Recherche appliquée

1 932 souris vont être utilisées, toutes mises à mort à l'issue, dans des procédures classées de souffrance légère. Chaque animal est mis à jeun une nuit, gavé jusqu'à quatre fois et reçoit jusqu'à huit injections dans l'abdomen, avant d'être tué pour le prélèvement de tissus. Le projet étudie des facteurs de virulence d'Escherichia coli résistants aux antibiotiques et vise à terme de nouvelles cibles thérapeutiques. Le porteur retient la souris parce qu'elle est "permissive" à l'infection sans manipulation génétique et s'appuie sur une littérature abondante pour limiter le nombre d'animaux.

Objectifs

Certains facteurs de virulence des bact?ries Escherichia coli (E. coli) sont impliqu?s dans l?invasion de l??pith?lium intestinal et ou la colonisation du tractus digestif. Une telle capacit? a r?cemment ?t? associ?e ? l??tablissement de populations dites persisters, r?sistantes aux antibiotiques et capables de faciliter des ?changes de g?nes de r?sistance. Le r?le de certaines toxines et facteurs d?adh?rence bact?riens dans l?internalisation des bact?ries par les cellules a ?t? montr? in vitro. Ce projet nous permettra de v?rifier leur implication in vivo chez la souris et de mettre en ?vidence leur r?le dans la colonisation et formation de r?servoirs infectieux dans le tractus digestif. Ce projet comprend l??tude de souches multi-r?sistantes aux antibiotiques. Les r?sultats acquis permettront de comprendre comment certains facteurs de virulence ? l??tude permettent ? plusieurs souche d?E. coli d?entrer en comp?tition pour coloniser le tractus digestif de l?h?te. Nous testerons sur la capacit? de colonisation des souches une petite mol?cule chimique capable de bloquer la croissance intracellulaire des bact?ries. Au final, un tel projet doit permettre d?identifier de nouvelles pistes de ciblage th?rapeutique pour le traitement des infections ? E. coli r?sistants aux antibiotiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compr?hension des m?canismes de colonisation bact?rienne de l?intestin par des souches d?Escherichia coli pathog?nes opportunistes. Nous testerons une approche th?rapeutique innovante ? l?interface bact?rie-h?te ciblant des E. coli multi-r?sistantes aux antibiotiques et des E. coli ?tablissant des r?servoirs intratissulaires, qui sont souvent r?fractaires aux antibiotiques. A terme, nous pourrions identifier une nouvelle strat?gie th?rapeutique cibl?e sur l?h?te pour combattre les infections bact?riennes en ?radiquant le portage asymptomatique de ces souches dans le microbiote intestinal.

Procédures

Les souris seront mises ? jeun sur une nuit (1 fois par souris, moins de 16h) ce qui peut induire un stress d? ? l?absence de nourriture pendant cette p?riode. Elles pourront d?velopper une irritation oesophagienne due ? la r?p?tition d?administrations par gavage (4 par souris, dur?e de l?acte inf?rieure ? 30 s). Certaines souris recevront un traitement par injection qui peut provoquer une douleur l?g?re, r?versible et de courte dur?e (maximum 8 par souris, dur?e de l?acte inf?rieure ? 30 s). Les souris seront mises ? mort par une m?thode r?glementaire en fin de proc?dure.

Impact sur les animaux

Les souris seront mises ? jeun sur une nuit (1 fois par souris, moins de 16h) ce qui peut induire un stress d? ? l?absence de nourriture pendant cette p?riode. Elles pourront d?velopper une irritation ?sophagienne due ? la r?p?tition d?administrations par gavage (4 par souris, dur?e de l?acte inf?rieure ? 30 s). Les souris peuvent ressentir une douleur l?g?re de courte dur?e ponctuelle et r?versible lors des injections intrap?riton?ales (7-8 par souris, dur?e de l?acte inf?rieure ? 30 s).

Devenir

Tous les animaux seront mis ? mort pour r?cup?rer des tissus pour des ?tudes mol?culaires et histologiques post-mortem.

Remplacement

Des ?tudes in vitro pr?liminaires sur cellules et organo?des ont permis de mettre en ?vidence l?int?r?t du facteur de virulence bact?rien ?tudi? dans ce projet. Cependant, pour confirmer le r?le de ce facteur dans la capacit? de diff?rentes souches bact?riennes ? coloniser l?intestin, un mod?le animal est n?cessaire pour mimer la complexit? des interactions complexes entre la bact?rie d?int?r?t, le microbiote intestinal et l'Homme.

Réduction

Le nombre de souris utilis?es (7 souris par groupe, pour un total de 1932 souris) sera toujours limit? au minimum n?cessaire pour fournir des donn?es biologiquement et statistiquement significatives. Ce nombre de souris par groupe a ?t? d?termin? sur la base d?exp?riences ant?rieures du laboratoire. Des tests non param?triques seront utilis?s pour comparer les diff?rents groupes. Plusieurs ?chantillons seront pr?lev?s (intestin, colon, ganglions m?sent?riques?) sur toutes les souris utilis?es dans ce projet afin de collecter un maximum d??chantillons et d??viter de relancer des exp?rimentations additionnelles.

Raffinement

Avant de d?buter le projet, les souris seront acclimat?es pendant une semaine en conditions standard d?animalerie avec un acc?s sans restriction ? l?eau et ? la nourriture avec un environnement enrichi (coton). Nous utilisons des sondes de gavage flexibles am?liorant le bien-?tre animal en facilitant le passage dans l??sophage. Pour les souris recevant plusieurs injections intrap?riton?ales, nous veillerons ? alterner les points d?injection pour ne pas injecter deux fois de suite dans la m?me zone. Des crit?res d?arr?t ou points limites ont ?t? d?termin?s pour chaque proc?dure exp?rimentale.

Choix des espèces

La souris est une esp?ce de choix pour l'?tude des facteurs de virulence de E. coli car elle est permissive ? l'infection par ce pathog?ne opportuniste sans n?cessit? de manipulation g?n?tique ou de modification du statut immunitaire des animaux. De plus, la litt?rature concernant ces infections est abondante et les mod?les exp?rimentaux bien ?tablis, ce qui permettra d'obtenir des r?sultats fiables en limitant le nombre d'animaux utilis?s. Enfin, l'exp?rience de l'exp?rimentation animale sur cette esp?ce au laboratoire permettra de limiter au maximum la souffrance des animaux lors de l'?tude. Les souris seront utilis?es au stade de jeunes adultes (environ 9-10 semaines). Il s?agit du stade le plus largement d?crit et valid? dans les publications. A cet ?ge, nous limitons les biais li?s ? l?utilisation de souris vieillissantes. De plus, leur taille est suffisante pour une manipulation ais?e.

Issues de la réforme d'un sélectionneur ou achetées jeunes, 144 poules pondeuses vont être utilisées, toutes mises à mort à l'issue, dans des procédures classées de souffrance légère. Chaque animal subit entre une et six prises de sang au sinus occipital, réparties de la vingtième à la cent-trentième semaine d'âge. Le porteur décrit une "montre biologique" épigénétique censée mesurer l'âge réel des poules à partir de leur ADN. La finalité affichée relève de la sélection en filière œuf, relier l'âge biologique à la ponte et à la solidité de la coquille, les poules étant tuées pour le prélèvement du foie.

Objectifs

Le présent projet entre dans un projet plus large visant à mieux comprendre comment les poules pondeuses vieillissent mais pas juste en comptant les semaines de vie mais en regardant l’ADN des tissus. Pour ça, on utilise une sorte de "montre biologique" appelée horloge épigénétique. La 1ère étape consiste à identifier les marques chimiques dans l’ADN permettant de prédire/estimer l’âge biologique des poules, ceci en utilisant une cohorte de poules d’âges variés dont la mise en place fait l’objet de ce présent projet. En effet ces marques appelées méthylations sont connues pour s’accumuler avec l’âge. La 2nde étape consiste à analyser ces marques sur des poules d’un âge donnée et de comparer leur âge biologique avec leur âge réel. On peut alors identifier des poules qui vieillissent "plus vite" que prévu ou "plus lentement". Enfin, la 3ème étape est d’évaluer si ces écarts entre âge biologique et âge réel peuvent prédire des écarts de performances pour des caractères d’intérêt tels que le taux de ponte, poids ou qualité des œufs, présence d’ascites, …. De telles prédictions ont été déjà obtenues chez l’humain pour différentes maladies. Concernant l’étape 1, différentes horloges épigénétiques ont été développées chez des espèces variées comme le poulet de chair mais jamais encore chez la poule pondeuse. Aussi ce projet a pour objectif de créer 2 horloges pour ce type de poules : une qui regarde l’ADN des cellules du sang (collecte non invasive), et l’autre qui regarde l’ADN des cellules d’un tissu métabolique, le foie, fortement impliqué dans la production d’œufs et maladies métaboliques. Par ailleurs, on souhaite qu’elles fonctionnent que les poules vivent en cage ou au sol. Aussi on prendra des poules issues des 2 systèmes avant leur entrée où elles seront toutes mises au sol.

Bénéfices attendus

Comme indiqué plus haut, grâce aux 2 horloges épigénétiques ‘sang’ et ‘foie’ développées dans le présent projet (étape 1), nous pourrons alors analyser les différences entre âge réel et âge biologique de centaines de poules (étape 2) pour lesquelles nous avons déjà les données de méthylation sang et foie. nous pourrons alors évaluer le pouvoir prédicteur de ces différences pour des phénotypes d’intérêt majeur en filière œuf comme le taux de ponte et la solidité de la coquille qui diminuent avec l’âge (étape 3). Autrement dit, y-a-t-il des poules à 70 ou 90 semaines qui ont vieilli moins vite que d’autres et si oui ont-elles tendance à avoir des performances meilleures ? ». De tels travaux pourraient alors déboucher sur de nouveaux marqueurs à prendre en compte dans la sélection des animaux.

Procédures

Les prélèvements sanguins seront effectués au sinus occipital entre 1 et 6 fois aux âges indiqués ci-dessous: 1) 12 poules seront prélevées 6 fois entre 70 et 130 semaines d'âge avec un délai minimum de 5 semaines entre prélèvements. 2) 24 poules seront prélevées 2 fois entre 70 et 112 semaines d’âge 3) 7x12 poules soit 84 poules seront prélevées 1 fois entre 20 et 112 semaines d'âge en fonction des lots 4) 12 poules seront prélevées 5 fois entre 20 et 71 semaines d'âge avec un délai minimum de 11 semaines entre prélèvements. 5) 12 poules seront prélevées 4 fois entre 20 et 57 semaines d'âge avec un délai minimum de 10 semaines entre prélèvements. Le prélèvement sera réalisé en quelques secondes.

Impact sur les animaux

La contention lors des prises de sang engendre du stress pour l’animal, une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome.

Devenir

Suite à la procédure des prises de sang ultimes, les 144 animaux seront mis à mort pour réaliser les prélèvements des foies.

Remplacement

Les deux horloges épigénétiques seront ainsi utilisées dans le cadre de l’étude de la longévité fonctionnelle. Il est inenvisageable d'utiliser un autre modèle pour analyser les différences entre âge chronologique et âge épigénétique et évaluer leur pouvoir prédicteur pour différents phénotypes d’intérêt chez la poule pondeuse à un âge avancé.

Réduction

Ainsi, trois lots de poules vont entrer à la station expérimentale : 1) un premier lot de 48 poules dites « vieilles » arrivera à l’âge de 68 semaines en mai 2025. Nous profitons ainsi de la réforme des poules d’un sélectionneur. Ces poules seront alors prélévées aux âges de 70 , 90, 107, 114, 119 et 130 semaines d’âge 2) un second lot de 48 poules dites « jeunes » arrivera en septembre 2025, sera alors etudié aux âges de 20, 36, 49, 60 et 70 semaines d’âge. 3) un troisième lot de 48 poules dites « jeunes » arrivera en janvier 2026, sera alors etudié aux âges de 20, 35, 45 et 57 semaines d’âge

Raffinement

Les animaux seront élevés dans un bâtiment d’élevage standard, au sol sur litière avec copeaux de bois dans des parquets où ils resteront en groupe. La taille du parquet est suffisante (3 m²) pour permettre aux poules pondeuses de se déplacer avec une zone de repos significative en plus de l’espace mangeoire, abreuvement et nid. Les animaux auront à disposition plusieurs enrichissements leur permettant de grimper et de se cacher. Toute manifestation de symptômes persistants définis par un point limite entraînera le retrait de l’animal de l’expérimentation. Les prises de sang seront effectuées dans un lieu différent des espaces d’hébergement.

Choix des espèces

La poule pondeuse a été choisie comme modèle, car il s’agit de l’espèce agronomique cible du projet. Concernant les différents âges retenus (20, 30, 50, 70, 90, 110 et 130 semaines), ils ont été choisis de manière à inclure les âges de 70 et 90 semaines, pour lesquels des données sont déjà disponibles par ailleurs et seront ici re-analysées sous l’angle de l’horloge épigénétique. Autour de ces deux âges clés, nous avons intégré au moins deux autres classes d’âge espacées d’environ 20 semaines en amont et en aval, pour la raison suivante : ces differents ages permettent, par exemple, de détecter d’éventuelles poules âgées de 70 semaines qui seraient plus jeunes biologiquement avec un âge biologique non pas de 70 sem. mais de 50 voire 30 semaines ; Ou encore des poules de 90 semaines qui seraient, au contraire, biologiquement plus âgée jusqu’à 20 à 40 semaines de plus par rapport à leur âge réel. Grâce à cet étalement progressif de 20 à 130 semaines, l’horloge épigénétique que nous développons pourra ainsi capter finement les écarts entre âge biologique et âge réel.

Isolés jusqu'à quatre heures dans un compartiment individuel, sans eau et sans nourriture, seize macaques crabiers sont soumis à des collectes d'urine répétées, dans des procédures classées de souffrance légère. Chaque animal participe à un maximum de quatre sessions et reste gardé vivant pour une réutilisation ultérieure. Le porteur présente ce projet comme un raffinement, la durée d'isolement passant de seize à quatre heures pour les futures études de toxicité. La finalité reste réglementaire, valider une méthode de collecte d'urine applicable aux tests de toxicité menés sur cette espèce pour de futurs médicaments.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de valider la réduction de la durée de la collecte d’urines chez le primate non humain afin d’appliquer cette méthode par la suite dans les études de toxicologie réglementaires réalisées chez cette espèce. Actuellement, la collecte d’urines chez le primate non humain est réalisée pendant une durée maximale de 16 heures avec accès à l’eau, mais nous sommes confrontés à une problématique de densité urinaire faible probablement consécutive à une contamination des urines récoltées par de l’eau de boisson, ce qui compromet l’interprétation des paramètres de biochimie urinaire. La réduction de la durée de la collecte d’urines représentera d’une part une amélioration du bien-être animal dans le cadre de cette procédure car les animaux seront donc isolés pendant seulement 4 heures au lieu de 16, et permettra également de réaliser les collectes sans accès à l’eau afin d’éviter la dilution des urines sans pour autant priver les animaux d’eau pendant une durée excessive. Avant de déployer cette méthode dans les études de toxicologie réglementaires, il est nécessaire de vérifier que le volume et la qualité des urines obtenues dans nos conditions expérimentales en effectuant la collecte pendant une durée plus courte sont compatibles avec la réalisation des analyses urinaires prévues dans le cadre des études de toxicologie, et notamment que la densité urinaire est suffisante pour l’interprétation des paramètres de biochimie urinaire.

Bénéfices attendus

La validation de la réduction de la durée de la collecte d’urines chez le primate non humain permettra de mettre en place cette méthode par la suite dans les études de toxicologie réglementaires réalisées chez cette espèce, afin de contribuer à démontrer la sécurité de futurs médicaments. Cette validation représente un raffinement de la méthode de collecte d’urines chez le primate non humain, en offrant la possibilité de la réaliser sur une durée réduite (environ 4 heures) au lieu de la durée de 16 heures environ actuellement pratiquée pour les études de toxicologie. Cela permettra de diminuer le stress provoqué par cette procédure en réduisant significativement la durée d’hébergement dans un espace réduit avec privation de contact social lors des occasions de collecte d’urines pour les animaux utilisés dans les études de toxicologie réglementaires. La validation de cette méthode permettra aussi d’améliorer la qualité des urines récoltées en évitant le problème de dilution par l’eau de boisson.

Procédures

Chaque animal inclus dans ce projet participera au maximum à quatre sessions de collecte d’urines réalisée sur une durée d’environ 4 heures. Une session de collecte d’urines implique l’isolement des animaux vigiles dans un compartiment individuel de surface réduite équipé d’un système de récolte des urines pendant environ 4 heures, avec restriction alimentaire (retrait des croquettes mais possibilité d’accès à un légume) et sans accès à l’eau pendant la collecte afin d’éviter la dilution ou la contamination des urines (un légume pourra tout de même être distribué à chaque animal). Cette collecte peut éventuellement être répétée à l’identique le lendemain dans le cadre d’une même session si un animal n’urine pas lors de la première collecte. Le volume d’urines obtenu lors de chaque collecte pendant une période de 4 heures sera mesuré, et la qualité des urines sera évaluée grâce à une mesure de la densité, la réalisation d’une bandelette urinaire et l’analyse des paramètres de biochimie urinaire. Si un animal est réutilisé pour plusieurs sessions, une période de repos minimale de 3 jours sera respectée entre chacune. Le nombre de sessions pourra être réduit si des résultats satisfaisants et un nombre suffisant d’échantillons sont obtenus avec moins de sessions.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pour les animaux peuvent être les suivants : stress et inconfort liés à l’hébergement isolé dans un compartiment individuel de surface réduite, incluant une restriction alimentaire (retrait des croquettes mais possibilité d’accès à un légume) et l’absence d’accès à l’eau, pendant environ 4 heures pour la collecte d’urines.

Devenir

Le degré de sévérité de la procédure étant classé à priori comme léger, les animaux seront gardés en vie avec l’accord du vétérinaire pour une éventuelle réutilisation dans un autre projet après une période de repos.

Remplacement

Dans les études de toxicologie réglementaires, un relevé des signes cliniques et une analyse semi-quantitative des urines (pH, quantité d’urine, présence de sang, protéines, leucocytes, glucose, ...) sont réalisés, ce qui nécessite d’avoir accès à l’animal dans son entièreté. Le but de ce projet est de valider la réduction de la durée de la collecte d’urines chez le primate non humain pour appliquer cette méthode par la suite dans les études de toxicologie réglementaires conduites chez cette espèce. A ce jour, il n’existe pas de méthode non animale qui permettrait de modéliser nos conditions de collecte, et de vérifier que le volume et la densité des urines de macaque cynomolgus récoltées sur 4 heures dans nos conditions expérimentales soient suffisants et compatibles avec les analyses faites sur les urines dans les études de toxicologie.

Réduction

Le nombre d’animaux dans ce projet correspond au minimum requis pour pouvoir conclure à la validation de la méthode, en prenant en compte la variabilité individuelle et le fait qu’il est possible que certains animaux n’urinent pas pendant une ou plusieurs occasion(s) de collecte. Si possible, les mêmes animaux seront réutilisés pour plusieurs sessions de collecte d’urines (dans la limite de quatre sessions maximum par animal), ce qui permettra de réduire le nombre total d’animaux utilisés dans le projet. Les animaux inclus dans ce projet sont des animaux précédemment utilisés pour un autre projet et/ou susceptibles d’être réutilisés ensuite dans un autre projet, sur avis vétérinaire et après avoir respecté une période de repos définie dans les procédures internes encadrant la réutilisation des animaux en accord avec la structure chargée du bien-être animal.

Raffinement

Le projet dans son ensemble a pour finalité le raffinement de la méthode de collecte d’urines chez le primate non humain, en validant la possibilité de la réaliser sur une durée réduite (environ 4 heures) au lieu de la durée de 16 heures environ actuellement pratiquée pour les études de toxicologie réglementaires. Cela permettra de diminuer le stress provoqué par cette procédure en réduisant significativement la durée d’hébergement dans un espace réduit avec privation de contact social lors des occasions de collecte d’urines pour les animaux utilisés dans les études de toxicologie réglementaires. Pour améliorer leur bien-être, les animaux seront hébergés en groupes sociaux en dehors des périodes de collecte d’urines et auront une période d’acclimatation d’au moins une semaine dans la salle d’étude avant la première procédure. Si les animaux sont réutilisés d’un projet précédent, une période de repos sera respectée. Les animaux bénéficient également hors du temps de procédure de divers enrichissements tels que des jouets (en rotation sur la semaine), des bâtonnets de bois à ronger, des graines de tournesol/raisins secs, des tunnels en carton et des fruits et légumes sont distribués en plus de l’alimentation classique. Les animaux sont hébergés dans des volières qui comportent des tubes en PVC, des perchoirs, des barrières visuelles et des balançoires. La musique sera présente dans l’ensemble des hébergements. Des récompenses alimentaires seront distribuées après les actes contraignants. Un légume pourra être distribué à chaque animal pendant les collectes d’urines. Les animaux seront observés au moins une fois par jour (incluant le week-end) afin de permettre la détection rapide de signes cliniques et d’agir au plus vite pour limiter toute souffrance ou douleur inutile. En cas de signes cliniques ayant des répercussions sur le bien-être animal, des mesures appropriées seront prises par le vétérinaire (mise en place d’un traitement médical, interruption de la procédure par exemple).

Choix des espèces

L’utilisation du primate non humain pour les études de toxicologie se justifie d’un point de vue réglementaire car c’est une des espèces non-rongeurs acceptée pour la réalisation d’études non cliniques. Le choix du primate non humain est basé sur la réglementation qui réserve l’utilisation de primates non humains aux études non cliniques sur des candidats médicaments destinés à traiter des pathologies humaines invalidantes ou mortelles et sous réserve qu’il existe des éléments scientifiques indiquant que la finalité de la procédure ne peut pas être atteinte en utilisant d’autres espèces. L’objectif de ce projet étant de valider la réduction de la durée de la collecte d’urines pour appliquer ensuite cette méthode dans le cadre des études de toxicologie réglementaires réalisées chez le primate non humain, il est nécessaire de conduire cette validation chez la même espèce et dans les mêmes conditions expérimentales. Le projet sera mené sur des animaux jeunes adultes / adultes, correspondant au stade de développement des animaux dans les études de toxicologie réglementaires.