Recherche appliquée

96 rattes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque ratte subit une laparotomie et une chirurgie des cornes utérines pour tester des produits anti-adhérence, l'opération abdominale pouvant provoquer des douleurs post-opératoires, avant d'être tuée pour prélever ses cornes utérines. Le porteur indique utiliser les deux cornes de chaque animal pour tester deux produits et réduire ainsi le nombre de rattes. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou sur une autre espèce ne convient et que les produits ont été présélectionnés par méthode alternative.

Objectifs

Ce projet consiste à évaluer l'efficacité de produits anti-adhérence, destinés à la prévention de la formation d’adhésions intra-utérines post chirurgie. L’efficacité au niveau des cornes utérines sera réalisée en ex-vivo par imagerie médicale (scanner micro CT) et en histologie. Ces études, réalisées sur des rattes, ont pour but d’évaluer l’effet protecteur de différents produits anti-adhérence en comparaison à un produit de référence déjà présent sur le marché. Ce modèle in vivo est représentatif à la fois des adhérences observées après des chirurgies des cornes utérines chez la femme, mais également des modalités d’administration du futur produit chez le sujet traité. Les analyses par imagerie µCT permettrons d’évaluer les structures luminales de l’utérus et ainsi visualiser et localiser les potentiels adhérences. Ces analyses seront complétées par des analyses histologiques en fin de phase expérimentale.

Bénéfices attendus

Les adhésions sont une complication commune après de nombreuses chirurgies, incluant les chirurgies gynécologiques. Les adhésions post chirurgies peuvent entrainer des problèmes médicaux importants, comme l’infertilité, de la douleur chronique ou une perte de fonction. Des produits anti-adhérences peuvent ainsi aider à prévenir ou réduire le risque d’adhérences post-chirurgie en créant une barrière entre les tissues et l’organe pendant le process de réparation. Ce modèle animal permet de mimer ce qui est observer chez les femmes et ainsi tester de nouveaux produits. Ainsi, les dommages potentiellement infligés à un nombre restreint d’animaux lors de ces études sont justifiés au regard des futurs bénéfices éventuels dont pourront profiter les patientes présentant des adhérences intra-utérines.

Procédures

Tous les animaux subiront une laparotomie en vue d’une chirurgie des cornes utérines (à l’exception de l’animal contrôle chirurgie qui ne subira qu’une laparotomie) pour administration locale des produits anti-adhérence sous anesthésie générale réalisée par un chirurgien vétérinaire compétent.

Impact sur les animaux

Ce projet a pour objectif d’étudier les effets de produits anti-adhérence sur les tissus intra-utérins post-chirurgie. La chirurgie abdominale (laparotomie) peut entrainer des douleurs post-opératoires. Une surveillance poussée des plaies abdominales et l’utilisation d’analgésiques est donc prévus pendant la durée nécessaire au rétablissement des animaux.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de la phase expérimentale afin de prélever les cornes utérines et analyser les adhérences des tissus post-mortem via des analyses d’imagerie à rayons X et histologiques.

Remplacement

L’étude in-vivo chez le rongeur est la meilleure alternative en en termes de modèle chirurgical et de sélection de nouveaux produits candidats. La procédure expérimentale décrite dans le présent projet ne dispose pas de modèle in-vitro ou in-vivo sur une espèce alternative. Les produits tests ont été préselectionnés par méthode alternative in-vitro.

Réduction

L’utilisation des 2 cornes utérines de chaque ratte permet d’administrer 2 traitements différents par animal, ce qui permet d’optimiser l’utilisation de l’organe et ainsi réduire le nombre d’animaux nécessaire pour atteindre des données scientifiques robustes.

Raffinement

Afin d’éviter les phénomènes d’automutilation qui peuvent survenir suite à la chirurgie, une période d’acclimatation est prévue. Les animaux bénéficieront de 12 jours d’acclimatation minimum dont une période d’habituation de 7 jours minimum permettant aux groupes sociaux de se faire plusieurs jours avant la chirurgie. De plus, une surveillance accrue et quotidienne des rattes pendant 7 jours après la chirurgie (avec observation clinique de l’état général, observation des plaies abdominal, pesées) et l’utilisation d’analgésique pendant 3 jours après la chirurgie est prévu afin de prévenir et réduire la douleur post-chirurgicale. Des points limites adaptés à la procédure ont également été définis : - Perte de plus de 20% du poids maximum relevé dans l'étude, - Un état général de l'animal altéré associant différents signes cliniques (poil hérissé, dos vouté, prostration, perte de mobilité rendant l'abreuvement ou alimentation difficile, détresse respiratoire particulièrement si elle est accompagnée d’un écoulement nasal et/ou de cyanose, saignement ou écoulement purulent d’un orifice, écoulement au niveau des yeux, ataxie, tremblement) à l'appréciation des personnels en charge des animaux. - En soins post-opératoire : infection et/ou un gonflement de la zone opérée non compatible avec le comportement normal de l'animal, gonflement de la cicatrice, extériorisation d'organes par rupture de points.

Choix des espèces

Le rat est une espèce couramment utilisée pour réaliser des modèles chirurgicaux. En effet, l’anatomie du rat est bien connue et sa taille facilite les analyses histologiques et d'imagerie par rapport à des plus petites espèces. De plus, il s'agit d'un animal couramment employé en expérimentation animale, permettant ainsi d'une part de gérer plus facilement son bien-être au cours de l'étude et d'autre part de travailler sur des lots homogènes (âge et sexe fixés). De plus, c’est une espèce largement décrite dans la littérature pour la recherche sur les adhésions utérines et les traitements associés. Des rattes adultes seront utilisées dans ce projet pour avoir des utérus matures.

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections d'une neurotoxine, le MPTP, destinée à provoquer des symptômes parkinsoniens modérés comme une perte de mobilité et une posture prostrée, puis une illumination proche infrarouge, avant d'être tuées pour prélever leur cerveau. Le porteur revendique la recherche d'un traitement curatif comme une nécessité tout en renvoyant les résultats de l'essai clinique en cours à quatre ou cinq ans. Il justifie le recours à la souris par le fait que le modèle MPTP est un modèle de référence déjà utilisé dans son laboratoire.

Objectifs

La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative qui touche de plus en plus de personnes. Cette maladie se traduit par des tremblements, des difficultés à se mouvoir, des troubles cognitifs et moteurs, des sautes d’humeur ainsi que des troubles de la personnalité. Elle prend naissance à cause d’un dysfonctionnement progressif des ganglions de la base situés dans le cerveau. Les traitements les plus utilisés actuellement pour limiter les symptômes sont une administration de L-Dopa, qui est un substitut de dopamine (neurotransmetteur impliqué dans la maladie), ou encore un implant cérébral (Stimulation Cérébrale Profonde). Ces 2 traitements sont pour le moment symptomatiques et ont une durée d’efficacité limitée dans le temps. Il n’y a aucun traitement curatif permettant à l’heure actuelle de guérir cette maladie. Lors des 10 dernières années, des équipes ont étudié les effets de la photobiomodulation (PBM), qui est une technique d’illumination de tissus ou d’organes par un rayon proche infra-rouge, sur le cerveau dans un contexte préclinique mettant en place des modèles animaux parkinsoniens. Les résultats sont très encourageants avec des réductions de symptômes observés sur les différentes études menées. Une étude clinique est en cours chez des patients parkinsoniens pour évaluer le potentiel thérapeutique de la PBM pour ralentir l’avancée de la maladie. Ce projet consiste à mieux comprendre les effets de la PBM, sur des souris parkinsoniennes (induits par administration d’une neurotoxine, le MPTP). L’objectif de l’étude est d’évaluer si la PBM permet de préserver la fonctionnalité des neurones impliqués dans le processus de la maladie de Parkinson. En effet, nous ne savons toujours pas si la PBM garde la fonctionnalité de ces neurones intacte. Des neurones peuvent en effet rester en vie mais ne plus fonctionner; les symptômes restent donc présents. A l’inverse, si les neurones préservés conservent ou retrouvent même partiellement une fonctionnalité, traduite par une production de dopamine les symptômes de la maladie diminuent. Pour évaluer les effets de la PBM sur la dégénérescence fonctionnelle des neurones, il est nécessaire d’étudier si les cellules préservées par la PBM sont encore fonctionnelles ou si elles perdent tout de même leur activité. Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes mis en œuvre, et donc d’adapter et d’interpréter au mieux les résultats cliniques.

Bénéfices attendus

La maladie de Parkinson est une pathologie neurodégénérative et un problème de santé public. Il n’existe pour le moment que des traitements symptomatiques possédant une efficacité limitée dans le temps. La recherche d’un traitement curatif efficace de cette pathologie est donc une nécessité. Des études préalables ont déjà permis d’identifier la photobiomodulation (PBM) comme une alternative thérapeutique permettant de préserver la survie des neurones dopaminergiques dont la dégénérescence est responsable des symptômes de la maladie. Un essai clinique est en cours et les résultats ne seront connus que d’ici 4 à 5 ans. Néanmoins, son interprétation sur l’évaluation de la maladie et les symptômes associés nécessitera d’avoir des éléments de compréhension des mécanismes mis en jeu par la PBM, et notamment de savoir si la lumière permet, en plus de la survie des neurones, de préserver leur fonctionnalité. En effet, des neurones vivants mais non fonctionnels ne produisent plus de dopamine ; si la PBM permet de restaurer (même partiellement) la fonctionnalité des neurones, on peut espérer réduire certains symptômes (recul de la pathologie). Le modèle MPTP choisi induit des symptômes modérés, permettant aux animaux de rester autonomes (mais ralentis) le temps du protocole. Ce modèle est représentatif de patients dans les premières années après le diagnostic quand il reste encore 30 à 50% des neurones dopaminergiques à préserver et/ou rendre à nouveau fonctionnels. Si les résultats démontrent que la PBM restaure une partie de la fonctionnalité des neurones, cela ouvrira la porte au traitement de patients plus avancés dans la maladie, auxquels on peut espérer redonner de la mobilité en réduisant les symptômes, et en rendant à nouveau fonctionnels la petite proportion de neurones encore présents. Enfin, cette étude ouvrira des pistes d’applications pour d’autres pathologies neurodégénératives, ou de défaut de fonctionnalité des neurones.

Procédures

Un groupe d’animaux tests de 12 individus maximum sera mis en place au début de l’étude, afin que l’expérimentateur puisse se former aux gestes nécessaires qu’il aura à effectuer lors de la réalisation de ce projet. Ces animaux seront, dans la mesure du possible, des animaux issus de procédures expérimentales précédentes afin de réduire le nombre d’animaux à utiliser pour la procédure expérimentale. Pour pouvoir être inclus dans cette nouvelle procédure, ces animaux ne devront pas avoir subi de procédures autres que légères. Une fois la procédure réellement commencée, les animaux ne seront pas manipulés avant d’avoir observé une période d’acclimatation à l’expérimentateur ainsi que d’adaptation à l’environnement (habitat et salles dans lesquelles se dérouleront les procédures). Lors de la procédure, les animaux seront soumis à 2 prises de sang sous anesthésie générale gazeuse (le sang sera prélevé dans les deux cas par la veine de la queue), comprenant des prélèvements de 0,15ml maximum, à T=0 avant les premières injections et à J=6 avant la mise à mort. Les animaux seront également soumis à 2 injections (MPTP ou sérum physiologique, d’un volume permettant de rester en dessous du seuil limite de volume d’injection chez la souris, à savoir, 100µl/10g de poids corporel et permettant d’atteindre 25 mg/kg) par voie intrapéritonéale, à T=0 et T=24h. Les volumes d’injections seront calculés pour chaque animal après la pesée de ce dernier. Pour l’illumination, les animaux seront juste maintenus par contention sous le dispositif d’illumination pendant 90 secondes (dispositif allumé ou éteint), cette intervention arrivera 4 fois, à T=0, 6, 24, et 30 h. Pour la ponction du liquide céphalorachidien, les animaux seront sous anesthésie générale et ne seront pas réveillés.

Impact sur les animaux

Les animaux seront traités avec une neurotoxine, le 1-méthyl-4phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP). Cette procédure a pour but d’induire des symptômes parkinsoniens modérés aux animaux afin de pouvoir observer les effets de la photobiomodulation (PBM), qui est ici le traitement, sur la protection des fonctionnalités des neurones dopaminergiques impliqués dans la maladie. La dose injectée de MPTP aux souris va amener des symptômes parkinsoniens modérés. Les effets indésirables attendus sont donc une perte de mobilité partielle, des troubles de la locomotion et une inactivité relative illustrée par une posture plus facilement prostrée. Le protocole expérimental est rédigé pour durer 6 jours. Ces effets seront observés dans un intervalle allant de quelques heures après la première injection de neurotoxine à T=0 jusqu’à la mise à mort à J=6, soit des effets d’une durée comprise entre 5 et 6 jours. A noter qu’il est recensé dans la littérature que le modèle MPTP peut induire une hyperthermie (augmentation de la température corporelle) fugace suivie d’une hypothermie (baisse de la température corporelle) de quelques heures. Ces observations sont recensées sur certaines souches de souris, mais aucune de ce genre n’est recensée sur la souche de souris utilisée ici. Néanmoins, un suivi de la température corporelle des animaux sera mis en place dans les 24 heures suivant les 2 injections de MPTP, et la température de la pièce d’hébergement sera adapté aux éventuelles variations de température corporelle des souris. Si des observations sont portées sur ces changements éventuels de températures, ils seront retranscrits dans les résultats de l’étude afin d’apporter de nouvelles informations sur ce point dans l’état de l’art du modèle murin MPTP, ce qui permettra pour des procédures futures sur cette souche de souris de prendre ces éléments en compte et donc de prendre des dispositions particulières pour améliorer le bien-être des animaux. Lors des prélèvements sanguins, l'anesthésie gazeuse est brève (quelques minutes), les animaux seront sur une plaque chauffante durant l'anesthésie et la phase de réveil, nous ne nous attendons donc pas à des effets indésirables particuliers sur les animaux. Pour éviter tout stress lors du test de comportement une phase d'habituation va être réalisée et le test Open Field n'est pas un test contraignant pour les animaux.

Devenir

Les animaux sont obligatoirement mis à mort dans cette procédure, afin de pouvoir prélever les pièces anatomiques qui permettront par la suite d’effectuer les dosages de neurotransmetteurs, de métabolites d’intérêt, et les tissus nécessaires aux coupes histologiques. La mise à mort permet donc de pouvoir prélever les cerveaux des animaux, qui sont essentiels pour pouvoir évaluer la neuroprotection, ainsi que les fonctionnalités préservées ou non par photobiomodulation des neurones dopaminergiques impliqués dans la maladie de Parkinson.

Remplacement

Les animaux seront traités avec une neurotoxine, le 1-méthyl-4phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP). Cette procédure a pour but d’induire des symptômes parkinsoniens modérés aux animaux afin de pouvoir observer les effets de la photobiomodulation (PBM), qui est ici le traitement, sur la protection des fonctionnalités des neurones dopaminergiques impliqués dans la maladie. La dose injectée de MPTP aux souris vont amener des symptômes parkinsoniens modérés. Les effets indésirables attendus sont donc une perte de mobilité partielle, des troubles de la locomotion et une inactivité relative illustrée par une posture plus facilement prostrée. Le protocole expérimental est rédigé pour durer 6 jours. Ces effets seront observés dans un intervalle allant de quelques heures après la première injection de neurotoxine à T=0 jusqu’à la mise à mort à J=6, soit des effets d’une durée comprise entre 5 et 6 jours. A noter qu’il est recensé dans la littérature que le modèle MPTP peut induire une hyperthermie (augmentation de la température corporelle) fugace suivie d’une hypothermie (baisse de la température corporelle) de quelques heures. Ces observations sont recensées sur certaines souches de souris, mais aucune de ce genre n’est recensée sur la souche de souris utilisée ici, que ce soit dans l’état de l’art ou les travaux sur ce même sujet effectués précédemment. Néanmoins, un suivi de la température corporelle des animaux sera mis en place dans les 24 heures suivant les 2 injections de MPTP, et la température de la pièce d’hébergement sera adapté aux éventuelles variations de température corporelle des souris. Si des observations sont portées sur ces changements éventuels de températures, ils seront retranscrits dans les résultats de l’étude afin d’apporter de nouvelles informations sur ce point dans l’état de l’art du modèle murin MPTP, ce qui permettra pour des procédures futures sur cette souche de souris de prendre ces éléments en compte et donc de prendre des dispositions particulières pour améliorer le bien-être des animaux.

Réduction

La procédure se déroulera sur un rythme de 12 animaux par semaine (répartis aléatoirement selon les groupes). Pour le traitement des résultats, les données seront confrontées par les tests statistiques appropriés. Au préalable, l’étude de mise au point sera arrêtée dès que les gestes nécessaires à la bonne réalisation des procédures seront acquis ; les dosages seront mis au point sur ces pièces anatomiques. Si des animaux ont été réalisés dans des conditions qui les rendent incluables dans le groupe correspondant (Contrôle + photobiomodulation), cela permettra de réduire le nombre d’animaux à utiliser pour atteindre les 12 animaux par groupes prévus initialement. Le groupe n=12 est donc déterminé en fonction de 2 choses : 1) Avoir assez d’individus au sein de chaque groupe pour pouvoir effectuer les tests mentionnés plus haut dans cet encadré de manière correcte, avec une vraie puissance statistique robuste. Ce nombre est déterminé grâce à l’état de l’art et l’expertise de l’équipe. 2) Au sein des individus, il y a n=2 souris qui sont déclarées dans cette demande d’autorisation de projet pour pallier à d’éventuels soucis d’analyses sur certains animaux au cours de la procédure expérimentale. En effet, il est admis qu’en expérimentation préclinique, la variabilité interindividuelle entre les individus inclus dans l’étude peut parfois amener des situations de non réponse à l’induction de la maladie ou une non réponse au traitement testé. De plus, des conditions d’hébergement et de manipulation identiques peuvent amener de temps en temps un stress ou une réponse de la part des animaux totalement différente ; pouvant entraîner une impossibilité d’inclusion de l’individu en question dans les données traitées. Sans cette marge de n=2 individus, le nombre d’animaux pris en compte dans les résultats peut engendrer un sous-effectif au sein de certains groupes ce qui rendrait caduque les analyses statistiques des résultats, rendant ainsi les données et résultats obtenus inexploitables. Afin de se prémunir de ce scénario, même rare, il est déclaré ici n=12 pour chaque groupe, en accord avec la règle de REDUIRE au maximum le nombre d’animaux à utiliser.

Raffinement

Une fois les souris réceptionnées, elles seront transférées dans leurs cages propres, avec un temps d’acclimatation de minimum 7 jours avant le début des protocoles. Les zootechniciens veilleront à leur bien-être au quotidien, à leur adaptation à leur nouvel environnement ainsi qu’à la nourriture et la boisson. Un enrichissement de leur milieu de vie sera mis en place pour assurer le bien-être des souris (tunnels en carton, « nids » en coton etc). Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligée aux animaux, ces derniers seront parfaitement habitués aux manipulations et bénéficieront d’une surveillance quotidienne. Les conditions d’hébergement des animaux respecteront strictement toutes les normes relatives au bien-être animal en vigueur. Nous n’attendons pas de gêne ou de douleur induite par le protocole d’illumination. Par expérience, le protocole envisagé pour rendre les animaux MPTP ne génère pas de douleur et les symptômes moteurs induits permettent à l’animal de rester autonome. Il est recensé que le modèle MPTP peut induire une hyperthermie (augmentation de la température corporelle) fugace suivie d’une hypothermie (diminution de la température corporelle) de quelques heures. Ces observations sont recensées sur seulement certaines souches de souris. Aucune observation de ce genre n’est recensée sur la souche utilisée ici. Néanmoins, un suivi de la température corporelle des animaux sera mis en place dans les 24 heures suivant les 2 injections de MPTP, et la température de la pièce d’hébergement sera adapté aux éventuelles variations de température corporelle des souris. Le seul prélèvement effectué sur les animaux impliquant un réveil est une prise de sang à T=0. Elle sera effectuée par veine de la queue selon la méthode préconisée par les instances du bien être animale. Les animaux seront sous anesthésie générale gazeuse. Les autres prélèvements se font sous anesthésie sans réveil via injection d’anesthésiques appropriés. Le vétérinaire en charge des animaux sera contacté si un animal présente une souffrance inhabituelle ; une euthanasie précoce pourra être décidée en concertation avec l’équipe de recherche, la SBEA et le vétérinaire si besoin, le tout en accord avec les observations des points limites établis (perte de poids, toilettage, singes de souffrance…)Une intervention appropriée sera prise en compte par le personnel responsable selon la situation.

Choix des espèces

Afin de standardiser nos études nous utiliserons des souris traitées au MPTP, comme dans les publications passées en revue sur ce même sujet d’étude. En effet, ce modèle fait partie des modèles de référence afin de mener des études précliniques sur la maladie de Parkinson. En plus d’être bien référencé dans la littérature, ce modèle détude est déjà utilisé lors des précédentes études sur les effets de la photobiomodulation sur la neurodégénérescence des cellules dopaminergiques de la substance noire compacta. Enfin, le modèle murin est bien connu et maitrisé au sein des laboratoires. Le mécanisme d’action de la photobiomodulation (PBM) semblant générique, les résultats obtenus via l’étude sur les souris devrait, qui plus est, bénéficier à une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeu par la PBM dans d’autres maladies neurodégénératives. La bibliographie et les études antérieures sur cette thématique, s’appuyant eux même sur la littérature et l’état de l’art existant sur les modèles murins MPTP démontrent une vraie cohérence entre la souche de souris proposée ici et le modèle d’expérimentation. En effet, avec des injections de 25 mg/kg de MPTP par animaux, sur un modèle Parkinson aigu destiné à ne durer que 6 jours, nous nous trouvons dans une fenêtre de 40 à 60 % de neurones dopaminergiques supprimés, ce qui correspond environ au stade moyen de diagnostic et de prise en charge de la maladie de Parkinson chez l’Homme. Les 2 injections espacées de 24 h à la dose de 25 mg/kg permettent une dégénérescence progressive jusqu’à 7 ou 8 jours en moyenne, avant un recouvrement d’une partie des neurones dopaminergiques. Les animaux étant mis à mort au bout de 6 jours pour le prélèvement des pièces anatomiques, le recouvrement des neurones dans ces délais chez les animaux n’est pas un problème et reste cohérent avec le modèle envisagé ainsi que l’état de l’art sur le sujet. Ce projet nécessite de travailler avec des animaux adultes afin que les résultats obtenus ne soient pas biaisés par d’éventuels processus développementaux non impliqués dans la pathologie. Dans le but d’éviter tout biais dû aux cycles hormonaux, et dans un souci d’homogénéité des résultats, des rongeurs mâles seront utilisés.

8 chevaux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis rendus à leur établissement éleveur à la fin de l'étude. Chaque animal, sous sédation, subit une nouvelle technique de pose de garrot, quatre perfusions locorégionales d'antibiotique et de nombreux prélèvements, jusqu'à seize prises de sang et vingt ponctions dans l'articulation du boulet. Le porteur indique que l'arthrite septique, jugée très peu probable, constitue un point limite qui exclurait le cheval de l'étude. Il conclut que ces cinétiques mettent en jeu plusieurs systèmes et que le remplacement est donc impossible, les manipulations devant se faire dans l'espèce cible.

Objectifs

Lors d’une atteinte des membres des chevaux, un traitement incluant une antibiothérapie peut être nécessaire. Une alternative intéressante est la réalisation de cette antibiothérapie par voie locorégionale, grâce à une injection d’antibiotique par voie intraveineuse (veine du membre du cheval) sous garrot afin de concentrer l’antibiotique dans la zone d’intérêt. En temps normal le garrot est mis en place sur le membre du cheval avec le pied posé au sol, cependant dans ces conditions les muscles et tendons sont en tension. Nous avons donc souhaité étudier une nouvelle technique de pose du garrot avec le membre fléchi afin de limiter la fuite de produit sous le garrot, permettant une meilleure concentration des antibiotiques dans la zone d’intérêt et en conséquence une perfusion locorégionale plus efficace. Cette procédure peut se réaliser sur cheval sédaté (ne nécessite pas d’anesthésie générale). Cette technique permettrait d’obtenir des concentrations d’antibiotiques effectivement supérieures aux techniques précédemment décrites. Pour évaluer l’efficacité de cette nouvelle méthode, il est nécessaire de réaliser des dosages d’antibiotiques dans une articulation du membre du cheval (boulet) ainsi que d’évaluer la décroissance de leur concentration locale, puis d’évaluer la fuite des antibiotiques dans la concentration sanguine au moment de la perfusion locorégionale. Ces mesures seront réalisées sur deux groupes de traitement (pose du garrot sur membre à l’appui ou au soutien) avec l’utilisation des deux antibiotiques les plus fréquemment utilisés en pratique vétérinaire équine, et les données seront comparées par des études statistiques. Il pourra également être discuté de l’intervalle de temps nécessaire entre deux administrations d’antibiotiques par perfusion locorégionale. En effet, en pratique les perfusions locorégionales sont répétées toutes les 24 à 48 heures, sans que les différentes études n’aient tranché sur l’intervalle de temps optimal. Les dosages d'antibiotiques réalisés dans notre étude permettront d’établir si les perfusions locorégionales peuvent être d'avantage espacées dans le temps, ou au contraire s'il est nécessaire de les réaliser plus fréquemment.

Bénéfices attendus

L’administration d’antibiotiques par voie locorégionale permet d’augmenter la concentration de la molécule dans la région que l’on souhaite traiter (distale au garrot) au niveau du membre du cheval. Cette technique est également une méthode alternative à l’antibiothérapie par voie générale et permet donc d’en limiter les effets secondaires (toxicité rénale par exemple). Notre étude a pour but de raffiner la méthode de réalisation de la perfusion locorégionale afin d’obtenir une efficacité maximale de l’antibiothérapie et donc de permettre un traitement plus efficace des affections du membre distal chez le cheval. Par ailleurs cette étude pourrait aussi permettre de montrer qu’il est nécessaire de rapprocher ou à contrario d’espacer les administrations d’antibiotiques par voie locorégionale, afin d’améliorer également l’efficacité de ces perfusions et donc de diminuer au maximum le développement de souches bactériennes résistantes aux antibiotiques (liées à une concentration circulante d’antibiotique insuffisante).

Procédures

Les animaux seront soumis à différents types d'interventions : Prélèvements sanguins sur chevaux sédatés : avant réalisation de la perfusion locorégionale, 1 minute post-injection, puis 1 min avant et une minute après le retrait du garrot, pour évaluer l’efficacité de ce dernier. Soit 4 prises de sang par cheval et par phase (chaque phase étant espacée d’au moins 2 semaines), en comptant 30 secondes par prise de sang. Soit un total de 16 prises de sang sur la durée de l'étude. Les chevaux (sédatés) seront également soumis à des prélèvements articulaires dans l’articulation du boulet : prélèvement à 10 min, 12h, 24h, 36h et 48h après le retrait du garrot. Soit 5 prélèvements de synovie par cheval et par phase, en comptant 2 minutes par ponction synoviale (sans compter le temps de nettoyage de la peau). Soit un total de 20 prélèvements sur la durée de l'étude. En plus des différents prélèvements, les chevaux seront soumis à des perfusions locorégionales. Ces perfusions sont réalisées sous sédation et consistent en l'injection d'un anesthésique local (pour réduire la douleur), d'un antibiotique et de liquide stérile physiologique. Cette injection se réalise dans la veine céphalique du membre antérieur selectionné, après la mise en place d'un garrot. L'injection en elle même dure 1 minute puis le garrot est laissé en place pendant 20 minutes après cela. Chaque cheval recevra donc 4 perfusions locorégionales sous sédation au cours de l'étude (espacées de 2 semaines). Après la perfusion locorégionale et les ponctions synoviales, des bandages stériles seront mis en place. Cela correspond à la mise en place d'un bandage à 5 reprises par phase de l'étude l’étude (soit 20 bandages en tout dans l'étude), en comptant 5 minutes par pose de bandage. Enfin, les chevaux recevront deux examens cliniques par jour (en comptant 5 minutes par examen) pendant les 10 jours de box de chaque phase (soit 20 examens cliniques par phase et donc 80 examens cliniques au total sur l'étude); ainsi qu’un examen locomoteur simplifié une fois avant le début de la procédure, puis de manière quotidienne pendant les 3 jours de manipulation et une dernière fois au 10ème jour de la phase avant de remettre le cheval dans son environnement initial, soit 5 examens locomoteurs par phase de l’étude (20 examens locomoteurs au total pendant l'étude), en comptant 10 minutes par examen locomoteur.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pouvant être attendus sur les animaux sont les suivants : Douleur très faible immédiate associée à des ponctions sanguines et synoviales multiples (effet qui ne dure pas dans le temps), douleur modérée en cas de développement d'un complication (au niveau de la veine céphalique ou de l'articulation métacarpo-phalangienne) - pouvant durer quelques jours (mais prise en charge immédiate en cas de développement d'une complication). Le développement d'une arthrite septique semble très peu probable mais constitue un point limite qui entraînera l'exclusion du cheval de la procédure expérimentale (et la mise en place immédiate du traitement adapté).

Devenir

L'étude est formée d'une unique procédure. A la fin de l'étude, tous les chevaux retourneront à l'établissement éleveur après accord du vétérinaire désigné.

Remplacement

Les études de cinétiques mettent en jeu plusieurs systèmes organiques et ce caractère intégratif ne peut être reproduit in vitro ou in silico. Le remplacement est donc impossible. D'autre part, les manipulations doivent être réalisées dans l'espèce cible pour reproduire les modalités de réalisations.

Réduction

Nombre minimal estimé de chevaux sains permettant la réalisation du projet (nombre de chevaux utilisés pour de nombreuses études portant sur les perfusions locorégionales d’antibiotiques dans l’espèce équine). Aucun test statistique n’a été utilisé.

Raffinement

Les chevaux utilisés seront placés dans des conditions d’hébergement répondant au bien-être animal : box individuel de taille adéquate avec une litière propre et un nettoyage quotidien, accès à de l’eau et du foin à volonté, enrichissement de l’environnement, présence de congénères placés dans des box contigus. Il y aura une période d’habituation préalable de 5 jours avec des sorties quotidiennes en main (1 heure par jour, soit 3 fois 20 minutes). Pendant les 3 jours de manipulations et les 2 jours suivants de repos, les chevaux seront laissés au box strict. Chaque jour les chevaux seront pansés. L’environnement sera enrichi à l’aide de pierres à sel et de pipolino notamment. Les manipulations seront effectuées dans une même salle dans les locaux de la clinique équine (lieu de vie des chevaux) pour éviter tout stress. Pendant toute la durée de la procédure, les chevaux seront surveillés en permanence et en cas de problème, celui-ci sera pris en charge immédiatement par le vétérinaire désigné de l'établissement. Les chevaux recevront une analgésie afin de prévenir un potentiel inconfort lié à la procédure expérimentale (sédation et anesthésique local au moment de la réalisation de la perfusion locorégionale et mise en place d’un traitement anti-inflammatoire pendant toute la durée des prélèvements synoviaux).

Choix des espèces

Espèce cible pour la pratique concernée. Chevaux adultes sains (population cible pour la pratique concernée).

60 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sans mise à mort prévue, les animaux étant réintégrés dans la colonie de l'établissement pour être réutilisés. Sensibilisés à des allergènes pour développer une dermatite atopique, ils présentent érythème, papules, pustules et démangeaisons, et subissent des prélèvements de sang à la jugulaire ainsi que des biopsies de peau. Le projet sert à tester des molécules vétérinaires sur l'espèce cible. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit cette maladie, la complexité des mécanismes n'étant pas selon lui reproductible in vitro.

Objectifs

L’objectif du projet est de mettre en place des modèles de Dermatite Atopique Canine (DAC) aigus chez le chien, et de maintenir la sensibilisation afin d’obtenir un modèle de DAC subchronique, et d’utiliser ces modèles pour la sélection de futures molécules thérapeutiques pouvant entrer dans la composition de nouveaux médicaments destinés à une mise sur le marché. La maîtrise de ces modèles permettra d’évaluer primairement l’efficacité, secondairement la tolérance, le profil pharmacocinétique de molécules et également de suivre l’évolution de certains bio-marqueurs de l’inflammation (interleukines, PBMCs (peripheral blood mononuclear cell)…) dans nos modèles avec et sans traitement.

Bénéfices attendus

La DAC est la deuxième cause de démangeaisons chez le chien : elle touche environ 10% de la population canine mondiale. C’est une dermatose inflammatoire, prurigineuse, caractérisée parfois par une prédisposition génétique, le développement d’allergie à des allergènes environnementaux et des altérations de la barrière cutanée. Elle se caractérise par du prurit, des lésions cutanées plus ou moins caractéristiques et nécessite des soins coûteux et chronophages de la part du propriétaire tout au long de la vie de l’animal. Sa gravité réside principalement dans son impact sur la qualité de vie du propriétaire et de son chien, ceci pouvant être une cause de demande d’euthanasie. Le traitement et la gestion à long terme de la dermatite atopique sont difficiles. La majorité des traitements anti-inflammatoires ou immunomodulateurs sont susceptibles de causer des effets secondaires, surtout quand ils sont utilisés à forte dose et/ou de façon répétée, quotidienne ou prolongée. La recherche de nouveaux traitements pour un contrôle efficace et sûr de cette maladie chronique doit être évaluée sur l’espèce cible lors d’un épisode clinique. La mise en place, la maitrise et le maintien d’un modèle de DAC (aigu et subchronique) induisant des signes cliniques similaires aux lésions dermatologiques observés chez les chiens souffrant de la DAC spontanée, permettent d’évaluer l’efficacité d’un traitement dans des conditions réelles, d’améliorer les phases de screening de nouvelles molécules et ainsi de sélectionner plus vite et de façon plus sûre, des molécules présentant une probabilité de succès importante sur un nombre optimisé d’animaux. Un modèle de DAC présente plusieurs avantages par rapport aux dermatites atopiques de terrain. Lors d’une inflammation expérimentale de la peau, la dose appliquée d’allergène est connue et les caractéristiques de l’inflammation/lésions dermatologiques peuvent être suivies dès la phase précoce de la maladie. Un suivi rapproché par des personnes formées dans des conditions standardisées permet une évaluation d’efficacité mais aussi de tolérance, pharmacocinétique et la possibilité de chercher des bio-marqueurs. C’est un grand avantage de pouvoir récolter autant d’informations dans l’espèce cible par procédure expérimentale dans un modèle représentatif de la DAC spontanée.

Procédures

Traitements : Lors de cette procédure expérimentale, l’administration du produit sera réalisée par voie intraveineuse (IV), intramusculaire (IM), sous-cutanée (SC), orale, transcutanée, ou autre. Le volume maximal administré sera en accord avec les bonnes pratiques vétérinaires : • IV : 1-5 mL/kg • IM : 0.25-0.5 mL/kg • SC : 1-2 mL/kg • Transcutanée : le volume administré dépendra de la viscosité du produit et de l’espèce de destination. • Oral : les tablettes/comprimés ou solutions liquides seront adaptées à l’espèce de destination. Prélèvements de sang : généralement à la veine jugulaire sur animal vigile Les volumes totaux de sang prélevés suivent les volumes définis pour respecter le bien-être animal, et ne dépasse jamais 20% du volume de sang circulant par kg de poids vif. Un temps de repos suffisant est déterminé entre chaque phase de prélèvement si l’étude en compte plusieurs et entre chaque étude. Ainsi, pour un volume maximum prélevé correspondant à 7.5%, 10%, 15% et 20% du volume de sang circulant par kg de poids vif sur une période de 24h, le temps de récupération est de 3, 7, 14, et 28 jours respectivement. Prélèvements de fluides biologiques/tissus/matrices : Des raclages cutanés et/ou des biopsies de peau pourraient être réalisés. Dans le premier cas, le prélèvement s’effectuera avec une lame de bistouri émoussée. Dans le second cas, l’acte sera réalisé sous anesthésie locale, sur un animal vigile avec ou sans tranquillisation et suivies les cas échéant par des points de suture. Le nombre de biopsies sera limité à 3 par jour et 12 par étude pour chaque chien. La taille et la profondeur de la biopsie seront définies et argumentées dans le plan d’étude.

Impact sur les animaux

Les chiens sensibilisés dévélopperont des signes d’allergie cutanée ; l’erythème (rougeur de la peau), des papules (surélévation de la peau), pustules (soulèvement de la peau contenant du pus) et/ou de l’excoriation (écorchure superficielle). Ils peuvent aussi dévélopper un prurit passager (démangeaisons). Les signes cliniques apparaissent généralement dans les 24h après l’application des allergènes. Les lésions dermatologiques les plus sévères seront généralement observées entre 72h et 96h après la première application, ensuite ils se résolvent spontanément. Des prélèvements sanguins répétés pourront également générer un léger inconfort. Des biopsies de peau pourraient être collectées Avant de conduire des études d’efficacité nous avons généralement des informations de tolérance dans le chien, des réactions d’intolerance sévère à cause des produits évalués ne sont donc pas attendues. Les phases de traitement/prélèvement sur un animal vigile peuvent occasionner un léger stress/baisse de bien-être en raison de la légère contention nécessaire pour le traitement/recueil d’échantillons.

Devenir

Dans le cadre de ce projet, les euthanasies ne sont pas prévues. Par conséquent une réintroduction de l’ensemble des animaux qui participeront à ce projet dans la colonie hébergée au sein de l’EU est envisagée. Les informations concernant chaque animal sont conservées et consultées avant une réutilisation potentielle d’un animal dans un autre projet.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative pour reproduire la DAC et pouvoir évaluer l’état général de l’animal et l’intensité des manifestations dermatologiques, la complexité des mécanismes biologiques en jeu ne pouvant être reproduite in vitro.

Réduction

Les réactions allérgiques sont répétables entre chaque « challenge » pour tous les chiens sensibilisés mais avec une variabilté entre individus. L’expérience avec ce modèle nous montre qu’il ne faut pas utiliser moins de 4 et idéalement 6 ou 8 chiens par groupe pour garantir des résultats exploitables. Ce sont des études de preuve de concept : étapes précoces de l’évaluation d’un nouveau produit/composé actif. L’évaluation et l’intérprétation des résultats sont faites en comparant l’évolution des moyennes des scores dermatologiques journaliers des différents groupes de traitement. Les groupes de traitement sont : non-traité (contrôle négatif) et/ou le groupe traité avec un produit de référence (contrôle positif) et le (ou les) groupe(s) traité(s) avec le produit à évaluer. Le score moyen des chiens dans le contrôle négatif est au dessus du score défini le « seuil allergique » et le score moyen des chiens dans le groupe contrôle positif est en dessous du « seuil allergique ». Il est possible de réduire le nombre d’animaux par groupe, au cas par cas, selon la finalité de la procédure expérimentale. Cette décision sera dûment justifiée dans le plan d’étude spécifique dans le cadre de ce projet. Dans le plan d’étude, le nombre d’animaux par groupe sera toujours argumenté et justifié de manière à optimiser l’utilisation des animaux et à en réduire leur nombre tout en s’assurant que ce nombre d’animaux permette d’atteindre l’objectif de l’étude, c'est-à-dire que les résultats de l’étude permettent de prendre une décision sur le niveau de sensibilisation et/ou l’efficacité du produit/des produits évalués.

Raffinement

Les animaux sont régulièrement manipulés afin de les habituer à la contention et au contact des expérimentateurs. Les traitements et prélèvements sont réalisés généralement sur animaux vigiles selon les procédures en vigueur au sein de l’EU. Pour les chiens, une contention légère est suffisante pour l’administration du traitement et les collectes d’échantillons et n’induit pas de nuisance au bien-être des animaux autre que d’être maintenus pendant des temps très courts. Les volumes prélevés et les temps de récupération des animaux sont déterminés de manière anticipée pour s’assurer que le bien-être ne sera pas altéré. Dans le cas d’administrations ou de prélèvements spécifiques (biopsie de la peau), les animaux pourront être anesthésiés localement ou totalement pendant la durée de l’acte. L’anesthésie et le réveil des animaux se feront sous la surveillance d’un vétérinaire et selon les procédures en vigueur au sein de l’EU. Depuis leur inclusion dans l’étude jusqu’à la fin de la phase animale, les animaux sont observés quotidiennement par du personnel formé. Des observations plus fréquentes sont prévues dès que requis, particulièrement après l’application des allergènes et la prise de traitements (examen dermatologique et observations cliniques générales), pour s’assurer que l’apparition des signes cliniques n’entraine pas de dégradation trop importante de l’état général de l’animal et que les traitements sont bien tolérés. Toute observation d’un état de santé ou d’un comportement anormal d’un animal fera l’objet d’un examen par un vétérinaire qui proposera les mesures adéquates pour protéger l’animal : si nécessaire, le sortir de la procédure expérimentale et/ou lui administrer un traitement. L’euthanasie (si nécessaire) sera effectuée sur site. Pendant le challenge, des personnes qualifiées évaluent quotidiennement les lésions cutanées avec une grille qui permet de définir si les réactions sont absentes, légères, modérées ou sévères, le seuil allergique et /ou plusieurs points limites qui une fois atteints ou dépassés, entraineront l’exclusion de l’animal de l’étude et son traitement. La réaction allergique et l’inconfort que le challenge peut engendrer sont vite et efficacement contrôlés avec par exemple des corticoïdes et/ou des shampooings. La grille d’évaluation des lésions et les points limites sont validés par le comité d’éthique et pourront être révisés de manière rétrospective selon les résultats obtenus à chaque étude.

Choix des espèces

Les produits vétérinaires doivent obligatoirement être testés dans l’espèce de destination. Les modèles expérimentaux qui permettront d’évaluer les produits vétérinaires doivent être développés dans la même espèce pour plus de pertinence. L’espèce canine a été retenue comme correspondant à l’application clinique future des produits visant à traiter les signes d’allergie suite à la dermatite atopique du chien. Les modèles seront à mettre en place chez des chiens jeunes adultes sains. Ceci correspond à des animaux de plus de 6 mois avec un système immunitaire mature.

1 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souriceaux de trois jours et adultes reçoivent le parasite Cryptosporidium par voie orale puis des immunostimulants par injection intrapéritonéale, avant une mise à mort pour prélèvement de tissus. Le projet évalue des immunostimulants contre cette infection responsable de diarrhées. Le porteur signale que le stress de certaines lignées favorise le cannibalisme des portées, et affirme que l'étude de l'immunité intestinale ne peut se faire sans animaux, les modèles in vitro ignorant selon lui la complexité de l'environnement intestinal.

Objectifs

Les infections par le protozoaire Cryptosporidium sont très fréquentes à travers le monde. Elles conduisent à des pertes économiques importantes en santé vétérinaire puisque cette maladie provoque des diarrhées sévères chez les ruminants dès la naissance et affectent aussi la santé humaine (notamment les enfants de moins de 5 ans - 2ème cause de mortalité due aux diarrhées dans les pays en voie de développement). En absence de vaccins ou de traitements autorisés et efficaces, l’objectif du projet est d’évaluer l’effet protecteur de différents immunostimulants de l’immunité innée et de décrire les mécanismes immunologiques mis en jeu lors de ces traitements.

Bénéfices attendus

En l’absence de vaccin ou de traitements efficaces qui pourraient induire des résistances, l'utilisation d’immunostimulants pour stimuler de manière non spécifique les cellules de l’immunité est une approche très prometteuse qui pourrait être bénéfique pour toute autre infection en période néonatale puisqu’elle n’est pas basée sur une réponse spécifique vers l’agent pathogène (comme les vaccins).

Procédures

Les animaux seront soumis à une administration orale du parasite, (une fois à l’âge de 3 jours pour les souriceaux, et une fois entre 7-12 semaines pour les adultes) puis à une administration intra-péritonéale des immunostimulants (5 jours après l’infection) (introduction aiguille) sur animaux vigiles sous contention.

Impact sur les animaux

Il est possible que la conjonction des traitements : infection et déficience génétique, immunostimulation et traitement antibiotique, puisse altérer l’état général de l‘animal.

Devenir

Mise à mort des animaux pour prélèvements de tissus biologiques voués à l’étude scientifique.

Remplacement

L’étude de l’immunologie et de la muqueuse intestinale ne peut être réalisée sans expérimentation animale. En effet, les études in vitro ne tiennent pas compte de la complexité des coopérations cellulaires et de l’environnement intestinal (flore bactérienne et antigènes alimentaires).

Réduction

Le plan expérimental (nombre d’animaux par lot, nombre de lots expérimentaux, répétition des expérimentations) a été établi de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de l’exploitabilité et de la significativité des résultats. Toutefois, malgré l’enrichissement, l’état de stress qui caractérise certaines lignées de souris, favorise le cannibalisme, c’est pourquoi plus d’animaux sont mis en reproduction (20 à 30% de plus, les reproductions sont gérées par la PFIE). Du point de vue statistique, nous utilisons des tests non paramétriques adaptés pour les petits échantillons mais 6 animaux par lots au minimum sont requis. Les animaux surnuméraires sont toujours utilisés et peuvent être introduits dans un autre protocole. Les immunostimulants cibleront spécifiquement des récepteurs des cellules immunitaires. Les immunostimulants non commerciaux seront tous préalablement validés in vitro pour leur capacité à stimuler fortement les cellules immunitaires avant de procéder à des études in vivo. Pour analyser les données (charge parasitaire ; cytokines ; % cellules immunitaires), nous utiliserons des modèles statistiques mixtes qui tiennent compte à la fois des facteurs à effet fixe (exemple Infection ou déficience génétique de l’animal ou traitement immunostimulant) et des facteurs à effet aléatoire (répétition des expériences). D'après nos expérimentations précédentes et dans ces conditions, ces effectifs et répétitions sont suffisants pour conclure du point de vue significatif ET biologique sur nos données (ex : pour la charge parasitaire avec un effet protecteur des immunostimulants d’environ 40% (faible) : puissance estimée à 95% avec un risque de 0.05% avec 6 animaux par lots). Deux animaux supplémentaires sont ajoutés dans chaque lot car de la mortalité est parfois observée dans les portées (très jeunes animaux) (indépendamment de l’infection ou d’un traitement).

Raffinement

Les souris sont hébergées en animalerie A2 en atmosphère contrôlée, à raison de 5 souris maximum lorsqu’elles sont adultes, dans un environnement enrichi (refuge en polycarbonate, feuilles de papier absorbant, copeaux, morceau de bois) ou 1 mère avec sa portée par cage, dans un environnement enrichi (papier absorbant qui diminue le cannibalisme des souris à la mise-bas, sizzle-nest, bâtonnets de coton, morceau de bois). Toute médication est proscrite pour ne pas interférer avec les paramètres immunologiques étudiés. Cependant les animaux sont suivis plusieurs fois par jour afin de prendre une décision rapide en cas d'atteinte des points limites durant tout le protocole et de limiter la douleur induite : (i) de souriceaux mis à l’écart par la mère, qui ne grossissent pas ou dont le pelage ne se développe pas (lié au retard de croissance), (ii) de souris amaigries, prostrées et avec le poil ébouriffé. Nous prenons encore plus de précautions (bruits) lors des visites lorsqu’il s’agit d’expérimentations avec les femelles gestantes et les premiers jours suivant la mise-bas

Choix des espèces

Le modèle souris est utilisé en tant que modèle expérimental pour étudier la cryptosporidiose. Le souriceau est représentatif de l’infection chez les jeunes ruminants. Dans les élevages, les jeunes ruminants se contaminent rapidement dès la naissance et éliminent le parasite en 3 semaines environ. Le souriceau inoculé avec le parasite entre 3 et 7 jours de vie élimine le parasite comme le jeune ruminant en 3 semaines environ. La souris adulte immunodéficiente, notamment lorsqu’elle est génétiquement modifiée pour un gène de l’immunité, est également utilisée dans la présente demande pour comprendre la spécificité du mécanisme de protection chez le jeune. Dans la présente demande, l’utilisation de souris (souriceaux, souris adulte) nous permettra de décortiquer très précisément les mécanismes de protection. Notre établissement élève de nombreuses lignées de souris transgéniques (gènes rapporteurs, déficientes, invalidation fonctionnelle etc.) pour parvenir à cet objectif. Les souriceaux sont inoculés par le parasite lorsqu’ils auront 3 jours. Les souris adultes seront également utilisées et âgées entre 7-12 semaines.

350 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour évaluer les seuils de toxicité d'un candidat médicament à doses croissantes. Ils reçoivent le produit par diverses voies, dont intrathécale, puis subissent des prélèvements de sang, d'urine, de liquide céphalo-rachidien et de moelle osseuse. Le champ structuré déclare les 350 animaux réutilisés, mais le porteur indique qu'ils pourront aussi être mis à mort pour prélèvement d'organes selon la demande du "donneur d'ordre". Il affirme que ces études de toxicité sont "indispensables" et que la proximité avec l'humain justifie le recours au primate.

Objectifs

Pour presque tous les types d’effets toxiques (organospécifiques, neuro-comportementaux, immunologiques, cancérogènes épigénétiques...), on estime généralement qu’il existe une dose ou une concentration en dessous de laquelle aucun effet indésirable ne se produit : il existe un seuil de toxicité. L’objectif est alors de d terminer la dose ou la concentration en dessous de laquelle la probabilité de survenue de l’effet critique sera en théorie nulle : la dose maximale sans effet nocif observable (DMSENO). Plus précisément, elle correspond à la dose la plus élevée pour laquelle aucune augmentation statistiquement (ou biologiquement) significative en fréquence ou en sévérité d’un effet nocif n'est observée dans un groupe exposé à la substance par rapport un groupe non exposé . L'objectif de ce projet est donc de tester différentes doses (en commençant par la plus faible puis en l'augmentant progressivement) d'un nouveau candidat médicament afin de déterminer la DMSENO. Les groupes de doses (un ou plusieurs animaux par dose) seront décalés dans le temps afin de pouvoir adapter la dose suivante en fonction des résultats du groupe précédent.

Bénéfices attendus

Ce projet permet d'évaluer la tolérance d'un candidat médicament après une à une exposition répétée ou non, de doses croissantes et d'estimer les marges de sécurité pour lesquelles aucun effet indésirable n'est observé. Ces marges de sécurité permettront par la suite de déterminer une dose initiale "sûre" pour la réalisation des essais cliniques chez l'Homme.

Procédures

Après une période d’acclimatation suffisante (15 jours minimum), les animaux recevront de façon répétée ou non la molécule d’intérêt, ou la combinaison de molécules, par voie entérale, parentérale, respiratoire, intra-articulaire ou intrathécale selon les recommandations du donneur d’ordre. Par exemple, pour une injection intraveineuse en bolus, l'animal pourra être contenu manuellement et pour une injection intraveineuse lente, l'animale sera contenu en siège. Pour d'autres types d'administration, les animaux pourront être sédatés ou anesthésiés. La méthode de contention dépendra aussi du poids de l’animal. Pour un animal de plus de 5 kg, une contention en siège sera priviligiée pour la sécurité du personnel. Les animaux seront entrainés à la méthode de contention Après chaque administration, des prélèvements sanguins seront effectuées pour l’étude des paramètres biologiques (hématologiques, biochimiques, immunologiques, de coagulation) de chaque animal afin de mettre en vidence une toxicité potentielle. Des prélèvements d’urine et de fécès pourront également survenir. Des prélèvements de liquide céphalo-rachidien (LCR) et de moelle osseuse (MO) sous anesthésie générale pourront galement être réalisés. Les volumes de sang, de LCR et de MO préleves et le temps de repos accordés aux animaux entre chaque prise seront en accord avec les recommandations éthiques.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables éventuels dépenderont de la molécule injectée et de la dose. Avant chaque étude, les effets indésirables seront discutés avec le client afin de mettre en place un suivi et un traitement adapté en cas d'apparition de signes indésirables.

Devenir

Les animaux seront réutilisés si le protocole le permet et si la fréquence et le volume des prélèvements ont respecté le pourcentage du volume sanguin circulant (VSC) ainsi qu'une période de repos. Le sort des animaux sera préalablement discutés avec la structure chargé du bien-être animal et approuvé par le vétérinaire. De plus, les animaux pourront être mis à mort pour récolte d'organes selon le protocole défini avec le donneur d'ordre.

Remplacement

Les études de toxicité in vivo chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. En effet, celles-ci permettent de déterminer la toxicité de la molécule en fonction de la dose administrée et affine la connaissance des caractéristiques de l’effet principal et des effets indésirables éventuels. Les résultats de ces tests permettront ainsi d’ajuster la dose optimale à administrer chez l’Homme indispensable à la poursuite des essais réglementaires en clinique.

Réduction

Dans ce projet, les approches de dosage échelonnées ("en escalier": doses croissantes) permettent d'atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés. Une fois la première dose administrée à un faibe effectif, les observations sont ensuite notées et utilisées pour informer la dose suivante, qui peut être supérieure ou inférieure selon la nature des observations observées. Le nombre d'animaux dosés à chaque niveau doit être petit dans les études initiales (par exemple un ou deux de chaque sexe) avec des tailles de groupe augmenté une fois qu'une dose-réponse est établie.

Raffinement

Les animaux seront suivis individuellement et quotidiennement tout au long de l’ étude afin de détecter tout signe clinique de douleur ou de détresse (grille d' évaluation du bien-être). Comme les animaux ou groupes d'animaux seront injectés par groupes de dose (à savoir de la plus faible à la plus forte dose- administration en "escalier"), les données obtenues pour les premières doses serviront à affiner la dose suivante et le suivi clinique en fonction des signes cliniques observés. Des périodes de récupération suffisantes seront accordées aux animaux entre les prélevements ainsi qu’entre les administrations de la ou des molécule(s) étudiée(s). Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress seront déterminées au préalable de la procédure. Les animaux seront hébergés par groupes sociaux dans des volières conformes aux recommandations et bénéficieront du programme d’enrichissement défini par la structure du bien-être animal de l'installation, notamment la mise disposition de jouets dans les hébergements. Une rotation du matériel d’enrichissement, incluant une désinfection, sera organisée une fois par semaine pour éviter la lassitude et renouveler l’intérêt des animaux. Des friandises seront galement distribuées systématiquement en fin de journée aux animaux. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendé par les manipulations. Dans le cas où les animaux feront l’objet d’une réutilisation, un avis vétérinaire sera obligatoire pour justifier du bon état de santé de l’animal. Il sera veillé à ce que la gravité des procédures expérimentales ne dépasse pas le stade modéré .

Choix des espèces

Le primate non humain (macaque cynomolgus) est choisi pour sa proximité phylogénétique avec l'Homme et du fait des similitudes des réponses immunitaires. Les molécules en développement étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinant. Il est donc légitime de penser que les résultats observés chez le primate non humain seront très utiles pour prédire les mêmes phénomènes physiologiques et comportementaux chez l’Homme. Le stade de deloppement des animaux (juvénile à adulte) ainsi que le sexe (mâle et/ou femelle) dépendra de la demande du donneur d'ordre et des objectifs des études.