Recherche appliquée

Faire valider par les autorités de santé le nouveau design d'un dispositif oculaire destiné à l'être humain : 48 lapins vont être utilisés pour cela, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Vingt-huit d'entre eux reçoivent un prototype posé sur l'œil pendant cinq minutes sous anesthésie générale, les vingt autres le dispositif final, activé par des impulsions électriques qui percent transitoirement la membrane des cellules pour y faire entrer du matériel génétique. Le porteur ne retient comme effets indésirables qu'une sécheresse oculaire, une rougeur de la conjonctive et une réaction mortelle à l'anesthésie qu'il qualifie de très rare. Il justifie le choix du lapin par la taille de son œil, proche de celle de l'œil humain, et utilise les deux yeux de chaque animal pour réduire l'effectif.

Objectifs

Une technique de thérapie génique oculaire n’impliquant pas l’utilisation de virus, basée sur le transfert de gènes dans un tissu ciblé de l’œil en appliquant des impulsions électriques contrôlées a été développée. Ce procédé permet de générer, grâce à des impulsions de courte durée et de faible intensité, des « trous » transitoires dans la membrane des cellules favorisant ainsi l’entrée dans la cellule de matériel génétique permettant la synthèse de protéines thérapeutiques. Grâce à l’utilisation d’un dispositif oculaire dédié, il est possible de cibler spécifiquement l’injection du matériel génétique dans un tissu cible de l’œil et d’appliquer des impulsions électriques par le biais des électrodes du dispositif oculaire. Le tissu-cible assure ensuite la production des protéines thérapeutiques dans l’œil. Divers paramètres influencent l’étendue mais aussi l’efficacité d’entrée du matériel génétique dans les cellules cibles, dont notamment le positionnement des deux électrodes. En raison des similarités d’anatomie et de taille, l’œil du lapin est le mieux adapté pour ces travaux de conception et d’optimisation du dispositif oculaire. Un dispositif oculaire destiné à l’homme a donc été conçu sur la base d’un dispositif oculaire développé au préalable chez le lapin. Ce dispositif permet ainsi de standardiser les étapes d’injection et d’entrée du matériel génétique dans le tissu cible de l’œil et donc d’assurer ainsi une reproductibilité optimale. Les données d’utilisation et d’ergonomie du dispositif oculaire de première génération collectées lors de précédentes études cliniques ont conduit au développement d’un nouveau design du dispositif favorisant la stabilisation du globe oculaire lors de la procédure d’administration. Les objectifs du projet sont : (i) d’évaluer la sécurité des modifications du nouveau design du dispositif oculaire en testant différents prototypes chez le lapin et (ii) de démontrer l’efficacité de transfert du matériel génétique dans le tissu cible de l’œil en utilisant le dispositif de seconde génération.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de générer des données précliniques nécessaires pour démontrer aux autorités de santé la sécurité et l’efficacité du dispositif en développement et permettre ainsi la poursuite des essais cliniques chez l’homme en développant un dispositif adapté à l‘homme. Les bénéfices attendus du projet sont le développement d’un nouveau design de dispositif oculaire permettant une administration dans le tissu cible de l’œil sûre, efficace et reproductible. Ces différents éléments seront ensuite transposés chez l’homme pour la production d’un dispositif de seconde génération qui sera utilisé lors de prochaines études cliniques.

Procédures

28 lapins auront un prototype de dispositif placé sur l’œil une seule fois pendant 5 min sous anesthésie générale. 20 lapins auront le dispositif final mis en place et activé, sous anesthésie générale d’une durée de 5 minutes, une seule fois.

Impact sur les animaux

En plus du stress initial de la contention, les effets indésirables identifiés sont : -sécheresse oculaire, rougeur de la conjonctive : peu fréquents et de courte durée (1 à 2 jours maximum) -réaction/mort à l’anesthésie : très rare

Devenir

La totalité des animaux seront mis à mort à l’issue des procédures pour collecte des tissus pour les études histologiques ou prélèvement des liquides oculaires pour le dosage du niveau d‘expression des protéines thérapeutiques.

Remplacement

Des études ex-vivo ont été réalisées sur explants (culture de cellules) d’œil de rat, de lapin ou de singe. Ces études ont permis de définir certains paramètres du transfert de gènes tels que la zone d’injection ou le seuil des impulsions électriques. L’utilisation de ce modèle ex-vivo reste limité car le niveau de production de la protéine diffusée dans le milieu de culture ainsi que sa durée d’expression ne sont pas représentatifs du fonctionnement du muscle cible de l'œil in vivo en raison de la dégradation rapide de ce tissu dans ces conditions de culture (2 jours de culture maximum). Par ailleurs, l’utilisation d’un œil isolé avant la mise en culture présente également des limites. La tonicité d’un œil isolé est différente de celle de l’œil d’un animal vivant et l’évaluation des inflammations oculaires liées à l’utilisation du dispositif ou à la production de la protéine thérapeutique au cours du temps est impossible. Le recours à un œil sur animal vivant, et plus particulièrement l’œil de lapin en raison de ses caractéristiques anatomiques et physiologiques est indispensable pour développer le dispositif oculaire et montrer que, via cette technologie, la protéine cible est efficacement produite et de façon sécurisée pour l’animal, et qu'elle diffuse depuis le muscle cible jusqu'aux tissus à traiter.

Réduction

Les procédures expérimentales standardisées ont été mises au point afin de pouvoir réduire le nombre d'animaux à utiliser et obtenir des résultats statistiquement exploitables. Nous avons également choisi d’utiliser les 2 yeux pour chaque animal et chaque animal sera utilisé pour tester un ou plusieurs prototypes (dans le respect des contraintes éthiques et de bien-être), lorsque cela est possible (par exemple, œil droit vs œil gauche), ce qui contribue à réduire le nombre total d’animaux requis. Le nombre d’animaux a été déterminé en fonction de la variabilité attendue sur la bases d’études précédentes et sur la nécessité d’avoir une représentativité suffisante. Le nombre d'animaux nécessaires a été déterminé grâce à un test statistique, tout en anticipant d’éventuelles pertes liées à l’expérimentation.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans les conditions standards (environnement contrôlé, présence systématique d’enrichissement du milieu) au minimum 1 semaine dans leur nouvel environnement avant toute manipulation afin d’éviter le stress. Sur toute la durée expérimentale, l’état de santé des animaux sera contrôlé deux fois par semaine par les expérimentateurs et une fois par jour par le personnel de l'animalerie. Les animaux seront anesthésiés et recevront un traitement anti-douleur adéquat lors des procédures mises en œuvre afin de limiter le stress de la manipulation et une meilleure prise en charge de la douleur. Ils seront maintenus sur un matelas chauffant durant les anesthésies. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet ont été définis et seront appliqués.

Choix des espèces

Le lapin s'avère être le modèle animal le plus adapté pour le développement de notre système d’administration et plus particulièrement l’optimisation de notre dispositif oculaire : - La taille de l’œil de lapin est similaire à celle de l’œil humain, il est donc facile de transposer le design du dispositif oculaire du lapin à l’homme. - Il n’existe pas de modèle in vitro représentatif du transfert de matériel génétique par impulsion électrique contrôlée. - Les caractéristiques physiologiques du lapin sont bien connues et documentée dans la littérature scientifique. Les animaux utilisés seront des jeunes adultes âgés de 3 à 5 mois avec un poids moyen de 3,5 kg. La taille de l’œil du lapin varie en fonction de l’âge et du poids de l’animal et les données anatomiques de l’œil de lapin d’environ 3,5 kg sont les plus proches de celles de l’œil humain adulte. Les modélisations du dispositif oculaire adapté à l’œil du lapin ont été réalisées sur des données anatomiques de lapin de cet âge et cette fourchette de poids.

Les souris dont la tumeur dépasse 1 500 mm3, qui perdent plus de 20 % de leur poids ou dont le point d'injection s'ulcère sont mises à mort avant paralysie complète. 792 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules de myélome, une injection du composé radioactif, des séances d'imagerie sous anesthésie pouvant durer deux heures, puis une ponction cardiaque terminale suivie d'une dislocation cervicale. Le projet reprend une molécule abandonnée en essai clinique de phase II sur le cancer du pancréas, reformulée avec du cuivre radioactif pour cumuler chimiothérapie et radiothérapie interne.

Objectifs

Malgré des avancées importantes dans les stratégies thérapeutiques ces dernières décennies, le myélome multiple (MM) reste incurable. La surveillance de la progression maligne et de la récidive après traitement sont des défis centraux pour améliorer le taux de survie des patients atteints de MM. Le mécanisme de cuproptose induisant la mort cellulaire dépendante du cuivre a été exploré à travers l'utilisation de l'elesclomol en chimiothérapie. En raison d'un effet thérapeutique suboptimal dans le cancer du pancréas ainsi que de problèmes de solubilité, celui-ci a été abandonnée lors des essais de phase II . Actuellement, il a été mis au point une version hydrosoluble de l'elesclomol offrant ainsi la possibilité d'améliorer l'efficacité thérapeutique de cette molécule et suscitant un nouvel intérêt clinique. À travers ce projet, l'objectif est d'exploiter le double effet de l'elesclomol en le fonctionnalisant avec le cuivre (Cu64 ou Cu67), permettant ainsi la réalisation de la cuproptose tout en associant l'efficacité potentielle de la radiothérapie interne du cuivre radioactif. Le cuivre est l'un des radioéléments les plus prometteurs pour l'approche théranostique en raison de sa disponibilité en cyclotron et de ses propriétés physiques. Les objectifs du projet sont de développer de nouvelles molécules à base d’elesclomol dans le cadre de traitement du myélome multiple mais également le dépistage et le suivi du développement tumoral chez l’homme. Après la confirmation par les études in vitro, les molécules présentant les meilleurs résultats sur les lignées cellulaires de MM seront étudiées in vivo sur modèles murins. Le projet in vivo consistera aux études de pharmacocinétiques, de biodistribution et d’efficacité thérapeutique sur souris après greffe tumorale. L’étude de biodistribution des molécules radiomarquées sera réalisée par tomographie d’émission de positons (TEP) couplée à l’imagerie par tomodensitométrie X (TDMX). Cette démonstration de concept pourrait conduire au développement d'une nouvelle approche thérapeutique de radiothérapie interne vectorisée en utilisant la chimiothérapie comme double vecteur thérapeutique, ouvrant ainsi la voie à une nouvelle approche thérapeutique.

Bénéfices attendus

Menée à bien, cette étude devrait permettre d’ajouter ces molécules comme nouvel outil de traitement et de diagnostic du myélome multiple. Elle permettra également de mieux comprendre la conjugaison des effets liés à l’elesclomol combiné à l’approche par radiothérapie interne vectorisée. Cette étude devrait également démontrer l’intérêt de cette approche pour réduire les toxicités associées aux traitements du cancer chez l’Homme grâce à l’amélioration de la pharmacocinétique par rapport aux chimiothérapies classiques.

Procédures

L’administration des molécules se feront par voie intraveineuse sur animal vigil d’une durée

Impact sur les animaux

L’elesclomol a été testé chez l’Homme dans des essais cliniques précoces dont aucune nuisance n’a été observée. L’ensemble des informations liées à la toxicité cellulaire de la molécule et de sa formulation ont été établies in vitro sur plusieurs lignées cellulaires cancéreuses. Nous n’attendons pas de nuisances liées à la molécule sur les souris immunodéficientes car celle-ci sera réalisée à 70% de la MTD identifié en PE1 au maximum. Les nuisances et les points limites identifiées sur souris avec tumeur attendues sont une perte de poids (max >20%), une augmentation du volume tumoral excessif (jusqu’à induire des difficultés locomotrices, à induire une souffrance/une douleur ou >1500mm3), l’apparition de nécrose/ulcération/infection possible au lieu d’injection. Un score de 3 sur la grille de score impliquera la mise à mort de l’animal avant paralysie complète

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort pour prélèvement et analyses post-mortem.

Remplacement

Des études in vitro déterminant la cytotoxicité de la molécule ont été préalablement réalisés afin de remplacer une partie des expérimentations in vivo. Cependant à ce stade du projet, l’utilisation de modèles animaux reste inévitable pour examiner l’aspect translationnel de nos travaux. La pharmacocinétique et la toxicité systémique (toxicité qui affecte tout l’organisme) ne peuvent être déterminées que in vivo. Cette étude préclinique, visera à évaluer la pertinence clinique de l’utilisation de ces molécules radiomarquées pour étudier la biodistribution par imagerie TEP ainsi que le traitement du myélome multiple et du glioblastome, et d’y intégrer les paramètres environnementaux inhérents à un organisme entier.

Réduction

Les effectifs sont justifiés par l’importante variabilité des résultats obtenus pour l’efficacité du traitement pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Une approche statistique a déterminé que le nombre d'animaux par groupes nécessaire pour déterminer un effet significatif lors de l'analyse des données est de 6 individus. Cette taille fournira la puissance nécessaire pour détecter une réduction du volume tumoral de ≥30% par rapport au contrôle, avec un écart-type de 25% au maximum dans le groupe de contrôle. Le nombre d’animaux a été réduit au strict minimum pour être statistiquement significatif et scientifiquement irréprochable. Le nombre de paramètres mesurés par animal a été optimisé et nous avons privilégié les études longitudinales lorsque cela était possible. L’étude de toxicité sur souris saine ainsi que de biodistribution servent d’études pilotes avec un nombre restreint de groupes qui conditionnera la suite du projet, le nombre annoncé est donc un nombre maximum d’animaux pour l’étude de 3 fonctionnalisations de elesclomol.

Raffinement

Toutes les manipulations susceptibles de générer de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale. Les souris seront observées et la croissance des tumeurs sera mesurée régulièrement. Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin d’éviter toute souffrance animale par interruption de la procédure. Une période d’acclimatation de 2 semaines sera observée avant le début d’une procédure. Les animaux seront habitués 2-3x par semaine pendant au moins 1 semaine avant le début d’une procédure, afin de réduire le stress dû aux manipulations lors de l’étude. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux selon les normes en vigueur avec des conditions d’hébergement et d’enrichissement de leur environnement permettant à l’animal d’exprimer des comportements naturels. L’imagerie se fait sous anesthésie gazeuse dans une enceinte chauffée avec monitora de la température et de la fréquence respiratoire.

Choix des espèces

La raison la plus importante du choix des souris pour nos études est leur similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. La disponibilité d’animalerie agrée pour la souris ainsi que l’expertise présente à proximité facilite le suivi et la qualité des expérimentations. Le modèle murin est d’autant plus indiqué car il permet de combiner une étude de toxicité et d’efficacité thérapeutique sur des souches immunodéprimées particulièrement adaptées à l’études de la biologie des cancers. Les souris mâles et femelles auront un poids compris entre 20 et 45g lors de leur utilisation et seront âgés de 8-12 semaines, soit l’âge de leur maturité sexuelle. Cet âge permet de s’affranchir des problèmes à la fois prés pubères et de vieillissement et donc évite d’inclure des paramètres supplémentaires dans la compréhension des mécanismes mis en jeu.

Rendre l'élevage de truites plus résistant aux canicules : 270 truites arc-en-ciel juvéniles sont soumises pendant 18 jours à un manque d'oxygène, à des températures proches de leur limite physiologique, ou aux deux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont ensuite anesthésiées puis tuées par surdosage de tricaïne pour prélever leur système digestif. Le porteur annonce une léthargie initiale et une baisse de prise alimentaire de 15 à 20 %, qu'il présente comme temporaire, et n'attend aucune mortalité. Il justifie ces conditions en indiquant qu'elles correspondent à ce que les poissons rencontrent dans le milieu naturel, et rappelle que la truite arc-en-ciel est l'espèce piscicole la plus produite en France.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer les mécanismes de réponse cellulaire du système digestif de la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) soumis à un stress thermique et à une diminution de la disponibilité en oxygène dans le milieu (hypoxie).

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu de ce projet est la production de données expérimentales solides sur les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la réponse du système digestif de la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) soumise à un stress thermique et hypoxique. Ces connaissances apporteront des éléments essentiels pour identifier les cibles physiologiques et moléculaires clés permettant des interventions nutritionnelles adaptées, nécessaires pour renforcer la résilience des poissons face aux épisodes de canicule, dont la fréquence augmente avec le changement climatique.

Procédures

Les animaux seront soumis, pendant une durée de 18 jours, à des contraintes spécifiques, en fonction du groupe de traitement : • Traitement 2 : exposition à des conditions hypoxiques. • Traitement 3 : exposition à des contraintes de température. • Traitement 4 : exposition à des contraintes combinées de température et d’hypoxie. • Traitement 5 : exposition à des contraintes de température. • Traitement 6 : exposition à des contraintes combinées de température et d’hypoxie. À la fin de la période expérimentale, les poissons seront capturés par du personnel formé et expérimenté, anesthésiés dans un bain de tricaïne méthanesulfonate, puis euthanasiés par surdosage de tricaïne.

Impact sur les animaux

Le stress thermique et hypoxique auquel les animaux seront soumis est susceptible d’induire une léthargie au début, le temps que les poissons s'habituent, mais cette gêne sera temporaire. Par ailleurs, la prise alimentaire diminuera, mais cette réduction sera faible (de 15 à 20% retour d’expérience sur des expérimentations similaires), car l'impact global reste limité en raison de l'exposition à des températures proches de la limite physiologique des poissons. Aucune mortalité n’est attendue, du moins pas en conséquence de la manipulation des animaux, des conditions expérimentales ou des modifications physiques de leur environnement.

Devenir

Tous les poissons impliqués (270 animaux) seront euthanasiés afin de prélever des tissus pour les analyses biologiques et biochimiques essentielles aux objectifs du projet.

Remplacement

L’objectif de cette étude est d’examiner les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la réponse digestive de la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) lorsqu’elle est exposée à un stress thermique et hypoxique. Ces processus physiologiques reposent sur des interactions complexes et intégrées entre plusieurs tissus du système digestif, qui ne peuvent pas être reproduites de manière fiable par des approches in vitro (culture cellulaire) ou in silico (modélisation informatique). Par conséquent, le recours à des animaux vivants est indispensable afin d’obtenir des données précises et biologiquement pertinentes sur les impacts physiologiques de ces facteurs de stress environnementaux dans des conditions expérimentales contrôlées.

Réduction

Le plan expérimental a été soigneusement conçu pour utiliser un nombre minimal de poissons, tout en garantissant la rigueur scientifique et la reproductibilité des résultats. L’étude comprend six traitements (un témoin et cinq conditions de stress), chacun répliqué dans trois bacs, soit un total de 18 bacs, avec 15 truites arc-en-ciel juvéniles par bac, pour un total de 270 poissons. Cette taille d’échantillon et ce niveau de réplication ont été déterminés afin de fournir une puissance statistique suffisante pour détecter les effets des traitements sur les réponses moléculaires, tout en évitant une surreprésentation inutile. Les poissons seront répartis aléatoirement dans les bacs et acclimatés avant le début des traitements expérimentaux, afin de minimiser la variabilité et de maximiser les informations obtenues de chaque individu. De plus, le choix des conditions de stress et de la réplication des bacs a été guidé par l’expérience préalable et la littérature scientifique, dans le but de réduire le nombre d’animaux tout en maintenant la robustesse et la fiabilité des résultats.

Raffinement

Dans le cadre de ce projet, plusieurs mesures seront mises en œuvre afin d’améliorer le bien-être animal et de minimiser la douleur, la souffrance et le stress : • Les conditions d’hébergement seront optimisées en termes de nutrition, densité de peuplement, qualité de l’eau et photopériode. • Les stress thermiques et hypoxiques appliqués dans l’étude correspondent à des conditions naturellement rencontrées par les animaux dans le milieu naturel, ce qui limite l’introduction de facteurs de stress artificiels. • Une surveillance continue des animaux sera assurée afin de détecter précocement tout signe de détresse et de permettre la mise en place rapide de mesures correctives. Ces mesures garantissent que les procédures expérimentales sont conduites conformément aux principes de raffinement, en priorisant le bien-être des animaux tout en maintenant la validité scientifique de l’étude. Le bien-être animal sera évalué quotidiennement à l’aide d’une grille de scoring basée sur des points limites prédéfinis. Les critères pris en compte incluront : comportementaux : prostration ou isolement prolongé, anomalies de nage, diminution marquée de la prise alimentaire, positions inhabituelles dans la colonne d’eau ; physiques : altérations de l’état corporel, lésions cutanées, signes de pathologies ou dégradation de l’aspect général. En cas d’atteinte d’un seuil critique (score ≥3 pour l’un des critères), l’animal concerné sera euthanasié sans délai, conformément aux procédures réglementaires en vigueur, afin de prévenir toute souffrance inutile.

Choix des espèces

La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est l’espèce piscicole la plus produite en France et présente une importance agronomique et commerciale majeure. Cependant, cette espèce est de plus en plus confrontée à la fréquence et à l’intensité croissantes des vagues de chaleur liées au changement climatique. Ces épisodes thermiques peuvent avoir des effets sévères sur sa physiologie, sa croissance et sa survie. Ainsi, l’identification de stratégies d’atténuation efficaces constitue une priorité pour assurer à la fois la durabilité de l’aquaculture et le bien-être des animaux. Pour développer de telles stratégies, il est essentiel de comprendre comment la température et la disponibilité en oxygène influencent le métabolisme cellulaire du système digestif de la truite arc-en-ciel. Les poissons auront un poids moyen compris entre 20 et 40 g au début de l’expérience, ce qui indique qu’ils seront au stade juvénile. Cette taille permettra de réaliser les expériences dans des conditions optimales au sein de l’unité expérimentale, tout en étant suffisamment grande pour prélever des échantillons de tissus digestifs en quantité adéquate pour les différentes analyses moléculaires ultérieures.

Des prélèvements sanguins tous les deux jours pendant une semaine, jusqu'à trois injections intraveineuses dont deux à trente minutes d'intervalle sur deux sites distincts : 197 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Quatre molécules capables de dégrader les anticorps circulants sont testées à trois doses chacune, pour rendre possible une seconde administration de vecteurs AAV chez des personnes déjà immunisées. Le porteur situe le bénéfice au stade de la preuve de principe, qui "ouvrira la porte" à d'autres études avant tout passage en clinique. Il justifie le choix de la souris C57BL/6 par la disponibilité de données précliniques et par une petite taille qui limite les volumes biologiques requis.

Objectifs

Les vecteurs adéno‑associés (AAV) sont des virus naturellement inoffensifs que l’on vide de leur contenu pour en faire de petits transporteurs capables d’apporter un gène thérapeutique. Ils permettent ainsi de traiter certaines maladies génétiques dépourvues de traitement curatif, grâce aux avancées de la thérapie génique. Cependant, comme ces virus circulent largement dans la population, beaucoup de personnes ont déjà été exposées et possèdent des anticorps capables de les reconnaître et de les neutraliser. Le système immunitaire garde en mémoire ces anticorps : en cas de nouvelle exposition, il réagit rapidement et massivement. Cette protection naturelle peut devenir un obstacle pour la thérapie génique, car les anticorps anti‑AAV peuvent empêcher le traitement d’agir. Certaines personnes ne peuvent donc pas recevoir un traitement par AAV, et celles qui en ont déjà reçu un développent ensuite des anticorps rendant une seconde administration difficile. Ce projet vise à développer de nouvelles approches pour contourner cette limite. Il repose sur l’utilisation de molécules capables de réduire temporairement la quantité d’anticorps circulants, y compris ceux dirigés contre les AAV. Contrairement aux immunosuppresseurs classiques, qui affaiblissent globalement le système immunitaire, ces molécules agissent de façon plus ciblée, plus rapide et pour une durée limitée, ce qui réduit le risque d’effets secondaires. Quatre molécules ayant déjà montré leur efficacité sur des cellules en laboratoire seront testées chez la souris, chacune à trois doses différentes. L’objectif est d’identifier la dose la plus efficace pour diminuer les anticorps dans le sang et déterminer la durée de cet effet. À cette dose, on vérifiera ensuite si chaque molécule permet l’administration d’un vecteur AAV même en présence d’anticorps préexistants. Enfin, la molécule la plus prometteuse sera évaluée dans un protocole simulant une réadministration, étape essentielle pour permettre des traitements durables en thérapie génique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de définir un immunomodulateur efficace à dégrader les immunoglobulines in vivo et de faire la preuve de principe qu’il est possible en l’utilisant de réaliser un transfert de gène médié par l’AAV efficace voire de réaliser une réadministration AAV. Ces démonstrations ouvriront la porte à d’autres études visant à amener cette stratégie en clinique.

Procédures

Dans ce projet, les traitements, qu’il s’agisse des AAV, des immunoglobulines ou des immunomodulateurs seront administrés soit sur animal anesthésié, en moins de 3 min., soit sur animal vigile, en moins de 2 min. Sur une durée expérimentale de 21 à 49 jours, les animaux recevront au cours des protocoles au maximum 3 injections par voie intraveineuses espacées de 24h à plusieurs jours. Cependant, une seule fois, deux injections seront réalisées à trente minutes d’intervalles à deux sites bien distincts. Des prélèvements sanguins sont effectués régulièrement pour le suivi biologique à raison d’une fois par semaine, sauf après l’injection des composés immunomodulateurs, où la fréquence passera à tous les deux jours pendant 7 jours. Ils seront réalisés sur animal vigile (très courte durée

Impact sur les animaux

Les nuisances (douleur et stress) attendues sur les animaux sont estimées de degré de gravité de légère à modérée. Elles sont liées à la nature des différents actes réalisés. Les actes qui seraient susceptibles d’entrainer des douleurs seront réalisées sous anesthésie gazeuse (classe légère). Une des nuisances est liée à la douleur de l’injection lors de l’administration des molécules ou lors des prélèvements sanguins (classe légère). Une nuisance liée à l’acte d’anesthésie est que celle-ci peut entrainer une sécheresse oculaire (classe légère). Une seule fois dans l’étude, deux injections sont à réaliser dans une fenêtre de 30 minutes et sont donc faites à deux sites distincts, l’une sur animal vigile et l’autre avec anesthésie (classe modérée). Dans une partie de l’étude, des prélèvements sanguins seront réalisés une fois tous les 2 jours sur une courte période de 7 jours (classe modérée).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de réaliser le prélèvement des organes et des muscles pour l’analyse des tissus et des niveaux de produits thérapeutiques reçus afin de vérifier l’efficacité thérapeutique et l’absence de toxicité.

Remplacement

Avant d’envisager un traitement chez l’animal, nous réalisons d’abord des tests en laboratoire sur des cellules (tests dits in vitro). Cela nous permet d’éliminer les approches qui ne sont pas efficaces et de mieux comprendre comment certains composés agissent. Ces premières études ont déjà montré que certains immunomodulateurs peuvent réduire les anticorps qui empêchent les vecteurs AAV d’agir correctement, et ainsi améliorer leur efficacité sur les cellules. Toutefois, les expériences sur cellules ne permettent pas de reproduire toute la complexité du fonctionnement du système immunitaire dans un organisme vivant. C’est pourquoi nous avons besoin d’un modèle animal, en l’occurrence la souris, dont le système immunitaire présente des similarités importantes avec celui des autres mammifères. Ce modèle nous aidera à vérifier si les traitements sont bien tolérés et efficaces dans un organisme complet, avant d’envisager des applications chez l’humain.

Réduction

Ce projet a été conçu pour limiter au strict minimum le recours aux animaux, en ne réalisant que les expériences jugées indispensables pour répondre aux objectifs scientifiques. La sélection méticuleuse sur des cellules (in vitro) des immunomodulateurs les plus pertinents permet de réduire au mieux le nombre d’animaux nécessaires aux approches expérimentales. Un test statistique a été utilisé pour déterminer le nombre de souris par groupe, afin de garantir des résultats fiables, tout en évitant l’usage excessif d’animaux. Les mêmes souris témoins seront utilisées dans plusieurs expériences, en tant que groupes contrôles pour différentes conditions expérimentales.

Raffinement

Les interventions potentiellement douloureuses ou stressantes seront réalisées sous anesthésie appropriée, précédée d’un traitement analgésique si nécessaire. Les prélèvements de sang seront effectués avec une méthode rapide (moins de 2 minutes) et bien tolérée, avec un faible volume et une alternance des deux côtés pour limiter les effets locaux. Nous appliquons les points limites établis préalablement grâce à l’utilisation d’une grille d’évaluation de la souffrance pour lesquels des mesures sont mises en œuvre. Nous utilisons les procédures d’euthanasie appropriées. Des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées, telles que l’utilisation d’une plaque thermostatée pour maintenir une température corporelle stable lors de la phase de réveil et l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus lors des anesthésies. Nous appliquons les points limites établis préalablement grâce à l’utilisation d’une grille d’évaluation de la souffrance pour lesquels des mesures sont mises en œuvre. Une attention particulière est également portée au risque d'infection, notamment durant les phases de vulnérabilité immunitaire induites par certains traitements, avec des mesures barrières renforcées pour limiter toute exposition.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi pour sa pertinence scientifique, sa compatibilité avec les vecteurs AAV et la disponibilité de données précliniques robustes. Cette souche présente une réponse immunitaire bien caractérisée et répertoriée dans de nombreuses publications, permettant une évaluation précise des effets des immunomodulateurs sur la neutralisation des vecteurs viraux. Elle est largement utilisée dans les études de thérapie génique, notamment pour la validation de stratégies de transduction et de réadministration d’AAV, facilitant ainsi la comparaison avec les données existantes. Sa petite taille permet de limiter les volumes biologiques requis tout en assurant une puissance statistique suffisante avec un nombre réduit d’animaux. L’utilisation de ce modèle s’inscrit pleinement dans le respect des principes des 3R, en particulier la réduction, grâce à l’optimisation des conditions expérimentales et à l’exploitation des résultats obtenu. Les souris de génotype sauvage sont réceptionnées au stade jeune adulte, pour une période d’acclimatation avant leur utilisation expérimentale entre 4 à 12 semaines d’âge. À ce stade, le système immunitaire est mature. De plus, leur condition physique est optimale pour les études de thérapie génique, notamment celles ciblant le tissu musculaire, car l’efficacité du transfert de gène rapporteur et son expression sont significativement plus élevées chez les jeunes adultes comparé aux animaux plus âgés. Ce choix d’âge garantit ainsi la robustesse des résultats.