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Réponses immunitaires systémiques à la dystrophie musculaire de Duchenne.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Les animaux utilisés portent la mutation responsable de la dystrophie musculaire de Duchenne, pris à 1,5 mois et à 6 mois pour couvrir un stade précoce et un stade tardif de la maladie. 180 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour des analyses histologiques et moléculaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent une injection abdominale de molécules activant le système immunitaire, quatre injections hebdomadaires d'un médicament contre le stress et quatre ponctions sanguines réparties sur 21 jours. Les nuisances décrites se limitent à de la fatigue, de la fièvre, un malaise léger à la piqûre et une douleur au point de prélèvement, sans rien qui explique le classement en gravité sévère, et l'espèce n'est jamais nommée autrement que comme "un mammifère appartenant à la même classe que l'être humain".
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est causée par une anomalie génétique, que génère l’absence d’une protéine essentielle pour le fonctionnement du muscle. Lors de l'usure normale, les muscles atteints de DMD se réparent mal et diminuent progressivement de volume et de force. Le système immunitaire détecte la présence de composants musculaires endommagés et généralement les élimine. Cependant, dans la DMD, ces composants persistent anormalement. Cette étude vise à comprendre l'impact à long terme de cette persistance sur la réponse immunitaire. Nous utilisons un modèle animal, porteur de la même anomalie génétique que celle responsable de la DMD, comme substitut aux patients atteints de cette maladie. Le modèle animal utilisé dans cette étude a montré une diminution de certains types d'anticorps (protéines produites par le système immunitaire qui reconnaissent et neutralisent les substances étrangères) dans le sang. Afin de comprendre les causes de ce phénomène, nous souhaiterions administrer aux animaux, des molécules activatrices du système immunitaire pour étudier en détail comment le processus de production d'anticorps en réponse à ces molécules diffère entre les animaux atteints de DMD et les animaux sains.
Bénéfices attendus
Cette étude sera importante pour les patients atteints de DMD pour plusieurs raisons. Elle pourrait donner les outils pour améliorer les stratégies médicales pour le traitement de la maladie, reconnaissables par le système immunitaire pour corriger les anomalies génétiques. De plus, les résultats de cette étude contribueront à l'élaboration de meilleures recommandations vaccinales pour les patients atteints de DMD.
Procédures
Dans ce projet, tous les animaux recevront : - une injection dans la zone abdominale avec des molécules activatrices du système immunitaire (moins de 1 minute par injection). - quatre injections avec une médicament pour réduire le stress (une fois par semaine reparties en 21 jours, moins de 1 minute par injection). - quatre ponctions pour prélèvement sanguin (une fois par semaine reparties en 21 jours, environ de 1 minute chaque fois).
Impact sur les animaux
La vaccination peut provoquer un léger inconfort dans les jours qui suivent, notamment de la fatigue et de la fièvre. L’injection elle-même peut générer un malaise léger en raison de la piqûre, ainsi que le stress généré par la contention. De plus, des prélèvements sanguins peuvent engendrer un certain inconfort chez les animaux, notamment une douleur au point de prélèvement sanguin.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
Dans cette étude, nous utilisons un modèle animal présentant la même anomalie génétique que les patients atteints de dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Ceci nous permet de simuler plus précisément les processus biologiques complexes entre les différents composants de l'organisme, à l'origine de la maladie. Il est impossible de simuler cela sans utiliser un modèle animal.
Réduction
Grâce aux données de nos expériences précédentes, nous avons pu calculer le nombre minimal d'animaux nécessaires à cette étude pour obtenir des données concluantes et fiables. Ceci nous permet de limiter la souffrance animale. Une phase pilote à plus petite échelle, avec un nombre réduit d'animaux, sera menée au préalable afin de vérifier l'adéquation du protocole expérimental à la collecte de données. Cela évite tout gaspillage de vie animale si le protocole s'avère inadéquat pour l'obtention de données concluantes et fiables. Enfin, un maximum de données et d'observations sera collecté lors des expériences afin d'éviter de les répéter ultérieurement.
Raffinement
Les animaux sont habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés en douceur très régulièrement. Les animaux sont hébergés à deux ou plus et le milieu est enrichi. La douleur est prise en charge tout au long des procédures, y compris de manière préventive avant les traitements, grâce à l’utilisation de molécules destinées à la sédation et anti-douleur. Afin d’anticiper tout signe de douleur, des critères de suivi du bien-être ont été établis et sont évalués quotidiennement en observant individuellement les animaux, week-ends et jours fériés inclus. Ces critères portent sur l’aspect général des animaux (pelage et yeux), leur comportement (mobilité) et l’état général de l’animal (masse corporelle). En cas de signes de douleur, des mesures sont prises : surveillance renforcée (biquotidienne) et mesures médicamenteuses visant à atténuer ou supprimer la douleur.
Choix des espèces
L’espèce choisie est un mammifère appartenant à la même classe que l'être humain. Cette proximité évolutive en fait un modèle apprécié. Il partage de nombreux aspects anatomiques et physiologiques avec l’humain, notamment pour la constitution et le fonctionnement des organes ainsi que les processus métaboliques. Les récents outils génétiques ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculaires. Ce modèle animal mime ce type de maladies humaines de manière très fidèle et il est un excellent complément aux autres modèles. Nous utilisons notamment des animaux âgés de 1,5 et 6 mois, car ces âges correspondent respectivement aux stades précoce et tardif de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Grâce à eux, nous pourrons comparer les réponses du système immunitaire entre ces deux stades de la maladie.
Etudes des mécanismes réduisant l’efficacité de traitement antibiotique et promouvant l’émergence d’antibiorésistance chez la souris infectée par Mycobacterium tuberculosis
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Anesthésiées puis infectées en une minute par des bacilles de la tuberculose, 2 136 souris subissent ensuite jusqu'à six périodes de traitement antibiotique, gavage quotidien sept jours de suite puis trois semaines sans rien, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont tuées pour mesurer la charge bactérienne dans leurs organes. Les souches inoculées portent des mutations construites au laboratoire pour survivre aux antibiotiques ou reprendre leur croissance après traitement, l'enjeu étant d'observer l'apparition de résistances chez un hôte vivant. Le porteur retient la souris parce que sa sensibilité au bacille et la cinétique de réplication y sont bien caractérisées et qu'elle reproduit selon lui une bonne part des observations faites chez l'humain.
Objectifs
La progression de la résistance bactérienne aux traitements antibiotiques est une menace mondiale. L’identification des mécanismes bactériens qui facilitent le développement de résistance et mènent à des échecs thérapeutiques sont des priorités urgentes. Plusieurs résultats suggèrent un rôle moteur de deux processus complémentaires, mis en évidence chez Mycobacterium tuberculosis, l'agent infectieux bactérien le plus fatal au niveau mondial : la tolérance, qui désigne la capacité de la bactérie à survivre lors de l’exposition antibiotique, et la résilience, qui désigne sa capacité à réinitier rapidement sa réplication après une telle exposition. Cependant, la dynamique d’interaction entre ces mécanismes de tolérance et de résilience et le développement de résistance reste méconnue. L’objectif du projet est de déterminer ces interactions en utilisant une approche d’évolution expérimentale dans le modèle souris sous traitement antibiotique reproduisant des conditions favorables de souches modifiées de tolérance, de résilience et de résistance. A cette fin, des souches de M. tuberculosis porteuses de différentes mutations connues de tolérance et/ou de résilience ont été construites. Le but initial est d’évaluer la dynamique de croissance et d’évolution de résistance de ces souches exposées à un traitement antibiotique chez la souris, en comparaison de souches parentales dépourvues de ces mutations de tolérance ou de résilience. L’objectif final est de déterminer si, et dans quelle mesure, la présence mutations de tolérance et/ou de résilience réduisent l’efficacité antibiotique chez l’hôte et accélèrent l’émergence de résistance au traitement. La compréhension avancée des interactions entre tolérance, résilience et résistance qui en est attendue devrait permettre de mettre en lumière les mécanismes fondamentaux expliquant les échecs de traitements et le développement global d’antibiorésistances. Les informations visées devraient fournir des données essentielles pour le développement d’outils diagnostiques et thérapeutiques inédits de détection et/ou de prévention de risque d’émergence de chimiorésistance.
Bénéfices attendus
La tuberculose est une cause majeure de mortalité globale due à l’antibiorésistance. La recherche de nouveaux antibiotiques, en particulier contre cette maladie, est une tâche très ardue. Cependant, la majorité des cas de tuberculose dans le monde restent encore sensibles aux traitements. Il est donc essentiel de préserver l’efficacité des traitements actuels et futurs, et d’éviter que la bactérie ne développe davantage de résistances. Ce projet permettra d’acquérir de nouvelles connaissances scientifiques sur les rôles et les dynamiques d’interaction de mécanismes génétiques de tolérance et de résilience aux antibiotiques dans la réduction de l’efficacité chimiothérapeutique et la facilitation de l’évolution de l’antibiorésistance chez le bacille de la tuberculose. Les résultats attendus devraient fournir des informations permettant l’identification de marqueurs génétiques bactériens prédictifs de traitement déficient et de risques d’émergence de résistance, offrant la perspective du développement d’un nouvel outil de diagnostic moléculaire capable de détecter à la fois les populations bactériennes tolérantes/résilientes et l’émergence de résistances. Ces schémas d’évolution expérimentale in vivo pourront également fournir de nouveaux modèles expérimentaux pour l’évaluation pré-clinique de composés candidats inhibant la tolérance et/ou la résilience aux médicaments, augmentant l’efficacité des traitements et prévenant l’émergence de résistances.
Procédures
Les animaux seront infectés avec des bacilles de la tuberculose après avoir été anesthésiés. Cette opération dure 1 minute. Certains groupes d'animaux recevront jusqu’à 6 périodes de traitement par antibiotique pendant 7 jours consécutifs par semaine.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables ou nuisances attendus chez les animaux dans le cadre de nos expériences se situent à deux niveaux, soit lors de l’infection expérimentale, et lors de l’administration des traitements antibiotiques. Pour l’infection, il s’agit de nuisances modérées d’une durée de 1 minute. Lors de chaque période de traitement antibiotique, les animaux seront soumis à une contention quotidienne (d’une durée maximum 1 minute) suivie d’un gavage (si choisi), 7 jours par semaine pendant une semaine, suivie de trois semaines sans traitement.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour évaluer la charge bactérienne dans différents organes
Remplacement
Les modèles in vitro ou cellulaires ne permettent pas de rendre compte des conditions pharmacocinétiques, ni des conditions métaboliques bactériennes et d’interactions avec la réponse immunitaire prévalant lors du traitement antibiotique au sein de tissus de l’hôte infecté par Mycobacterium tuberculosis. Le modèle animal est donc incontournable à l’heure actuelle pour une telle étude. Le modèle animal le plus couramment utilisé est le modèle souris, car il reproduit en termes de réponses au traitement anti-tuberculeux bon nombre des observations faites chez l’humain.
Réduction
Chaque phase du projet sera suivie d’une décision de poursuite ou d’interruption de l’étude, en fonction des résultats obtenus. Pour atteindre des valeurs statistiques satisfaisantes,4 ou 5 souris par groupe et par point de temps seront nécessaires afin de tenir compte de la variabilité inter-individus, attendue sur base de données disponibles dans la cadre d’autres projets précédemment menés dans des modèles murins d’infection par M. tuberculosis sous traitement antibiotique. Les différences de charge bactérienne entre groupes expérimentaux seront analysées à l’aide de tests statistiques. Afin de limiter la variabilité expérimentale, nous constituerons des lots d’animaux homogènes.
Raffinement
Des mesures seront mises en place afin de minimiser les nuisances pour les animaux : réduction maximale du temps de contention lors des phases d’infection et d’administration des antibiotiques, surveillance renforcée après chaque intervention. Les animaux seront suivis avec une table de suivi de soins comportant des points limites et spécifiques du projet. Pour l’infection, les animaux seront anesthésiés.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet visant à explorer le lien entre tolérance, résilience et émergence de résistance aux antibiotiques chez l’hôte infecté, à travers l’étude de souches modifiées et contrôles de Mycobacterium tuberculosis, le modèle murin s’impose comme le choix le plus pertinent. La souris est très bien caractérisée quant à son niveau de sensibilité à ce pathogène et à la cinétique de réplication bactérienne au cours de l’infection. Elle est aussi un modèle couramment utilisé pour l’évaluation préclinique d’efficacité d’antibiotiques in vivo. En particulier, après établissement initial de l’infection pendant une période de trois semaines, la relation entre le traitement quotidien par doses thérapeutiques d'antibiotiques et la réduction de charge bacillaire dans lesorganes est bien établie Nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes et, si possible, âgées entre 6 et 10 semaines. L’objectif est que les souris aient un système immunitaire mature et que les groupes soient homogènes en âge
Etude de l’efficacité thérapeutique de nouveaux traitements dans des modèles d’infection pulmonaire chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
12 096 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, toutes dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une infection respiratoire leur est provoquée par une administration unique de virus ou de bactéries dans les voies aériennes sous anesthésie, puis des traitements sont administrés jusqu'à deux fois par jour pendant plusieurs semaines. Le porteur annonce une perte de poids, une baisse d'activité, une respiration rapide ou difficile et, dans les cas les plus graves, des complications pulmonaires ou générales, effets qu'il déclare "nécessaires" à l'évaluation des traitements. Les effectifs qu'il détaille, sept groupes de six à douze animaux par étude, ne sont jamais rapportés aux 12 096 souris annoncées, et ni les pathogènes ni les molécules testées ne sont nommés.
Objectifs
Les infections respiratoires constituent un problème majeur de santé publique, à l’origine d’un grand nombre d’hospitalisations et de décès chaque année. Elles regroupent différentes entités cliniques, d’origine bactérienne ou virale, pouvant évoluer vers des formes sévères telles que les pneumonies ou les syndromes de détresse respiratoire aiguë. Parmi elles, les pneumonies acquises sous ventilation mécanique (PAVM) représentent une complication fréquente et grave chez les patients en réanimation, caractérisée par une inflammation pulmonaire aiguë et la colonisation des voies respiratoires profondes par des agents pathogènes opportunistes, souvent hyper- virulents et/ou multi-résistants. Les options thérapeutiques actuelles demeurent limitées et parfois inefficaces face à l’antibiorésistance croissante. Il est donc nécessaire de développer de nouveaux traitements ou de repositionner des molécules existantes afin d’améliorer la prise en charge des infections respiratoires sévères. Le présent projet s’inscrit dans ce cadre et a pour objectif de développer et caractériser des modèles précliniques d’infection respiratoire bactérienne et virale permettant l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques. Ces modèles ont pour finalité de reproduire différentes situations cliniques : mimer une infection physiologique par voie respiratoire haute ou reproduire des infections pulmonaires profondes de type PAVM. Ces études permettront d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules dans des contextes infectieux variés, de documenter leurs effets sur la charge bactérienne, la réponse inflammatoire et la fonction respiratoire, et de sélectionner les candidats les plus prometteurs pour la poursuite du développement préclinique.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à étudier et valider, dans un contexte physiopathologique pertinent, l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques ou de molécules repositionnées dans le traitement des infections respiratoires bactériennes et virales, incluant les pneumonies acquises sous ventilation mécanique. Les bénéfices attendus concernent la mise au point de modèles précliniques d’infection respiratoire permettant d’évaluer chez l'animal l’efficacité de ces molécules sur des infections pulmonaires induites par des souches d’intérêt clinique, et de comparer leur efficacité à celles des traitements de référence. Ces études permettront également de mieux comprendre leurs mécanismes d’action à travers l’analyse de la charge bactérienne, des biomarqueurs inflammatoires et de la réponse pulmonaire. À terme, ce projet contribuera à identifier des candidats thérapeutiques prometteurs susceptibles de réduire la sévérité et la durée des infections respiratoires, d’améliorer la fonction pulmonaire et de diminuer la mortalité associée à ces pathologies.
Procédures
Les animaux participeront à une étude visant à reproduire une maladie respiratoire, puis à tester l’efficacité de différents traitements. Pour induire la maladie, les animaux recevront une administration unique de virus ou bactérie pathogènes au niveau des voies respiratoires. Cette intervention sera réalisée sous anesthésie afin de limiter toute douleur ou inconfort et durera quelques minutes. Certains animaux recevront uniquement une solution sans principe actif afin de servir de groupe de comparaison. Les traitements étudiés pourront être administrés avant ou après l’apparition de la maladie, sur une durée pouvant aller de quelques jours à plusieurs semaines. La fréquence d’administration pourra varier de quelques fois par semaine à une ou deux fois par jour selon les besoins de l’étude. Les modes d’administration pourront varier en fonction du composé et de la posologie envisagée. Ces manipulations peuvent entraîner un stress lié à la manipulation ainsi qu’un inconfort léger et transitoire. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours de l’étude, sous anesthésie, à intervalles espacés et dans des volumes respectant les recommandations en vigueur. Les animaux seront surveillés pendant leur réveil après chaque intervention. À la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés selon des méthodes réglementaires, après anesthésie, afin de permettre des analyses complémentaires.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de l’étude, les animaux développeront une infection respiratoire. Cela pourra entraîner des signes de maladie tels qu’une perte de poids, une diminution de l’activité, une respiration plus rapide ou difficile, ainsi qu’un état de fatigue. Dans les cas les plus sévères, l’infection pourra provoquer des complications au niveau des poumons ou affecter plus largement l’organisme. Ces effets sont attendus dans ce type de modèle et sont nécessaires pour permettre l’évaluation des traitements étudiés. Les traitements testés ne devraient pas entraîner d’effets indésirables particuliers, car les doses utilisées sont connues pour être bien tolérées.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. Les poumons et le sang seront prélevés à des fins d’analyses.
Remplacement
L’étude de l’efficacité de nouvelles molécules dans le traitement des infections respiratoires bactériennes et virales nécessite de disposer de modèles animaux capables de reproduire la complexité de la pathologie humaine, incluant la réponse immunitaire, l’inflammation pulmonaire, l’élimination de l’agent pathogène et les lésions tissulaires associées. Bien que des essais sur cellules soient réalisés en amont pour évaluer la toxicité, la réponse inflammatoire cellulaire et l’activité antimicrobienne ou antivirale des composés, ces approches ne permettent pas de reproduire l’ensemble des interactions entre les pathogènes, le système immunitaire et les organes cibles. L’utilisation du modèle souris reste indispensable pour évaluer de manière intégrée les effets du traitement sur l’infection, l’inflammation et la fonction pulmonaire. Les procédures proposées présentent donc un caractère de stricte nécessité scientifique et ne peuvent être remplacées par des méthodes alternatives ne faisant pas appel à l’animal vivant.
Réduction
Pour chaque étude pilote, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les concentrations d’inoculum testées (3 concentrations) selon les souches, seront choisies en s’appuyant sur les modèles infectieux déjà décrits dans la littérature. Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour obtenir une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité des traitements. L’analyse des données impliquera la comparaison de 7 groupes (4 groupes pour les pilotes) de 6 à 12 animaux pour chaque étude et bénéficiera d'une analyse statistique appropriée.
Raffinement
Pour chaque souche bactérienne ou virale testée, une étude pilote sera menée sur un petit nombre d'animaux afin d'optimiser les études ultérieures. Les conditions d’hébergement respecteront les exigences réglementaires pour le respect de l’animal ; 5 à 6 souris par cage selon le poids de l’animal, avec nourriture et eau à disposition et présence d’un enrichissement. Les procédures seront réalisées dans une pièce calme, différente de la pièce d’hébergement. Pour limiter le stress, la peur et l’angoisse des animaux, ils seront manipulés avec délicatesse et sociabilisés (habitués à l’expérimentateur) avant le début de l’étude, leur environnement sera enrichi avec du matériel de nidification et de divertissement afin que les animaux puissent exprimer leur comportement naturel. Une manipulation des animaux à l'aide d'un tunnel ou avec les mains en coupe sera privilégiée pour limiter la contention des souris par la queue. Pour minimiser l'impact sur les souris, une étude pilote sera menée sur un petit nombre d'animaux afin d'optimiser les études ultérieures. Toutes les procédures d’infection seront réalisées sous anesthésie générale afin de bien maîtriser le geste et prévenir toute douleur ou inconfort. L’anesthésie sera induite par inhalation (induction et maintien au masque) ou par une injection d'un couple anesthésiant/analgésique. Dans ce dernier cas, l’anesthésie sera interrompue au bout d’environ 30 minutes, afin de favoriser un réveil rapide et limiter la durée d’exposition anesthésique. Les manipulations seront effectuées par du personnel formé et habilité, maîtrisant les techniques d’administration et de surveillance anesthésique. Les animaux anesthésiés seront surveillés jusqu’à leur réveil. L’administration dans les poumons, nécessitant la mise en place d’une sonde, sera réalisée avec précaution afin de limiter les lésions locales et les risques d’irritation, à l’aide d’un endoscope à fibre optique. Cette stratégie de raffinement vise à assurer une maîtrise rigoureuse de la douleur et du stress, à limiter les nuisances tout en maintenant la validité scientifique et la reproductibilité des modèles d’infection respiratoire mis en œuvre.
Choix des espèces
La souris a été choisie car elle constitue un modèle de référence pour l’étude des infections respiratoires bactériennes et virales. Sa réponse immunitaire bien caractérisée, sa reproductibilité expérimentale et sa taille adaptée permettent d’obtenir des résultats fiables tout en limitant la quantité de composé administrée et les nuisances associées. Les animaux seront âgés de 6 à 8 semaines au minimum, au début de l’étude, en accord avec la littérature existante pour effectuer ces différents modèles. De plus, à cet âge, le système immunitaire de ces animaux est totalement développé.
Pose de sonde pour admnistration de composés par voie intraduodénale
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Le protocole dépend du candidat médicament et de la durée de traitement demandée, dix substances devant être évaluées sur cinq ans. 80 chiens adultes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun est anesthésié une à deux heures pour l'implantation chirurgicale d'un cathéter intraduodénal relié à une chambre sous-cutanée ou la pose d'une sonde nasogastrique, puis subit jusqu'à douze prélèvements sanguins en 24 heures et des administrations répétées pendant des jours ou des semaines, avec un hébergement en box individuel estimé à deux semaines. Le porteur retient le chien pour son anatomie digestive proche de celle de l'humain et pour sa taille, qui autorise des cathéters permanents et des prises de sang répétées, et prévoit de réutiliser ces animaux après accord du vétérinaire.
Objectifs
L’administration intraduodénale est une méthode permettant d’administrer une substance directement dans la première portion de l’intestin grêle, en contournant la dégradation gastrique. Cette voie est utilisée en pharmacologie expérimentale, en nutrition entérale, et dans certains protocoles thérapeutiques vétérinaires. Cependant, les techniques d’accès au duodénum (utilisation temporaire d’une sonde nasoduodénale ou pose d’un cathéter à demeure) présentent des variations méthodologiques importantes, souvent non standardisées. Le présent projet vise à décrire la mise en oeuvre de deux approches pour réaliser les administrations intraduodénales. Même si les 2 approches permettent la réalisation de plusieurs administrations duodénales chez le même animal, la première approche (sonde naso-gastrique) est d'avantage envisagée dans le cas d'études nécessitant des traitements répétés de courte durée (probablement 2 semaines maximum). La seconde approche (cathéter intraduodénal relié à une chambre sous cutanée de type Access port) est d'avantage envisagée pour des taritements répétés chroniques (au delà de 2 semaines). L'obectif de ce projet est donc double. Il permettra de déterminer la faisabilité technique, la stabilité post-opératoire, la tolérance clinique, la reproductibilité et la sécurité des administrations. Ce projet permettra également d'étudier la pharmacocinétique de 10 substances d'essais évalulées, sur 5 ans, dans chacune des deux techniques.
Bénéfices attendus
La voie intra-duodénale permet aux éléments testés de contourner l'estomac et de les diriger vers l'intestin grêle, afin d’éviter l’inactivation du candidat médicament par l'acidité gastrique, le retard d’absorption, et les interactions avec le contenu gastrique. Cette voie d’administration est ainsi couramment utilisée lors d’études de pharmacocinétiques (absorption intestinale pure), pour l’administration de nutriments ou médicaments sensibles à l’acidité gastrique et l’évaluation de l’effet de substances sur la muqueuse intestinale. Ce projet pemettra d'établir les profils pharmacocinétiques de candidats médicaments. Ce projet nous fournira également des données expérimentales permettant de définir et de choisir, en fonction du candidat médicament et de la durée du traitement, la meilleure approche pour assurer les administration intra-duodénales chez le chien. De plus, le projet contribuera à diminuer la douleur et le stress des animaux dans les futurs protocoles et des essais répétés et d’optimiser les conceptions expérimentales futures. Ce projet contribuera également à l'amélioration du bien-être animal grâce à l’optimisation des soins anesthésiques, antalgiques et postopératoires.
Procédures
Les animaux seront anesthésié (généralement entre 1 et 2 heures) et subiront une intervention chirurgicale afin de placer un dispositif permettant de délivrer des candidats médicaments dans le duodénum. Après réveil et une période de récupération (de 2 à 7 jours selon la technique utilisée), des prélèvements sanguins veineux seront réalisés après administration de la substance à évaluer (12 prélèvements maximum sur 24 heures; volume et fréquence adaptés à l'espèce) elon les bonnes pratiques vétérinaires. La durée de la procédure de prélèvement est de quelques secondes. Les administrations intraduodenales sont effectuées selon les bonnes pratiques vétérinaires. La durée de la procédure d’administration devrait être inférieure à une minute. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours ou plusieurs semaines, en fonction des spécificités du candidat traitement. La fréquence des administrations (exemple : journalière, hebdomadaire) est variable et également adaptée à la spécificité des substances testées. Pour que les animaux soient au calme pendant la phase de réveil post-chirurgicale, de faciliter les soins et protéger le dispositif d'administration, ils seront hébergés en box individuel (estimation 2 semaines maximum). Un enrichissement sera mis en place et les animaux seront hénergés à proximité de congénères (maintien visuel, olfactif et auditif avec les congénères).
Impact sur les animaux
La phase de chirurgie sous anesthésie (et mise à disposition de ration journalière de nourriture après le réveil), la phase de réveil post-chirurgicale, l'hébergement individuel (estimée à 2 semianes maximum), les administrations ou les prélèvements sanguins (sous contention légère) peuvent entrainer un stress ou une douleur légère.
Devenir
Les animaux pourront être réutilisés après l’approbation du vétérinaire.
Remplacement
En amont des tests in vivo, des tests in silico ou in vitro peuvent être envisagés (ou même requis d'un point de vue réglementaire) afin d'évaluer la tolérance locale des candidats médicaments. Cependant, même si ces tests peuvent apporter des données préliminaires ou complémentaires (permettant ainsi un tri des substances à étudier, et donc réduisant de fait le nombre d'animaux utilisés), ils ne peuvent entièrement suppléer les modèles animaux car ils ne permettent pas d’évaluer la pharmacocinétique et les effets dans un environnement biologique et physiologique intact comme cela est possible chez l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-concentration/effet (si plusieures doses sont testées). Dans la mesure du possible (dépend de la durée d'action de la ou des substances testées), plusieurs doses d'une même substance (ou de substances différentes), ainsi qu'un contrôle négative et/ou positif (si nécessaire) peuvent être testés chez le même animal à des jours différents, réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés. Dans le cas des études de pharmacocinétique, un groupe de traitement comprend classiquement entre 3 et 6 animaux (nombre basé sur les standard des études de pharmacocinétiques).
Raffinement
Le raffinement des méthodes expérimentales pour réduire au maximum la souffrance animale est mis en œuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis, permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse dépassant le cadre de l'étude. En cas de doute sur l’état général de l’animal, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux (ou attendus) ou jusqu’à atteinte des points limites. De plus, suite à la phase de chirurgie, un formulaire interne spécifique à l’espèce sera complété. Il intègre une évaluation de l’appétit, du poids, de l’attitude, de l’activité, et du comportement général de l’animal, ainsi que l’évaluation du comportement vis-à-vis de la zone de chirurgie et de la réaction lors de la palpation de la zone de chirurgie. Ce formulaire d’évaluation de la douleur permet de prendre les bonnes décisions en évitant toute souffrance animale. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans l'hébergement des animaux (e.g. litière, plateformes, bacs de repos, jouets et musique, présence de congénères...). Pour les phases chirurgicales, les animaux sont anesthésiés et analgésiés, le programme d’anesthésie et d’analgésie étant défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De plus, la phase de chirurgie est raffinée au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins pré- et post-opératoires complets. Ce projet est en développement dans notre établissement utilisateur, et une évaluation interne impliquant la cellule de bien-être animal sera demandée afin de vérifier et adapter (si nécessaire) la catégorie éthique et les méthodes de raffinement.
Choix des espèces
Le chien présente une anatomie gastro-intestinale (taille, pH intestinal, motricité) et un temps de transit plus proches de l'humain que ceux des petits rongeurs, facilitant ainsi l'extrapolation des résultats. La taille du chien permet également la pose de cathéters intraduodénales permanents ainsi que des prélèvements sanguins répétés (sans saignées excessives) afin d'établir une courbe pharmacocinétique complète. Chiens adultes, conformément à la littérature scientifique et aux pratiques dans les études de pharmacocinétiques.
Évaluation de l’effet d’une thérapie ciblée sur le développement des lésions endométriales dans des modèles murins d’endométriose.
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Ovariectomisées pour une partie d'entre elles, puis opérées pour recevoir un fragment d'utérus hors de l'utérus, 384 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Suivent dix semaines d'injections hormonales hebdomadaires, des injections de traitement en intraveineuse, jusqu'à neuf échographies sous anesthésie et trois nuits de seize heures passées seules pour observer si elles construisent encore un nid. Le porteur décrit une douleur chirurgicale modérée mais prolongée, des douleurs abdominales pendant les semaines de développement des lésions et un stress supplémentaire lié à l'isolement nocturne. Des points limites déclenchent la mise à mort des souris dont la douleur n'a pas pu être corrigée, les autres étant tuées à la fin pour prélever les lésions.
Objectifs
L'endométriose est une maladie gynécologique inflammatoire qui touche plus de 10 % des femmes en âge de se reproduire (190 millions). Elle se caractérise par la présence anormale de tissus/lésions endométrial(e)s en dehors de l'utérus. Cette maladie touche plusieurs organes situés dans l’abdomen. Huit à dix ans sont généralement nécessaires afin de détecter cette maladie. L'endométriose a un impact considérable sur la qualité de vie des femmes et sur l'économie mondiale (environ 80 milliards de dollars par an). Les traitements disponibles actuellement servent uniquement à diminuer les symptômes mais ne soignent pas cette maladie. Dans certains cas, les lésions peuvent être retirées par chirurgie cependant 30 % des femmes opérées ont de nouvelles lésions dans les 5 ans post chirurgie. La progression de la maladie et de ces lésions endométriales se rapproche de ce qui est observé dans le développement des cancers comme le développement anarchique de cellules en dehors de leur organe d’origine. Récemment, une protéine connue pour son implication dans le développement du système nerveux a été identifiée pour jouer un rôle potentiel dans l’endométriose. Notre objectif est de tester un nouvel anticorps permettant de bloquer cette protéine et de voir les effets potentiels de ce traitement sur le développement des lésions endométriales.
Bénéfices attendus
En 2022, la France a décrété la lutte contre l’endométriose comme cause nationale. Ce projet fait partie du consortium national de recherche sur l’endométriose (dans le cadre du PEPR Santé des femmes, santé des couples). Cette demande d’expérimentation a pour objectif de tester l'efficacité d’une nouvelle thérapie afin d’améliorer le bien-être des femmes atteintes d’endométriose et également d'accroître les connaissances sur cette maladie.
Procédures
Les animaux subiront 1 ou 2 interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie parmi elles ; pour une partie des souris une ovariectomie (20 min/souris) qui vise à retirer les ovaires afin de contrôler la production d’hormones sexuelles, et pour toutes les souris une intervention permettant d’induire l’endométriose (selon 2 méthodes d’induction différentes ; soit la première 5 min/souris, soit la deuxième 15-20 min/souris). Les souris ovariectomisées recevront une injection hebdomadaire d’hormone en sous-cutanée pendant 10 semaines. Les injections sous-cutanées nécessitent une contention d’environ 30 secondes et les injections intraveineuses (pour les traitements) une contention de maximum 2min. Les souris subiront un test de comportements spontané pour lequel elles seront individualisées sur une nuit (16h) afin de voir leur capacité à former un nid reflétant leur bien-être. Ce test sera réalisé 3 fois au total.
Impact sur les animaux
Au sein de ce projet, les animaux seront soumis à différentes nuisances. La première des nuisances aura pour origine les procédures chirurgicales mais les douleurs post-chirurgies sont diminuées par la mise en place d'une analgésie spécifique et d’un suivi fréquent permettant de l’ajuster en cas de besoin. L'anesthésie des animaux peut entrainer une détresse légère et une courte hypothermie. La chirurgie peut entrainer une douleur modérée mais prolongée. Les souris subiront différentes manipulations chaque semaine pour des pesées et des traitements (injections sous-cutanées et/ou intraveineuses) et le suivi du développement des lésions par échographie (au maximum 9 fois). Ces manipulations peuvent entraîner du stress durant le temps des contentions ainsi que pour l'anesthésie (endormissement et réveil). Durant les semaines de développement de la maladie, il est possible que des douleurs abdominales apparaissent également. Les souris subiront un test de comportements spontané pour lequel elles seront individualisées sur une nuit (16h) pouvant induire un stress supplémentaire et ce test sera réalisé 3 fois (au départ puis sur les dernières semaines de suivi avec 1 semaine d’intervalle).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour collecter les tissus, puisqu'il faudra analyser les lésions générées par l'endométriose et comparer les différents groupes de traitements.
Remplacement
L’endométriose est une maladie qui fait intervenir de nombreux processus cellulaires et de nombreuses interactions tissulaires entre organes. En effet, l’endométriose est une maladie qui a pour origine la présence de tissu endométrial en dehors de l’utérus. Le seul moyen de l’étudier est donc de mimer la pathologie dans un contexte « corps entier » en apportant expérimentalement un fragment d’utérus là où il ne devrait pas être. Il n’existe à ce jour aucun modèle alternatif en culture cellulaire ou autre.
Réduction
Le nombre de groupes et l’effectif de chaque groupe d’animaux ont été réduits au maximum, en se basant sur la littérature et l’utilisation de tests statistiques. Les observations sur la taille et le volume des lésions endométriales et l’amélioration du bien-être des animaux seront analysés avec des méthodes statistiques appropriées, avec des groupes de 12 souris chacun. Les tests utilisés permettent de vérifier si le traitement a un effet réel sur le développement des lésions. La procédure est séparée en 2 lots d’animaux, le second lot ne sera réalisé que dans le cas où le premier lot a montré un effet sur le développement des lésions ou le bien être des animaux.
Raffinement
Les souris ont une période d’habituation aux expérimentateurs qui vont suivre le protocole. Les souris seront élevées et hébergées par groupes, avec un milieu enrichi pour améliorer leur bien-être (maison en carton, coton). Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux (pesées, suivi post-opératoire etc.) plusieurs fois par semaine permettra la recherche de tout signe de souffrance. Des points limites adaptés sont mis en place au- delà desquels, si aucun moyen de correction de la douleur n’a été efficace, les souris sont mises à mort. Les procédures de chirurgie et les injections sont réalisées par du personnel qualifié afin de réduire au maximum le temps de manipulation et le stress des animaux avec anesthésie et analgésiques adaptés dès que nécessaire. Des mesures de confort sont mises en place : éléments de nidification supplémentaires, tapis chauffant pendant l’anesthésie, nourriture semi- liquide en cas de perte de poids, gel protecteur pour les yeux, et enrichissement des cages après les injections.
Choix des espèces
La souris présente l’avantage d’être très similaire à l’homme que ce soit anatomiquement, physiologiquement et génétiquement. En effet, plus de 98% de ses gènes sont identiques à ceux de l’homme. Cette proximité physiologique et génétique permet de récapituler les évènements cellulaires observés chez l’homme et donc de l’utiliser comme modèle d’étude. Dans notre cas, le modèle d’endométriose murin permet de se retrouver dans des conditions physiologiques très proches de celles observées chez les patientes atteintes d’endométriose. De plus, la protéine étudiée n'est pas exprimée dans certaines espèces mais on retrouve une forte ressemblance entre la forme humaine de cette protéine et la forme murine, justifiant encore l'usage des souris. Les souris utilisées dans ce projet sont des souris femelles vierges d’au moins 8 semaines, possédant un utérus mature et fonctionnel.
Etude préliminaire des variations de virulence de l’agent de la furonculose chez la truite Arc-en-ciel pour mieux comprendre la maladie en élevage
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
Des furoncles couvrant une certaine surface du corps déclenchent la mise à mort de l'animal, selon la grille à sept critères du projet. 273 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la bactérie de la furonculose puis observées deux fois par jour jusqu'à l'apparition de lésions cutanées, d'hémorragies ou d'une septicémie pour les formes les plus graves, les survivantes étant tuées par surdosage d'anesthésique et exsanguination. Le porteur justifie l'absence de relâcher par l'impossibilité sanitaire de remettre en circulation des poissons infectés, et rattache l'étude aux pertes économiques de la pisciculture, la truite arc-en-ciel étant l'espèce de poisson la plus élevée en France.
Objectifs
La furonculose est une maladie bactérienne des Salmonidés causée par la bactérie Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida. Elle entraîne des pertes économiques importantes en raison de sa forte mortalité lors des formes suraiguës et des lésions cutanées qu’elle provoque dans les cas aigues à chroniques. La maladie est saisonnière et se déclare pour toutes les classes d’âges des poissons particulièrement en période estivale. Les signes cliniques et la mortalité peuvent varier entre les souches, soulignant l’importance de mieux comprendre l’expression de leur virulence pour aboutir à des vaccins protégeant contre les formes les plus mortelles. Des travaux in vitro réalisés sur 46 souches isolées d’élevages piscicoles touchés par la furonculose montrent des différences d’expression de facteurs de pathogénicité notamment la couche A. Certaines souches expriment toutes (100% des colonies) ce facteur à partir d’un même clone (A+) alors que d’autres non (A-). Enfin, d’autres souches montrent deux sous-populations produisant ou non la couche A (A±). L’objectif est d’étudier si ces différences peuvent expliquer les variations de signes cliniques observés en élevage et ainsi proposer de nouveaux antigènes dans le cadre du développement de nouveaux vaccins mais également permettre la distinction au sein des populations pathogènes pour le diagnostic en élevage.
Bénéfices attendus
La compréhension du pouvoir pathogène d’A. salmonicida salmonicida permettra de proposer de nouvelles approches diagnostic pour distinguer la virulence des souches isolées en élevages piscicoles et adapter le recours à un traitement mais aussi de contribuer à optimiser les vaccins sur le terrain en sélectionnant des souches possédant des antigènes pertinents pour améliorer la protection des truites.
Procédures
Les animaux seront soumis à une infection expérimentale en condition contrôlée. Les animaux vigiles seront suivis quotidiennement. Ceux morts en raison de l’infection ou nécessitant une mise à mort sur la base des points limites décrits en 3.3.6.3. seront anesthésiés puis mis à mort par surdosage d’anesthésique accompagnée d’une exsanguination. En fin d’expérimentation, les animaux survivants seront également mis à mort selon la procédure préalablement décrite ci-avant. Toutes les manipulations seront réalisées sous anesthésie, par des personnes expérimentées, en possession du niveau "concepteur" ou de niveau "applicateur" de la formation expérimentation animale", et formées aux gestes techniques nécessaires à la procédure
Impact sur les animaux
L’étude du pouvoir pathogène des différentes populations bactériennes nécessite d’infecter des poissons pour mieux le comprendre. Le déclenchement de la maladie peut aboutir à des signes cliniques pouvant entrainer de la souffrance chez les animaux (furoncles superficiels jusqu’à hémorragie et septicémie pour les formes les plus graves). Sept critères d’observation ont été choisis pour évaluer la souffrance des animaux avec pour chacun des niveaux) de gravité (de la condition normale à l’état dégradé de l’animal. A chacun de ces niveaux est affecté un score dont la somme permet de définir un seuil d’intervention pour augmenter la fréquence de surveillance des animaux voire de les mettre à mort pour certains points limites individuels comme la présence de furoncles sur une superficie de l’animal.
Devenir
L'euthanasie des poissons est prévue en fin de protocole, pour des raisons notamment sanitaires (impossibilité de relâcher ou de réutiliser des poissons potentiellement infectés par A. salmonicida)
Remplacement
L’objectif du projet étant de comparer le pouvoir pathogène de différentes souches d’A. salmonicida salmonicida, cela ne peut se faire uniquement sur animaux vivants. Bien que des modèles cellulaires de truites existent, ils ne permettent pas de valider l’apparition de signes cliniques tels que les furoncles ni d’évaluer le taux de mortalité.
Réduction
Dans l’étude préliminaire, nous limiterons le nombre d’animaux en testant 3 souches uniquement (A+, A-, A. Ainsi, l’expérimentation préliminaire contiendra 3 groupes test et 1 groupe contrôle. Chacun contiendra 31 animaux en duplicat, soit 62 animaux par groupe au total. Ce nombre a été calculé en utilisant un outil statistique qui nous permettra d’obtenir des résultats exploitables tout en minimisant le nombre d’animaux utilisés dans l’expérimentation.
Raffinement
Une observation quotidienne des poissons est assurée. Lors des procédures de challenge infectieux, les poissons font l’objet d’une observation deux fois par jour, chaque jour, de manière systématique avec des seuils d’alarme définis pour la température et l’oxygène. Une photopériode de 12h de jour et 12h de nuit sera respectée en lien avec le rythme de poissons, ainsi que des enrichissements pour leur permettre de se cacher et réduire le stress. Enfin, les points limites ont été définis sur la base de 7 critères pour lesquels sont attribués 4 niveaux d’observation (de l’état normal à dégradé de l’animal) avec des scores pour chacun. La somme de ces scores permet de définir un seuil d’intervention pour augmenter la fréquence de surveillance des animaux. Cinq de ces critères ont également un niveau d’observation pouvant conduire à la mise à mort de l’animal indépendamment des autres critères car ils peuvent être à l’origine d’une souffrance animale à eux seuls.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel est un hôte naturel d'Aeromonas salmonicida salmonicida. C'est de plus l'espèce de poisson la plus élevée en France et donc pour laquelle il est essentiel de mieux comprendre le processus infectieux pour améliorer le diagnostic, la thérapeutique et les approches vaccinales. Les truites utilisées seront de 20 à 30g. La furonculose est une maladie que l'on observe à différents stades d'élevage (alevins, truites portions = 200-250g et grosse truite > 1kg)
Évaluation de l’efficacité et du mode d’action de composés d’intérêt thérapeutique en développement chez un modèle souris d’inflammation colique chronique
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant jusqu'à 63 administrations et quatre prélèvements sanguins. Une colite chronique leur est provoquée par un composé chimique ajouté trois semaines durant à l'eau de boisson, avec diarrhées, sang dans les selles et douleurs abdominales, et chaque souris est hébergée seule alors que le porteur reconnaît des animaux sociaux. Le projet aligne dix études sur cinq ans pour tester des composés en développement contre les maladies inflammatoires de l'intestin. Les retombées annoncées pour les patients passent par des essais cliniques et une autorisation de mise sur le marché qui restent au conditionnel, quand l'inflammation infligée est programmée.
Objectifs
Les maladies chroniques de l’intestin, comme la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, touchent plusieurs millions de personnes dans le monde, et leur fréquence augmente, surtout dans les pays industrialisés et chez les jeunes adultes. Cette augmentation résulte d’une combinaison de facteurs génétiques, environnementaux, alimentaires et liés au mode de vie. Les traitements existants sont encore limités et une partie des patients ne répond pas aux médicaments actuels ou perd leur efficacité avec le temps. Cela montre l’importance de développer de nouvelles solutions pour réduire l’inflammation et améliorer la santé intestinale. Le projet utilise un protocole standardisé et prévoit 10 études sur cinq ans. L’objectif est de tester l’efficacité de nouveaux composés susceptibles de réduire l’inflammation de l’intestin. Les résultats permettront de mieux comprendre leur fonctionnement et, si les résultats sont positifs, de poursuivre leur développement pour un usage chez l’homme.
Bénéfices attendus
La présente étude devrait permettre de mettre en évidence l’efficacité de composés d’intérêt thérapeutique en cours de développement pour réduire la colite, et d’apporter une confirmation de leur mode d’action. En cas d’efficacité avérée, ces composés pourront être testés ultérieurement dans le cadre d’études cliniques et pourraient, à terme, obtenir une autorisation de mise sur le marché.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1) Administration des traitements (7 administrations lors de l'habituation et 56 administrations lors de la phase de traitement : < 1 minute). 2) Hormis pour les 10 souris du groupe expérimental contrôle du modèle de colite, les animaux seront exposés à trois reprises pendant une semaine à un composé chimique induisant une inflammation du colon via leur eau de boisson (3 semaines). 3) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel deux fois par semaine avant traitement et quotidiennement pendant l'ensemble de la période de traitement (durée des pesées < 1 minute). 4) Prélèvements sanguins (4 prélèvements sanguins par souris : 5 minutes).
Impact sur les animaux
Le modèle utilisé est un modèle de colite chronique chez la souris. La concentration du composé chimique employée permet d’induire une colite légère. Cette concentration est inférieure à celle utilisée dans les modèles de colite aiguë afin de tenir compte du caractère chronique du modèle et de la répétition des phases d’exposition à ce composé. Dans ce contexte, les souris peuvent présenter des épisodes de diarrhée, parfois accompagnés de la présence de sang dans les selles, ainsi que des douleurs abdominales. Les différentes procédures réalisées au cours de l’étude, telles que les administrations, ainsi que les pesées quotidiennes à l’état éveillé, peuvent être sources de stress ou d’inconfort. Enfin, l’hébergement individuel, bien que nécessaire pour le bon déroulement du protocole, constitue également une contrainte pour les souris, qui sont des animaux sociaux.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure. En effet, l'étude implique des analyses biochimiques et histologiques sur les colons et les rates qui doivent ainsi être collectés à l'issue de la procédure.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques est justifiée dans ce projet, car il n’existe actuellement aucune méthode de substitution permettant d’étudier l’impact d’un composé sur l’inflammation du côlon sans recourir à un animal de laboratoire. Les inflammations chroniques de l’intestin sont des maladies complexes faisant intervenir plusieurs mécanismes biologiques, notamment inflammatoires et immunitaires.Des modèles alternatifs, comme les tests in vitro, sont utilisés en amont pour évaluer l’efficacité potentielle des composés. Toutefois, l’étude sur l’animal entier demeure indispensable afin de mieux comprendre les effets globaux du composé et constitue une étape nécessaire avant toute demande d’autorisation pour la réalisation d’études cliniques chez l’humain.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés a été calculé et rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Le nombre de 15 animaux par groupe a été défini comme le minimum nécessaire pour mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés, en tenant compte de l’hétérogénéité du modèle employé. Un total de 70 souris sera utilisé, réparties en 1 groupe de 10 souris (groupe contrôle du modèle) et 4 autres groupes de 15 animaux chacun. Le groupe contrôle du modèle a été réduit à 10 animaux, puisqu’il ne présente pas de colite, ce qui réduit la variabilité des mesures.
Raffinement
Le modèle animal utilisé est un modèle d’inflammation du côlon chez la souris, induite par l’administration d'un composé chimique, largement décrit et validé dans la littérature scientifique. Le protocole a été conçu afin de limiter au maximum le stress et la souffrance des animaux, et des points limites adaptés ont été définis. La dose du composé chimique utilisée a été réduite par rapport aux modèles de colite aiguë, afin de tenir compte des administrations répétées et de limiter la sévérité de l’inflammation. Les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien à l’aide de grilles d’évaluation standardisées permettant d’identifier précocement tout signe de souffrance ou d’aggravation de la colite. En cas d’atteinte de seuils prédéfinis, un traitement antalgique sera administré afin de prévenir toute douleur. Si l’inflammation devenait trop sévère, l’animal concerné serait retiré de l’étude. Les animaux seront hébergés individuellement pour les besoins du protocole, tout en conservant des contacts visuels et olfactifs avec leurs congénères. Un enrichissement renforcé de l’environnement sera mis en place, comprenant des briquettes de bois adaptées aux rongeurs, des abris en carton et du matériel de nidification.
Choix des espèces
Le modèle animal utilisé est un modèle d’inflammation colique induite par administration d'un composé chimique chez la souris qui est très bien caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans le cadre d'études précliniques. Les animaux seront réceptionnés à 7 semaines d'âge et les traitements débuterons à 9 semaine d'âge. Cela correspond à un stade de jeune adulte mimant la population cible majoritaire des inflammations chroniques de l'intestin chez l'humain.
Évaluation de nouvelles approches diagnostiques et thérapeutiques pour traiter la sclérose en plaques dans un modèle d’induction de la pathologie chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Une encéphalomyélite est provoquée par une injection sous la peau accompagnée de deux injections intrapéritonéales, puis 1 750 souris subissent gavages, prélèvements sanguins répétés et ponctions de liquide céphalorachidien, toutes tuées à l'issue par ponction cardiaque, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'objectif est de tester des molécules candidates contre la sclérose en plaques, dont l'arrivée en clinique reste renvoyée à un "terme" non daté. Le porteur décrit des déficits moteurs progressifs et une perte de poids qui "pourra être importante", l'incapacité complète à se déplacer constituant un point limite, et prévoit de réhydrater par injection sous-cutanée les souris qui n'atteignent plus l'eau. Il affirme dans le même temps que ces déficits moteurs ne comportent aucune douleur associée.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans la recherche d’une nouvelle approche diagnostique ou d’un nouveau traitement pour la sclérose en plaques, une maladie qui touche le système nerveux central, en particulier le cerveau, les nerfs optiques et la moelle épinière. Dans cette pathologie, la transmission des influx nerveux est altérée, ce qui se manifeste par des symptômes très variables : engourdissement d’un membre, troubles de la vision, sensations de décharge électrique dans un membre ou le dos, troubles des mouvements. La sclérose en plaques évolue par poussées au cours desquelles les symptômes réapparaissent, mais aussi accompagnés de nouveaux symptômes. Au bout de quelques années, les poussées laissent des séquelles qui peuvent devenir très invalidantes (altération du contrôle des mouvements, de la perception sensorielle, de la mémoire, de la parole).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation en préventif ou en curatif sur la sclérose en plaques. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cette maladie pour lesquelles les options sont pour le moment limitées.
Procédures
Induction de la maladie : au maximum 1 administration sous cutanée et deux administrations intrapéritonéale (
Impact sur les animaux
Une petite plaie pourra apparaître au niveau du site d’injection du CFA. Dans ce projet nous nous attendons à des déficits moteurs progressifs chez les animaux, sans douleur associée. Cependant les déficits moteurs empêchant complètement le déplacement seront des points limites. Une paralysie des sphincters n’est en général pas observée à part dans des cas très rares. Les animaux présenteront une perte de poids qui pourra être importante. Les administrations de produit et prélèvements et contentions associées pourront induire un stress léger de quelques minutes. Du fait de leur difficulté à se déplacer, les animaux pourront présenter de la déshydratation qui sera gérée par des injections sous cutanée de fluides de réhydratation.
Devenir
Après la procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang.
Remplacement
Les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront, dans la mesure du possible, été au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité apparente. Elles auront si possible aussi été sélectionnées sur leurs propriétés pharmacocinétiques in vivo. Cependant, l’ensemble de ces données est insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée in vivo en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez l’homme.
Réduction
Sur la base de nos expériences préalables et d’analyse des résultats par un test ANOVA, nous avons conclu qu’un nombre de 15 animaux par groupe est nécessaire si des paramètres variables sont mesurés (dosage de composé, scores cliniques). On pourra réduire jusqu’à 8 animaux pour une étude préliminaire. En moyenne, nous utilisons 10 animaux par groupe.
Raffinement
Dans le cadre de ce modèle, les animaux induits présenteront des déficits moteurs et de la perte de poids. Le poids sera suivi tous les jours et les pertes de poids persistantes ou importantes seront des points limites justifiant une euthanasie. Une déshydratation pourra résulter des déficits moteurs et de l’inflammation. Les animaux déshydratés seront réhydratés (NaCl ou RL SC). Les déficits moteurs seront quantifiés quotidiennement, afin de procéder à l’euthanasie des animaux dont l’état ne leur permettra plus d’aller chercher de l’eau et de la nourriture. La grille de scoring est détaillée dans la procédure. Des croquettes seront déposées en fond de cage ainsi que de la nourriture gélifiée. Des bâtons à ronger sont présents dans toutes les cages. Une paralysie des sphincters n’est pas attendue dans la plupart des cas mais ce point sera surveillé et une incapacité à uriner constituera un point limite.
Choix des espèces
La souris est l’espèce utilisée pour étudier la démyélinisation des neurones. Différents modèles induits de sclérose en plaques ont été décrits avec leurs avantages respectifs (Methods Mol Biol – 2012; 900: 381-401). Sur des souris de fond génétique SJL/J ou C57BL/6, l’induction de la sclérose en plaques par injection de protéines ou peptides provoquant une encéphalomyélite est considérée prédictive de la maladie humaine, car les altérations observées dans le système nerveux central ont une très grande similitude avec celles observées chez les patients atteints de sclérose en plaques. Des animaux sevrés (jeunes adultes de plus de 6 semaines) seront utilisés, ces modèles étant bien décrits chez les animaux adultes. Les adultes de plus de 10 semaines répondent mieux à l’induction, et seront privilégiés.
Evaluation de l’activité antitumoral de thérapies cellulaires sur la croissance tumorale ovarienne chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
Les souris utilisées sont sévèrement immunodéficientes, condition sans laquelle les cellules tumorales et immunitaires humaines qu'on leur injecte seraient rejetées. 40 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules cancéreuses humaines dans l'abdomen, y développe une tumeur suivie deux fois par semaine par imagerie sous anesthésie, avec jusqu'à 17 administrations d'un réactif de détection, quatre injections intraveineuses dans la queue et 24 injections sous-cutanées. Toutes sont tuées à la fin pour le prélèvement d'organes, le porteur n'excluant pas une dissémination tumorale et une gêne respiratoire en cas de métastases pulmonaires.
Objectifs
L’immunothérapie dans le domaine du cancer est une approche thérapeutique qui vise à stimuler le système immunitaire du patient pour qu’il puisse éliminer les cellules cancéreuses. Parmi les approches disponibles, il est possible de récupérer certaines cellules immunitaires du patient, de les modifier afin qu’elles reconnaissent spécifiquement les cellules cancéreuses avant de les réinjecter au patient. Cette approche, appelée thérapie cellulaire, a démontré son efficacité dans de nombreux essais cliniques pour le traitement de différents cancers. Nous avons réussi à générer des cellules immunitaires modifiées capables de reconnaître différents types de cancers, tels que le cancer de l’ovaire et un sous-type de cancer du sein très agressif. De plus, nous avons démontré que ces cellules immunitaires modifiées sont capables d’éliminer des cellules cancéreuses in vitro. Cependant, il est nécessaire de vérifier leur potentiel thérapeutique in vivo. Dans ce projet, nous utiliserons des souris immunodéficientes permettant l’étude de la croissance tumorale en présence de cellules immunitaires humaines spécifiques. L’objectif principal est de valider la capacité de ces cellules immunitaires modifiées à éliminer les cellules cancéreuses in vivo, et de déterminer si la version optimisée du produit présente une efficacité supérieure à celle du traitement de référence.
Bénéfices attendus
En cas de résultats positifs, cette étude permettra de valider une nouvelle approche thérapeutique innovante pour les patients atteints de cancer, notamment de cancers de l’ovaire et du sein qui ne répondent pas aux traitements standards. Ceci accélèrera la validation préclinique de cet outil thérapeutique afin d’entamer le transfert vers la clinique.
Procédures
Pour réaliser l’injection intrapéritonéale de cellules cancéreuses humaines, chaque souris est brièvement maintenue pendant environ 15 secondes. Une seule injection sera effectuée par animal. À la suite de cette injection, les souris développeront une tumeur au niveau de la cavité abdominale. La croissance tumorale sera suivie par imagerie deux fois par semaine durant toute la durée de la procédure. La veille de la première mesure, les animaux seront rasés. Cette intervention, d’une durée d’environ 2 minutes, pourra être répétée une fois au cours de la procédure si nécessaire. Le jour de chaque acquisition, les animaux seront anesthésiés et maintenus brièvement afin de recevoir un réactif permettant la détection du signal tumoral, puis resteront sous anesthésie durant toute la séance d’imagerie (environ 10 minutes). Chaque souris pourra recevoir au maximum 17 administrations de ce réactif. Le traitement expérimental sera administré par voie intraveineuse au niveau de la queue, nécessitant une immobilisation d’environ une minute ; quatre injections intraveineuses seront effectuées par animal. Des injections sous-cutanées de molécules de soutien aux cellules lymphocytaires seront réalisées trois fois par semaine durant toute la procédure, soit un total de 24 injections sous-cutanées, avec une contention d’environ 15 secondes par geste. Les animaux seront également pesés deux fois par semaine durant la procédure, une contention de 15 secondes étant nécessaire pour cette opération.
Impact sur les animaux
L’injection de cellules tumorales dans la cavité abdominale de la souris est susceptible d’entraîner une douleur modérée et temporaire au moment de l’administration. À la suite de cette injection, les animaux développeront des tumeurs localisées principalement dans la cavité péritonéale. Toutefois, une dissémination tumorale ne peut être totalement exclue. En cas de formation de métastases, notamment au niveau des poumons, une gêne respiratoire pourrait survenir. L’injection intraveineuse du traitement dans la queue peut provoquer une gêne modérée et passagère au moment de l’injection. Des inflammations locales légères peuvent également apparaître à la suite de multiples injections. À ce jour, aucun effet indésirable majeur lié au transfert de cellules immunitaires modifiées chez la souris n’a été rapporté dans la littérature. Nous n’envisageons donc pas d’effets secondaires spécifiques liés à ce traitement. L’administration sous-cutanée de protéines solubles pourrait entraîner une douleur légère ou temporaire au site d’injection. De même, les injections intrapéritonéales répétées nécessaires au suivi de la croissance tumorale par imagerie peuvent induire une inflammation locale ou une gêne transitoire, sans conséquence durable sur le bien-être des animaux. Enfin, les manipulations répétées (injections, pesées, surveillances) peuvent occasionner un stress transitoire.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever certains organes dans le but d’analyser leur composition immunitaire.
Remplacement
Des expériences in vitro ont déjà été réalisées afin de confirmer l’efficacité des cellules immunitaires modifiées générées et leur capacité à éliminer des cellules tumorales. Les animaux sévèrement immunodéficientes correspondent au modèle majoritaire pour l’évaluation de l’efficacité des thérapies cellulaires utilisant des cellules immunitaires modifiées puisqu’elles permettent la greffe de cellules tumorales humaines et l’injection de cellules immunitaires humaines en l’absence de cellules immunitaires murines. Ce modèle est le seul modèle vivo disponible dans le cadre de notre projet, aucune alternative non-animale n’est aujourd’hui disponible pour s’assurer de la fonctionnalité des cellules immunitaires modifiées in vivo, ce qui est l’objectif de cette étude.
Réduction
Le projet comporte une seule procédure expérimentale, ayant pour objectif principal de démontrer l’effet antitumoral du traitement standard et d’évaluer si la version optimisée de ce traitement présente une efficacité supérieure au produit non optimisé. Dans l’hypothèse où les résultats in vitro montreraient que le traitement optimisé est moins efficace que le prototype initial, aucun test in vivo ne serait réalisé avec ce traitement optimisé. Un outil statistique approprié a été utilisé pour déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaire et suffisant afin de garantir la validité scientifique de l’étude tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés. De plus, un ensemble optimal de données et d’échantillons sera collecté pour chaque animal, de manière à maximiser les informations obtenues tout en limitant le recours aux animaux au strict minimum requis pour répondre à l’ensemble des objectifs expérimentaux.
Raffinement
L’effet des composés (cellules cancéreuses et réactifs injectés) sur l’état physiologique des souris est suivi par observation clinique, pesée des animaux et mesure des tumeurs par imagerie. Des points limites adaptés sont définis de manière objective pour le projet, incluant des critères d’arrêt de l’expérience en cas de souffrance des animaux. Aucun effet indésirable lié à des molécules de soutien dans le modèle de souris utilisé n’est attendu. Les souris seront anesthésiées pour le suivi longitudinal réalisé par imagerie. Leur réveil est facilité en plaçant la cage sur un tapis chauffant.
Choix des espèces
Les souris utilisées correspondent au modèle majoritaire pour l’évaluation de l’efficacité des thérapies cellulaires utilisant des cellules immunitaires modifiées puisqu’elles permettent la greffe de cellules tumorales humaines et l’injection de cellules immunitaires humaines en l’absence de cellules immunitaires de souris. Ce modèle est le seul modèle vivo disponible dans le cadre de notre projet, aucune alternative non-animale n’est aujourd’hui disponible pour s’assurer de la fonctionnalité des cellules immunitaires transférées in vivo, ce qui est l’objectif de cette étude. Les animaux utilisés seront à l’âge de 6-8 semaines afin de pouvoir réaliser les greffes dans l’abdomen et l’injection en intraveineuse des cellules immunitaires dans des conditions optimales.
Test de composés pharmacologiques ciblant le dysfonctionnement d’organelles dans la maladie de Charcot-Marie-Tooth
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un composé par voie orale six jours sur sept pendant huit semaines, puis passent le rotarod, où elles sont forcées de marcher cinq minutes sur une roue en rotation, le test du gait, et le test de von Frey, qui applique des forces croissantes sur la patte au moyen d'un filament. La lignée utilisée porte une mutation de Mfn2 qui reproduit une dénervation musculaire et des défauts locomoteurs apparaissant après six mois. Le porteur indique que les composés ont déjà montré un effet bénéfique sur un modèle in vitro dérivé de cellules humaines de patients, et qualifie néanmoins le passage chez la souris d'étape "indispensable".
Objectifs
La maladie de Charcot Marie Tooth (CMT) est une maladie génétique touchant le système nerveux périphérique (SNP). Les patients souffrant de CMT présentent une faiblesse et atrophie musculaire prédominante aux membres inférieurs, des déformations squelettiques des extrémités, ce qui entraine une difficulté pour se mouvoir et pour les formes de CMT les plus sévères, la nécessité d'un fauteuil roulant. Contrairement à la maladie de Charcot (ou sclérose latérale amyotrophique), la CMT ne réduit pas l’espérance de vie des patients, mais affecte fortement leur qualité de vie. Une des formes les plus fréquente de CMT est la forme CMT2A. Au niveau cellulaire, nos travaux précédents ont montré que la Mfn2 mutée entraine des défauts d'organelles dans les neurones conduisant à l’activation d’un stress cellulaire . Ce projet a pour but de tester plusieurs composés pharmacologiques, dont l’effet a d’abord été validé dans des modèles cellulaires, permettant d’améliorer le contact entre ces deux organelles et de réduire le stress cellulaire, dans un modèle murin modélisant de la maladie CMT2A.
Bénéfices attendus
L'ensemble de ce projet nous permettra de déterminer si ces composés pharmacologiques représentent une possibilité thérapeutique pertinente pour la CMT2A. Si un effet bénéfique est obtenu, cela pourrait dans le futur conduire à un essai clinique chez l’homme. A plus long terme ces approches pourront être mise en place pour d'autres formes de CMT liées à des défauts de stress du réticulum endoplasmique ou à des défauts d’organelles
Procédures
Les animaux seront soumis à : une administration de traitement par voie orale en prise spontanée 6j/7 pendant 8 semaines (léger; quelques minutes); des tests de comportement permettant la mesure de la locomotion et de la sensibilité des pattes (maximum 15 minutes par animal pour chaque test) . Chaque test sera réalisé sur deux jours (entrainement et test) en incluant des moments de récupération pour les animaux entre chaque essais ( 5 minutes) et entre chaque test (au moins deux jours). A la fin de l'expérience, les animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Les animaux CMT2A présentent un phénotype léger d’apparition tardive (après 6 mois) sans impact sur la qualité de vie et surive des animaux. Dans le cas de l’administration guidée par micropipette, les animaux subiront à l’âge adulte un traitement par voie orale de 6 jours par semaine pendant deux mois. Cela impliquera une légère contention de l'animal une fois par jour au moyen d'une légère pression exercée par la paume de la main de l'expérimentateur. L'administration par micropipette ne créera pas d'inconfort, et les composés ont déjà été testé et sont bien tolérés. Au cours du test rotarod, les souris seront forcées à marcher sur une roue qui tourne pendant 5 min. Pour les souris transgéniques qui présentent des défauts locomoteurs sur ce test, cela pourra conduire à une fatigue musculaire légère. Nous n'anticipons pas de nuisance liée au test du gait. Le test VonFrey, qui a pour but d’analyser la réponse sensitive, entraîne par contre un inconfort de courte durée suite à l’exposition à un filament de 0.5 mm qui vient exercer des forces croissantes sur la patte de la souris. Les souris ressentiront ainsi une légère piqûre au niveau de leur paume qui entraine un léger inconfort de quelques secondes.
Devenir
mise à mort et récupération des tissus
Remplacement
l est difficile d'accéder aux cellules de patients du système nerveux périphériques (neurones moteurs et sensitifs et cellules de Schwann). Les neurones moteurs et sensitifs de patients peuvent être différentiés à partir de cellules pluripotentes humaines induites et constituer ainsi un modèle humain de la pathologie CMT pour les formes axonales. Nos données préliminaires ont déjà montré un effet bénéfique de ces composés sur un modèle in vitro de la CMT2A. Néanmoins le passage in vivo, notamment chez la souris, est une étape indispensable pour établir la preuve de concept et la mise au point de la dose du traitement, sa biodisponibilité, afin d'envisager par la suite un essai thérapeutique chez l'homme.
Réduction
Le nombre d'animaux a été limité au minimum nécessaire (= 15 animaux par groupe) pour mettre en évidence un effet significatif sur des paramètres de locomotion et de sensibilité en se basant sur nos travaux précédents et des tests statistiques. Au total nous utiliserons 420 animaux répartis de la manière suivante : Deux groupes génétiques : contrôles et mutants - Quatre groupes thérapeutiques : 1 solution véhicule (contrôle) et 4 différents composés pharmacologiques.
Raffinement
Nous nous assurerons de diminuer le stress des souris en les manipulant en coupe ou en tunnel. Afin d’optimiser le bien-être de nos animaux, nous avons opté pour une méthode d’identification couplée au prélèvement pour génotypage afin de réduire la douleur et le stress des animaux. Nous avons choisi de privilégier un mode d’administration de notre composé pharmacologique par voie orale via la méthode MDA plutôt que par gavage afin de réduire considérablement le stress des animaux et d’éventuels risques de blessures lors de l’injection.
Choix des espèces
La souris reste un des modèles les plus aisés à modifier génétiquement et proche de l'homme (99% des gènes sont homologues). Elle est l'espèce la plus utilisée pour modéliser des maladies neurodégénératives ou neuromusculaires telles que la CMT. Elles développent la plupart du temps des anomalies observées chez l'homme et ont permis de mieux comprendre les mécanismes cellulaires sous-jacents à ces pathologies. Dans notre cas, la lignée utilisée pour la CMT2A reproduit une partie des anomalies histologiques et comportementales observés chez ces patients telles qu'une dénervation musculaire, et des défauts locomoteurs tardifs. Pour les trois études, les traitements seront réalisés à 4 mois (proche du début ds symptômes moteurs) pendant 8 semaines. L'ensemble des groupes de souris de ces études seront suivis pendant les deux mois de traitement (soit de 4 à 6 mois).
Modélisation de l’hidradénite suppurée par inactivation conditionnelle de la nicastrine dans les cellules souches du follicule pileux.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Épilées sous anesthésie, badigeonnées trois jours de suite d'un produit sur le dos, puis exposées quatre fois à des bactéries appliquées au coton-tige, 2 352 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent aussi cinq prélèvements sanguins étalés sur soixante jours, une injection abdominale et cinq semaines de régime hyperlipidique. Le but est de construire un modèle d'hidradénite suppurée par inactivation d'un gène dans les cellules souches du follicule pileux, ce qui provoque hyperprolifération folliculaire et inflammation cutanée massive. Le porteur présente ce nouveau modèle comme une amélioration du bien-être des animaux non-humains et une limitation de leur nombre, tout en annonçant 2 352 souris toutes tuées pour l'analyse de leurs tissus.
Objectifs
L'hidradénite suppurée (HS) est une maladie inflammatoire chronique de la peau affectant le follicule pileux. Notre équipe étudie le rôle de certaines cellules et a mis en évidence une altération de leur homéostasie chez les patients. Des mutations d’un gène de la protéine nicastrine ont été identifiées chez environ 10 % des patients HS. Un modèle de souris avec une délétion spécifique de la nicastrine dans certaines cellules développent des lésions cutanées associant hyperprolifération des follicules et une inflammation massive. Nous proposons un nouveau modèle murin qui permettra une meilleure compréhension des mécanismes à l'origine de l'HS et pourrait aboutir à de nouvelles pistes thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Le développement d'un modèle murin amélioré est essentiel pour comprendre la physiopathologie de l'HS et identifier de nouveaux traitements pour cette maladie actuellement sans solution curative. Ce modèle permettra aussi d'améliorer le bien-être animal en ciblant plus précisément les cellules d'intérêt, réduisant ainsi les effets secondaires indésirables et limitant le nombre d'animaux nécessaires. En effet, l’animal pourra servir de contrôle pour lui-même, minimisant la variabilité interindividuelle et optimisant la pertinence des résultats.
Procédures
Préparation des souris et traitement initial : Les souris seront épilées sous anesthésie afin de garantir une application homogène des traitements. Pendant trois jours consécutifs, une application cutanée de produit sera réalisée sur la région dorsale. Des prélèvements sanguins seront effectués à intervalles réguliers (J0, J14, J30, J45, J60) une méthode rapide (< quelques secondes). Une injection dans l’abdomen sera réalisée en quelques secondes. Application topique cutanée avec des bactéries à l’aide d’un coton-tige sur la surface cutanée sans nécessité de raser la fourrure. Cette application topique sera répétée de manière quotidienne un total de 4 fois (quelques minutes à chaque fois). Introduction d’un régime hyperlipidique sur une période de cinq semaines.
Impact sur les animaux
L'administration d’un des produits par voie cutanée pourrait induire des effets secondaires locaux tels qu'une irritation cutanée, une sécheresse excessive ou une inflammation transitoire au site d'application. Ces effets seront surveillés et atténués par une application contrôlée du traitement et l'utilisation éventuelle d'agents apaisants. De plus, l'inactivation de la nicastrine dans notre modèle pourrait provoquer une altération de la structure des follicules et une inflammation cutanée, ce qui sera évalué régulièrement afin d'adapter les conditions expérimentales si nécessaire.
Devenir
L'ensemble des animaux est mis à mort afin de déterminer sur les tissus isolés l'évolution de la réponse immunitaire sur la totalité de la cinétique expérimentale.
Remplacement
Nous avons évalué les alternatives existantes, notamment les modèles in vitro (cultures cellulaires, organoïdes, folliculoïdes) Toutefois, l’HS est une maladie complexe et multifactorielle, impliquant des interactions entre les cellules épithéliales du follicule pileux, le microbiote cutané et le système immunitaire inné et adaptatif. À ce jour, aucun modèle in vitro ne permet de reproduire cette complexité de manière fidèle. Modèles in vitro et limites : Les folliculoïdes que nous développons offrent une plateforme intéressante pour étudier certains aspects précoces de la maladie, mais ils ne permettent pas d’analyser l’infiltration immunitaire ni les interactions systémiques entre les cellules de l’hôte et le microenvironnement inflammatoire. Les cultures isolées ne permettent pas de reconstituer l’architecture folliculaire ni les phénomènes de rupture folliculaire, caractéristiques clés de l’HS. Ainsi, l’utilisation de notre modèle murin est nécessaire pour explorer les mécanismes précoces de l’HS, notamment : le rôle de certaine scellules dans l’initiation de la maladie ; les interactions entre diffrérents types scellulaires ; et la formation des lésions caractéristiques. En complément, nous continuerons à développer et affiner des modèles alternatifs, notamment les folliculoïdes, afin de limiter le recours aux modèles animaux lorsque cela est possible
Réduction
Nous avons optimisé notre approche expérimentale afin de limiter autant que possible le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la robustesse scientifique de nos résultats. 1. Optimisation de la taille des cohortes: Nos calculs de puissance statistique ont été réalisés en amont afin de déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats significatifs tout en évitant une surutilisation. 2. Maximisation des données obtenues par animal: nous utilisons plusieurs approches/réalisons plusieurs analyses sur un même animal, ce qui permet d’exploiter pleinement chaque individu et d’éviter la nécessité de cohortes supplémentaires pour différentes analyses. Nous avons développé un modèle fluorescent qui permet un traçage précis des cellules étudiées facilitant l’interprétation des résultats tout en réduisant le besoin d’animaux supplémentaires. 3. Intégration de modèles in vitro pour réduire la dépendance au modèle murin: Nous avons mis en place des modèles de folliculoïdes, qui permettent d’explorer certains aspects de la physiopathologie de l’HS et de tester des candidats thérapeutiques en amont, avant de valider les résultats dans le modèle murin. Ces modèles in vitro nous permettent également d’affiner nos hypothèses expérimentales et d’orienter nos analyses in vivo, réduisant ainsi le nombre d’animaux requis. 4. Standardisation et harmonisation des protocoles : L’homogénéisation de nos procédures (croisements génétiques optimisés, conditions expérimentales rigoureusement contrôlées) permet de minimiser la variabilité et donc de limiter le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre une signification statistique. En combinant ces stratégies, nous nous engageons à minimiser le recours au modèle murin tout en garantissant la pertinence scientifique de nos travaux sur l’HS.
Raffinement
Nous avons choisi un modèle murin permettant une perte spécifique de nicastrine dans les cellules souches du follicule pileux sans affecter d’autres tissus. Cette approche ciblée réduit les effets secondaires systémiques et limite la sévérité des phénotypes, garantissant un impact minimal sur le bien-être général des animaux. Les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter précocement tout signe de souffrance. Les points limites précoces définis sont : diminution de l’activité spontanée, grooming excessif, posture légèrement courbée, ainsi que l’apparition de rougeur ou perte de poils débutante. En cas de détection, la surveillance sera intensifiée et un avis vétérinaire sera sollicité. Les procédures nécessitant une manipulation potentiellement inconfortable seront realisés sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane, permettant de limiter la douleur, le stress et la durée d’immobilisation. Les animaux feront l’objet d’une surveillance attentive pendant et après l’anesthésie, avec mise en place de mesures de soutien appropriées, notamment le maintien de la température corporelle. L’hébergement intègre plusieurs mesures de raffinement supplémentaire au cours de l’expérimentation: • enrichissement optimisé avec litière douce en cellulose ; • apport de gel nutritif en cas de baisse transitoire d’appétit ou pour limiter le stress post-manipulation ; • contrôle strict de la température. Nous collaborerons étroitement avec les vétérinaires et référents en expérimentation animale pour garantir l’application des meilleures pratiques en matière de raffinement.
Choix des espèces
1. Homologie génétique avec l'humain : La souris partage environ 85 % de son génome avec l’humain, permettant une extrapolation fiable des résultats. 2. Modèle précliniquement validé : Les souris sont couramment utilisées pour étudier les maladies dermatologiques, y compris les pathologies inflammatoires du follicule pileux, garantissant une base de comparaison avec des études antérieures. 3. Manipulation génétique avancée : La disponibilité de lignées transgéniques permettent une étude fine des mécanismes moléculaires impliqués. 4. Facilité d’élevage et de suivi : Leur cycle de reproduction court et leur coût relativement bas permettent une étude efficace et reproductible sur plusieurs générations. 5. Ainsi, l'utilisation de la souris comme modèle animal est essentielle pour élucider les mécanismes sous-jacents à l’hidradénite suppurée et tester de nouvelles stratégies thérapeutiques avant d'envisager des études cliniques. L'étude portera sur des souris adultes entre 3 à 24 semaines. L'hidradénite suppurée atteint principalement les adultes.
L’implantation sous-cutanée chez le rat : un modèle pour évaluer la biocompatibilité de matériaux destinés à la régénération osseuse MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Huit échantillons de matériau implantés sous la peau du dos d'un même animal, en une chirurgie de trente minutes : 20 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour les analyses histologiques. Une douleur modérée est annoncée après l'implantation, ainsi qu'un risque d'infection en cas de rejet du matériau ou de réouverture de la plaie. L'objet est de vérifier la biocompatibilité de membranes destinées à la régénération osseuse, avant une éventuelle mise sur le marché. Le rat est présenté comme la première étape de validation, le porteur annonçant qu'en cas de résultats satisfaisants une validation sur "gros animal" sera "nécessaire".
Objectifs
Les pertes de substances osseuses représentent un défi en chirurgie orale et orthopédique. En clinique, l'utilisation de greffe autologue est très répandue mais présente certains inconvénients (chirurgie additionnelle, morbidité du site donneur...). Ainsi, le développement de biomatériaux en régénération osseuse est indispensable pour pallier ces limitations. Pour évaluer la biocompatibilité des biomatériaux étudiés, nous souhaiterions avoir recours à un modèle animal déjà développé et maîtrisé au sein de notre unité. Ce modèle est facile à mettre en œuvre et reproductible. Le modèle sous-cutané chez le rat adulte réalisé au niveau dorsal est le modèle choisi afin d’évaluer la bicompatibilité des biomatériaux implantés.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait le développement de nouveaux dispositifs médicaux (membranes pour la régénération osseuse guidée) dans le domaine de l'ingénierie tissulaire osseuse dans la perspective d’une utilisation en clinique.
Procédures
Les animaux auront une chirurgie cutanée au niveau dorsal (implantation sous-cutanée de conditions expérimentales). L’intervention a lieu une seule fois et dure environ 30 mn par animal.
Impact sur les animaux
L'implantation en site sous-cutané peut entraîner une douleur modérée. Des complications post-opératoires sont à envisager : infection, notamment en cas de rejet du matériel implanté, ou réouverture de la plaie.
Devenir
Après l'implantation, les animaux de chaque lot correspondant à un temps expérimental donné seront mis à mort à l’issu du temps expérimental. Des analyses histologiques seront ensuite réalisées sur ces animaux.
Remplacement
La cytotoxicité des matériaux utilisés aura au préalable était évaluée in vitro selon les recommandations de la norme NF EN ISO 10993. En suivant, les produits destinés à être implantés chez l'humain doivent nécessairement être testés chez l'animal avant les essais cliniques. Les matériaux doivent être d'abord testés dans modèle de rat, et si les résultats obtenus sont satisfaisants, d'autres essais seront envisagés permettant de valider tous les aspects nécessaires à une future application chez l'Homme. Ces différentes phases ne peuvent être remplacées actuellement dans le processus de validation d'un nouveau dispositif médical.
Réduction
Ne seront testés in vivo que les matériaux ayant démontré une absence de cytotoxicité in vitro , et une seule lignée de rats sera utilisée. De plus, afin de réduire le nombre de rat, 8 échantillons seront implantés par animal. Enfin, la même lignée de rats que celle déjà utilisée au sein de notre unité est choisie, afin de diminuer le nombre de conditions à évaluer et d'éviter l'ajout de rats supplémentaires pour cette évaluation.
Raffinement
Pour réduire l’angoisse : une période d’adaptation d’une semaine sera respectée avant le début des expérimentations. Une cage après l’autre sera amenée à la salle de chirurgie, séparée de la zone d’hébergement des animaux pour éviter toutes sources de stress des animaux opérés et des animaux à opérer. Avant la chirurgie, les animaux recevront des analgésiques afin de prévenir toute douleur lors de l'opération. Ils seront ensuite anesthésiés dans une chambre à induction puis maintenue anesthésiés au masque avec de l'isoflurane. Après la chirurgie, chaque rat se réveille dans une cage à part pour éviter le contact avec des congénères non anesthésiés. Après le réveil complet, le rat sera réintégré à sa cage d’origine. Les animaux seront ensuite observés sur une semaine. Toutes les modifications de comportement et d’aspect seront consignées dans un fichier informatique par les personnes impliquées directement dans ce projet. Une grille de score basée sur des critères significatifs sera mise en place et des points limites adaptés seront utilisés. Un arbre décisionnel sera suivi pour déterminer la conduite à tenir, incluant la mise à mort en fonction de critères d'arrêt de souffrance définis. Un raffinement est également mis en place lors de l'hébergement : les animaux sont avec leurs congénères, en présence de litière en copeaux de peupliers AVEC ENRICHISSEMENT EN TUNNEL DE POLYPROPYLENE, ainsi que des bâtons à ronger qui sont régulièrement mis dans les cages.
Choix des espèces
Le Rat est une espèce adaptée à la première étape de validation chez l'animal de matériaux destinés au traitement des pertes osseuses. Le rat permet de valider la biocompatibilité du produit. De plus, il est utilisé dans de nombreuses études. En cas de résultats satisfaisant et supérieurs à ce qui est obtenu avec les produits de référence actuellement sur le marché, une validation chez le gros animal sera nécessaire. Des rats adultes de 9 à 10 semaines, d'un poids d'environ 350 g seront utilisés. En effet les animaux utilisés doivent avoir achevé leur développement et leur croissance.