Recherche appliquée

100 porcs et 100 brebis vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous mis à mort pour une évaluation nécropsique et histologique. Les animaux subissent des prélèvements sanguins hebdomadaires puis des chirurgies sous anesthésie générale pouvant durer plusieurs heures, avec pose de dispositifs implantables et douleur postopératoire de plusieurs jours. Le projet teste des implants et des techniques chirurgicales pour la gynécologie et l'obstétrique, le porc servant de modèle pour la glande mammaire, la brebis pour l'appareil urogénital. Le porteur écrit avoir fixé les effectifs sans aucune analyse statistique, au "minimum nécessaire" selon sa propre estimation.

Objectifs

La Santé de la Femme regroupe l’ensemble des spécialités de la médecine s’intéressant à diagnostiquer et/ou soigner les pathologies et les affections gynécologiques, sénologiques, les troubles obstétricaux, les dysendocrinies, l’infertilité et les pathologies de la glande mammaire et du sein comme le cancer et ses conséquences, ce domaine de la santé s'interesse aussi au suivi des cycles hormonaux physiologiques, au diagnostic et au suivi du bon déroulé de la grossesse par exemple. Le développement des techniques et méthodes d’imagerie et de chirurgie interventionnelles, l’essor de la thérapie génique et cellulaire ou la découverte et l’amélioration des connaissances vis-à-vis de nouvelles entités pathologiques comme par exemple l’endométriose dont la lutte est une stratégie nationale depuis 2021, permettent d’envisager le développement de nouvelles techniques chirurgicales et dispositifs médicaux implantables pour améliorer la santé des patientes, et parfois aussi celle du fœtus ou du nourrisson. On entend par dispositif implantable tout dispositif destiné à être implanté de façon invasive en totalité dans le corps humain ou à remplacer une surface épithéliale grâce à une intervention chirurgicale et à demeurer en place après l'intervention. L'évaluation et le développement des nouveaux dispositifs, méthodes et techniques, pour le diagnostic et/ou le traitement des pathologies gynécologiques, obstétricales et sénologiques par des méthodes de chirurgie standard et mini-invasives requièrent une phase pré-clinique de recherche et de développement. La réponse tissulaire et les modifications anatomophysiologiques au cours des cycles ne peuvent être simulés à l’heure actuelle par des méthodes de remplacement. Durant ce projet le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes pour reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patientes est indispensable. Les objectifs du projet sont doubles : raffiner les prototypes pour en geler les versions jugées efficaces (efficacité) et sécuritaires (innocuité) dans sa phase initiale, puis ces versions entreront alors dans la phase règlementaire du projet pour valider les dispositifs/méthodes/techniques selon la règlementation en vigueur (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58).

Bénéfices attendus

L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patientes, une amélioration de la durabilité, de l’efficacité et de la sécurité des implants pour améliorer leur tolérance et éviter leur rejet et ainsi les ré opérations parfois multiples des patientes, pour réduire les temps de cicatrisation et le traumatisme tissulaire, corollaires de ces interventions et qui handicapent les patientes, ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections grâce au recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patientes avec des durées d'hospitalisation et de convalescence réduites.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - La faim ,lors de la mise à jeun (12 heures pour les porcs, 12 à 16 heures pour les ovins) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - En fonction des besoins et préalablement à la procédure d'évaluation du dispositif, l'induction d'une lésion à la faveur d'une intervention chirurgicale mini-invasive, - La douleur en phase postopératoire : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique, pour ces derniers points, des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple le recours systématique à l'anesthésie générale avec prise en charge multimodale de l'analgésie per, et post-opératoire avec l'usage systématique de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur opiacés avec ajout d'anesthésique locaux pour certaines actes chirurgicaux, la protection et la surveillance des plaies, la surveillance du reveil d'anesthésie dans des espaces calmes et spécialement aménagés avec évaluation et scoring de la douleur réguliers, ou la mise en place d'un suivi clinique quotidien des animaux avec surveillance des signes de douleur par des Techniciens spécialement formés supervisés par des Véterinaires).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs médicaux implantables et des méthodes techniques innovantes dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. Le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes afin de reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients est indispensable. En effet leur utilisation in fine chez les patients représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur l'animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en oeuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateaux techniques opératoires et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Un suivi de la température est réalisé pendant toute la procédure d'implantation chirurgicale et des dispositifs de maintien de la normothermie tels que le système de couverture de réchauffement Bair Hugger© ou des tapis chauffants sont utilisés. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, des protocoles de prise en charge mult imodale de la douleur sont systématiquement appliqués. Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques sont appliqués tout au long du projet. Les transports d'animaux réalisés entre les 2 EU (35 km) seront réalisés à l'aide de véhicules de types camionnettes fermées ayant reçu une autorisation AT1 délivrée par la DDPP, ventilés, climatisés et spécialement équipés pour le transport des animaux vivants (dispositifs d'abreuvement, tapis antidérapants ou cages de transport, suivi et enregistrement des températures lors des trajets, système de surveillance vidéo des animaux). Les personnels en charge sont formés et titulaires du certificat de convoyeur (CCTROV) et le transport est validé par un Vétérinaire. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.

Choix des espèces

Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie semblable à celle de l’Homme avec les mêmes dimensions. Le porc est par son nombre de mammelles le modèle de choix pour l'évaluation de dispositifs interessant la glande mammaire, le modèle brebis possède une anatomie de la sphère urogénitale et de son appareil suspenseur plus proche de ceux de la Femme. Les modèles utilisés ont fait l'objet d'études similaires et sont considérés comme appropriés à cette fin. - La taille relative de ces modèles animaux permet une visualisation à l'aide d'équipements de chirurgie interventionnelle et d'imagerie standards utilisés chez l'Homme. - L'ovin est le modèle pertinent pour l'évaluation de la durabilité des dispositifs chez l'Homme. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez la Femme.

Opérées pour une dénervation musculaire, parfois alors qu'elles sont gestantes, 1 048 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort pour l'analyse de leurs tissus. Les animaux subissent des injections, des chirurgies sous anesthésie, des tests comportementaux d'une heure, un électromyogramme et une mesure de force, la chirurgie pouvant provoquer douleurs, infection et boiterie. Le projet étudie la jonction entre le nerf et le muscle, en vue de comprendre des maladies neuromusculaires rares comme les syndromes myasthéniques congénitaux. Le porteur décrit ces syndromes comme touchant une personne sur 250 000, situant le bénéfice attendu à distance de l'atteinte infligée.

Objectifs

La jonction neuromusculaire (JNM) est la zone de contact entre les neurones moteurs et les muscles striés squelettiques qu'ils innervent. Cette synapse est responsable de l'initiation et du contrôle du mouvement. Le dysfonctionnement de cette synapse entraîne un défaut de la transmission nerf muscle, avec des conséquences dramatiques sur notre capacité à contracter nos muscles, à nous mouvoir ou tout simplement à respirer. Décrypter comment la JNM acquiert sa morphologie complexe et régule sa communication nerf/muscle au cours du développement embryonnaire et tout au long de la vie est essentiel pour comprendre comment le système nerveux fournit le lien entre les pensées et les actions, en relayant des messages qui voyagent si vite que nous ne les remarquons même pas. Compte tenu de la complexité de ces connexions spécifiques, même des défauts subtils dans les événements moléculaires entraînant l'attachement nerf muscle sont à la base d'un large éventail de troubles neurodéveloppementaux affectant en particulier le système neuromusculaire. Par conséquent, l'étude des mécanismes moléculaires qui sous-tendent la formation et la maintenance de la JNM est essentielle pour comprendre les mécanismes impliqués et restaurer une connectivité synaptique appropriée dans les pathologies de la JNM.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet vont de l’élucidation, in vivo, des mécanismes moléculaires physiopathologiques qui sous-tendent la formation et la maintenance de la jonction neuromusculaire (JNM) chez les mammifères, jusqu’à la création d’une base solide pour le développement d’essais cliniques chez des patients atteints de certaines pathologies neuromusculaires comme par exemple les syndromes myasthéniques congénitaux (SMC). Les SMC sont des maladies rares (1 personne sur 250 000) causées par la mutation d'un ou plusieurs gènes impliqués dans la formation et la maintenance de la jonction neuromusculaire.

Procédures

Au cours du projet, une partie des animaux recevront des injections non répétées apres anesthésie (générale et locale) et analgésie. Des femelles gestantes subiront une procédure chirurgicale anesthésie et analgésie (générale et locale) suivie d'une injection non répétée pour une durée de 10 minutes par animal. L'ensemble des animaux du projet effectueront tests comportementaux totalisant une durée d'une heure de tests par animal. De plus, un électromyogramme unique d'une durée de 10 minutes sera réalisé sur animaux anesthésiés et analgésiés. Enfin l'ensemble des animaux du projet subiront un test de mesure de force (10 minutes) apres anesthésie et analgésie de l'animal et sera ensuite euthanasié. Une autre parti des animaux subira une procédure chirurgicale apres anesthésie et analgésie (générale et locale) d'une durée de 20 minutes maximum par animal. A la fin de le période de maintien, les animaux seront euthanasiés pour des prévelement tissulaires suivis d'analyses cellulaires et moléculaires.

Impact sur les animaux

Les expérimentations réalisées sur les animaux nécessitent leur manipulation (injections, tests comportementaux), ce qui engendre un stress de courte durée pour l’animal. Les injections et éléctromyogrammes peuvent induire une douleur locale également de courte durée. Les différentes anesthésies réalisées peuvent entraîner une baisse de la thermorégulation et, dans de rares cas, une détresse cardiorespiratoire. La chirurgie visant une dénervation musculaire peut engendrer des douleurs, des risques d’infection postopératoire ainsi qu’une boiterie.

Devenir

L'euthanasie est, dans ce projet, strictement nécessaire pour l'analyse phénotypique au niveau cellulaire et moléculaire des animaux impliqués et est réalisée selon des méthodes réglementaires.

Remplacement

L'étude de la formation et de la maintenance de la jonction neuromusculaire (JNM) est un processus complexe incluant pléthore d'acteurs cellulaires et moléculaires ne pouvant pas être modélisés in vitro. La qualité de la mise en place de la jonction neuromusculaire et de sa maintenance a des conséquences physiologiques qui nécessitent l’analyse de paramètres physiques, moteurs, propres aux animaux vivants. Cependant, une partie des études in vivo est complétée par des méthodes de (co-)culture cellulaire cherchant à mimer le développement de la JNM dans le but d'évaluer le rôle d'acteurs moléculaires sur celui-ci.

Réduction

Au total, 1048 animaux sont impliqués. Ce nombre est calculé et strictement limité afin d'avoir une puissance statistique suffisante permettant de montrer la significativité d'une différence lorsque celle-ci existe et d'obtenir des résultats fiables. Le calcul de puissance est réalisé avec un logiciel statistique dédié à cet effet. Par ailleurs, diverses cultures et co-cultures cellulaires sont mises en œuvre afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel étant limité au maximum) en portoirs ventilés, avec un système d’abreuvement automatique et un accès ilimité à la nourriture et à l’eau. Le milieu est enrichi avec au moins deux enrichissements, et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été conçu de manière à permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Les études comportementales reposent sur les comportements spontanés propres aux animaux. L’évaluation motrice est réalisée après différentes phases d’habituation (à l’expérimentateur et aux tests), permettant de minimiser le stress associé aux manipulations répétées. La majorité des actes techniques sont réalisés sous anesthésie et analgésie. Pour les chirurgies, une analgésie post opératoire sera également mise en place. Ainsi, la douleur et le stress sont limités grâce à des soins adaptés et une surveillance attentive, accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces. Le protocole mis en place est optimisé pour respecter le bien-être des animaux et pour réduire la durée de l’expérimentation au minimum.

Choix des espèces

Le développement des techniques d’imagerie et de transgénèse chez la souris rend cet animal le plus adapté à l’identification et à l’étude de nouvelles molécules impliquées dans la formation et la maintenance de la jonction neuromusculaire (JNM). Les animaux sont des souris agées de 20 à 180 jours pour les études comportementales et l’analyse des étapes de maintenance de la JNM.

Gavées ou perfusées jusqu'à six heures avec des composés à tester, 1 800 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort après un prélèvement sanguin terminal et une nécropsie. Le projet mesure la tolérance de produits d'un commanditaire avant leurs études d'efficacité, en identifiant les doses qui déclenchent apathie, convulsions ou perte de poids d'au moins 20 %, seuil à partir duquel l'animal est tué. Le porteur présente un cathéter implanté dans la jugulaire comme un gain de "bien-être" qui évite six heures de contention, une contrainte que le protocole crée lui-même. Il conclut que la souris reste "indispensable" faute de modèle in vitro reproduisant un "organisme entier".

Objectifs

Ce projet vise à évaluer la tolérabilité de produits administrés par voie orale et intraveineuse chez la souris, en administration aiguë et répétée. L'objectif est de déterminer les effets potentiels sur les paramètres cliniques, le comportement, la mortalité, et les organes cibles, afin de garantir la sécurité des composés avant leur développement.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à sécuriser les études d’efficacité en amont, en évaluant la tolérabilité des produits testés chez la souris, en administration aiguë et répétée. Lors de ces études, il est essentiel de s’assurer que les doses administrées ne génèrent pas d’effets indésirables non anticipés. L’objectif est de mieux cibler les plages de doses à utiliser dans les protocoles d’efficacité, en identifiant les seuils de tolérance et les éventuelles toxicités liées à la formulation ou à la voie d’administration. Cette approche permet d’éviter l’exposition inutile des animaux à des doses potentiellement délétères, tout en garantissant la robustesse des résultats obtenus dans les études suivantes. Les données générées permettront également d’optimiser les plans expérimentaux, de réduire les risques d’échec liés à une mauvaise tolérabilité, et de renforcer la qualité des dossiers réglementaires associés au développement des produits. Justification scientifique et éthique de l’usage du VAB : L’utilisation du VAB permet une administration intraveineuse sans contention physique prolongée. En méthode traditionnelle, les animaux doivent être maintenus dans un tunnel de contention pendant au maximum 6 heures, ce qui génère un stress important. Ce stress est d’autant plus problématique dans les protocoles à administration répétée, où il serait réitéré plusieurs fois. Avec le VAB, les animaux restent libres de leurs mouvements, ce qui réduit significativement le stress et améliore leur bien-être. Cette approche est donc scientifiquement pertinente pour garantir des données fiables, et éthiquement justifiée pour respecter les principes du raffinement dans l’expérimentation animale.

Procédures

Dans le cadre des administrations intraveineuses, deux modalités sont envisagées : Administration aiguë : chaque injection est réalisée sur un animal vigile après passage dans une enceinte thermostatée à 38°C avec une durée maximale de 15 minutes, la durée de l'administration est courte, généralement comprise entre 5 et 10 secondes. Perfusion lente : l’administration est réalisée sur animaux implantés , qui leur permettent d'avoir une totale liberté de mouvement, elle peut durer jusqu’à 6 heures. Pour les procédures par gavage, les administrations sont brèves, inférieures à 10 secondes. Fin de procédure : À l’issue des expérimentations, les animaux seront anesthésiés profondément. Un prélèvement sanguin terminal sera alors réalisé, suivi d’une euthanasie sans réveil, conformément aux recommandations éthiques et réglementaires en vigueur.

Impact sur les animaux

Les études de tolérabilité visent à identifier les effets délétères liés à l’administration de composés, immédiats ou après expositions répétées. Bien que supposés bien tolérés, certains effets peuvent survenir selon la dose, la formulation ou la voie d’administration. Les injections IV peuvent provoquer des réactions locales (érythème, œdème, hématome, croûte), notamment en cas d’irritation liée au véhicule. Les administrations orales peuvent entraîner des troubles digestifs, une baisse de consommation alimentaire ou une perte de poids. Ces effets seront surveillés quotidiennement. Le traitement est interrompu en cas de signes cliniques sévères : apathie, prostration, yeux fermés, décubitus latéral, piloérection, tremblements, convulsions, œdème sévère, perte de poids ≥ 20 %, ou absence d’alimentation (liste non exhaustive). Ces critères permettent de limiter la douleur sans compromettre les résultats. Lors d’administrations répétées, l’évolution clinique sera suivie avec attention. Une adaptation des doses ou de la durée pourra être envisagée en cas de toxicité. Les injections seront réalisées dans les règles de l'art. La couleur de la peau (pâleur) et le comportement seront observés le lendemain pour détecter toute atteinte physiologique. Afin de faciliter l’injection IV et éviter le passage en périveineux, les animaux sont placés au maximum 15 minutes dans une enceinte thermostatée à 38°C. Chez les animaux porteurs de VAB implantés à la veine jugulaire, des effets indésirables spécifiques peuvent apparaître : réactions locales (érythème, œdème, croûtes, hématomes), gêne ou douleur à la manipulation, risque d’infection ou de déplacement du dispositif. Une surveillance renforcée est mise en place : inspection du site, suivi du comportement et de l’état général, mesures d’hygiène strictes. Toute anomalie est évaluée par le porteur de projet ou le personnel du bien-être animal, et peut conduire au retrait de l’animal de l’étude.

Devenir

À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort de manière éthique et réglementaire, après un prélèvement sanguin terminal réalisé sous anesthésie profonde. Ce prélèvement a pour objectif de détecter d’éventuels effets indésirables ou toxiques du composé testé, notamment par l’analyse de biomarqueurs spécifiques. Par ailleurs, une nécropsie sera systématiquement effectuée afin d’identifier, par observation macroscopique, d’éventuelles altérations des organes cibles, permettant ainsi une évaluation complète de l’impact du traitement.

Remplacement

Avant toute expérimentation in vivo, plusieurs tests de toxicité cellulaire sont réalisés afin d’évaluer la cytotoxicité, les effets mutagènes et les interactions métaboliques des composés. Ces tests permettent d’éliminer les produits les plus toxiques et d’éviter des expositions trop fortes ou inappropriées chez l’animal. Cependant, malgré leur utilité, ces modèles in vitro présentent des limites importantes. Ils ne permettent pas de reproduire les interactions complexes d’un organisme entier, notamment les effets systémiques, les réactions immunitaires, les compensations physiologiques ou les effets secondaires liés à la voie d’administration. De plus, certains effets indésirables ne se manifestent qu’en contexte multi-organes ou après plusieurs jours d’exposition. C’est pourquoi l’expérimentation animale reste indispensable pour confirmer la tolérabilité des produits dans des conditions proches de leur usage clinique. Les études in vivo permettent de valider les doses sûres, d’identifier les seuils de toxicité, et de garantir la sécurité des protocoles d’efficacité à venir.

Réduction

Les études de tolérabilité sont conçues pour être réalisées sur un nombre restreint d’animaux, tout en permettant une évaluation fiable des effets potentiels des produits testés. Chaque protocole est optimisé pour limiter les effectifs tout en assurant la détection des signes de toxicité, qu’ils soient liés à la dose, à la formulation ou à la voie d’administration. Ces études préalables permettent d’éviter l’administration de doses potentiellement toxiques dans les protocoles d’efficacité, qui mobilisent un nombre d’animaux plus important. En ciblant précisément les plages de tolérance, elles contribuent à réduire significativement le nombre total d’animaux utilisés dans l’ensemble du programme de recherche. Cette approche est pleinement conforme au principe de réduction des 3R, en évitant les expositions inutiles, les traitements non pertinents, et en affinant les plans expérimentaux grâce aux données obtenues. Les effectifs sont définis à partir de données bibliographiques, de tests in vitro, et d’études pilotes, permettant le calcul de puissance statistique et l’ajustement des groupes en fonction de la réponse observée.

Raffinement

Les études de tolérabilité ont été conçues pour limiter au maximum les nuisances potentielles tout en garantissant la qualité des observations. Contrairement aux modèles pathologiques, les produits testés dans ce protocole ne sont pas censés induire de symptômes sévères. Toutefois, des effets liés à la formulation, à la voie d’administration ou à la dose peuvent survenir et seront surveillés avec attention. Ces signes sont considérés comme des atteintes de points limites et entraînent la mise à mort éthique de l’animal concerné, ainsi qu’un réajustement des paramètres expérimentaux (dose, durée, formulation). Les procédures sont réalisées avec un hébergement adapté au bien-être des animaux, incluant un enrichissement du milieu (igloos, éléments de nidification, bois à ronger). Les injections intraveineuses sont réalisées dans les règles de l’art,avec application de lidocaïne au niveau du site d'injection, afin d’éviter les réactions locales ou les erreurs techniques. Les observations sont renforcées dans les heures suivant l’administration, et une attention particulière est portée à la couleur de la peau et au comportement des animaux. Le prélèvement de sang terminal et la mise à mort des animaux seront réalisés sous anesthésie à l'isoflurane. Ce niveau de raffinement permet de garantir une expérimentation respectueuse, conforme aux exigences réglementaires et éthiques, tout en assurant la fiabilité des données générées.

Choix des espèces

Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour de reproduire de manière fiable les mécanismes physiopathologiques ciblés par nos produits, notamment ceux liés à des atteintes systémiques ou métaboliques. Les modèles murins, tels que le rat et la souris, présentent une homologie génétique d’environ 90 % avec l’humain, ce qui en fait des espèces de choix dans les études pharmacologiques. Le choix d’utiliser à la fois le rat et la souris repose sur le fait que nos modèles d’efficacité ont été développés spécifiquement dans l’une ou l’autre de ces espèces. Il est donc pertinent, avant de procéder aux tests d’efficacité, de vérifier la tolérabilité des produits dans l’espèce concernée par le modèle utilisé.Le test de tolérabilité chez le rat fait l'objet d'une autorisation indépendante de celle-ci. La présente autorisation porte sur le modèle souris. Les animaux utilisés dans ce projet seront des individus jeunes adultes, âgés de 8 à 10 semaines. Ce stade de développement est choisi car il correspond à une période où les animaux sont suffisamment matures sur le plan immunologique et physiologique, tout en étant encore dans une phase de stabilité métabolique. Cela permet d’obtenir des données fiables et reproductibles sur la tolérabilité des composés testés, tout en limitant les biais liés à l’âge ou au développement.

Entretenir une lignée de souris atteintes de dystrophie musculaire de Duchenne, tel est l'objet de ce projet qui prévoit d'élever 3 864 souris dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ces animaux portent une maladie génétique qui dégrade leurs muscles, avec des douleurs musculaires dès trois semaines de vie, une faiblesse, puis des difficultés à se déplacer en fin de vie. Les trios reproducteurs sont mis à mort à dix mois ou après dix à douze portées, et la plupart des petits partent vers d'autres protocoles expérimentaux. Le porteur décrit le modèle comme "indispensable" pour tester des thérapies dont les bénéfices, de son propre aveu, dépendront des projets à venir.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique à transmission récessive liée au chromosome X due à l’absence de la protéine dystrophine. Cette maladie entraîne une dégénérescence de l’ensemble des muscles (squelettique, cardiaque ou lisse), une inflammation, de la fibrose et une perte de masse et de force musculaire. L’utilisation de modèles murins de la DMD est indispensable pour mieux comprendre l’évolution de la maladie et pour tester les thérapies que nous développons. L’objectif de ce projet est donc la génération, le maintien et l’entretien d’une lignée de souris dystrophiques.

Bénéfices attendus

L'objectif est d'identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour la Dystrophie musculaire de Duchenne. Les bénéfices attendus dépendront du projet dans lesquels seront utilisés ces animaux. A long terme, l’utilisation des ces souris a pour vocation l’identification de nouvelles thérapies utilisables chez les patients ou permettra de décrypter des mécanismes essentiels pour l’optimisation de ces thérapies.

Procédures

Seul le phénotype dommageable justifie cette demande. Les animaux générés dans cet élevage seront ensuite inclus dans d'autres projets dans lesquels nous indiquerons les interventions potentielles.

Impact sur les animaux

Les souris dystrophiques présentent une atteinte des muscles squelettiques, du diaphragme et du cœur. Elles ont une importante faiblesse musculaire, de l’inflammation, de la fibrose et de l’infiltration de tissu adipeux. Ces animaux peuvent donc ressentir des douleurs musculaires et présenter des difficultés à se déplacer en fin de vie. Les souris de cette lignée peuvent ressentir des douleurs musculaires au moment de la crise aigue de nécrose-régénération à partir de l’âge de 3 semaines de vie et une faiblesse musculaire. De plus, ces animaux peuvent présenter un phénotype anxieux et des problèmes d'audition à partir de 5 mois de vie.

Devenir

Les trios reproducteurs seront euthanasiés lorsqu’ils auront atteints l’âge de 10 mois et/ou lorsqu'on aura atteint 10 à 12 portées par trio. Des animaux en élevage seront utilisés pour des prélèvements après euthanasie. Enfin, la plupart des animaux issus de l’élevage seront utilisés dans des procédures expérimentales.

Remplacement

Le but de nos projets est l’identification d’une possible stratégie thérapeutique pour le maintien de l’intégrité musculaire dans le muscle dystrophique. L’utilisation d’un modèle murin de la dystrophie musculaire de Duchenne est indispensable car les modèles in vitro ne peuvent rendre compte de la dégénerescence progressive observée au cours de cette maladie ni de bénéfices fonctionnels comme l’augmentation de la force musculaire. Néanmoins, autant que possible et si la question posée peut être résolue ainsi, des expériences in vitro avec des lignées cellulaires seront réalisées pour limiter au maximum le recours à l'utilisation de souris.

Réduction

Les protocoles expérimentaux des projets seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que les expériences soient interprétables et pour éviter de les répéter. Afin de réduire le nombre d'animaux générés dans ces élevages, le pilotage de l’élevage sera réalisée de manière groupé pour permettre de mutualiser nos besoins de lots expérimentaux, d’anticiper le nombre d’animaux nécessaires et donc de limiter le nombre d’animaux produits mais non utilisés. Nous contrôlerons le nombre d'accouplements afin de ne pas générer d'excédent de stock en fonction des projets en cours autorisés. En tenant compte de la productivité moyenne observée pour cette lignée (fertilité, taille des portées et survie des petits), nous savons que nous aurons besoin d’un maximum de 8 trios (2 femelles et 1 mâle) en continu pour entretenir la lignée et générer les lots expérimentaux nécessaires. Nous estimons qu’au cours des 5 ans, nous aurons besoin de 24 géniteurs au départ (16 femelles et 8 mâles), qui seront remplacés à l'âge de 10 mois. Et nous génèrerons 3840 animaux soit un total de 3864 animaux. Comme il s’agit d’un projet ne décrivant que de l’élevage, nous ne réaliserons pas de tests statistiques. Ils seront réalisés dans les projets expérimentaux.

Raffinement

Les conditions d’hébergement et l’enrichissement du milieu sont gérés par l’animalerie. Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec eau et nourriture ad libitum. La température et l’hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h).Les animaliers procèdent à un contrôle quotidien des cages et un changement régulier sous hotte aspirante. Les animaux sont maintenus sous un statut sanitaire (exempte de pathogènes et d'opportunistes, tout le matériel est stérilisé par autoclavage (enrichissement, cages) et l'eau est osmosée. L’enrichissement du milieu consiste en l’ajout de cocoon et de huttes en carton afin que les souris puissent faire un nid ainsi que la présence de croquettes au fond de la cage. Les animaux en accouplement sont 3 par cage et après le sevrage, les petits seront 5 par cage maximum et l'hébergement individuel est évité. Cependant il est possible que certains animaux se retrouvent hébergés individuellement de manière imprévue (seul mâle d’une portée, agression entre congénères, dernier animal dans la cage..). Dans ce cas, l’animal bénéficiera d’un enrichissement supplémentaire dans sa cage. Enfin, si nécessaire, la nourriture pourra être mise à disposition sur le plancher de la cage ou en bouillie dans des coupelles. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement afin de relever le moindre signe de souffrance. Nous mettrons en place des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces pour permettre de limiter la douleur à son minimum.

Choix des espèces

La souris est l’espèce de choix pour la caractérisation de l’homéostasie musculaire. Cette espèce permet de combiner les études moléculaires et fonctionnelles du muscle squelettique. Le modèle de souris dystrophique utilisé dans ce projet est très couramment utilisé pour étudier l’évolution de la Dystrophie musculaire de Duchenne et pour tester l’efficacité des différentes thérapies. Pour les accouplements, nous utiliserons des animaux âgés de 2 à 10 mois, période au cours de laquelle les animaux sont les plus fertiles.

Toutes mises à mort à l'issue pour prélèvement des tumeurs et des organes, 288 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules cancéreuses du sein, jusqu'à six injections intraveineuses dans la queue, des mesures d'haleine en cage métabolique et une ponction intracardiaque, pour tester une molécule qui libère à la fois une chimiothérapie et un marqueur volatil détectable dans l'haleine. Les bénéfices annoncés pour les patientes, un suivi en temps réel et moins d'effets secondaires, restent au conditionnel et à long terme. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit la diffusion du marqueur dans un "organisme entier" et conclut au caractère "indispensable" de la souris.

Objectifs

Le cancer reste l’une des principales causes de mortalité dans le monde, avec 10 millions de décès estimés chaque année selon l’Organisation mondiale de la Santé. Le cancer du sein constitue la première cause de décès par cancer chez les femmes. Certaines formes de cancer du sein sont particulièrement agressives, avec un risque élevé de rechute. Malgré les progrès récents en cancérologie, les traitements disponibles restent limités et le suivi de leur efficacité demeure difficile. Ce projet propose de tester une nouvelle approche qui combine, traitement et suivi de l’efficacité du traitement dans une même molécule. Cette molécule reste inactive dans le sang et ne s’active qu’au contact de certaines substances présentes autour de la tumeur. Une fois activée, elle libère à la fois une chimiothérapie et une petite molécule volatile détectable dans l’haleine ou dans le sang. La chimiothérapie agit directement sur la tumeur, en limitant les effets secondaires sur les tissus sains. La libération de la molécule volatile sur le site tumoral permet de suivre l’efficacité de la chimiothérapie sans recourir à des examens invasifs. Le projet prévoit d’évaluer une molécule issue de cette technologie. Au préalable, nous évaluerons l’efficacité de cette molécule sur des cellules tumorales humaines en boite de culture. Par la suite, le composé sera testé sur un modèle murin. Ce modèle permet de reproduire au plus près la physiologie complexe d’un organisme humain. En effet, à ce jour, aucun modèle biologique, autre que les modèles animaux, ne peut reproduire le fonctionnement du système respiratoire et de la circulation sanguine de manière optimale. À terme, cette approche vise à offrir une nouvelle option thérapeutique pour les cancers du sein agressifs. Cette approche permettra d’améliorer la prise en charge clinique, de réduire les effets secondaires et de faciliter le suivi personnalisé des patientes.

Bénéfices attendus

Dans le domaine de l’oncologie, le développement de nouvelles approches thérapeutiques demeure une priorité majeure, notamment pour les cancers solides tels que le cancer du sein, dont certains sous-types restent difficiles à traiter. Cette approche pourrait apporter plusieurs bénéfices importants dans la lutte contre le cancer du sein. Elle permettrait de suivre l’évolution de la tumeur en temps réel grâce au sous-produit volatil libéré dans l'organisme. Cette approche limite ainsi le recours à des examens lourds ou invasifs nécessaires au suivi de l’efficacité thérapeutique. Ce suivi rapide de l’efficacité des traitements, permettrait de l’ajuster plus précocement en fonction de la réponse de la tumeur. D’autre part, comme cette molécule est activée au niveau de la tumeur, cela réduit les effets secondaires souvent observés avec les chimiothérapies classiques. À terme, cette approche innovante présenterait un intérêt clinique majeur car elle offrirait une nouvelle façon d’évaluer l’efficacité d’un traitement anticancéreux tout en améliorant le confort et la qualité de vie des patientes.

Procédures

La totalité des animaux seront soumis à un baguage auriculaire des animaux sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane pour permettre leur identification. Dans l’étude de toxicité chaque animal subit les actes suivants : 6 injections intraveineuses par voie caudale (2 injections par semaine pendant 3 semaines) 1 injection maximum sur animal vigil, sous anesthésie locale, jusqu’à 5 injections sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane. 1 mesure de l’haleine par animal durant 2 heures sur animaux vigiles, en cage métabolique 3 prélèvements sanguins submandibulaires sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane avec une fréquence : 1 prélèvement avec un intervalle de plus de 7 jours sur 3 animaux . Dans l’étude de libération du sous-produit volatil sur le site tumoral chaque animal subit les actes suivants : 1 injection sous-cutanée de cellules cancéreuses du sein ou PBS/matrigel (selon le lot) sous anesthésie gazeuse. 1 injection intraveineuse par voie caudale sur animal vigile, sous anesthésie locale. 1 mesure sur l’haleine par animal d’une durée comprise entre 30 minutes et 2 heures sur animal vigile, en cage métabolique 1 ponction intracardiaque gazeuse à l’isoflurane avec analgésie à la buprénorphine Certains animaux subiront 1 prélèvement sanguin submandibulaire sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane pour le groupe 4 heures après l’injection du composé. Dans l’étude d’efficacité antitumorale chaque animal subit les actes suivants : 1 injection sous-cutané injection de cellules cancéreuses du sein sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane. 6 injections intraveineuses par voie caudale (2 injections par semaine pendant 3 semaines) : 3 injections maximum sur animal vigile, sous anesthésie locale et 3 injections sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane. 3 mesures de l’haleine par animal entre 30 minutes et 2 heures sur animal vigile, en cage métabolique. 3 prélèvements sanguins submandibulaires sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane avec une fréquence : 1 prélèvement tous les 7 jours à un temps post-injection défini précédemment.

Impact sur les animaux

Les souris immunodéprimées présentent un phénotype fragile et sensible aux infections. Ce phénotype nécessite des conditions d’hébergement adaptées, telles que celles présentes au sein de notre animalerie. L’utilisation de l’anesthésie gazeuse au cours de ce projet peut provoquer un stress léger et passager lors du réveil des animaux. Cette anesthésie sera utilisée pendant l’implantation des cellules tumorales en sous cutanée, les injections et les prélèvements sanguins ainsi que le marquage auriculaire. La croissance des tumeurs en sous-cutané entraînera une gêne locomotrice proportionnelle à la taille de la protubérance tumorale. Enfin les injections intraveineuses de composé pourront être réalisées chez des animaux vigiles sous anesthésie locale à l’aide de tubes de contention, ce qui induit un stress et l’inconfort pour les animaux.

Devenir

À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort. Des études des tissus, incluant des prélèvements d’organes et de tumeurs, seront réalisées post mortem. Ces études sont absolument fondamentales. Elles permettront de vérifier dans les tumeurs récupérées après la mise à mort, l’efficacité de notre composé sur les tumeurs ainsi que leurs effets potentiels chez des animaux ne portant pas de tumeur. De plus, ces procédures permettront également d’investiguer le mécanisme d’action de notre composé. Nous réaliserons différents marquages immunohistochimiques de protéines cibles couramment étudiées en cancérologie. Nous évaluerons aussi les niveaux d’enzymes dans le tissu intra-tumoraux et péri-tumoraux sur les tissus à l’aide de techniques de chimie analytique.

Remplacement

Les paramètres de distribution de notre composé ne peuvent être obtenus qu’au moyen d’animaux. Ces études précliniques sont indispensables avant toute évaluation en essais cliniques chez l’homme. À l’heure actuelle aucun modèle non biologique ou in vitro ne permet de réaliser ces analyses sans perte d’informations scientifiques essentielles. Le développement de notre composé nécessite le recours à un modèle systémique complexe intégrant les systèmes circulatoire et respiratoire. En effet, l’activation du composé dans l’environnement tumoral entraîne la libération d’un sous-produit volatil. Ce dernier diffuse dans la circulation sanguine, puis est transféré vers le système respiratoire, où il est finalement expiré par les animaux. La détection du sous-produit de notre composé dans l’haleine des animaux constituera un marqueur direct de la libération du composé au sein du microenvironnement tumoral. Elle servira également de marqueur indirect de l’efficacité du composé sur la tumeur. Ce phénomène repose sur des interactions physiologiques dynamiques entre plusieurs organes. Elles sont impossibles à reproduire de manière pertinente à l’aide de modèles in vitro ou in silico. L’utilisation d’un modèle animal est donc indispensable pour reproduire fidèlement la diffusion et l’élimination du sous-produit volatil dans l’organisme.

Réduction

Afin de limiter le nombre de composés à tester chez l’animal, des essais préliminaires in vitro ont été réalisés sur des lignées cancéreuses afin d’évaluer leur efficacité et la libération du sous-produit volatil. Nous avons ainsi pu réduire le nombre d’animaux grâce à ces études. De plus, seul le composé le plus prometteur sera ainsi évalués in vivo. Nous disposons également des connaissances et du savoir-faire technique pour mesurer les produits volatils contenus dans l’haleine chez l’animal. En effet, cette technique a déjà été mise en œuvre avec succès lors de précédentes études in vivo menées par notre équipe. Cette maîtrise de la technique réduit les risques d’échec des mesures. Elle contribue aussi à limiter le nombre d’animaux utilisés en évitant des essais exploratoires supplémentaires. Les protocoles ont été conçus pour maximiser les informations obtenues tout en minimisant la douleur et la souffrance des animaux. De plus, certaines parties des procédures seront réalisées de manière séquentielle. Nous ajusterons les différents paramètres expérimentaux sans mobiliser l’ensemble des souris dès le départ, conformément au principe de réduction. De plus nous avons prévus de faire des tests pilotes qui seront des étapes conditionnant la poursuite de certaines procédures. Une organisation optimisée des groupes expérimentaux permettra également de réduire le nombre d’animaux sans compromettre la fiabilité des résultats. Le nombre d’animaux a été déterminé grâce à une analyse statistique a priori permettant de déterminer le nombre minimal qui donnera des résultats robustes. Les données utilisées pour le calcul se basent sur des données issues de la littérature décrivant des modèles murins comparables. Le calcul conduit à un effectif de 12 souris par groupe permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante tout en respectant le principe de réduction des animaux. Ces procédures d’expérimentation animale sont nécessaires pour progresser dans la mise au point de nouvelles thérapies anti-tumorales et de procéder à leur évaluation préclinique avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. À ce jour, aucun modèle alternatif ne permet de réaliser de manière fiable des études biologiques aussi complexes. De plus, la collecte post-mortem des organes et des tumeurs permettra de compléter nos procédures à posteriori.

Raffinement

Des mesures de raffinement ont été mises en place afin de réduire la douleur, la souffrance, le stress et l’anxiété des animaux tout au long du protocole. À leur arrivée, les souris immunodéprimées présentent un statut sanitaire contrôlé garantissant l’absence d’agents infectieux connus. Elles seront hébergées dans des armoires ventilées en pression positive qui sont adaptées au maintien de leur statut sanitaire et permettent de limiter l’expression de leur phénotype immunodéficient. Les animaux seront maintenus en groupes dans un environnement enrichi, grâce à la présence de tunnels, et des modules en bois, favorisant leurs comportements naturels et leurs interactions sociales. Les conditions d’hébergement seront strictement contrôlées, et une période d’acclimatation de 10 jours. Au cours cette période, les animaux seront progressivement habitués aux manipulations grâce à la distribution de récompenses alimentaires stérilisées, afin de réduire le stress. Les interventions susceptibles de provoquer de la douleur, telles que l’implantation tumorale, le baguage auriculaire et les prélèvements sanguins, seront réalisés sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane, avec maintien de la température corporelle. Lorsque cela est compatible avec le protocole expérimental, les injections seront également réalisées sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane afin de réduire la douleur. Dans les cas où l’anesthésie gazeuse n’est pas possible, une anesthésie locale (lidocaïne gel) sera utilisée pour garantir le confort des animaux tout en préservant l’intégrité des mesures. Pour anticiper toute douleur, une analgésie adaptée sera systématiquement mise en place, incluant des injections et l’ajout de buprénorphine dans l’eau de boisson. Toutes les manipulations seront effectuées avec du matériel stérile à usage unique afin de minimiser le risque de contamination. L’état clinique et le comportement de chaque animal seront évalués quotidiennement à l’aide d’une grille d’observation spécifique, permettant de détecter précocement tout signe de souffrance. Des points limites précis et validés seront appliqués pour assurer une prise en charge rapide et appropriée des animaux présentant des signes cliniques anormaux. Si les animaux atteignent les points limites nous effectuons une mise à mort par dislocation cervicales sous anesthésie gazeuse. De plus, toutes les mises à morts seront réalisées après sédation pour limiter le stress des animaux et améliorer la réalisation de l’acte.

Choix des espèces

Les souris immunodéprimées offrent la possibilité de développer des modèles tumoraux humains sans risque de rejet immunitaire. Les techniques employées pour l’induction tumorale sont rapides, reproductibles et bien documentées, ce qui permet de connaître précisément les limites éthiques associées à ce type d’expérimentation. Ces modèles animaux sont essentiels pour le développement de nouvelles thérapies et pour leur évaluation préclinique avant d’être testées chez l’homme. La souris constitue l’espèce la mieux adaptée et la mieux caractérisée pour la réalisation de protocoles de thérapie in vivo. Nous allons avoir recours à des souris ayant 5 semaines. À ce stade de développement, elles sont considérées comme jeunes adultes et présentent une capacité optimale de prise tumorale. Une période d’acclimatation de 10 jours sera mise en place à leur réception, afin de leur permettre de s’habituer à leur nouvel environnement. Les procédures expérimentales débuteront lorsque les souris auront atteint l’âge de 7 semaines.

Pour satisfaire les études réglementaires exigées avant tout essai chez l'être humain, 940 lapins vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Ils reçoivent des candidats médicaments ou des vaccins par voie orale, oculaire, musculaire ou intraveineuse, de façon répétée sur des études pouvant durer jusqu'à 52 semaines, avec prélèvements sanguins et examens réguliers. Les effets attendus correspondent aux effets pharmacologiques des produits testés et à la douleur liée aux procédures. La mise à mort en fin d'étude est présentée comme obligatoire pour l'analyse des organes, le lapin étant retenu comme espèce non-rongeur imposée par la réglementation.

Objectifs

Ce projet consiste en l'administration d'un ou de plusieurs candidats médicaments (humain ou vétérinaire) ou substance vaccinale à des lapins par administration unique ou répétée afin d’évaluer son risque toxique et d’optimiser ses conditions d’utilisation pendant son développement pré-clinique. Dans le cadre des lignes directrices pour l’approbation d’un candidat médicament, deux espèces, une rongeur et une non-rongeur, sont requises dans le cadre des études pré-cliniques. Pour l'évaluation des vaccins et dans le cadre de certaines voies d’administration (oculaires), une espèce est généralement acceptée, et le lapin est l'espèce privilégiée. Les administrations se feront au même rythme que pour l’administration chez l’Homme, et elles pourront être journalières, hebdomadaires, ou par cycle (1 administration + une période sans traitement, ce cycle étant répété plusieurs fois).

Bénéfices attendus

Ce projet permet les études réglementaires obligatoires chez une espèce non-rongeur (le lapin) pour le développement préclinique de médicaments (humains ou vétérinaires). Des études préliminaires in vivo chez le lapin sont parfois également nécessaires. Ces études peuvent être demandées par les autorités réglementaires, en amont des études réglementaires, pour affiner ou mettre en place des conditions expérimentales, pour répondre à des questions de sécurité, ou pour confirmer un mécanisme d’action. Ces études préliminaires permettent souvent de limiter le nombre global d'animaux utilisés dans le développement d'un produit. L'ensemble des études du projet vise à évaluer les conditions d’utilisation envisagées, de réduire le risque potentiel encouru par le volontaire sain à la suite de l’administration du candidat médicament au cours des premiers essais cliniques et de calculer la marge de sécurité en gardant à l'esprit le ratio bénéfice/risque du produit concerné pour la santé humaine/animale. La réalisation de ce projet est indispensable à la réalisation de la première administration chez l'Homme ou l'animal. L'espèce lapin est l’espèce la plus pertinente pour le développement préclinique de certains composés : notamment les vaccins et les médicaments administrés par voie oculaire.

Procédures

Les animaux sont traités par différentes voies (principalement orale mais aussi intramusculaire, oculaire, sous-cutanée ou intraveineuse…) de façon journalière (voire plusieurs fois/j) hebdomadaire, ou de manière plus espacée (ex: toutes les 2 semaines, mensuel), avec le(s) produit(s) d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 30 minutes dans le cas de perfusion intraveineuse. La durée des études peut être courte (1j) ou longue (jusqu’à 52 semaines). Des prélèvements sanguins, tissulaires, de fèces, urinaires ou/et de fluides corporels (ex. salive, larmes) pourront être réalisés au cours du temps et analysés afin de déterminer les niveaux du ou des composés administrés et/ou de leurs métabolites. D’autres prélèvements sanguins ou urinaires sont également possibles pour bilan urinaire, hématobiochimique ou hormonal par exemple. Ces prélèvements sont réalisés à une fréquence et à des volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Les animaux seront examinés quotidiennement afin de déceler tout signe clinique. Le poids corporel sera mesuré régulièrement au cours du projet. La consommation alimentaire sera suivie quotidiennement, la consommation hydrique plus rarement. Des examens ophtalmologiques, échographiques ou radiologiques, pourront être réalisés. Les animaux seront euthanasiés à la fin du projet et un examen microscopique sera réalisé sur les tissus collectés si nécessaire.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent aux effets pharmacologiques du produit administré (ex : action au niveau du système nerveux central), à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés aux procédures [prélèvements, administration répétée, contention et/ou aux effets systémiques (exemples : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire)] qui peuvent être observés. L’hébergement des animaux mâtures (>1 an) se fait en individuel, avec contacts olfactifs, visuels et sonores préservés et enrichissements additionnels. Des enrichissements variés (ex : mise à disposition de foin, tablette en hauteur) et le maintien des contacts sonore, visuel et olfactif, sont mis en place permettant d’exprimer les comportements physiologiques et activités qu’ils auraient dans leur habitat naturel (ex : temps d’isolement).

Devenir

Les études de toxicologie règlementaires incluent une évaluation obligatoire des effets sur les organes et tissus (analyse histopathologique), incluant la comparaison avec les observations sur le groupe contrôle, et nécessitent par conséquent une mise à mort des animaux en fin d’étude.

Remplacement

L’évaluation de la toxicité de candidats médicaments (humains ou vétérinaires)/vaccin selon les règlementations en vigueur nécessite encore l’utilisation d’animaux (une espèce rongeur et une espèce non-rongeur), et ces études ne peuvent pas être réalisées in vitro, en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant. L'espèce lapin est l’espèce la plus pertinente pour le développement préclinique de certains composés : notamment les vaccins (volume d’administration proche de l’Homme et bonne réponse immunitaire) et les médicaments administrés par voie oculaire (bonne homologie avec l’œil humain).

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est celui recommandé dans les lignes directrices ICH ou OCDE, et se base sur des tests statistiques, comprenant a minima des tests de normalité, d’analyse de la variance et tests comparant les moyennes des groupes, le nombre d’animaux utilisés est le minimum possible pour atteindre les objectifs de l’étude. Le besoin de groupe contrôle, le nombre de doses nécessaires, ainsi que les techniques de prélèvements sanguins sont évalués systématiquement pour assurer une réduction du nombre d’animaux. Des animaux des deux sexes seront utilisés pour permettre l'évaluation d’un effet sexe.

Raffinement

L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. En fonction des signes cliniques attendus, la fréquence de contrôle de l’état de santé des animaux sera adaptée (ex. poids corporel et consommation de nourriture et d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité…). Toute anomalie est signalée au vétérinaire selon la sévérité et le degré d’urgence. Si un ou plusieurs points limites sont atteints, que la douleur de l’animal ne peut être soulagée ou que l’inconfort ne peut pas être suffisamment réduit, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Des prélèvements sanguins seront effectués à l’artère auriculaire selon les bonnes pratiques vétérinaires et les procédures internes validées. Certains traitements sont réalisés sous anesthésie locale ou générale pour éviter le stress, le douleur ou l’inconfort, comme les administrations intramusculaire. Les animaux mâtures sont hébergés en individuel, avec des enrichissements et le maintien des contacts visuel et olfactif, en raison d’un tempérament territorial et combatif avec ses congénères dans les conditions de vie en laboratoire. Les lapins bénéficient d’un environnement enrichi comprenant la diffusion de musique, une manipulation régulière incluant des caresses quotidiennes, la distribution de récompenses après procédures, la mise à disposition de foin, la présence de jouets (haltères), des surfaces de repos adaptées et un hébergement en groupe favorisant leur bien-être et leur permettant d’exprimer les comportements physiologiques et activités qu’ils auraient dans leur habitat naturel. Pour certains produits (à visée du système nerveux central par exemple) une période d'habituation aux doses peut être effectuée sur les animaux avant la première administration. Les procédures, les conditions d’hébergement et matériel utilisé dans ce projet sont adaptés aux animaux utilisés dans ce projet (ex. sondes de gavage, cathéter). Enfin une sédation sera réalisée au préalable de l’anesthésie pour permettre l’acheminement du lapin en salle d’autopsie et limiter ainsi le stress du déplacement.

Choix des espèces

Il n'existe pas de méthode alternative in vitro permettant l'évaluation de la toxicité d'un candidat médicament (humain ou vétérinaire)/vaccin, en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant. Des animaux de 2 à 7 mois en début d'étude, l’âge moyen généralement requis dans les études de toxicité, correspond à un niveau « jeune adulte » de croissance et de développement nécessaire et suffisant pour conduire les expérimentations (capacité fonctionnelle des organes, volume circulant, etc.). Le choix du lapin est justifié par : • les homologies avec l'Homme (physiologiques, métaboliques...) ; • le respect du modèle utilisé dans les études préliminaires ; • les données de pharmacocinétique, pharmacodynamie… ; • les données d'immunogenicité chez le lapin. Ce projet pourra être effectué avec des animaux plus âgés (> 1 an) en fonction de l’objectif de l’évaluation et de manière à ce que l’état physiologique de l’animal permette une réponse claire des systèmes analysés après traitement avec le(s) composé(s) et ainsi permettre une évaluation adéquate des paramètres ciblés. Les animaux ne doivent pas être gravides. Pour ce projet, les animaux auront de 2 à 7 mois en début d'étude, l’âge moyen généralement requis dans les études de toxicité, correspondant à un niveau « jeune adulte » de croissance et de développement nécessaire et suffisant pour conduire les expérimentations (capacité fonctionnelle des organes, volume circulant, etc.). Toutefois, ce projet pourra être effectué avec des animaux plus âgés (> 1 an) en fonction de l’objectif de l’évaluation et de manière à ce que l’état physiologique de l’animal permette une réponse non équivoque des systèmes analysés après traitement avec le(s) composé(s) et ainsi permettre une évaluation adéquate des paramètres ciblés. Les animaux ne doivent pas être gravides.

Une injection de toxines dans le cerveau pour détruire des neurones, un choc électrique de 0,7 milliampère et une restriction alimentaire : 2 280 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Plusieurs modèles de la maladie de Parkinson sont reproduits, avec pose d'une canule cérébrale et injections répétées sur quatre semaines, suivies de tests comportementaux et d'imagerie. Le protocole prévoit la mise à mort dès qu'un rat atteint des points limites : perte de 20 % du poids, prostration, automutilation ou hémorragie. L'objectif est d'identifier des marqueurs d'imagerie des troubles moteurs et cognitifs, sur des modèles dont le porteur reconnaît qu'ils ne reproduisent que partiellement la maladie humaine.

Objectifs

Le projet se déroulera désormais dans 2 EU. La maladie de Parkinson (MP) se caractérise par les classiques signes moteurs permettant le diagnostic mais également par des troubles cognitifs et psycho-comportementaux, plus variables dans leur apparition et leur expression, mais ayant un impact considérable sur l’autonomie et la qualité de vie des patients ainsi que sur les décisions thérapeutiques. Pourtant, leur prise en charge reste limitée et requiert une meilleure compréhension des mécanismes impliqués, notamment via l’identification de biomarqueurs. Les biomarqueurs sont des indicateurs des processus pathogènes et des outils précieux tant pour faciliter le diagnostic précoce, que pour suivre l’évolution de la pathologie ou l’efficacité d’un traitement. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) avec ses explorations anatomiques et fonctionnelles, combinée à des méthodes spécifiques d’analyse a récemment permis de mettre en évidence des marqueurs de certains des troubles observés en clinique. Cependant son utilisation reste encore marginale notamment pour le diagnostic, et le lien entre ces marqueurs d’imagerie et l’histologie reste à établir. Cette corrélation est indispensable tant à la compréhension des mécanismes sous-jacents qu’à la validation de ces marqueurs en tant que Biomarqueurs de la pathologie. L’utilisation de modèles animaux est le moyen le plus adapté pour mener ce type d’études. Cependant, ils ne miment que partiellement la pathologie humaine et chaque modèle présentent des avantages et des limites. Il convient donc de valider les résultats obtenus sur plusieurs modèles complémentaires pouvant représenter les différents aspects physiopathologiques de la maladie. Le présent projet vise d’abord à étudier plusieurs de ces modèles afin de reproduire les différents troubles moteurs et non moteurs associés à la pathologie. Les objectifs seront ensuite d’identifier des biomarqueurs des troubles moteurs et non moteurs en IRM/TEP et d’étudier les mécanismes physiopathologiques sous-jacent. Enfin, en fonction des résultats de cette première partie (et des résultats in vitro fait en parallèle), certains de ces modèles seront reproduits afin de tester l’effet de stratégies thérapeutiques . Un modèle de démence induite par une déplétion cholinergique centrale sera aussi utilisé comme contrôle positif de déclin cognitif sévère afin de contrôler l’efficacité de ces stratégies.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier des biomarqueurs des troubles moteurs et non moteurs en imagerie in vivo (IRM ou TEP) et d’étudier les mécanismes physiopathologiques sous-jacent (Histologie). Ces biomarqueurs pourraient être validés et utilisés en clinique pour aider au diagnostic de certains troubles, le suivi non invasif de l'évolution de la pathologie et/ou de l'effet des traitements. L'étude des mécanismes sous jacents permettra l'idenitfication de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dont l'efficacité sera testée.

Procédures

Les animaux seront soumis à des procédures chirurgicales visant à injecter des toxines pour induire des lésions cérébrales (30 minutes) dans l'EU2/2 pour les AAV2/9 hm-alpha-syn en A2 et dans l'EU1/2 pour les autres toxines (6OHDA, MPTP, IgG saporine). Après transfert dans l'EU1/2, certains d'entre eux subiront à nouveau une procédure chirurgicale pour l'implantation d'une canule d'administation cérébrale (30 minutes). Certains animaux subiront des injections sous-cutanées ou intra-péritonéales (Maximum 2/jours pendant 4 semaines). Tous les animaux subiront une série de tests comportementaux dont certains nécessitent une restriction alimentaire avec rationnement, ou la délivrance d'un choc electrique (0,7 mA - 2 sec, 1 seule fois). Le transport entre les 2 EU sera assuré par un transporteur agréé respectant les conditions optimales pour limiter le stress et maintenir le BEA.

Impact sur les animaux

Les toxines injectées induisent une dégénérescence des voies cérébrales dopaninergiques et/ou cholinergiques, un déficit du contrôle moteur et/ou cognitif est donc attendu et étudié dans ce projet. Une perte de poids corporel peut aussi être observée chez certains animaux plus sévérement lésés. L'anesthésie subie lors de la chirurgie ou de l'imagerie en IRM pourrait être mal tolérée par certains animaux. Les évaluations comportementales n'induisent pas de perturbation en elles-mêmes. La restriction alimentaire associée au touchscreen pourrait être mal tolérée par certains animaux. La pose de canule intracérébrale et les injections de traitments pourraient être mal tolérées.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin des évaluations en imagerie in vivo ou après l'evaluation des effets thérapeutiques sur ces variables

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à l’utilisation d’animaux pour étudier la physiopathologie de troubles cognitifs et comportementaux. Cependant pour limiter l’utilisation d’animaux, l'étude de la potentielle toxicité, des mécanismes d'action et l’efficacité des molécules thérapeutiques testées seront étudiés en parallèle sur un modèle cellulaire (Remplacement).

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé au minimum sur la base d'un test de puissance. L'analyse statistiques des données débutera par une étude de la normalité et de l'homogénéité des variances. Selon la distribution des valeurs, des tests paramétriques (ANOVA puis Test de Fisher pour la compariason 2 à 2) ou non paramètriques (Kruskal-Wallis et Wil-Coxon test pour la comparaison 2 à 2) seront utilisés. Les mêmes animaux seront réutilisés pour l'analyse comportementale et l'imagerie cérébrale à différents temps du processus pathologique, ainsi que pour les analyses histologiques post-mortem. Les animaux seront réutilisés pour différentes évaluations (Comportement et Imagerie) à différents temps du processus pathologique, ainsi que pour les analyses histologiques post-mortem.

Raffinement

Les rats seront hébergés dans des portoirs ou armoires ventilées sous un cycle de lumière 12h/12h selon la règlementation, avec nourriture et accès à l'eau ad libitum. Le raffinement est assuré par un hébergement collectif, de l’enrichissement dans les cages, des sessions d’acclimatation aux expériences, une manipulation expérimentée des animaux. L'unique transport entre les 2 EU après la procédure de chirurgie en A2 sera effectuée par un transporteur agréé pendant 15 minutes maximum, dans des conditions optimales pour limiter le stress et maintenir le BEA (cage de transport spécifique, climatisation du camion, respect cycle lumière, vibrations amorties). De plus, un suivi quotidien du bien-être des animaux sera effectué pour surveiller l'apparition éventuelle de souffrance ou de points limites pour lesquels des décisions adaptées seront prises. Un point limite a été déterminé selon les critères suivants : Le comportement général : -Difficulté de mobilité, isolement, perte partielle de réactions aux stimuli -Prostration, automutilation, tremblements - Vocalisations, agressivité Le poids : perte de poids importante (20%) L’apparence physique : pelage très terne ou souillé, plaie cutanée, hémorragie oculaire, génitale et/ou anale. Selon les critères observés et la cause identifiée, les animaux seront soit isolés et soignés, et/ou recevront un traitement analgésique (Buprénorphine, 0.05 mg/kg), ou seront euthanasiés par dose létale de pentobarbital dans une salle dédiée (Doléthal®, 182.2mg/kg) . La structure BEA ou le vétérinaire référent seront sollicités pour avis si besoin.

Choix des espèces

Parmi les petits rongeurs, le rat est l’espèce la mieux adaptée pour l’évaluation des troubles cognitifs et psycho-comportementaux. Par ailleurs, les modèles expérimentaux choisis ont été décrits chez le rat. Les rats utilisés auront 8-10 semaines. Cet âge a été choisi en raison de la référence utilisé pour l’ATLAS cérébral de rat et la précision de localisation des repères stéréotaxiques pour les injections cérébrales.