Recherche appliquée

1 496 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une injection intracérébroventriculaire d'agrégats de peptide bêta-amyloïde par chirurgie stéréotaxique, puis reçoivent un candidat-médicament chaque jour pendant dix-sept jours, avant un prélèvement terminal de sang et de cerveau. Le porteur mesure l'activité locomotrice pour évaluer les rythmes circadiens et indique que des effets indésirables comme une sédation peuvent apparaître. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun test in vitro ni modèle informatique ne rend compte du comportement d'un "organisme vivant entier" et conclut à l'impossibilité de remplacer l'animal.

Objectifs

Au cours du vieillissement normal, le sommeil se modifie et il peut être profondément altéré par certaines maladies neurodégénératives, tel que la maladie d’Alzheimer (MA). Les personnes souffrant de démences présentent à la fois des modifications de l’architecture de leur sommeil et des perturbations de leurs rythmes circadiens. Des études ont montré que le manque de sommeil peut augmenter de manière significative les taux de bêta-amyloïde dans certaines régions du cerveau. L’objectif de cette étude est 1) d'examiner si une injection intracérébroventriculaire (ICV) d'agrégats du peptide bêta-amyloïde Aβ (1-42) perturbe le rythme circadien chez le rat et 2) dans le cas où l'injection ICV d'agrégats Aβ (1-42) perturbe le rythme circadien, d’examiner l’effet d’une administration quotidienne de candidats médicaments sur ces perturbations préalablement observées.

Bénéfices attendus

Au cours du vieillissement normal, le sommeil se modifie et il peut être profondément altéré par certaines maladies neurodégénératives, tel que la maladie d’Alzheimer (MA). Les personnes souffrant de démences présentent à la fois des modifications de l’architecture de leur sommeil et des perturbations de leurs rythmes circadiens. 40 à 70 % des personnes ayant la MA éprouvent des problèmes de sommeil qui au fil du temps vont être amplifiés ; ce qui est épuisant pour la personne atteinte mais également pour son aidant. La prise en charge de ces troubles repose sur des traitements médicamenteux tels que des antipsychotiques ou des benzodiazépines. Mais ces médicaments ont souvent des effets indésirables inquiétants chez les personnes atteintes de la MA ; ils peuvent aggraver le déclin cognitif et accroître les risques de chute. Ainsi, ce modèle peut être utile pour le développement de cibles thérapeutiques pour traiter cette problématique.

Procédures

Dans un premier temps, les animaux sont soumis à une intervention chirurgicale (injection d'Aβ (1-42) par stéréotaxie) qui dure dans sa totalité environ 45 minutes (de l'anesthésie jusqu'au réveil). Ensuite, au moment du test de comportement (test de l'activité locomotrice), les animaux reçoivent une injection par jour du candidat médicament; et ceci durant 17 jours maximum. A la fin de l’étude, juste avant la mise à mort, un prélèvement de sang et de cerveau est réalisé sur l'ensemble des animaux. Cette procédure est réalisée sous anesthésie générale et elle dure en moyenne 20 minutes (dans sa totalité). Le prélèvement de cerveau est une demande fréquente dans les études de recherche préclinique. Cela permet de réaliser des mesures de paramètres biochimiques.

Impact sur les animaux

1) Chirurgie : injection ICV - Les rats sont anesthésiés avec de l’isoflurane et placés dans un appareil stéréotaxique. Puis, selon les groupes, une injection intracérébroventriculaire (ICV) d'agrégats du peptide bêta-amyloïde Aβ (1-42) ou de véhicule est réalisée. 2) Administration des candidats médicaments - Les administrations sont réalisées tous les jours et pendant toute la durée de l’enregistrement de l’activité locomotrice. Lors de l’administration d’un nouvel agent thérapeutique, différents effets indésirables peuvent être observés : inconfort dû à l’injection, des effets secondaires dus aux produits (comme la sédation par exemple)

Devenir

Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à la fin de l’étude à un prélèvement sanguin et de cerveau.

Remplacement

L’étude du comportement animal est une étape essentielle dans le développement des médicaments actifs sur le système nerveux. L’effet de molécules sur le comportement est la conséquence de leur action au niveau de l’ensemble de l’organisme et en particulier sur le système nerveux. La mise en évidence de ces effets est réalisée sur un organisme vivant entier. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. A ce jour, aucun test in vitro ou modèle informatique ne permet de rendre compte de l’ensemble de ces phénomènes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilisés pour les études comportementales ne peuvent pas donc être remplacés par des méthodes alternatives. Pour le présent projet : il n’existe aucun modèle permettant d’évaluer le cycle circadien dans la maladie d’Alzheimer.

Réduction

Le nombre total d’animaux utilisés pour une étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables ; ceci afin d'éviter de multiplier les expériences. Il correspond à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles.

Raffinement

Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Les animaux reçoivent trente minutes, avant l’acte chirurgical, une administration en sous-cutanée d’’un analgésique (Opiacés ou AINS). Après la chirurgie, les animaux reçoivent 1 ml de solution de lactate Ringer en sous-cutanée. Une coupelle contenant du « Gel Diet Energy » (Safe) mélangé à de la nourriture mouillée est déposée sur le sol de la cage pour stimuler l’appétit et la mobilité gastro-intestinale de l’animal. 24h post-opératoire, les animaux reçoivent une administration en sous-cutanée ou voie orale (per os) d’analgésique (Opiacés ou AINS). Ils sont pesés et leur état général est évalué selon notre grille de surveillance pour détecter tous signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des rats correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. La lignée de rat utilisée est : Sprague-Dawley 9-10 semaines au moment de la chirurgie. Les molécules développées sont destinées à des patients adultes.

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal porte une tumeur de mélanome mesurée deux fois par semaine jusqu'à un centimètre cube, suivie avec ses métastases par bioluminescence sous anesthésie gazeuse, pour caractériser le rôle du gène BAHCC1. Le porteur reconnaît un inconfort lié à la tumeur et aux métastases, avec perte de poids et d'appétit, et justifie la mise à mort de toutes les souris par la nature agressive du mélanome. Il décrit les objectifs et les bénéfices du projet en une seule phrase quasi identique, centrée sur la caractérisation de la croissance tumorale.

Objectifs

Caractérisation de la formation et de la croissance tumorale en présence ou en absence de BAHCC1 in vivo.

Bénéfices attendus

Caractérisation de la formation et de la croissance tumorale en présence ou en absence de BAHCC1 dans un contexte plus physiologique comparé aux conditions in vitro.

Procédures

Tous les animaux vivants seront suivis pour évaluer deux paramètres : 1- taille de la tumeur primitive au moins 2 fois par semaine pendant tout le temps nécessaire à la tumeur pour atteindre la taille limité de 1cm3 : les animaux seront éveillés et la taille de la tumeur sera évaluée au pied à coulisse. Durée de intervention 5 minutes pour souris. 2- taille de la tumeur primaire et des lésions secondaires 2 fois par semaine par bioluminescence pendant tout le temps nécessaire à la tumeur pour atteindre la taille limité de 1cm3 : durant cette procédure les animaux seront endormis par anesthésie gazeuse (2% d'isoflurane). Durée de intervention 15 minutes pour souris.

Impact sur les animaux

Inconfort généré par la présence de la tumeur primitive et des métastases pouvant entraîner une perte de poids, d'appétit et d'autres effets biologiques liés à la perturbation des organes vitaux touchés par la métastase tumorale.

Devenir

Lot A : 20 animaux subiront les procédures 1 et 2 pour caractériser la cinétique tumorale des 4 lignées cellulaires utilisées pour cette étude (5 souris pour la lignée cellulaire pour générer une étude statistique de base). Lot B : 120 animaux subiront les procédures 1 et 2 qui sont combinées pour analyser la croissance et la cinétique métastatique des tumeurs en présence ou en l'absence de BAHCC1. En raison de la nature agressive du mélanome, toutes les souris seront sacrifiées afin d'éviter tout type de souffrance et de douleur (par inhalation de CO2 ou dislocation cervicale).

Remplacement

Nous avons effectué l'inactivation de BAHCC1 dans des lignées cellulaires humaines in vitro, démontrant son importance pour la prolifération des mélanomes. Cependant, ce modèle a des limites et ne prend en compte ni la croissance dans des conditions tridimensionnelles, ni le rôle du microenvironnement tumoral. Ces caractéristiques ne peuvent être récapitulées que dans un modèle in vivo tel qu'une souris immunodéficiente, facile à manipuler et capable d'héberger des cellules humaines. De plus, notre xénogreffe de souris sera comparée à d'autres modèles de mélanome de souris utilisés par nos collaborateurs de laboratoire.

Réduction

Le nombre total de souris expérimentales sera de 140. Cet effectif correspond au nombre d’animaux nécessaires afin que les résultats obtenus soient exploitables et reproductibles (statistiquement valides). Par ailleurs, plusieurs expériences sont réalisées sur la même cohorte de souris afin de réduire le nombre total de souris nécessaires. L'analyse statistique sera effectuée avec le software GraphPad (Prism 9) avec unpaired t-test ou avec One-way ANOVA non-parametric.

Raffinement

Des souris femelles seront utilisées : moins agressives entre congénères que les mâles, elles pourront être hébergées en cohorte afin de conserver l’interaction sociale et confortera le résultat des expériences. Les expérimentateurs établiront le contact avec les cohortes au moins 8 jours avant le début de l’expérimentation pour habituation à la manipulation et réduction de l’angoisse des animaux. Les cages seront agrémentées de coton type « nestlet ». Nous mesurerons la taille de la tumeur au moins deux fois par semaine (lundi et vendredi plus éventuellement le mercredi) pour chaque lignée cellulaire injectée à l'aide d'un pied à coulisse tout au long de la croissance tumorale jusqu’à l'atteinte de la taille limite de la tumeur de 1 cm3 par souris. La vitesse de croissance des tumeurs n’est pas connue, nous adapterons donc la période de mesure pour chacune des quatre lignées cellulaires utilisées. Toutes les lignées expriment la luciférase, nous pourrons donc surveiller en parallèle le développement et la taille des métastases en mesurant l'activité de la luciférase avec le système IVIS tous les lundis et vendredis de la semaine. La mesure de l’activité luciférase sera effectuée tout au long de la cinétique tumorale avant d'atteindre la taille limite de la tumeur de 1 cm3. Nous surveillerons également quotidiennement l'état des souris après injection des lignées tumorales afin de détecter tout effet dommageable. En cas de souffrance liée au phénotype, les animaux seront suivis régulièrement et des critères d'évaluation appliqués si nécessaire.

Choix des espèces

Les procédures expérimentales proposées visent à étudier l’importance de BAHCC1 dans des conditions de croissance tumorale in vivo. Nous estimons que ces approches sont très importantes et ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation des souris. Les expériences in vitro nous ont permis de valider nos techniques d’expérimentation et d’apporter de premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes de substitution in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et donc ne pourront pas apporter le niveau d'information requis. Nous utiliserons des souris adultes de 6 semaines qui seront injectées avec les cellules tumorales par voie sous-cutanée dans le flanc.

6 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection intraveineuse ou intrathécale d'un vecteur AAV et subit cinq à huit prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie, sur une période allant jusqu'à neuf mois, pour préparer un essai de thérapie génique chez des enfants atteints de leucodystrophie métachromatique. Le porteur indique des risques anesthésiques, infectieux et de fuite de liquide céphalo-rachidien. Les macaques sont euthanasiés en fin de projet pour prélever le cerveau, la moelle épinière et les organes.

Objectifs

Les vecteurs AAV sont parmi les vecteurs les plus efficaces pour transporter et intégrer des gènes d’intérêt dans des parties précises du système nerveux central, en particulier, le cerveau . Les AAV constituent une voie de thérapie pour des maladies neurodégénératives, notamment la leucodystrophie métachromatique. Le but de cette étude est de valider la capacité de transduction du vecteur AAVPHP.eB ARSA apres administration intraveineuse ou intrathecale chez le primate non humain, afin de realiser les étapes préclinique (efficacité et tolérance) et de de supporter le depot d'un CTA à l'agence du medicament en vue d'un essai clinique de phase I/II chez les enfants souffrants de leucodystrophie métachromatique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont la validation de l'efficacité et de la tolérance de l'approche permettant les étapes precliniques chez le primate non humain, afin de supporter le depot d'un CTA à l'agence du medicament en vue d'un essai clinique de phase I/II chez les enfants souffrants de leucodystrophie métachromatique et de pouvoir ainsi proposer un traitement alors qu'aujourd'hui il n'existe que des soins palliatifs et les enfants decedent avant l'age de 4 ans.

Procédures

Injections intraveineuse ou intrathécale et prelevement de sang et de liquide céphalo-rachidien. Toutes les procédures sont réalisées sur animaux anesthésié et sous analgésie. Il y a au total une procédure d'injection (IV ou IT) et 5 prelevements de sang et LCR si maintien pour 6 semaines ou 8 prelevements si maintien pour 9 mois. Toutes les anesthésies durent moins de 1h30.

Impact sur les animaux

Les 3 effets indesirables possibles sont: - un risque anesthésique - un risque infectieux pour l'injection intrathécale - un risque de fuite de LCR - la formation d'hématomes lors des prises de sang

Devenir

Euthanasie à la fin du projet afin de collecter cerveau, moelle epiniere et organes peripheriques et fluides biologiques afin de valider la biodistribution, l'expression et la tolérance du produit thérapeutique

Remplacement

Toutes les études in vitro possibles ont été effectuées en amont de ce projet, en particulier la démonstration de la fonctionnalité des AAV. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de cette approche thérapeutique chez l’Homme nécessite une étude de scale-up (efficacité, biodistribution, toxicité, etc) chez le gros animal (NHP). Ces étapes sont requises par l’ANSM pour toute demande d’autorisation d’étude clinique

Réduction

2 animaux par dose et approche est le minimum statistique pour repondre à l'objectif du projet soit 6 animaux au total Le projet va nous permettre de realiser les marquages pour evaluer l'expression et le coverage des zones ciblées ainsi que determiner la biodistribution. Il n'y a pas de statistiques faites sur les marquages. Nous nous basons aussi sur des résultast préalables obtenus sur d'autres projets pour pouvoir limiter le nombre d'animaux necessaires.

Raffinement

Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, les procédures sont réalisées par du personnel formé et experimenté notamment l’intrathécale réalisée par un neurochirurgien expert de la technique. qui a déja posé le meme catheter d'injection chez des bébés achondroplastes (nain) ayant un rétrécissement du canal lombaire. Enfin, le nombre d'anesthesie est minimisé en regroupant les procédures (prise de sang, ponction lombaire) au sein de la meme anesthesie. Les animaux sont hebergés en groupe. Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens du projet, un suivi de poids à chaque anesthesie, l'utilisation de buprecare pour les ponctions lombaires pour eviter tout inconfort et enfin des antibiotiques (amoxicilline) lors de l'intrathecale.

Choix des espèces

La capacité des vecteurs AAV à pénétrer dans un organe donné et y faire exprimer un gène thérapeutique est dépendante de l'espèce. Dans les maladies que nous ciblons, il existe un modèle murin de la maladie, utilisé dans une première étape, déjà réalisée. Les organes du NHP en particulier le cerveau, se rapprochent le plus de celui chez l’homme en terme de structure anatomique et connectivité fonctionnelle. L’administration du vecteur dans un cerveau proche du cerveau humain permet de définir au mieux les paramètres du protocole clinique (nombre de sites, volumes, débit, nombre de particules). L'injection de vecteurs AAV chez le NHP est le seul moyen d'évaluer au mieux la faisabilité, l'efficacité et la tolérance d'une telle approche thérapeutique réalisée préalablement chez les rongeurs. NHP : macaques (1-10 ans) (2 à 12kg) Les mâles NHP atteignent la maturité sexuelle à 6 ans et les femelles à 4 ans, de plus le cerveau est bien formé à ces âges-là. Sachant que nous travaillons sur une pathologie qui apparaît dans l'enfance, nous realiserons nos procédure sur un cerveau formé et myelinisé et non pas avant l'âge d'un an.

663 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des vaccins puis sont volontairement infectées par la bactérie de la furonculose lors d'un challenge, avec cinq à six prises de sang sous anesthésie, pour évaluer des protocoles vaccinaux en pisciculture. Le porteur indique que l'infection peut faire souffrir les poissons et qu'un individu présentant un furoncle de plus d'un centimètre carré ou moribond est euthanasié. Aucune truite n'est relâchée ni réutilisée, l'euthanasie étant justifiée par le risque sanitaire lié à la bactérie.

Objectifs

Le projet FEAMP Medic'eau vise à évaluer les pratiques actuelles vaccinales et thérapeutiques appliquées par les pisciculteurs afin de contôler la furonculose à Aeromonas salmonicida sub. salmonicida. Sur la partie "vaccin", le projet a pour objectif d'optimiser les schémas vaccinaux afin d'améliorer leur efficacité et reduire l'usage d'antibiotiques en élevage aquacole.

Bénéfices attendus

L'évaluation des protocoles vaccinaux pratiqués actuellement par les éleveurs permettra de les optimiser afin d'augmenter la résistance des truites contre la furonculose. Les résultats permettront de présenter aux éleveurs et vétérinaires les choix les plus efficaces. Cela permettra d'augmenter le bien être des poissons en élevage d'une part, et de diminuer l'usage d'antibiotiques d'autre part.

Procédures

Prises de sang (100 µl) : 5 prélèvements (T0, T0+1 mois ; T0+3 mois ; T0+4 mois ; T0 + 6 mois ; T0 + 6.5 mois) Administration de vaccins par voie Intrapéritonéale, par voie orale via l'alimentation ou par balnéation. Challenge infectieux par balnéation. Toutes les interventions de type prélévement/administration seront effectuées après anesthésie des poissons.

Impact sur les animaux

L'evaluation d'e l'efficacité vaccinale nécessaite d'infecter les truites avec la bactérie Aeromonas salmonicida sub salmonicida. Les manifestations cliniques peuvent entrainer de la souffrance chez les animaux. Les animaux seront exclus (euthansasiés) dès l'observation de furoncles de tailles supérieure à 1 cm2 ou de poissons moribonds (mélanisme, na erratique sur le dos, arrêt d'alimentation).

Devenir

L'euthanasie des poissons est prévu en fin de protocole, pour des raisons notamment sanitaire (impossibilité de relacher ou réutiliser des poissons potentiellement infectés par A. salmonicida)

Remplacement

L'objectif du projet Medic'eau étant d'évaluer l'efficacité de la vaccination contre la furonculose, cela ne peut se faire que sur animaux vivants.

Réduction

Le RPS (relative percent survival) d'un vaccin est calculé par la formule suivante : (1 - nombre de morts dans le lot vacciné après infection / nombre de morts dans le lot non vacciné après infection) x 100. On fait l'hypothèse qu'avec un schéma vaccinal testé, le RPS est de 60%. En utilisant le site internet https://biostatgv.sentiweb.fr/, le test de comparaison de 2 proportions observés (pourcentage de mortalité dans le lot vacciné P1 = 20%, pourcentage de mortalité dans le lot non vacciné P2 = 50%), avec un risque alpha de 0.05 et une puissance à 0,9, un nombre de 51 poissons par lot est préconisé.

Raffinement

Les animaux seront observés 2 fois par jour durant toute le durée du protocole (6,5 mois). Les points limites sont d'une part les paramètres d'ambiance de l'élevage (température, oxygène). Si les paramètres critiques sont atteints (température > 20°C, oxygène 1 cm2) seront retirés de l'expérimentation et euthanasiés par surdosage d'anesthésique. La densité sera de 16 kg/m3, ce qui est bien en deça de ce qui est réalisé en élevage (50-70 kg/m3) et les bacs seront enrichis de tubes permettant aux poissons de se cacher.

Choix des espèces

La truite arc en Ciel est l'hôte naturel d'Aeromonas salmonicida. C'est de plus l'espèce de poisson la plus élevée en France. Les truites utilisées pèseront environ 200g. La furonculose est une maladie que l'on observe à différents stades d'élevage (alevins, truite portion -200-250g- et grosse truite > 1kg). Sur le terrain les problématiques sont plus importante chez les truites pesant plus de 1 kg. Du fait du matériel de la station aquacole (taille des bassins), il ne nous est pas possible d'élever des truites arc en ciel de cette taille (> 1 Kg) en nombre suffisant et pour permettre l'aquisition de résultats répétables. L'étude sur des poissons de poids de 200 g est un bon compromis entre le poids et le nombre de poissons pouvant entrer dans l'étude. A ce poids (200g), les animaux sont considérés comme physiologiquement proche des animaux d'un poids plus élevé (hors période de gamétogènèse).

396 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardées vivantes pour être réutilisées dans d'autres enregistrements. Rendues épileptiques, elles sont irradiées par microfaisceaux de rayons X sous anesthésie, la tête fixée dans un cadre stéréotaxique, pour tester une alternative à la chirurgie du foyer épileptique. Le porteur indique qu'un animal perdant plus de 20 % de son poids ou présentant une akinésie est mis à mort, et qu'un surdosage d'irradiation entraîne aussi l'euthanasie. Les bénéfices annoncés pour les patients épileptiques restent renvoyés à une éventuelle application chez l'humain.

Objectifs

Le traitement pharmacologique des différents types d’épilepsie est complexe et doit répondre au mieux aux différents types de crises présentées par les patients. Il n’est efficace que chez 70 % des patients. L’épilepsie Mésio-Temporale (MesioTemporal Lobe Epilepsy ou MTLE) est la forme d’épilepsie focale la plus fréquente en clinique parmi celles qui ne répondent pas aux traitements pharmacologiques par les anti-épileptiques de référence. La MTLE est le plus souvent caractérisée sur le plan histologique par une sclérose de l’hippocampe (dispersion des cellules granulaires du gyrus denté et mort des neurones pyramidaux au niveau de la corne d’Ammon, CA1 et CA3). La résection chirurgicale du foyer épileptique ou zone épileptogène (ZE) est l’unique possibilité, à l’heure actuelle, de guérir les patients atteints de MTLE. Cette chirurgie nécessite une craniotomie pour enlever le foyer épileptique. C’est une méthode efficace dans 50 à 70 % des cas, mais qui comporte plusieurs risques (infection, effets secondaires, troubles cognitifs) et représente un coût hospitalier important (plus de 10 jours d’hospitalisation et suivi pendant plusieurs mois). L’irradiation par microfaisceaux de Rayons-X ou « Microbeam Radiation Therapy » (MRT) est de plus en plus étudiée chez l’animal dans le but d’une application à l’homme dans le cas de tumeurs cérébrales ou de maladies neurologiques dans lesquelles un circuit nerveux dysfonctionne (Serduc et al, 2010 ; Studer et al, 2015). Il s’agit d’une technique non invasive, focalisée et avec une très faible toxicité pour les tissus adjacents du fait de sa grande précision. Dans des pathologies comme la MTLE, cette méthode permettrait de s’affranchir d’une chirurgie invasive (Pouyatos et al, 2013). L’objectif de ce projet est donc de développer sur un modèle de MTLE chez la souris (Riban et al, 2002 ; Heinrich et al, 2011) un protocole de MRT qui permette de rendre moins invasive la prise en charge des patient atteints d’une épilepsie focale.

Bénéfices attendus

L’irradiation par microfaisceaux de Rayons-X ou « Microbeam Radiation Therapy » (MRT) est de plus en plus étudiée chez l’animal dans le but d’une application à l’homme dans le cas de tumeurs cérébrales ou de maladies neurologiques dans lesquelles un circuit nerveux dysfonctionne (Serduc et al, 2010 ; Studer et al, 2015). Il s’agit d’une technique non invasive, focalisée et avec une très faible toxicité pour les tissus adjacents du fait de sa grande précision. Dans des pathologies comme la MTLE, cette méthode permettrait de s’affranchir d’une chirurgie invasive (Pouyatos et al, 2013).

Procédures

- Pendant l’irradiation les souris seront anesthésiées et, après vérification de l’absence de réflexe du retrait de la patte, elles seront fixées dans un cadre stéréotaxique afin d’éviter tout mouvement de la tête et les précautions suivantes seront prises afin de limiter le stress et la douleur: - Anesthésie générale: Kétamine + Xylazine (voir ci-dessous) d’environ 40 min. - Anesthésie locale: baume à la lidocaïne 2% au niveau des oreilles.

Impact sur les animaux

Comme le développement d’une épilepsie et le traitement par MRT peuvent altérer la prise alimentaire, notre point limite se basera à la fois sur le poids de l’animal et sur son comportement général. Un animal sera immédiatement euthanasié si l’un des signes suivants est observé: perte de poids > 20% du poids mesuré le jour de l’irradiation, akinésie, rotation (voir Annexe 3). La radiothérapie peut être une source de souffrance si la dose délivrée est trop élevée. Les choix concernant les champs d’irradiation et les doses délivrées à la peau ont donc été effectuées en fonction des connaissances actuelles et de notre expertise. En cas d’erreur ou de problème technique au moment de l’irradiation d’un animal et notamment de surdosage, l’animal sera euthanasié immédiatement par surdosage de pentobarbital (150 mg/kg). Après radiothérapie, des effets secondaires invalidants (hyper ou hypo-locomotion, modification de la prise de nourriture, nécrose de la peau, ischémie cérébrale) peuvent apparaitre avec des délais différents selon les animaux

Devenir

L’ensemble des animaux seront gardés en vie à la suite de la manipulation. Ils seront rapatriés dans l’animalerie du GIN afin de réaliser les enregistrements de leurs crises, leur comportement et les contrôles histologiques. Ces procédures font l’objet d’une demande d’autorisation gérée par le comité d’éthique du GIN.

Remplacement

L’utilisation de l’animal dans son intégrité est nécessaire pour répondre à notre question. Il n’existe aucun modèle cellulaire qui permette de mettre en évidence un foyer épileptique dans le cerveau ni de le traiter par irradiation et l’utilisation d’irradiation fractionnée spatialement n’est pas encore possible chez l’homme. Le développement d’une stratégie thérapeutique telle qu’envisagée dans cette étude nécessite d’avoir recours à un modèle animal dans lequel le développement d’un foyer épileptogène a été clairement caractérisé et mis en évidence. Dans cette étude, la souris sera utilisée, malgré sa petite taille, en complément de l’étude effectuée chez le rat en parallèle. En effet, le modèle souris d’épilepsie mésiotemporale présente une plus grande stabilité, une évolution plus rapide de la pathologie, une fréquence de crises plus importante et une plus grande similitude des symptômes avec la clinique humaine. L’utilisation des modèles souris et rat sera ainsi très complémentaire et permettra d’obtenir des résultats plus fiables pour la préparation des essais cliniques.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum tout en permettant une exploitation statistique rigoureuse des résultats. Pour cela, en fonction de l’expérience acquise en modélisation animale des épilepsies, nous estimons que 396 animaux au total seront utilisés pendant 5 ans dans les quatre séries d’expériences de ce projet.

Raffinement

Nous veillerons à suivre les animaux quotidiennement de façon à intervenir immédiatement dès qu’un signe évocateur de douleur serait observé. Pour réduire toute douleur, souffrance ou anxiété, ils seront anesthésiés et analgésiés de façon profonde durant toutes les interventions (chirurgie, IRM, irradiation) et les techniques d’imagerie que nous utiliserons dans nos procédures sont sans douleur pour l’animal et permettent de répéter les acquisitions chez le même animal. Les animaux seront maintenus avec de la nourriture et de la boisson à volonté, ainsi que des objets en carton et du coton. Il seront habitués à la manipulation par des expérimentateurs agrémentés. A la fin des expériences, les animaux seront euthanasiés par surdosage de pentobarbital.

Choix des espèces

Le modèle d’épilepsie KA-MTLE chez la souris et chez le rat sont actuellement les modèles de référence les plus proches des conditions observées chez l’homme, aussi bien sur le plan électrophysiologique, histologique que pharmacologique. Malgré sa taille réduite nous souhaitons utiliser l’espèce souris, en complément de l’étude sur le rat, en raison de sa plus grande prédictivité et sa plus grande stabilité dans le temps que le modèle rat. Des animaux adultes seront utilisés dans ce projet. Ils auront 8 semaines en début d’expérience et 12 à 15 semaines lorsqu’ils seront irradiés à l’ESRF. Le modèle de souris KA-MTLE a été développé chez des animaux de cet âge afin de travailler sur un cerveau mature qui restera stable tout au long de la procédure.

5050 souris transgéniques 5XFAD vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des composés en développement par voie orale jusqu'à 50 jours ou par injection, avec des prélèvements sanguins hebdomadaires, avant d'être tuées pour prélever le cerveau et enregistrer l'activité neuronale sur coupes. Le porteur indique n'attendre aucun effet indésirable notable hormis une possible agressivité des mâles. Il précise que les animaux surnuméraires servent à l'entraînement technique du personnel puis sont eux aussi tués.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est un syndrome neurodégénératif associé à une perte progressive des fonctions cognitives. La MA est corrélée à des modifications cérébrales incluant le dépôt de plaques amyloïdes, des dégénérescences de neurones et la mort neuronale qui conduisent inévitablement à la perte de mémoire et aux déficits dans la transmission synaptique. L’objectif de ce projet est d’étudier les modifications du réseau neuronal par électrophysiologie sur coupes cérébrales dans des modèles animaux transgéniques présentant des déficits cognitifs et de tester l'efficacité de molécules en développement sur ces modifications. Pour ce projet, nous utiliserons le modèle 5XFAD, bien décrit dans la littérature. Ce modèle de souris associe 5 mutations responsables de la MA: trois mutations du gène de l’APP : la suédoise, la « Florida », la londonienne, et deux mutations du gène PS1. La lignée 5xFAD présente une accumulation intracellulaire précoce d'un peptide caractéristique de la MA dès 1,5 mois, suivie à 2 mois d’une perte neuronale importante. Une atteinte de la mémoire de travail, de la mémoire associative et de la mémoire de référence sont observées dès l’âge de 3 mois. Les souris transgéniques 5XFAD présentent les principales caractéristiques de la MA et constituent un modèle de choix pour l’étude de la neurodégénérescence intra neuronale et l’efficacité de composés en développement. Les modèles de souris sur lesquels nous allons travailler ne présentent pas de phénotype dommageable à l'âge auquel nous les utilisons (moins de 6 mois).

Bénéfices attendus

Ce projet scientifique associé à notre plateforme d'électrophysiologie ex-vivo (sur coupes cérébrales) permettra de tester les effets neurotoxiques/neuroprotecteurs de composés en développement sur les modifications du réseau neuronal liées à la maladie d’Alzheimer (MA). La technique utilisée sera l'électrophysiologie ex-vivo, c'est-à-dire sur coupes cérébrales.

Procédures

Au cours de ce projet, nous allons tester l'effet de composés en développement sur les modifications de plasticité synaptique observées dans le modèle 5XFAD. Pour cela, des composés seront administrés à des souris 5XFAD, par voies entérales (orale) ou parentérales (intrapéritonéal, sous-cutané, intramusculaire et intraveineux). -voie intrapéritonéale : La durée d’administration consécutive du produit sera fonction de la nature du véhicule utilisé ou de la tolérance du produit et ne pourra dépasser 21 jours, à raison d’une fois par jour. -voie orale : de 1 à 50 jours maximum, une ou deux fois par jour. -voie sous-cutanée : de 1 à 7 jours maximum, une fois par jour. -voie intraveineuse : de 1 à 7 jours maximum, une fois par jour. -voie intramusculaire : 1 à 7 jours maximum, une fois par jour Lors de l’expérimentation, des prélèvements sanguins au niveau de la veine caudale pourront être effectués 1 fois par semaine maximum sur animal vigile selon les méthodes en vigueurs suivantes : - Au niveau de la veine caudale, sur animal vigile maintenu dans une boite à contention ; - Au niveau de la veine sub-mandibulaire, sur animal vigile ; - Au niveau de la veine jugulaire, sur animal anesthésié à l’isoflurane (après induction 3min à 5%). Selon les recommandations, le volume maximum prélevé sera de 7,5% de volume sanguin total (soit 100 à 140µL de sang). Un point de compression sera réalisé pour arrêter tout saignement avant que l’animal ne retourne dans sa cage.

Impact sur les animaux

A priori, aucun effet indésirable n’est attendu sur ces animaux, hormis une augmentation possible d’agressivité chez les mâles. En cas d’agressivité, un isolement des animaux sera mis en place. Une fiche d’observations/points limites (en annexe) permettra d’assurer le suivi des points limites adaptés aux modèles et aux différentes voies d’administration des composés. Les animaux sont évalués sur leur comportement, leur respiration, leur aspect général, si besoin leur poids quotidiennement. Les points limites ainsi que les procédures de soins ou d’hébergement seront affinés en fonction des observations réalisées sur cette lignée. Les recommandations du fournisseur concernant l’hébergement (stabulation, enrichissement…) seront suivies afin d’améliorer le bien-être animal. Le modèle de souris transgéniques 5XFAD que nous utiliserons présentent un phénotype non dommageable à l'âge étudié (moins de 6 mois). Si des phénomènes inattendus, non répertoriés par le fournisseur se manifestaient, les points limites seraient adaptés. Suite à l’administration des composés à tester, il se peut que des signes d’inconfort ou d’intolérance se manifestent (rougeur, gonflement…). L’altération de l’état d’un animal entraînera la mise en place d'interventions précoces et adaptées et des procédures de modifications de soins pourront être mises en œuvre en cas de besoin comme détaillé dans la fiche de suivi. Les animaux exprimant des signes permanents de douleur seront exclus de l’étude et mis à mort immédiatement, sur décision du directeur de l'étude et/ou du vétérinaire désigné.

Devenir

A la fin de la période d'administration du composé, les animaux seront mis à mort afin de réaliser des coupes cérébrales et d'enregistrer l’activité neuronale par la technique d’électrophysiologie ex-vivo. Les animaux surnuméraires seront utilisés pour la formation et le maintien des gestes techniques du personnel et seront mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

L'organisation des réseaux neuronaux et la plasticité synaptique peuvent être étudiés sur des coupes cérébrales de rongeurs par électrophysiologie. Elles ne peuvent pas être reproduites, ni étudiées dans des modèles de cultures cellulaires in-vitro. L'étude de l'effet de composés en développement et une meilleure compréhension des pathologies du système nerveux central nécessitent donc l'administration de composés sur un organisme entier. Nos expérimentations au sein de la société, même si elles nécessitent l’utilisation d’animaux, sont pratiquées avec un souci permanent de réduction du nombre d’animaux et de bien-être pour nos animaux en expérimentation. Toutes les expériences sont réalisées dans le respect éthique de la règle des 3 R.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par un programme statistique. Les résultats seront analysés avec un logiciel adapté. Nous adapterons les tests statistiques en fonction de la distribution des observables, qu'elle soit normale ou non.

Raffinement

Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés dans des cages collectives avec un environnement enrichi (par exemple : igloos, briques de bois à grignoter, ambiance sonore dans la salle, commutation progressive de la lumière, etc.). Suivra alors une période d’acclimatation de 5 jours minimum, pendant laquelle aucun geste technique lié à la procédure expérimentale ne sera réalisé. Les conditions d’hébergement et de soins et les méthodes utilisées ont été choisies et conçues de manière à réduire au maximum toute douleur, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Le contrôle mortalité des animaux sera effectué quotidiennement sans exception (Week-ends & jours fériés inclus) par du personnel compétent et qualifié. Le bien-être des animaux sera évalué par l’observation des signes cliniques. Soins : Des points limites ont été établis afin d’anticiper toute dégradation de l’état de santé général des animaux et, le cas échéant, d’appliquer des protocoles de soins adaptés.

Choix des espèces

Nos expérimentations sont réalisées chez la souris, petit rongeur dont l’étude est extrêmement répandue au sein des laboratoires de recherche en Neurosciences, rendant les résultats pertinents pour une large communauté scientifique nationale et internationale. Ces rongeurs, de petite taille et d’élevage facile, possèdent un système nerveux dont le développement est extrêmement proche de celui du système nerveux humain, et dont l’organisation, certes simplifiée, est suffisamment complexe. Pour l'étude des déficits de la maladie d'Alzheimer, la souris représente un modèle de choix pertinent car il existe des modèles transgéniques, bien décrits dans la littérature et couramment utilisés pour tester l'effet de composés en développement. Les animaux seront utilisés de l'âge de 3 semaines à 24 semaines, âge auquel le phénotype n’est pas dommageable, et ceci afin de couvrir tous les âges, du jeune à l'adulte.

6060 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après implantation d'électrodes dans le cerveau par stéréotaxie, elles reçoivent des composés en développement par voie orale jusqu'à 50 jours ou par injection, avec un prélèvement sanguin hebdomadaire possible, pour tester des effets neuroprotecteurs ou neurotoxiques sur des modèles de la maladie d'Alzheimer. Le porteur indique que ces souris présentent un phénotype dommageable et que des signes de douleur peuvent persister après la chirurgie malgré les analgésiques. Les retombées annoncées se limitent à mieux comprendre les réseaux neuronaux, l'implantation cérébrale entraînant la mise à mort de tous les animaux pour contrôle histologique.

Objectifs

La neurodégénérescence avec perte progressive des structures et fonctions neuronales est le facteur causal clé de troubles neurologiques dévastateurs tels que la maladie d'Alzheimer (MA). Malgré les progrès significatifs de la recherche en neurobiologie, la prévalence de ces pathologies continue d’augmenter en raison du manque de traitements curatifs. La MA est un syndrome neurodégénératif associé à une perte progressive des fonctions cognitives. Elle est corrélée à des modifications incluant des plaques amyloïdes, des dégénérescencesde neurones et la mort neuronale. Les premières lésions apparaissent dans une zone du cerveau impliquée dans l'apprentissage et la mémoire, l'hippocampe. L’apprentissage et la mémoire reposent sur la plasticité des circuits de notre cerveau, c’est-à-dire la capacité des neurones à modifier de façon durable l’efficacité de leur transmission synaptique. De plus, un nombre croissant de données épidémiologiques a démontré un lien entre le diabète de type 2 et la MA. Cette découverte a permis d’ouvrir de nouvelles perspectives de recherche pour mieux appréhender la physiopathologie des maladies neurodégénératives et ouvrir de nouvelles approches thérapeutiques. Dans ce projet, nous proposons d'étudier dans des modèles de souris transgéniques de la MA et mutantes du diabète présentant des altérations de l’apprentissage et de la mémoire : -les modifications des réseaux neuronaux liées au génotype par des enregistrements électrophysiologiques in-vivo (animal vigile ou anesthésié). -l'efficacité / toxicité de composés en développement sur les modifications des réseaux neuronaux. Pour ces études, des enregistrements électrophysiologiques (animal vigile ou anesthésié) permettront d’étudier les modifications du réseau neuronal induites par administration unique ou répétée de composés en développement par voie entérale (orale) ou parentérale (intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée, intramusculaire).

Bénéfices attendus

Ce projet scientifique associé à notre plateforme d'électrophysiologie in vivo (sur animal vigile ou anesthésié) permettra de mettre en évidence les modifications des réseaux neuronaux associés à des modèles de la MA et de tester les effets neurotoxiques/neuroprotecteurs de composés en développement sur les modifications du réseau neuronal liées à la MA.

Procédures

Au cours de ce projet, nous allons tester l'effet de composés en développement sur les modifications de plasticité synaptique observées dans des modèles animaux de la maladie d'Alzheimer, après implantation d'électrodes par stéréotaxie au cours d'une unique chirurgie. Pour cela, des composés seront administrés à des souris, par voies entérale (orale) ou parentérales (intrapéritonéal, sous-cutané, intramusculaire et intraveineux). -voie intrapéritonéale : La durée d’administration consécutive du produit sera fonction de la nature du véhicule utilisé ou de la tolérance du produit et ne pourra dépasser 21 jours, à raison d’une fois par jour. -voie orale : de 1 à 50 jours maximum, une ou deux fois par jour. -voie sous-cutanée : de 1 à 7 jours maximum, une fois par jour. -voie intraveineuse : de 1 à 7 jours maximum, une fois par jour. -voie intramusculaire : 1 à 7 jours maximum, une fois par jour Si nécessaire, un prélèvement sanguin par semaine de moins de 7.5 % du volume sanguin circulant sera effectué.

Impact sur les animaux

Les modèles de souris que nous utiliserons présentent un phénotype dommageable. Leur bien-être sera attentivement suivi durant toute la durée du projet grâce à des fiches d'observation/points limites adaptées aux modèles. Des procédures de prise en charge adaptées seront mises en place. En cas d’administration de composés, il se peut que des signes d’inconfort ou d’intolérance se manifestent. Pour les études sur l’animal vigile, suite au placement par chirurgie des électrodes, il se peut que les animaux présentent des signes de douleur malgré les précautions prises pendant la chirurgie (analgésiques, anesthésiques) et en post-opératoire (antibiotiques). Dans tous les cas, des points limites préalablement définis et adaptés permettront d’assurer un suivi de l’état général des animaux et de mettre en place des interventions précoces et adaptées en cas de souffrance animale.

Devenir

Une chirurgie permettant l'implantation des électrodes nécessaires aux enregistrements électrophysiologiques sera effectuée sur tous les animaux de ce projet. A la fin des procédures expérimentales, tous les animaux seront donc mis à mort. Un contrôle histologique permettant de vérifier l'emplacement des électrodes pourra être réalisé.

Remplacement

L'organisation des réseaux neuronaux et la plasticité synaptique peuvent être étudiées sur animaux vigiles ou anesthésiés par électrophysiologie in vivo. Elles ne peuvent pas être reproduites ni étudiées dans des modèles de cultures cellulaires in vitro. L'étude de l'effet de composés en développement nécessite l'administration de ces composés sur un organisme entier. La souris représente un modèle de choix car il existe des protocoles bien établis permettant d'étudier la plasticité synaptique, l'activité oscillatoire et les taux de décharge, couramment utilisés par la communauté scientifique d'après les données bibliographiques. Nos expérimentations au sein de la société, même si elles nécessitent l’utilisation d’animaux, sont pratiquées avec un souci permanent de réduction du nombre d’animaux et de bien-être pour nos animaux en expérimentation. Toutes les expériences sont réalisées dans le respect éthique de la règle des 3 R.

Réduction

Le nombre de rongeurs utilisé a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. Sur un même animal, nous pourrons enregistrer simultanément différents paramètres électrophysiologiques (plasticité synaptique, transmission synaptique, activité neuronale). L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par l'utilisation de tests statistiques. Les résultats seront analysés avec un logiciel adapté. Nous adapterons les tests statistiques en fonction de la distribution des observables, qu'elle soit normale ou non.

Raffinement

Avant la chirurgie, une période d’acclimatation des animaux d’au moins 5 jours sera respectée. Pendant la chirurgie, des mesures seront mises en place afin de réduire au maximum la douleur : anesthésiques et analgésiques, gel ophtalmique, maintien d'une température constante... Pour les études sur animal vigile après la chirurgie, les animaux seront isolés afin d'éviter tout dommage au niveau des implants ou l'apport de germes susceptibles de provoquer une infection. Les animaux recevront une antibiothérapie adaptée. Un suivi renforcé des animaux sera réalisé après la phase d’opération. Une période de récupération post-chirurgicale d’au moins 7 jours sera respectée. Dès réception des animaux, une observation journalière sera mise en place. Des points limites préalablement définis et adaptés permettront d’assurer un suivi de l’état général des animaux (souffrance, angoisse…) et de préserver leur bien-être. En cas d’altération de l’état de l’animal, la surveillance sera rapprochée et les animaux seront soignés en fonction de la sévérite de la douleur observée.

Choix des espèces

Nos expérimentations sont réalisées chez la souris, petit rongeur dont l’étude est extrêmement répandue au sein des laboratoires de recherche en Neurosciences, rendant les résultats pertinents pour une large communauté scientifique nationale et internationale. Ces rongeurs, de petite taille et d’élevage facile, possèdent un système nerveux dont le développement est extrêmement proche de celui du système nerveux humain, et dont l’organisation, certes simplifiée, est suffisamment complexe. Pour l'étude des déficits de la maladie d'Alzheimer, la souris représente un modèle de choix pertinent car il existe des modèles transgéniques, bien décrits dans la littérature et couramment utilisés pour tester l'effet de composés en développement sur le fonctionnement cérébral. Les animaux seront utilisés de l'âge de 4 semaines à 40 semaines afin de couvrir tous les âges, du jeune à l'adulte et tous les stades de la pathologie.