyenne de volume tumoraux, 0.1213 +/- 0.077 cm3 et 0.031 +/- 0.03 cm3 respectivement. Nous obtenons donc une valeur de d=1.52 selon la formule de Cohen. Avec un risque alpha de 5% et une puissance de 95%, nous obtenons N = 11 par groupe, soit 5 animaux supplémentaires par groupe. Afin de s’affranchir d’éventuelles pertes lors de la chirurgie, il est préférable d’ajouter 2 animaux par groupe soit N=13 par groupe.
Raffinement
Une acclimatation de 7 jours sera respectée à l’arrivée dans notre animalerie. Les animaux seront hébergés dans des cages adaptées à leur taille (2 par cage, portoirs ventilés, environnement à température contrôlée, cycle diurne-nocturne de 12h, eau et nourriture fournies ad libitum). Un examen quotidien sera effectué par les zootechniciens, sous la supervision permanente du vétérinaire. Un environnement enrichi par un système de nidification périssable et renouvelé à chaque changement de cage sera fourni, selon nos procédures standards. - Les examens IRM et les prélèvements de sang à la veine saphène seront réalisés sous anesthésie isoflurane avec soutien thermique et suivi de la fréquence respiratoires et de la température de l’animal. - Nous utilisons un scoring quotidien pour surveiller le,bien être animal. 5 composantes seront évaluées : apparence (qualité du poil, propreté des yeux et du nez), posture, mobilité, comportement et signes cliniques. Si necessaire nous demanderons conseil auprès de notre vétérinaire pour envisager la mise en place ou la poursuite d’un traitement analgésique Si un point limite est atteint l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Pour des raisons immunologiques, des rats seront utilisés pour l’injection des cellules hypophysaires de rats (GH3). L’apparition d’un phénotype tumoral chez les rates après injection de cellules GH3 a déjà été observée par le passé . Ce choix d’utiliser une injection dans l’hypophyse repose sur la création d’un modèle fidèle de tumeur hypophysaire mimant le microenvironnement tumoral et permettant d’étudier de manière plus spécifique l’envahissement des structures cérébrales adjacentes. Par ailleurs, les rats sont adaptés pour étudier le cerveau car leur petite taille permet de les examiner dans des scanners IRM performants. De plus, nous disposons d’une antenne IRM spécifique pour cerveau de rat, ce qui permet de diminuer le temps d’acquisition et donc les durées d’anesthésie des animaux. Tous les rats arriveront dans notre animalerie à l’âge de 9 semaines. La procédure expérimentale débutera après 1 semaine d’acclimatation. L'utilisation de rats au stade de 9 semaines correspond à la maturité sexuelle des animaux afin d'obtenir un environnement oestrogenique favorable au développement de la tumeur.
Evaluation de l’efficacité et de la sécurité de deux dispositifs innovants pour la thrombectomie chez un modèle porcin d’ischémie cérébrale.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
12 cochons vont être utilisés dans une procédure unique d'environ quatre heures menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Un modèle d'ischémie cérébrale est provoqué pour évaluer deux dispositifs de thrombectomie destinés à retirer un caillot dans une artère du cerveau, deux dispositifs testés sur le même animal. Le porteur indique qu'aucune nuisance supplémentaire n'est prévue au-delà du stress de la prémédication, puisque la procédure est sans réveil. Il affirme que la sécurité de ces dispositifs ne peut pas être évaluée in vitro et que seul l'essai in vivo permet de la confirmer.
Objectifs
L'accident vasculaire cérébral ischémique (AVC) est la première cause de handicap et la troisième de décès dans le monde occidental. L’AVC résulte de l'occlusion d'une artère cérébrale par un caillot sanguin appelé thrombus. Le traitement de l'AVC consiste à retirer mécaniquement le thrombus par voie endovasculaire, c'est à dire en passant par les veines et les artères. C'est ce qu'on appelle la thrombectomie mécanique. Pour cette intervention l'opérateur utilise différents outils endovasculaires, et des techniques pour extraire le thrombus de l'artère bouchée. Ce traitement est efficace dans 80 à 90% des cas. Cependant, le temps nécessaire au rétablissement de la circulation sanguine dans l’artère est parfois excessivement long, ce qui influence négativement l'évolution clinique des patients. Notre étude consiste en l'évaluation in vivo de la sécurité et de l'efficacité de deux nouveaux dispositifs endovasculaires conçus pour améliorer les procédures de thrombectomie cérébrale. Ils sont conçus pour être utilisés en conjonction avec les outils habituels et permettront d’améliorer la procédure en renseignant l’opérateur sur la localisation du thrombus et en optimisant le retrait de celui-ci. Ces deux dispositifs, qui se trouvent encore dans une phase de développement, ont déjà fait l'objet de multiples évaluations in-vitro, à l'aide de modèles d'artères cérébrales en silicone qui ont démontré leur efficacité mais n’ont pas permis d'évaluer leur sécurité d’utilisation. En effet, ils pourraient engendrer des dommages au niveau de la paroi d’une artère réelle (dissection ou rupture). Par conséquent, l'objectif de notre projet est d’étudier l’impact de l’utilisation de ces dispositifs à visée clinique sur les parois artérielles réelles, étape indispensable pour leur développement futur. Nous envisageons de reproduire des procédures de thrombectomies chez l'animal (sous anesthésie générale) en utilisant les dispositifs en cours d'évaluation et de prélever les vaisseaux pour réaliser une analyse histopathologique des différentes couches de la paroi en accord avec d'autres études animales similaires de références.
Bénéfices attendus
L'expérience proposée est essentielle pour prouver l'efficacité et la sécurité de deux nouveaux dispositifs d’aide à la thrombectomie (action de déboucher une artère) pour le traitement des accidents vasculaires cérébraux (AVC). En effet, les deux dispositifs que nous avons mis au point, associés avec les outils endovasculaires utilisés pour réaliser des thrombectomies standards, ont montré une bonne efficacité et même une amélioration de la procédure. Néanmoins la sécurité de ces dispositifs ne peut pas être évaluée in vitro et l’efficacité reste à confirmer in vivo. Notre étude comparera directement une procédure nouvelle d’un côté et la procédure standard de l’autre côté sur le même animal. Le gain de connaissances attendu par cette expérience permettra d’envisager une application future chez l’homme. L’apport de ce développement est significatif car le traitement des AVC aigüs représente un nombre important d’interventions dont les résultats cliniques à moyen terme sont directement liés aux aspects techniques de la procédure. Toute amélioration bénéficiera donc à ce domaine de recherche qui est très important en termes de santé publique. L’optimisation de ces dispositifs permettra in-fine d’améliorer le traitement des accidents vasculaires cérébraux (AVC) et par conséquent les résultats cliniques pour les patients.
Procédures
Les animaux ne seront soumis qu'à une seule procédure expérimentale d'environ 4h00 et classée sans réveil. L’animal restera sous anesthésie générale et tous les prélèvements tissulaires seront réalisés post-mortem.
Impact sur les animaux
En dehors des contraintes liées à la préparation de l'animal (stress au moment de la prémédication), aucune nuisance supplémentaire n'est prévue puisqu'il s'agit d'une procédure sans réveil, au cours de laquelle la gestion de la douleur et de l'anesthésie seront rigoureusement surveillées.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure alors qu'ils sont sous anesthésie générale.
Remplacement
Notre étude consiste en l'évaluation in vivo de la sécurité et de l'efficacité de deux nouveaux dispositifs endovasculaires conçus pour améliorer les procédures de thrombectomie cérébrale. Ces dispositifs sont conçus pour être utilisés en conjonction avec les outils couramment utilisés pour la thrombectomie, en particulier les fils guides, les cathéters et les stentrievers. Ces deux dispositifs permettront d’améliorer la procédure de thrombectomie en renseignant l’opérateur sur la localisation du thrombus et en permettant d’optimiser le retrait de celui-ci. Ces deux dispositifs qui se trouvent encore dans une phase de développement, ont déjà fait l'objet de multiples évaluations in-vitro à l'aide de modèles d'artères cérébrales en silicone. Bien que tous les tests appropriés aient été réalisés pour évaluer l’efficacité des dispositifs, il est impossible d’estimer, dans un environnement in vitro ou in silico, si les dispositifs provoqueront une lésion de la paroi de l’artère traitée (dissection, rupture de la couche musculaire). Ainsi, la seule alternative restante pour évaluer l’impact sur la paroi artérielle est d’utiliser les dispositifs dans un organisme vivant et d'évaluer ses conséquences.
Réduction
Nous évaluerons sur les animaux l’efficacité des deux dispositifs dans les conditions les plus défavorables (caillots durs) car nous avons déjà évalué in vitro l’efficacité des deux dispositifs dans les cas favorables (caillots mous). Ceci permet de réduire le nombre de tests in vivo. Le nombre d'animaux sélectionné est aussi faible que possible pour évaluer la sécurité des dispositifs comme reporté dans des études similaires. Par conséquent, nous prévoyons 24 gestes de thrombectomie par dispositifs testés ce qui représente un total de 12 cochons répartis en 6 sessions de test. Le fait d’évaluer deux dispositifs sur le même animal réduit le nombre nécessaire.
Raffinement
Toutes les mesures nécessaires seront prises pour éviter les nuisances pour les animaux. Concernant l'hébergement de ces animaux, les mesures de raffinement seront mise place en amont : période d'acclimatation d'une semaine, hébergement en groupe afin de limiter leur stress. L'enrichissement est réalisé en créant une zone de repos couverte de litière, leur permettant de s'allonger tous ensemble et de répondre à leur comportement de fouissement. Ils disposent également de jouets suspendus à mordiller. Au cours de la procédure, les animaux seront anesthésiés profondément, avec l’utilisation de médicaments analgésiques et anesthésiques adaptés pour toute la durée des expériences. L’animal sera placé sous anesthésie générale avant de procéder à l’accès artériel fémoral et durant toute la durée de l’intervention jusqu’à sa mise à mort. Par conséquent, aucune expérience douloureuse ne sera ressentie par l’animal pendant les expériences.
Choix des espèces
Le porc convient à ce type d'étude car sa taille, son anatomie vasculaire et le diamètre de ses artères sont proches de celle de l’homme et permettent d’utiliser les mêmes cathéters et dispositifs interventionnels, dans les mêmes conditions de diagnostic et de surveillance (radiologie). Les animaux sont choisis au terme du post-sevrage à l'âge de 3 mois. A ce stade de développement les diamètres de vaisseaux correspondent à ceux de l’humain et permettent donc de réaliser l'étude dans de bonnes conditions.
Evaluation de l’autotransfusion par le système i-SEP dans un modèle de saignements massifs répétés d’origine cardiaque chez le cochon : comparaison avec un appareil de référence et effet sur le comptage plaquettaire
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
16 cochons vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque animal subit une thoracotomie avec pose d'une canule dans l'oreillette droite du cœur, puis trois cycles de saignement massif et d'autotransfusion sous une anesthésie de dix heures, pour tester un dispositif d'autotransfusion avant une étude clinique. Le porteur décrit un choc hémorragique prolongé qu'il juge incompatible avec le réveil de l'animal. Sur le remplacement, il affirme qu'un modèle grand format proche de l'humain est "indispensable" et "sans méthode alternative".
Objectifs
L’autotransfusion consiste à collecter le sang du patient épanché lors de la chirurgie associé à un anticoagulant, à le traiter pour pouvoir réinfuser une grande partie de la portion cellulaire du sang (globules rouges en premier). Le sang collecté est transféré dans le module de traitement, concentré et épuré des molécules contaminantes (héparine, hémoglobine libre), pour obtenir un concentré de globules rouges et de plaquettes avant transfusion peropératoire. Le projet présenté développe un nouveau dispositif d’autotransfusion basé sur la filtration, autour d’un modèle chirurgical d’hémorragie massive chez le miniporc pour évaluer la sécurité et la performance du dispositif lors de nombreux cycles consécutifs. En particulier, il est indispensable d’étudier les paramètres suivants avant une nouvelle étude clinique : performances de l’aspiration (intégrée dans le dispositif) afin de libérer le champ opératoire du sang écoulé, les vitesses de traitement du sang après de nombreux cycles permettant de rendre rapidement le sang au patient limitant la transfusion homologue, l’effet sur la physiologie du patient de la transfusion de grands volumes de sang traité. Il est particulièrement indispensable d’éprouver cette nouvelle technologie par filtration lors de nombreux cycle en conditions chirurgicales pour vérifier la durabilité de la performance de filtration.
Bénéfices attendus
Le bénéfice principal de ce projet est de s’assurer d’une utilisation optimale du dispositif d’autotransfusion chez l’humain. En effet, il s’agit de garantir les performances et la sécurité du dispositif dans les cas de multiples cycles consécutifs, et de les comparer avec un dispositif de référence déjà sur le marché. Les hémorrhagies massives sont des cas rares mais particulièrement exigeants. En effet, la perte d’un important volume sanguin peut très rapidement dégrader l’état d’un patient et engager sa vie. Dans ces cas, il est indispensable que les performances du dispositif d’autotransfusion soient maintenues afin de rapidement rendre le sang au patient. De plus, la comparaison avec un dispositif de référence actuellement déjà sur le marché permettra de s’assurer de performances au moins égales ou supérieures du dispositif testé. Il a été montré que le dispositif testé permet de récupérer les globules rouges mais aussi les plaquettes. La récupération des plaquettes est significativement supérieure pour le dispositif testé par rapport au dispositif référence. Les échantillons sanguins prévus au cours des cycles de saignement et pendant le suivi post-opératoire permettront de tester la supériorité du dispositif testé sur la numération plaquettaire de l’animal lors du saignement de 80% du volume sanguin de l’animal.
Procédures
Une injection intra-musuclaire initiale sur animal vigile Sous anesthésie générale, procédure chirurgicale (thoracotomie avec pose d'une canule de prélèvement dans l'oreillette droite du coeur), cycle de saignement massif et d'autotranfusion: Une anesthésie de 10 heures, 4 heures d'instrumentation et procédures chirurgicales incluant les saignements répétés (3 cycles saignement/autotransfusion) Prélèvements sanguins dans un cathéter en place pendant toute la procédure sur animal anesthésié Euthanasie sur animal anesthésié
Impact sur les animaux
L’objectif du modèle étant d’étudier la performance de la machine et la qualité diu sang retransfusé sur un saignement massif et prolongé dans des conditions extrêmes. Pour se faire, il est nécessaire de mettre en place une réanimation minimale évitant le développement d’une coagulopathie dilutionnelle et sans transfusion de plasma ni de concentré plaquettaire pour ne pas modifier les caractéristiques du sang auto-transfusé. Pour ces raisons, les animaux seront gardés sous anesthésie générale pendant la procédure puis sédation profonde/anesthésie légère pendant l’observation des effets post-transfusionnels avant d’être euthanasié. Ainsi la douleur sera prise en charge et le potentiel état de choc hémorragique sera pris en charge alors que l’animal restera inconscient.
Devenir
Euthanasie En raison de l’induction d’un choc hémorragique prolongé et de la nécessité d’une réanimation minimale (sans transfusion d’alloproduits sanguins de type plaquettes et plasma), il est jugé que ce modèle mis au point pour tester l’appareil dans des conditions extrêmes n’est pas compatible avec le réveil de l’animal.
Remplacement
La stratégie d’évaluation du dispositif développé doit conduire à la démonstration de sa sécurité et de ses performances en vue de l’obtention des autorisations réglementaires pour sa mise sur le marché. Cette stratégie a été discutée avec les autorités réglementaires et notamment l’ANSM. Les évaluations prévues ici consistent à reproduire des situations cliniques extrêmes grâce à un modèle d’hémorrhagie. L’utilisation d’un modèle animal grand format, proche de la situation chirurgicale et conditions d’analyses rencontrées chez l’Homme est indispensable, sans méthode alternative. En effet, l’anticoagulant contenu dans les poches de sang de donneurs utilisé pour les tests in vitro (citrate) est différent de celui utilisé en clinique lors des interventions chirurgicales (héparine). De plus, le sang épanché aspiré lors d’une chirurgie rentre brièvement en contact avec le milieu extravasculaire, ce qui est suffisant pour déclencher la cascade de coagulation ainsi que des méchanismes d’inflammation, dont l’origine est impossible à reproduire in vitro avec du sang anticoagulé au citrate.
Réduction
D’importantes étapes de mise au point in vitro et ex vivo d’échantillons sanguins fournis par EFS et Oniris respectivement ont permis de lever d’importants verrous technologiques et de limiter le nombre d’animaux au strict nécessaire. Le nombre d’animaux est fixé au minimum, tout en assurant l’analyse statistique des résultats obtenus et la pertinence clinique du projet. Un calcul statistique de l’effectif nécessaire a été effectué en prévision de l’étude : L’effectif necessaire pour démontrer la supériorité du dispositif test par rapport au dispositif référence pour la numération plaquettaire de l’animal est calculé d’après la formule suivante : n = f(α/2, β) × 2 × σ² / (μ1 − μ2)² où μ1 et μ2 sont les moyennes attendues pour le dispositif testé et le dispositif référence, σ est l’écart-type et f(α, β) = [Φ-1(α) + Φ-1(β)]², avec Φ-1 est la fonction de distribution cumulative d’un écart normal standardisé. Considérant un niveau de signification (alpha) à 5% et une puissance (1- β) de 90%, l’effectif total nécessaire est de 16, c’est-à-dire 8 pour le groupe du dispositif testé et 8 pour le groupe du dispositif référence. Références : Pocock SJ. Clinical Trials: A Practical Approach. Wiley; 1983. Julious SA. Sample sizes for clinical trials with Normal data. Statist. Med. 2004; 23:1921-1986. Sealed Envelope Ltd. 2012. Power calculator for continuous outcome superiority trial. [Online] Available from: https://www.sealedenvelope.com/power/continuous-superiority/
Raffinement
En plus du raffinement des conditions d’hébergement, les procédures de préparation, d’induction de l’anesthésie, de mise en place de l’analgésie répondent aux exigences de l’analgésie multimodale pré-emptive et sont confiées à des anesthésistes/réanimateurs spécialistes. Une attention identique est portée au suivi des animaux pendant les interventions chirurgicales et le suivi postopératoire grâce à l’ensemble des moyens de monitorage du plateau technique. Les données de monitorage sont enregistrées fréquemment afin de relever à posteriori d’éventuelles réponses physiologiques chez les différents animaux. Des échantillons sanguins sont prélevés avant la chirurgie (après anesthésie), pendant la chirurgie et après la chirurgie (pendant le suivi post-opératoire) afin de collecter le maximum de données sur la numération plaquettaire, l’évaluation de l’hémostase et la biochimie de l’animal. Les besoins en données sont anticipés et ouverts aux analyses exploratoires afin de pouvoir effectuer des analyses sur des paramètres qui n’auraient pas été anticipés. De plus, les études préliminaires in vitro ainsi que la première étude comparative ont permis de raffiner les procédures réalisées et le protocole d’échantillonnage et d’analyse.
Choix des espèces
Le choix du mini-porc est fondé sur plusieurs critères : - Animaux de grande taille, aspect anatomique proche de l’homme ; paramètres hémato- biochimiques comparables et dont les variations sont accessibles par des techniques de dosages similaires à celle utilisées en médecine humaine, afin d’assurer la prédictivité des résultats. - La taille des animaux permet une gestion aisée de l’anesthésie et de l’analgésie, ainsi que l’utilisation d’instruments et de matériels identiques à ceux utilisés chez l’Homme. - Le mini-porc à l’âge adulte atteint un poids minimum de 40 kg et reste maitrisé par le rationnement (environ 50 kg) ce qui représente un avantage lors des manipulations comparativement au porc charcutier qui peut doubler de poids sur la même période et à âge égal. Animaux adultes
Évaluation de la biodistribution de bactéries thérapeutiques (LBP : Live Biotherapeutic Products) après leur administration dans les voies respiratoires du macaques cynomolgus
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
150 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque macaque, maintenu vigile sur une chaise à contention, reçoit une administration de bactéries dans les voies respiratoires, puis subit jusqu'à cinq lavages bronchiques et dix prises de sang sous anesthésie, avant d'être tué pour prélever ses organes. Le porteur reconnaît que la contention représente la principale contrainte pour l'animal. Il justifie le recours au macaque par la proximité de son système respiratoire avec celui de l'humain, un passage préalable par des rongeurs étant prévu.
Objectifs
Les maladies inflammatoires respiratoires représentent un ensemble de syndrome dont le développement est croissant avec l'augmentation de la pollution athosméphique et d'autres facteurs d'environnement. Ces maladies invalidantes sont souvent bien contrôles chez les malades, mais les traitements peuvent être lourds ou présentent des effets indésirables. Actuellement, les traitements des maladies inflammatoires du système respiratoire font appel à des thérapeutiques anti-inflammatoires chimiothérapeutiques ou à des immunothérapies classiquees administrées par voie générale. Ce projet a pour but d'étudier l'innocuité, la biodistribution et la biodisponibilité de produits de type Live Biotherapeutics Product administré par voie pulmonaire. Ces produits sont en cours de développement, leur effet aura été prouvé au préalable in vitro et doit être testé in vivo chez le singe macaque cynomolgus.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de mieux caractériser produits immunostimulants innovants, et de mieux les connaître avant de les utiliser pour le traitement des maladies inflammatoires pulmonaires. Les informations obtenues chez les singes, dont la physiologie et l'immunologie des voies respiratoires sont très proches de l'homme.
Procédures
L'administration des produits se fait avec un animal vigile, maintenu sur une chaise à contention. Les prélèvements prévus sont des lavages broncho-alvéolaires, et des prélèvements de sang, d'urine ou de fécès. La fréquence et le durée des prélèvements sont fonction des caractéristiques estimées du produit, avec un maximum de 4 semaines. Au total, on peut envisager 5 lavages bronchiques et 10 prises de sang au maximum.
Impact sur les animaux
L'adminstration du produit représentante un stress pour les animaux, mais elle n'est pas douloureuse. La principale contrainte est que l'animal est immobilisé dans une chaise à contention. Les prélèvements réprésentante une contrainte, mais ils sont réalisés sous anesthésie générale. Il est prévu de pouvoir réaliser dees prélèvements sanguins ou des lavages bronchiques principalement.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés sous anesthésie à la fin des protocoles pour pouvoir prélever les organes.
Remplacement
L'administration de LBP dans les voies pulmonaires pour lutter contre des maladies inflammatoires chroniques nécessite des développements précliniques spécifiques, permettant de mesurer la quantité de bactéries nébulisées dans les voies respiratoires, il est nécessaire de disposer d’un modèle animal pertinent. En effet, la nécessite de pouvoir observer des interactions complexes et fines entre organes n’est aujourd’hui possible que sur modèle animal, dans ce cadre d’étude. Même si des modèles in vitro de poumons existent, ils ne permettent pas de prédire la distribution et la viabilité d'un produit biologique aussi spécifique qu'un LBP, ni la réponse de l'organisme a l'influx soudain d'une large quantité de bactéries, même non pathogènes. Une approche sur des modèles de rongeurs est préalable aux essais sur Singes.
Réduction
Le nombre d'animaux est limité au minimum nécessaire. Pour tester un LBP, un groupe de 3 à 5 animaux au maximum est suffisant. Nos études sont exploratoires, très en amont dans le développement des produits. L'évaluation de l'effet se fait sur la base de l'analyse hostologique microscopique et de l'évaluation des populations cellulaires détectées après administration du produit. Avec un groupe de 3 à 5 animaux, seules des statistiques descriptives sont possibles, sachant que nous n'utilisons pas d'animaux témoins non traités. Nous comparons les résultats obtenus avec nos données de base, en comparant les données et parfois les moyennes pour évaluer une tendance. Le nombre d'animaux présenté dans ce projet est une estimation qui tient compte du nombre de produits qui pourraient être confiés à notre société pour en évaluer la biodistribution et l'innocuité. Si la demande est faible, il est évident que seuls les animaux nécessaires (3 à 5 par produit) seront utilisés.
Raffinement
Chacun des actes techniques mis en oeuvre pour ce projet ont été mis au point, étudiés et raffinés pour limiter le stress ou la douleur des animaux. La plupart des prélèvements sont réalisés sous anesthésie générale. L'administration se fait avec un système de contention auquel les animaux sont habitués au préalable pendant plusieurs jours, sans administration. Les techniques analytiques auxquelles nous faisont appel sont suffisamment sensibles pour réduire la quantité de prélèvement nécessaire. Ainsi, les volumes des prises de sang ou des lavages alvéolaires sont très faibles.
Choix des espèces
La macaque cynomolgus possède une proximité physiologique et immunitaire avec l’homme ainsi qu’une anatomie des grandes fonctions extrêmement proche de l’homme. En effet, l’anatomie de son système respiratoire (en partie liée à sa posture verticale (semi-bipède- par opposition aux modèles rongeurs ou porcins) est très proche de celle de l’homme, ou encore un système digestif ou urinaire sensiblement similaire également. Ces similitudes permettent de tester la distribution et la viabilité d’un produit biologiques pour une transposition future chez l’Homme (thérapie par nébulisation, administration par voie orale). Selon le type de LBP choisi et sa cible thérapeutique, des animaux jeunes (2 ans) ou plus âgés (à partir de 3 ans) pourront être utilisés pour des raisons de maturité du système immunitaire et de poids. Cependant, le stade de développement pourra être affiné avec le donneur d’ordre selon le type d’individus visé par la thérapie.
Rôle d’Enterococcus faecalis dans la genèse de l’inflammation pancréatique : susceptibilité individuelle et gravité des atteintes pancréatiques
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pour provoquer une pancréatite, chaque souris reçoit jusqu'à dix-huit injections de céruléine, des gavages et des injections d'antibiotique ou de bactéries, la céruléine pouvant causer des douleurs modérées répétées. Les animaux sont tués pour des analyses post-mortem. Le porteur affirme que les interactions entre bactéries, tube digestif et pancréas ne peuvent être reproduites in vitro et que le modèle animal est le seul auquel il peut recourir.
Objectifs
Le microbiote intestinal influence le développement des maladies digestives. En effet, les patients avec une pancréatite alcoolique présentent des modifications de leur microbiote intestinal en comparaison des patients avec une consommation alcoolique similaire mais sans pancréatite ou développant une atteinte hépatique. On trouve notamment une augmentation des entérocoques, en particulier d’Enterococcus faecalis. Il a été́ démontré que, chez les patients ayant une hépatite alcoolique aigue, les souches d’E. faecalis produisant la toxine cytolysine sont augmentées, cela est corrélé à la sévérité de la maladie. Il est montré que les patients avec une consommation alcoolique excessive développant une pancréatite alcoolique hébergent plus souvent des souches exprimant la cytolysine que les patients ayant une hépatite alcoolique. De plus, l’abondance relative d’E. faecalis productrice de cytolysine est de 10 à 100 plus importante chez les patients développant une pancréatite par rapport à ceux développant une hépatite. Cependant, le rôle de cette souche dans l’apparition et la gravité de la pancréatite n’est pas connu. Notre objectif est de démontrer que cette bactérie est un facteur prédisposant à la pancréatite en particulier lorsque la souche est productrice de la toxine cytolysine. Nous avons isolé des souches de E. faecalis de patients ayant une pancréatite. Notre projet vise à évaluer sur des modèles murins de pancréatite chronique ou aigue induites par la céruléine, l’implication de E. faecalis (avec ou sans production de cytolysine) sur le développement des lésions de pancréatite.
Bénéfices attendus
La pancréatite et ses complications, notamment le risque de cancer du pancréas, sont associées à une mortalité élevée et il existe peu de traitements actuellement. Notre approche vise à évaluer le rôle du microbiote intestinal chez les patients alcooliques, et en particulier d’Enterococcus faecalis, dans la survenue des dommages du pancréas. Si notre hypothèse se confirme, des stratégies de modification du microbiote intestinal, avec éradication de E. faecalis, pourraient améliorer la prise en charge des patients atteints de pancréatite chronique, soit environ 15 000 patients en France, et potentiellement prévenir les complications de la pancréatite sur le long terme, comme le cancer du pancréas.
Procédures
- Induction d’une pancréatite chronique : de 3 à 6 injections maximum intrapéritonéales de céruléine espacées d’une heure, une fois par semaine, pendant 3 semaines soit 18 injections /souris, ce qui concerne 180 souris au total. - Induction d’une pancréatite aiguë : 6 injections intrapéritonéale de céruléine espacées d’une heure,suivi du sacrifice la même journée soit 6 injections intrapéritonéale /souris/ ce qui concerne 120 souris au total. - Gavage PBS ou E. Faecalis : 1 gavage par semaine pendant 2 semaines soit 2 gavages/souris ce qui concerne 168 souris au total. - antibiothérapie préalable au gavage : 1 injection sous cutanée de clindamycine pendant 3 jours, pendant 2 semaines soit 4 injections /souris ce qui concerne 168 souris au total. - injection intraveineuse d’E. Faecalis : 1 injection intraveineuse de souches d’enterococcus faecalis par semaine pendant 2 semaines soit 2 injections intraveineuse/souris ce qui concerne 36 souris au total.
Impact sur les animaux
Le traitement à la céruléine par injections intra péritonéales peut engendrer des douleurs modérées, mais répétées lors des injections et dans les heures qui suivent. Les injections sous cutanées d’antibiotiques peuvent entrainer des douleurs légères au moment de l’injection. Le gavage peut entrainer un stress de la souris, et des douleurs modérées lors du gavage.
Devenir
Mise à mort pour analyses post-mortem.
Remplacement
Les complications qui vont être observées au cours de la pancréatite mettent en jeu des interactions entre les différents organes qu’il est encore actuellement impossible de reproduire in vitro. Notre projet correspond à un travail qui permettra de comprendre le lien entre microbiote intestinal, la barrière intestinale et le développement d’une pancréatite. Le modèle animal est le seul auquel nous pouvons avoir recours et qui permet d’intégrer les interactions entre bactéries, tube digestif et pancréas.
Réduction
Nous nous sommes basés pour calculer la taille des groupes sur le dosage d’un marqueur sérique de pancréatite qui est augmentée dans le modèle avec céruléine. Nous avons ainsi déterminé la taille des groupes de souris afin à la fois d’obtenir des résultats robustes d’un point de vue statistique et permettant de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, 12 souris par groupe de comparaison seront utilisées dans les procédures.
Raffinement
Les souris seront hébergées par 4. L’enrichissement classique en cellulose, ayant un impact sur le microbiote intestinal, sera remplacé par un enrichissement plastique. Le jour de la mise à mort, les souris seront manipulées dans un local différent de celui où seront hébergées les autres souris en attente d’être manipulées. Le temps de manipulation des souris vigiles sera minimisé au maximum afin de limiter le stress et l’angoisse des souris. C’est une des raisons pour laquelle nous demandons à ne pas avoir à pré-traiter les souris par une pommade à la lidocaïne. Nous utilisons pour les injections intra-péritonéales des petites aiguilles et un volume réduit afin de minimiser la douleur de la piqure. Pour les injections en intra-veineuse au niveau du sinus retro-orbital, les souris seront anesthésiées et les 2 injections à une semaine d’intervalle seront réalisées sur le sinus gauche puis à droite la semaine suivante. Les gavages réalisés sur souris vigile pour éviter les fausses routes seront également réalisées 2 fois à 1 semaine d’intervalle avec un volume réduit à l’aide de canules de gavage fine et courte bien adaptées au modèle murin et à la taille de l’animal. Les injections sous cutanées permettant l’administration des antibiotiques au niveau interscapulaire seront réalisées. Dans tous les cas les souris hébergées par 4 seront remises dans la cage avec leurs congénères avec une quantité de sciure augmentée favorisant leur enfouissement, en particulier après les manipulations.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car les mécanismes cellulaires développés dans la physiopathologie de la pancréatite sont proches de ceux observés chez l’Homme.
Étude de l’activité anti-Pseudomonas aeruginosa d’une souche clinique de Porphyromonas instillée en prophylaxie
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque souris reçoit deux instillations nasales de suspensions bactériennes à dix-huit heures d'intervalle, puis est tuée vingt-quatre heures plus tard pour récupérer ses poumons ou réaliser des lavages, les groupes recevant Pseudomonas aeruginosa pouvant perdre du poids et devenir inactifs. Le porteur affirme ne pas pouvoir répondre à sa question avec des outils de culture cellulaire et choisit donc de conserver le modèle animal. Il retient la souris pour sa sensibilité permettant de provoquer une pneumonie sans mortalité trop importante.
Objectifs
Pseudomonas aeruginosa (PA) est une bactérie responsable d’infection pulmonaire grave chez les patients atteints de mucoviscidose et chez les patients en réanimation. Cette bactérie, au gré de successives antibiothérapies, devient résistante à tous les antibiotiques habituellement utilisés. Aussi il est capital de rechercher des alternatives thérapeutiques aux antibiotiques comme les probiotiques. Les probiotiques sont des microorganismes qui, administrés en quantités adéquates, confèrent un bénéfice à la santé de l’hôte. Lors d’une étude précédente, l’analyse du microbiote respiratoire de patients atteints de mucoviscidose a permis de mettre en évidence un genre bactérien particulier : Porphyromonas. Ce genre bactérien et plus particulièrement Porphyromonas cationae (PC) semble être prédictif de l’infection à PA. Il a été montré chez ces patients, que ceux qui avaient moins de Porphyromonas dans les poumons, avaient plus de risque de se coloniser à PA. Par la suite, il a également été montré que la quantité de PC pulmonaire venait à diminuer, voire disparaître, préalablement à la colonisation à PA alors que PC restait stable chez les patients non colonisés. Précédemment, nous avons testé une souche clinique de Porphyromonas catoniae isolée de patients atteints de mucoviscidose qui semblerait plus efficaces in vivo. Nous avons réalisés 2 expérimentations indépendantes qui ont permis de valider l’effet bénéfique observée ; (réduction significative de la quantité de Pseudomonas aeruginosa à 24h post infection) avec la souche clinique de Porphyromonas catoniae. Nous souhaitons donc poursuivre ces expérimentations afin d’évaluer le mécanisme d’action de cette souche potentiellement bénéfique avec un modèle murin d’infection pulmonaire à PA avec ou sans prophylaxie à PC.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de recueillir des données sur l’intérêt de l’utilisation de souches cliniques de Porphyromonas comme potentiels bactéries bénéfiques (probiotiques) à visée anti-Pseudomonas aeruginosa, pathogène clé de plusieurs pathologies respiratoires humaines dont la mucoviscidose.
Procédures
Les animaux recevront deux suspensions bactériennes par instillation nasale à 18h d’écart. 24h plus tard, les animaux sont mis à mort avant récupération des poumons ou réalisation de lavages broncho alvéolaires.
Impact sur les animaux
Ce projet a été conçu pour minimiser les effets indésirables. Ce projet peut induire un stress chez les animaux. Un geste maitrisé par l’expérimentateur, une surveillance accrue (deux fois par jour minimum) des animaux avec une table de suivi de soins permettent également une diminution de ses effets. Les groupes recevant seulement Pseudomonas aeruginosa souche PAO1 ou Pseudomonas aeruginosa résitant à plusieurs antibiotiques (PA MDR) peuvent être sujets à une perte de poids, des douleurs, une mobilité réduite voire, une inactivité. Ces derniers seront gérés en accord avec la table de soins. Pour les groupes recevant du Porphyromonas, aucun effet indésirable n’est attendu au vu des expérimentations précédentes.
Devenir
Les 90 souris C57BL/6 mâles survivantes sont mis à mort à l’issu du protocole
Remplacement
Compte tenu des résultats obtenus in vitro montrant une réduction de la quantité de Pseudomonas aeruginosa (PAO1) en présence de Porphyromonas cliniques ainsi que les premiers résultats positifs in vivo pour la souche clinique, nous souhaitons poursuivre sur cette voie en confirmant la capacité protectrice de Porphyromonas, ainsi qu’évaluer son effet sur le système immunitaire. Nous ne pouvons pas répondre à cette question scientifique en utilisant des outils de culture cellulaire et tissulaire (culture in vitro et ex vivo), nous choisissons donc de conserver le modèle animal.
Réduction
Approche statistique : Le nombre de souris est déterminé de façon à mettre en évidence une différence de 1 log au niveau de la quantité de P. aeruginosa entre le groupe recevant uniquement du P. aeruginosa et celui recevant du Porphyromonas préalablement à l’instillation de P. aeruginosa. Nous avons choisi de suivre nos souris uniquement jusqu’à 24 h post-infection et non 7 jours pour limiter le nombre d’individus en nous basant sur l’expérience apportée par notre équipe lors de DAP précédentes. Nous nous limitons à une seule espèce de Porphyromonas (P. catoniae) alors que plusieurs espèces sont décrites dans le poumon et une seule souche clinique parmi les 7 isolées par notre équipe.
Raffinement
Avant toutes instillation intranasale, les animaux seront préalablement anesthésiés, une analgésie est mise en place en accord avec notre table de suivi de soins. De plus, les points limites seront monitorés régulièrement afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux
Choix des espèces
Les souris C57BL6/J ont été choisies, car leur sensibilité à P. aeruginosa permet de provoquer une pneumonie tout en évitant une mortalité trop importante. Par ailleurs ce modèle a déjà été étudié au sein de notre équipe de recherche à plusieurs reprises. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 8 semaines, car c’est l’âge des souris du même modèle retrouvé dans la littérature. C’est également l’âge des souris utilisées dans de précédentes expérimentations réalisées dans notre équipe, ce qui nous permettra de conserver le même modèle d’étude pour l’interprétation de nos résultats.
Le Fingolimod, inhibiteur du métabolisme de la sphingosine 1-phosphate, comme stratégie thérapeutique pour traiter les calcifications vasculaires associées à l’insuffisance rénale chronique
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
66 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Un régime enrichi en adénine provoque une insuffisance rénale chronique, puis un régime calcique induit des calcifications vasculaires, avant l'administration de fingolimod dont l'effet immunosuppresseur entraîne souvent une baisse persistante des lymphocytes. Les rats sont tués par anesthésie terminale au pentobarbital, avec un prélèvement de sang par ponction cardiaque et une nécropsie. Le porteur affirme qu'une vérification in vivo est nécessaire pour confirmer ses résultats in vitro et espère faire du fingolimod un traitement des patients insuffisants rénaux.
Objectifs
La calcification vasculaire (CV) est un processus actif de formation osseuse par des cellules locales, notamment des cellules du muscle lisse (CML), qui se transdifférencient en cellules calcifiantes entrainant l’apparition des dépôts de cristaux de calcium dans la paroi des vaisseaux. La CV est reconnue comme une complication majeure chez les patients atteints d’une insuffisant rénale chronique (IRC) en augmentant fortement leur morbidité dû à l’apparition des complications cardiovasculaires. Malheureusement, les mécanismes moléculaires impliqués dans la CV restent largement méconnus ainsi que des thérapies ciblées pour éviter sa progression. Nos résultats préliminaires montrent que des patients IRC sous hémodialyse avec un score modéré de calcification abdominale aortique, ont la concentration sérique de la sphingosine 1 phosphate (S1P), un lidpide bioactif, significativement augmentée par rapport aux patients sous hémodialyse sans calcifications. Nous retrouvons également cette augmentation dans le sérum d’un modèle murin d’IRC avec des CV, dans un modèle ex-vivo d’aorte calcifié ainsi que dans le milieu extracellulaire d’un modèle de transdifférenciation des CML en cellules calcifiantes. De plus, nous avons impliqué plusieurs partenaires de la voie métabolique de la S1P, dans le processus de transdifférenciation des CML en cellules calcifiantes. Le but de ce projet de recherche est de déterminer si l’inhibition générale du métabolisme de la S1P avec l’immunomodulateur fingolimod a des effets délétères dans la calcification des aortes de nos modèles in vivo et ex vivo ainsi que dans la transdifférenciation des CML d’origine vasculaire en cellules calcifiantes.
Bénéfices attendus
Notre objectif est d’apporter une contribution importante dans la compréhension de la physiopathologie des CV associées à l’IRC ; l’axe S1P étant potentiellement impliqué dans la transdifférenciation des CML vasculaires ainsi que dans l’apparition et l’entretien de la calcification de l’aorte. La physiopathologie des CV associées à l’IRC est toujours méconnue et peu de données sont disponibles sur les mécanismes de la néoformation osseuse qui a lieu dans les vaisseaux. Aussi, nous allons évaluer l’impact du blocage de l’axe S1P sur les CV dans notre modèle murin d’IRC et particulièrement sur l’ossification ectopique de l’aorte. Le fingolimod, que nous utilisons dans ce projet comme inhibiteur général de la voie de la S1P, pourrait agir à la fois comme un inhibiteur de la CV ainsi que comme un immunomodulateur. A terme, nos données devraient permettre de valider l’intérêt thérapeutique de l'inhibition du métabolisme de la S1P pour prévenir ou traiter les CV chez des patients IRC et fournir des pistes pour améliorer la prise en charge médicamenteuse des patients, qui n’est actuellement pas entièrement satisfaisante.
Procédures
Néphrectomie chimique : Induction d'une IRC par régime enrichi en adénine (0,75% w/w). Un régime enrichi en adénine est une méthode non chirurgicale pour induire une IRC chez le rongeur (néphrectomie chimique). Les animaux seront nourris pendant 4 semaines avec un régime alimentaire A04 supplémenté avec 0,75% (w/w) d'adénine (Sigma Aldrich) Ces régimes sont produits à façon par la société SAFE (Augy, France). Le régime adénine est bien toléré par les animaux et n'induit qu'un léger ralentissement de la croissance pondérale lié à une moindre prise alimentaire résultant d'une nette différence de palatabilité entre les aliments (Skafi et al, J Cell Physiol, 2019). A l'issue du régime adénine, les animaux récupérent ce retard de croissance. Induction des CV chez le IRC - Les animaux seront nourris pendant 4 semaines avec un régime alimentaire A04 supplémenté avec 1% (w/w) de calcium et 0.9%(w/w) de phosphore (Sigma Aldrich). Ce régime est produit à façon par la société SAFE (Augy, France). Ce régime est bien toléré par les animaux et n'induit pas de manifestation observable. Ils recevront 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi) des injections intrapéritonéales de calcitriol (1,25-dihydroxycholécalciférol ou vitamine D3) (Rocaltrol, Roche) à la dose de 80 ng/kg afin de maximiser la fixation du calcium alimentaire. Le calcitriol est dilué dans du propylène glycol (injection 0,3mL/100 g) qui est un véhicule métabolisé et dépourvu de toxicité.
Impact sur les animaux
A cause de son action immunosuppressive, l’effet secondaire le plus fréquent et le plus préoccupant du fingolimod est une lymphopénie qui s’installe chez les animaux dès le début du traitement et qui persiste, très souvent, tout au long de l’étude. Il a été démontré que dans un modèle d’arthrite induite par le collagène, 4 semaines de traitement avec le fingolimod dans l’eau de boisson à 0,1 mg/kg/jour permettent de diminuer l’incidence de la maladie et de restaurer partiellement la qualité osseuse chez le rat. En même temps, cette dose n’affecte pas le nombre de monocytes ou neutrophiles présents dans le sang périphérique. Dans un modèle murin d’Alzheimer, la même dose de 0,1 mg/kg/jour de fingolimod, également administrée diluée dans l’eau de boisson, ne modifie pas le nombre de lymphocytes par rapport au nombre total de leucocytes, même après 28 semaines de traitement. De plus, la présence du fingolimod dans l’eau de boisson, ne modifie la prise d’eau quotidienne par les animaux. Nous attendons donc du traitement avec le fingolimod à faible dose pendant 5 ou 7 semaines, des effets sur les CV, sans induction de lymphopénie. La procédure expérimentale N°1 nous servira à choisir la dose de fingolimod la plus adaptée à utiliser dans la procédure expérimentale N°2 qui ne provoque pas de lymphophénie et qui ne modifie pas a priori la prise d’eau et/ou de la norriture à cause de son gout. Dans la procédure expérimentale N°2 nous utiliserons un regime à base d’adenine pendant 4 semaines pour provoquer une IRC irreversible. Cette procédure à recemment été validé et publiée par notre équipe (Skafi et al, J Cell Physiol, 2019). Le régime adénine est bien toléré par les animaux et n'induit qu'un léger ralentissement de la croissance pondérale lié à une moindre prise alimentaire résultant d'une nette différence de palatabilité entre les aliments. A l'issue du régime adénine, les animaux récupérent ce retard de croissance.
Devenir
A la fin des procédures, tous les animaux seront euthanasiés à l'issue du protocole expérimentale par anesthésie terminale au pentobarbital sodique (60 mg/kg). Nous réaliserons également un prélevement terminal de sang par ponction cardiaque et une nécropsie (prélevement de différents tissus pour des études histologiques et biochimiques).
Remplacement
Nos résultats montrent qu’il existe un lien entre le métabolisme de la S1P et les CV dans l’IRC. Plusieurs partenaires de la voie métabolique de la S1P semblent être impliqués dans la transdifférenciation des CML en cellules calcifiantes. Des manipulations dans un modèle in vivo s’avèrent nécessaires pour vérifier nos résultats préliminaires obtenus in vitro. Le ciblage global du métabolisme de la S1P avec le fingolimod semble être une approche idéale pour l’inhibition de la calcification à la fois in vitro et in vivo. Si les résultats s’avèrent concluants, le fingolimod pourrait devenir un traitement de choix pour les patients IRC dans le but de prévenir, diminuer ou ralentir l’apparition des CV et en conséquence diminuer les accidents cardiovasculaires et la morbidité.
Réduction
La procédure expérimentale N°2 ne sera réalisée que si la procédure expérimentale N°1 donne les résultats attendus. La procédure N°1 nous permettra de vérifier que la présence du fingolimod dans l’eau de boisson ne modifie pas la prise d’eau/croquettes quotidienne par les animaux et n’induit pas une lymphopénie.
Raffinement
Les conditions d’hébergement et d’entretien des rats seront adaptés pour éviter des conditions délétères pour l’animal. Les animaux sont réceptionnés des établissements Janvier, deux semaines avant le début de l’expérimentation. La surveillance de l'environnement, fournitures et équipement auxquels les rats sont exposés est essentiel à l'entretien. L’état de bien-être est évalué quotidiennement par l’observation des signes physiologiques (perte de poids, aspects du pelage, morsures...). De la nourriture sera disposée au fond de la cage par prévention dès la période de stabulation afin de permettre aux rats de se nourrir en cas d’apparition de douleur au cours des procédures. Une couche importante de litière sera mise au fond de chaque cage, et le non enfouissement des rats étant un signe de mal-être nous y ferons attention.
Choix des espèces
Le présent protocole sera conduit sur des rats Sprague-Dawley. Les rats IRC développent en 4-5 semaines des CV lorsqu'ils sont soumis à un régime enrichi en P/Ca et qu'il recoivent des injections calcitriol. L'incidence des CV dans cette population est supérieure à 60%. Les rats Sprague-Dawley procedant de Janvier arriveront à l’animalerie avec 6 semaines et seront stabulés 2 semaines avant le début des expériences. A 8 semaines, les rats sont considerés comme jeunes adultes en ayant adquis leur maturité séxuelle à environ 6 semaines. Les rats auront un poids d’environ d’environ 200-250 g à l’arrivée à l’animalerie et de 300-350 g au début des manipulations.
Évaluation de l’effet thérapeutique du transfert adoptif de lymphocytes T humains optimisés dans le traitement de tumeurs solides humaines dans un modèle de souris immunodéficientes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris NSG immunodéficientes reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales humaines puis des injections hebdomadaires de lymphocytes T, une grosseur tumorale se développant dans le flanc. Les animaux sont tués pour des analyses post-mortem, ou plus tôt si trois signes cliniques notables ou un signe sévère apparaissent. Le porteur reconnaît que davantage d'animaux par lot serait préférable statistiquement mais retient cinq souris pour des raisons éthiques, et affirme que les cellules tumorales se comportent différemment in vitro et in vivo.
Objectifs
L’immunothérapie, devenue une thérapie de référence pour certains cancers métastatiques, consiste à améliorer les mécanismes de défenses spécifiques du patient pour éliminer la tumeur. Parmi les différentes stratégies, l'immunothérapie passive par transfert adoptif repose sur l’administration à un patient de cellules du système immunitaire reconnaissant un antigène tumoral spécifiquement exprimé par les cellules à éliminer. Des essais cliniques d’injection de lymphocytes ont déjà été réalisés et, s’ils ont montré une bonne tolérance, ils ont eu une efficacité anti-tumorale encore trop limitée. Ce programme de recherche préclinique vise à évaluer la faisabilité et l’efficacité thérapeutique, dans le traitement des cancers, de nouvelles approches d’immunothérapie passive par transfert adoptif de différents types d’effecteurs lymphocytaires T anti-tumoraux. Afin que cette étude soit la plus représentative possible de la pathologie humaine, un modèle de développement de xénogreffes de cellules tumorales et d’administration d’effecteurs lymphocytaires T humains optimisés sera établi dans les souris immunodéficientes NOD-SCID-IL-2Rγ [NSG]. Compte-tenu de la diversité importante des cancers, les différentes stratégies thérapeutiques pourront être testées dans deux modèles de cancers humains hautement immunogènes : le mélanome et le cancer colorectal. Les effecteurs lymphocytaires T humains utilisés seront des : - lymphocytes T cytotoxiques spécifiques d'antigènes tumoraux. - lymphocytes T modifiés génétiquement pour inactiver l'expression des gènes codant pour des Immune Checkpoint (IC), dont les ligands sont exprimés par les cellules tumorales préalablement injectées.
Bénéfices attendus
En conclusion, l’objectif principal de ce programme est d’obtenir, à l’aide de modèles "in vivo", des preuves de concept précliniques pouvant justifier la mise en place d’immunothérapies par transfert adoptif de lymphocytes T cytotoxiques optimisés par modification génétique visant à inactiver un ou plusieurs IC, dans le traitement des cancers. En fonction des données de faisabilité et d’efficacité obtenues, ces travaux pourront aussi permettre de prioriser le ciblage de certains de ces IC.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection sous-cutanée de 50µL de tampon PBS stérile (avec ou sans cellules) dans le flanc à J0 dans chaque procédure. Dans les procédures 2, 3 et 4, les animaux seront également soumis à des injections hebdomadaires (à partir de J7) en intraveineuse de 100µL de PBS stérile (avec sous sans cellules) pendant 3 semaines. Ces injections en elles-mêmes sont de l’ordre de la minute. La procédure d’injection des cellules tumorales dans le flanc sera réalisée sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (4%/air comprimé pour induction puis 2%/air comprimé pour le maintien).
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis aux nuisances ou effets indésirables suivants : - une douleur intrisèque à l’injection (piqûre) dans le flanc, de cellules dans un volume donné (50 à 100µL) de tampon phosphate salin. - un refroidissement des souris lors de l’anesthésie gazeuse. - le développement d’une grosseur tumorale dans le flanc est attendu.
Devenir
Tous les animaux inclus dans le protocole seront mis à mort, car des études ex-vivo seront effectuées à partir de prélèvements post-mortem effectués sur les animaux.
Remplacement
Remplacement : Les paramètres observés dans cette étude ne peuvent pas à ce jour être remplacés par des procédures "in vitro". L'évaluation chez l'homme du bénéfice thérapeutique de l’administration d’effecteurs immunitaires, nécessite le développement d'études précliniques permettant de vérifier la faisabilité de ces thérapies et de détecter la survenue de premiers effets secondaires délétères. Concernant l’immunothérapie anti-tumorale, il est établi que les cellules tumorales se comportent différemment "in vitro" et "in vivo", en terme de croissance, de résistance à la lyse et de capacité à instaurer un environnement délétère pour le système immunitaire. Notre étude permet d'évaluer l'efficacité du traitement proposé en conditions physiologiques (notamment en termes de migration de lymphocytes T injectés sur le site tumoral), et de définir les modalités optimales d’administration des effecteurs lymphocytaires. Compte-tenu de la difficulté de mise en place d’essais cliniques et de recrutement de patients éligibles, il paraît clair que les informations obtenues suite à ces travaux précliniques, couplées aux données obtenues "in vitro", auront une importance capitale lors du transfert en clinique.
Réduction
Réduction : Le nombre d'animaux a été réduit à des lots de 5 souris et les résultats seront analysés statistiquement par des tests de comparaison : test de Wilcoxon ou Mann -Whitney. D'un point de vue statistique, l'utilisation de plus d'animaux par lot semble préférable mais d'un point de vue éthique, le nombre d'animaux utilisé est réduit au minimum. Plusieurs études publiées dans notre domaine de recherche avec des modèles animaux similaires décrivent l'utilisation de 5 animaux par lot.
Raffinement
Raffinement : Pour leur confort, les animaux seront hébergés dans des cages adaptées (groupe de 5 souris par cage maximum), avec enrichissement (frisottis et/ou dôme) et accès libre à l’eau et à la nourriture. De façon à diminuer le stress, les différentes procédures seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Le bien-être des souris sera surveillé tout au long de l'étude avec une évaluation des signaux généraux (visite 3 fois par semaine en présence d’un signe clinique notable et visite quotidienne s’il y a présence de signes cliniques notables (cf annexe « gestion de la douleur »)). De plus, en présence de trois signes notables ou un signe sévère : les animaux seront mis à mort, après une anesthésie gazeuse à l’isoflurane (4%/air comprimé) par dislocation cervicale.
Choix des espèces
Les souris sont des modèles d'étude pertinents, notamment en immunothérapie anti-tumorale, de par leur facilité d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. L'utilisation préalable de ces animaux par des équipes scientifiques internationales permet à d’autres travaux de recherche de débuter avec une base solide (connaissances théoriques, modèles, équipement, ...). Le développement de xénogreffes de tumeurs humaines chez la souris nécessite l’utilisation de sujets immunodéficients (évite le rejet de greffe) tels que les souris NSG qui sont dépourvues de lymphocytes T, B et de cellules NK. Ces souris permettent la croissance de nombreuses lignées tumorales humaines et l'utilisation d'effecteurs T d'origine humaine. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (6-10 semaines) pour des raisons de maturité du développement squelettique et nerveux, facilitant non seulement le geste lié aux greffes de cellules tumorales et de lymphocytes T mais renforçant aussi la pertinence des effets thérapeutiques (transfert clinique chez des patients adultes).
Impact de l’épilepsie sur un modèle murin transgénique de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 083 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère. Des souris transgéniques Alzheimer reçoivent une injection de kaïnate pour déclencher des crises d'épilepsie, avec pour certaines l'implantation chirurgicale d'électrodes ou d'une pompe sous-cutanée, les crises pouvant provoquer des morsures de la langue et, dans moins de 10 % des cas, un arrêt cardiaque. Le porteur indique que l'euthanasie est "incontournable" pour étudier le cerveau. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle alternatif validé pour étudier ensemble épilepsie, neurodégénérescence et déclin cognitif.
Objectifs
L'association entre crise épileptique et mort neuronale (ou neurodégénérescence) a été observé à maintes reprises en clinique. Les sujets épileptiques présentent des troubles de la mémoire, de l’attention, mais aussi des déficits dans les fonctions d’exécution (comme la gestion du temps et de l'espace, l'élaboration de stratégies...). Dans la maladie d'Alzheimer, l’état de mal ou des crises épileptiques mal contrôlées pourraient servir de déclencheur. Malgré ça, à l’heure actuelle, aucune étude n’a intégré des modèles de crises épileptiques avec des modèles de la maladie d’Alzheimer. De plus, aucun mécanisme ou cible pharmacologique n’a été proposé pour limiter la progression de la maladie d'Alzheimer dans le contexte de crises épileptiques. Ce projet permettra de tester les hypothèses suivantes: 1-les crises épileptiques suffisent à déclencher de la neurodégénérescence dans le cerveau. 2-ces effets sont plus sévères avec l’âge (cette exploration est importante, à la vue de l’incidence importante et croissante des épilepsies chez les personnes âgées). 3-les crises épileptiques sont capables d’accélérer la mort neuronal dans un modèle préclinique de la maladie d’Alzheimer. Un traitement pharmacologique spécifique et adapté pourrait freiner le développement de la maladie d'Alzheimer associé à l’épilepsie.
Bénéfices attendus
En terme de santé publique, aucune étude n’a encore établi un lien de cause à effet entre une crise épileptique aigue et l’apparition de signes associés à des processus neurodégénératifs chez un même patient. Par contre, il est bien connu, qu’un état de mal épileptique peut entrainer des séquelles neurologiques à long terme. L’absence de connaissances fondamentales sur la prédiction de la trajectoire neurologique et du suivi clinique est un réel problème après l’apparition d’une première crise épileptique sans cause définie. Nous connaissons, néanmoins, l’existence d’un lien entre crises et neurodégénérescence dans la maladie d’Alzheimer car l’état épileptique a été démontré comme un facteur de risque chez l’homme. Avec cette étude, nous posons donc l’hypothèse d’un mécanisme reliant l’hyperactivité des neurones aux processus neurodégénératifs associés à la maladie d’Alzheimer. Ce projet nous permettra d’en appréhender les mécanismes fonctionnels et biochimiques sur le long terme et de tester le potentiel thérapeutique d’une nouvelle famille de molécules ciblant les principales hormones endogènes anti-inflammatoires, les glucocorticoïdes.
Procédures
Les animaux pourront être soumis à différentes interventions selon leur groupe, soit des procédures chirurgicales (< à 35 min), soit des injections intrapéritonéales, soit des analyses comportementales et enfin la mise à mort pour analyses des tissus cérébraux: implantation d'électrodes pour enregistrement d'électroencephalogramme + injection intrapéritonéale de Kainate + tests comportementaux (120 animaux) - injection intrapéritonéale de Kainate + tests comportementaux (288 animaux) - injection intrapéritonéale de Kainate (288 animaux) - implantation d'électrodes pour enregistrement d'électroencephalogramme + injection intrapéritonéale de Kainate + implantation sous cutanée d'une pompe osmotique + tests comportementaux (160 animaux) - injection intrapéritonéale de Kainate + implantation sous cutanée d'une pompe osmotique + tests comportementaux (128 animaux). Les animaux seront suivi au maximum pendant 8 semaines.
Impact sur les animaux
L'induction de l'épilepsie sur la souris engendre des décharges neuronales fortes et incontrolables. Ces crises « épileptiques », comme chez l’homme, peuvent entrainer l'animal à se blesser (morsure de la langue). Dans moins de 10 % des cas, un arrêt cardiaque peut également survenir. Si les crises devaient perdurer au dela des 2 heures suivant l'induction de l'épilepsie, une injection intrapéritonéale d’un calmant (le diazépam) permettra de diminuer l’apparition des crises. Cette injection induit une somnolence prolongée de l’animal, entrainant une possible déshydratation, qui est anticipée de façon systématique par l’injection intraperitonéale d’une solution saline stérile. Tous les tests comportementaux sont des tests non douloureux basés sur de l'exploration d'arènes ou de labyrinthes. La pose d'un implant crânien pour le suivi électroencéphalographique, ou de la pompe osmotique, peut entrainer un inconfort temporaire, et être associé à un grattage plus intense au niveau de la zone de cicatrisation.
Devenir
Dans la mesure où il sera nécessaire d’étudier l’impact des différents traitements sur le cerveau, l’euthanasie des souris est incontournable.
Remplacement
De manière très générale, il est aujourd’hui très difficile en neurosciences d’étudier le fonctionnement du cerveaux sur des modèles simplifiés et donc de remplacer l’étude sur l’animal dans sa globalité. En effet, il n'existe pas de modèles alternatifs validés pour étudier les crises épileptiques, la neurodégénérescence et le déclin cognitif (e.g., maladie d’Alzheimer) dans leur globalité.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé pour ne pas compromettre les objectifs du projet. Le nombre d'animaux nécessaire est basé sur une connaissance approfondie des modèles et de l'expérience acquise par notre équipe . Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé par un logiciel de statistique.
Raffinement
Afin de minimiser les effets du stress le jour de l'expérimentation (en particulier au moment des tests comportementaux), mais également afin de contrôler l’état général des animaux, l’animalier, et/ou l’expérimentateur, manipuleront quotidiennement les animaux et observeront leur comportement général, ainsi que leur apparence. Toutes observations anormales (comportement, poids, pelage, plaie,…) seront transmises à l’expérimentateur afin d’être traités dans les plus brefs délais et seront notés dans un tableau de suivi expérimental. Un animal sera euthanasié s’il présente, une perte de poids > à 15%, une attitude inhabituelle traduisant un mal être (prostration, agressivité...), ou l’apparition de toute altération de l’état général (altération du pelage, tumeur, excroissance, prolapsus…). Tous les tests comportementaux sont des tests non douloureux basés sur de l'exploration d'arènes ou de labyrinthes. Tous les tests seront réalisés dans une pièce dédiée et les animaux y seront placés au minimum 30 minutes avant les tests. La chirurgie sera réalisée sous anethésie générale et afin de minimiser la douleur liée à la chirurgie, un analgésique sera injecté en amont.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix au niveau international pour l’étude de la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer et de l’épilepsie. Ces études chez l’animal vigile sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements potentiels. De plus, l'utilisation d'animaux transgéniques (modèle Alzheimer) justifie également le choix de cette espèce. Une première caractérisation sera effectuée à l’âge de 3, 6 et 9 mois sur le modèle de souris Alzheimer. La caractérisation comportementale a déjà été effectuée sur ce modèle dans notre laboratoire et des déficits de mémoire apparaissent dès l’âge de 3 mois. Nous nous baserons donc sur ces résultats obtenus et sur les résultats obtenus aux âges de 3, 6 et 9 mois, pour choisir l’âge le plus pertinent afin de tester des traitements préventifs et/ou curatifs.
Génération d’anticorps monoclonaux dirigés contre des protéines virales en utilisant des souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque paire de souris reçoit deux injections d'antigène dans la patte, à douze jours d'intervalle, puis est tuée par dislocation cervicale deux jours plus tard pour prélever les ganglions poplités et en extraire les lymphocytes. Le porteur affirme qu'aucune méthode de remplacement n'existe pour obtenir des anticorps monoclonaux de souris et que les méthodes de prédiction informatique ne sont pas prouvées pour des antigènes complexes. Il retient la souris plutôt que le rat ou le lapin au motif d'un coût plus faible.
Objectifs
Le but des travaux est d’obtenir des anticorps monoclonaux de souris dirigés contre des protéines virales de polyomavirus et coronavirus. Ces travaux permettent d’obtenir des réactifs immunologiques indispensables à l’étude de ces virus et potentiellement de développer des immunothérapie. Après une semaine d’acclimatation, les souris (2 souris/ antigène) seront immunisées par voie intrapodale avec 50μl/patte de solution contenant 5 μg d’antigène et 2 μg de QuilA (adjuvant de l'immunité permettant de renforcer l'immunogénicité des protéines injectées). Après 12 jours, une seconde injection avec la meme posologie et voie d'administration sera réalisée. Les souris seront mises à mort 2 jours après la seconde injection et les ganglions poplités seront récupérés afin d’en extraire les lymphocytes. Les souris seront utilisées par paires en fonction des besoins, une paire de souris permettant de réaliser des anticorps monoclonaux pour un antigène. Ainsi, nous prevoyons un total de 40 souris pour 20 antigènes sur la periode de validité de la saisine (5 ans).
Bénéfices attendus
Le projet vise à produire des anticorps monoclonaux dans le but d'avoir des réactifs immunologiques indispensables à l’étude de ces virus. De plus, dans le cas ou ces anticorps sont neutralisants, ils pourront par la suite servir au développement de nouvelles immunothérapies dans des pathologies liées aux Polyomavirus et aux coronavirus.
Procédures
Après une semaine d'acclimatation, les souris seront immunisées par voie intrapodale avec 50μl/patte de solution comportant 5 μg d’antigène et 2 μg de QuilA (Adjuvant de l'immunité permettant de renforcer l'immunogénicité des protéines injectées) Cette intervention dure environ 1 minute. Après 12 jours, une seconde injection avec la meme posologie et voie d'administration et la même durée d'intervention sera réalisée. Les souris seront mises à mort par dislocation cervicale 2 jours après la seconde injection (duré d'intervention inférieur à 1 minute) et les ganglions poplités seront récupérés afin d’en extraire les lymphocytes.
Impact sur les animaux
La seule douleur qui sera ressentie sera celle des inoculations par voie intrapodale (aiguilles 26G). L’adjuvant utilisé n’induit qu’une inflammation légère et le volume injecté n'est que de 50 μl/patte. Au vu de la durée de l'expérimentation et de sa nature, génération d'une réponse immunitaire, les animaux n'ont aucune raison rationnelle de developper un syndrome algique suite à l'injection, il n'existe donc pas de point limite strict liée à l'immunisation . Néanmoins, toute dégradation de l’état de santé des animaux (prostration, pelage hérissé) conduira à leur euthanasie au CO2.
Devenir
Les 40 souris (2/antigène) à J14 seront euthanasiées par dislocation cervicale et prélèvement des ganglions poplités.
Remplacement
Aucune méthode de remplacement n’existe pour l’obtention d’anticorps monoclonaux de souris, l’induction d’une réponse immunitaire in vivo est nécessaire pour l’obtention de ces réactifs. Les methodes informatiques par prédiction n'ont pas encore fait l'objet de preuve de concept pour des antigènes complexes comme des particules virales.
Réduction
Le nombre de souris utilisé (N=2/ antigène) est le nombre minimum de souris requis pour l’obtention d’anticorps monoclonaux, nombre suffisant de lymphocytes.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement physique des cages d'hébergement systématique (abris en plastique rouge transparent et papier absorbant) ainsi qu'un enrichissement social (2/cage)
Choix des espèces
La souris est actuellement l’espèce de référence pour la génération d’anticorps monoclonaux. Les autres espèces utilisables, rat et lapin, sont d’un coût plus élevé. 7 semaines (incluant semaine d’acclimatation. Stade physiologique : croissance