Recherche appliquée

1 100 souris reproduisant l'atteinte pulmonaire de la mucoviscidose vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par le nez, sous anesthésie, une molécule bactérienne qui déclenche une inflammation des poumons, subissent des injections dans la veine de la queue sur animal éveillé, et une canule est placée dans leur trachée pour mesurer le flux d'air. Pendant 72 heures, l'air de leurs cages est modifié pour reproduire un pic de pollution parisien. Le porteur écrit que "seule l'expérimentation sur des animaux vivants" permet d'étudier ces interactions entre organes, tout en indiquant que les travaux préalables du laboratoire ont porté sur des cellules in vitro.

Objectifs

La mucoviscidose est une maladie génétique caractérisée par une vulnérabilité à l’infection par les microbes de l’environnement qui induisent une forte inflammation des poumons, dégradant progressivement cet organe et conduisant à l’insuffisance respiratoire. Une des raisons pouvant participer à la gravité de la réponse inflammatoire est une mauvaise production par ces patients de molécules aidant à résoudre l’inflammation et qui sont appelées SPMs. Une autre possibilité est que l’exposition à la pollution de l’air aggrave l’inflammation. Nous étudierons la production des SPMs dans un contexte de pollution de l’air sur un modèle murin mimant l’infection pulmonaire des patients atteints de mucoviscidose. Nous évaluerons aussi si les SPMs peuvent être utilisés pour traiter l’inflammation. Nous utiliserons ici des souris qui reproduisent des symptômes proches des patients vivant avec la mucoviscidose au niveau du poumon pour que notre modèle soit réaliste. Nous nous intéresserons aussi aux différences d’inflammation et de production des SPMs chez les souris mâles et femelles car il existe des différences de l’atteinte respiratoire entre patients et patientes encore inexpliquées.

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme de ce projet sont : - une meilleure compréhension de l’impact de la pollution de l’air sur des souris dont l’atteinte mime la mucoviscidose des êtres humains, - une preuve de concept que les SPM pourrait traiter l’inflammation des poumons dans la mucoviscidose. - mieux comprendre les différences de gravité de la maladie respiratoire selon le sexe A long terme, les résultats de cette étude pourront être utilisés pour développer de nouvelles recommandations et de nouveaux traitements de l’inflammation des poumons pour les patients vivant avec la mucoviscidose.

Procédures

Les animaux seront soumis à des traitements administrés en moins d’une minute soit par injection dans la veine de la queue soit par aspiration de gouttes de solution par le nez. Conformément aux normes éthiques en vigueur, l’injection dans la veine de la queue sera réalisée sur souris éveillées, et l’administration intranasale sur les souris anesthésiées. Enfin pour mesurer la fonction pulmonaire des souris, celles-ci seront complètement anesthésiées et une canule sera placée (geste prenant moins d’une minute) dans leur trachée pour mesurer le flux d’air (la durée de la mesure est d’une dizaine de minutes). Pour induire un environnement pollué, l’air circulant dans les cages des souris sera modifié pour avoir une composition similaire à celle de Paris au cours d’un pic de pollution, cette exposition durera 72 heures.

Impact sur les animaux

Les souris exposées 3 jours à la pollution atmosphérique peuvent présenter des signes de stress liés au changement de lieu d’hébergement et au bruit environnant. Les animaux seront hébergés par 2 à 5 dans une cage identique à celle de leur environnement habituel afin de limiter leur stress. Les SPM sont des molécules produites par notre corps de façon naturelle. Elles ne sont pas toxiques et, à ce jour, aucun effet secondaire n’a été observé chez les souris qui en ont reçus. Nous ne prévoyons donc pas d’effets indésirables suite à l’utilisation de SPM. De plus, certaines études montrent que les SPM pourraient avoir un effet anti-douleur. Pour provoquer l’inflammation des poumons, nous administrons une solution d’une molécule produite par les bactéries. Cette molécule ne peut pas causer d’infection du poumon mais elle agit comme un signal qui alerte les défenses du corps. Le résultat est une réaction inflammatoire dans le poumon. Cela peut entraîner une perte de poids chez la souris ainsi qu’un inconfort temporaire et une diminution de l’activité. Cependant, aucune douleur importante ou stress fort n’est attendu. Les animaux seront tout de même suivis quotidiennement pour s’assurer de l’absence d’effet néfaste inattendu. Ils seront pesés et observés chaque jour pour détecter tout signe de malaise. Si nécessaire, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans la cage des souris pour faciliter leur alimentation et leur hydratation. Si un animal se trouve dans un état grave imprévu, celui-ci sera mis à mort pour éviter toute souffrance.

Devenir

L’ensemble des animaux utilisés ici sera mis à mort à la fin des protocoles pour un prélèvement et une analyse de la réponse inflammatoire dans le poumon.

Remplacement

Nous étudions ici un modèle complexe qui repose sur l’interaction entre plusieurs types de cellules, entre différents organes, et le déplacement de cellules d’un organe à un autre. Nous voulons aussi regarder des différences entre mâles et femelles. Malheureusement, à l’heure actuelle seule l’expérimentation sur des animaux vivants permet l’étude de ces différents éléments. Cette étude vient compléter les études préalables de notre laboratoire qui ont été réalisées sur des modèles de cellules in vitro.

Réduction

Afin d’utiliser le moins d’animaux possible, nous avons étudié les publications préexistantes et pris en compte leurs résultats pour construire notre projet. Un certain nombre d’expériences ont aussi été effectuées au préalable sur des modèles de cellules pour sélectionner un nombre réduit de SPM à tester dans notre projet sur la souris. Enfin, une étude statistique a été menée pour choisir le nombre minimal de souris à utiliser tout en étant sûr de pouvoir observer toute différence pertinente entre nos groupes de souris.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans un environnement adapté où elles disposeront de nourriture et eau à volonté. Les éléments nécessaires pour former un nid et une maisonnette seront fournis dans la cage pour assurer le bien-être des souris. Autant que possible, les souris seront au contact d’une seule personne pour leur permettre de s’habituer à elle et de diminuer leur stress. Le personnel qui manipule les souris est formé pour assurer leur bien-être et leur éviter toute souffrance. Au cours des expériences, les souris seront pesées et observées pour détecter tout mal-être le plus tôt possible et agir en conséquence. Si besoin de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans la cage de la souris. Si un animal se trouve dans un état grave imprévu, celui-ci sera mis à mort pour éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi pour plusieurs raisons : Les souris se reproduisent rapidement, ce qui permet d’avoir assez d’animaux pour l’étude en peu de temps. Le fonctionnement des poumons et du système immunitaire chez la souris est proche de celui de l’humain, ce qui rend les résultats plus utiles pour la recherche médicale. Notre équipe est déjà formée et expérimentée dans le travail avec les souris de laboratoire. C’est l’animal pour lequel on dispose du plus grand nombre d’outils scientifiques pour étudier les tissus, l’inflammation et les SPMs. Cette lignée de souris génétiquement modifiées est la seule à reproduire le phénotype pulmonaire des personnes atteintes de mucoviscidose.

Ni réutilisées ni replacées parce que la colite qu'on leur inflige modifie durablement leur état biologique, 686 souris sont tuées à l'issue pour prélever intestin, sang et organes lymphoïdes. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'inflammation du côlon est provoquée par le DSS ou par instillation intrarectale de TNBS sous anesthésie, avec perte de poids allant jusqu'à 15 à 20 %, diarrhée parfois sanglante, pelage ébouriffé et posture voûtée pendant cinq à sept jours. Le porteur cite organoïdes, organes sur puce et modèles informatiques, puis les écarte au motif qu'aucun ne reproduit à la fois le système immunitaire, la paroi intestinale et le microbiote.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, comme la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn, provoquent une inflammation durable du côlon et altèrent fortement la qualité de vie des patients. Les traitements actuels ne sont pas efficaces chez tous les patients, ce qui rend nécessaire le développement de nouvelles solutions thérapeutiques. Ce projet vise à développer puis utiliser un modèle d’inflammation du côlon chez la souris afin de tester de nouvelles molécules ou formulations ayant un effet anti-inflammatoire. Dans un premier temps, deux méthodes d’induction de l’inflammation, le DSS et le TNBS, seront comparées chez des souris non transgéniques afin de sélectionner le modèle le plus adapté et reproductible. Une fois le modèle établi, il sera appliqué à des souris transgéniques exprimant une protéine humaine impliquée dans l’inflammation intestinale, afin de mieux se rapprocher de la maladie humaine et d’évaluer des traitements ciblés. Sur la durée du projet, un nombre limité de nouvelles molécules sera testé de manière progressive. L’évolution de l’inflammation sera suivie par des méthodes d’imagerie non invasives, permettant de limiter les manipulations et de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Bénéfices attendus

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), comme la colite ulcéreuse ou la maladie de Crohn, sont des maladies de longue durée qui altèrent fortement la qualité de vie. Les traitements actuels ne fonctionnent pas chez tous les patients et peuvent perdre leur efficacité avec le temps, ce qui souligne la nécessité de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. À court terme, ce projet permettra de mieux comprendre comment l’inflammation du côlon s’installe et évolue dans des modèles expérimentaux chez la souris. Il apportera des informations claires sur le rôle d’une protéine impliquée dans l’inflammation intestinale, l’IL-26, en comparant des souris classiques et des souris modifiées pour se rapprocher de la situation humaine. Le projet permettra également d’identifier les conditions les plus adaptées pour tester de nouveaux traitements (choix du modèle, doses, schémas d’administration). L’utilisation d’une méthode d’imagerie non invasive permettra de suivre l’évolution de l’inflammation chez un même animal, d’améliorer la qualité des données et de réduire le nombre d’animaux utilisés. À long terme, ce projet ne vise pas à aboutir directement à un traitement pour les patients, mais à générer des données solides permettant d’orienter le développement de nouvelles molécules ou formulations dans des projets ultérieurs. Les résultats positifs serviront de base à des études précliniques plus avancées et à des collaborations industrielles ou académiques. En cas de résultats négatifs ou non concluants, les données produites permettront d’écarter certaines approches, d’optimiser les modèles expérimentaux et d’éviter des essais inefficaces par la suite. Ainsi, quels que soient les résultats, le projet contribuera à faire progresser la recherche et à guider plus efficacement le développement de futurs traitements contre les MICI.

Procédures

Au cours des procédures expérimentales, les animaux peuvent présenter des effets transitoires liés aux manipulations et aux modèles d’inflammation étudiés. Chaque animal pourra faire l’objet d’un prélèvement sanguin unique au niveau d’une veine du cou. Ce prélèvement sera réalisé sous anesthésie générale légère à l’isoflurane, un gaz anesthésiant couramment utilisé chez la souris. La durée d’anesthésie sera courte, comprise entre 5 et 15 minutes. Les animaux pourront également subir jusqu’à trois séances d’imagerie non invasive sur une période maximale de 48 heures. Ces séances, d’une durée de 5 à 15 minutes chacune, seront réalisées après l’administration d’un marqueur fluorescent, soit par injection dans une veine, soit par voie orale. Cette technique permet de suivre l’évolution de l’inflammation sans chirurgie ni douleur durable. Pour les animaux recevant le produit TNBS, l’induction de l’inflammation du côlon sera réalisée par administration intra-rectale, sous anesthésie générale à l’isoflurane afin d’éviter toute douleur ou stress. La durée d’anesthésie sera également limitée à 5 à 15 minutes. Les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure expérimentale concernée, après la dernière séance prévue pour chaque animal. La mise à mort sera réalisée par une méthode réglementaire et adaptée à l’espèce, sous anesthésie profonde, afin d’éviter toute souffrance.

Impact sur les animaux

Les procédures prévues reposent sur l’induction contrôlée d’une inflammation colique chez la souris par administration de DSS (dextran sulfate de sodium) ou de TNBS (trinitrobenzènesulfonique). Ces modèles bien établis reproduisent certains aspects physiopathologiques des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Les effets indésirables attendus sont principalement liés à la réponse inflammatoire locale et systémique ainsi qu’aux manipulations expérimentales. Dans le modèle DSS, les signes cliniques typiques incluent une perte de poids progressive (jusqu’à 15–20 %), une diarrhée plus ou moins marquée, parfois teintée de sang, et une diminution transitoire de la prise alimentaire. Un aspect ébouriffé du pelage, une posture voûtée et une baisse modérée de l’activité peuvent également être observés. Ces symptômes apparaissent entre le 3ᵉ et le 6ᵉ jour après l’induction et régressent généralement 7 à 10 jours après l’arrêt du DSS. Dans le modèle TNBS, l’instillation intra-rectale sous anesthésie peut induire une inflammation plus aiguë, avec douleurs abdominales modérées, réduction temporaire de la mobilité et diarrhée hémorragique dans certains cas. Ces signes surviennent dans les 24 à 48 h suivant l’administration et persistent 3 à 5 jours avant amélioration. Une surveillance rapprochée permettra d’adapter les soins (hydratation, réchauffement, arrêt anticipé ou euthanasie) en cas de souffrance excessive. Les injections sous-cutanées ou intrapéritonéales d’anticorps monoclonaux entraînent des nuisances mineures et transitoires (gêne au point d’injection). L’imagerie par fluorescence (NIR-dextran) est non invasive et sans effet délétère attendu. Les effets globaux sont donc qualifiés de modérés selon la classification réglementaire. L’inconfort est limité à la phase aiguë d’inflammation (environ 5 à 7 jours).

Devenir

À la fin des procédures, la majorité des animaux seront mis à mort de manière rapide et indolore, sous anesthésie, afin de pouvoir prélever les tissus nécessaires aux analyses (intestin, sang, organes lymphoïdes, etc.). Ces prélèvements sont indispensables pour observer au microscope l’état de la paroi intestinale, mesurer précisément l’inflammation et étudier l’effet des traitements sur les cellules et les molécules impliquées dans la maladie. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées sur des animaux vivants et sont essentielles pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. Les animaux ne seront ni réutilisés dans d’autres expériences, ni replacés, car la maladie induite et les traitements reçus modifient durablement leur état biologique et ne permettent pas une réutilisation dans des conditions éthiques et fiables.

Remplacement

La stratégie de remplacement a été soigneusement examinée avant la conception de ce projet. Il existe des méthodes alternatives, comme des cellules cultivées en laboratoire, des mini-tissus (organoïdes), des systèmes de type « organes sur puce » et des modèles informatiques. Ces outils permettent de mieux comprendre certains mécanismes de l’inflammation de l’intestin, mais ils ne reproduisent pas le fonctionnement d’un organisme entier. Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin sont en effet très complexes. Elles impliquent à la fois le système immunitaire, la paroi de l’intestin, les bactéries présentes dans le tube digestif et d’autres systèmes du corps. Aujourd’hui, aucune méthode uniquement en laboratoire ne permet de prendre en compte toutes ces interactions en même temps. L’objectif du projet est de tester de nouveaux traitements dans des modèles de colite chez la souris, qui reproduisent les mécanismes principaux de la maladie chez l’être humain. Pour évaluer ces traitements, il faut observer non seulement ce qui se passe au niveau des tissus et des molécules, mais aussi l’état général de l’animal, sa perte de poids et sa réaction inflammatoire globale. Cela n’est possible que chez un organisme vivant. Les souris choisies sont les modèles les plus pertinents pour ce type de recherche, car elles permettent de reproduire de façon contrôlée les caractéristiques essentielles de la maladie humaine. L’utilisation d’animaux reste donc nécessaire pour déterminer les bonnes doses, tester d’éventuelles associations de traitements et vérifier leur efficacité. Ce recours à l’animal s’inscrit dans une démarche stricte visant à limiter son utilisation autant que possible, à réduire le nombre d’animaux et à améliorer leurs conditions de prise en charge.

Réduction

Le nombre de souris prévu dans ce projet a été calculé avec des méthodes statistiques, afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en obtenant des résultats fiables. La variabilité des modèles de colite utilisés, la perte de poids, le niveau d’inflammation et l’effet attendu des traitements testés ont été pris en compte. Les expériences sont conçues pour tirer un maximum d’informations de chaque animal. Par exemple, une technique d’imagerie par fluorescence (NIR-dextran), non invasive, permet de suivre au cours du temps l’état de l’intestin et l’évolution de l’inflammation chez les mêmes souris. Cela évite de devoir en sacrifier davantage à différentes étapes et limite la création de groupes supplémentaires. Les résultats d’imagerie seront associés à d’autres mesures cliniques et d’analyse des tissus, afin de valoriser au mieux chaque animal inclus. Avant les grandes études, de petites études pilotes seront réalisées pour ajuster les doses de produits utilisés (DSS, TNBS et molécules testées). Cela permet de réduire le risque d’échec par la suite et d’éviter de devoir répéter les expériences. Les données recueillies serviront également à affiner les protocoles pour les étapes suivantes, toujours dans le but de limiter le nombre d’animaux. Les tissus prélevés à la fin des études seront utilisés pour des analyses complémentaires ou partagés avec d’autres projets, afin de ne pas devoir recréer les mêmes modèles de maladie. Enfin, des critères d’arrêt précoces, une surveillance clinique attentive et des examens répétés par imagerie permettront de réduire au maximum la durée de la maladie chez les animaux et d’éviter le recours à des animaux supplémentaires. L’ensemble de ces mesures vise à trouver un équilibre entre la qualité scientifique des résultats et le respect de principes éthiques stricts, en veillant à ce que chaque animal contribue de manière significative aux objectifs du projet.

Raffinement

Dans ce projet, les chercheurs mettent en place plusieurs mesures pour limiter au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. Les produits utilisés pour provoquer l’inflammation de l’intestin sont administrés à la dose la plus faible possible permettant de mener l’étude. Les animaux sont observés chaque jour afin de vérifier leur état de santé. Si un animal perd trop de poids, paraît très affaibli, ne mange presque plus, se déplace très peu ou montre des signes de détresse, il est retiré immédiatement de l’expérience et euthanasié de façon rapide et indolore. Les injections et manipulations sont réalisées par un personnel formé, pour que les gestes soient précis et les moins traumatisants possibles. Les animaux sont hébergés dans de bonnes conditions (température adaptée, environnement enrichi, vie en groupe lorsque c’est possible), avec un accès permanent à l’eau et à la nourriture, sauf exception clairement justifiée. Les chercheurs utilisent aussi des techniques d’imagerie non invasives pour suivre l’évolution de l’inflammation chez les mêmes animaux, ce qui évite des interventions plus lourdes et limite le nombre d’animaux sacrifiés. L’ensemble des procédures est régulièrement réévalué afin d’améliorer en continu les pratiques et de respecter au mieux le bien-être animal.

Choix des espèces

La souris a été choisie pour sa physiologie immunitaire bien caractérisée et sa grande sensibilité aux modèles expérimentaux de colite, en particulier après exposition au DSS ou au TNBS, qui reproduisent fidèlement les mécanismes inflammatoires observés chez l’humain. La souche C57BL/6 est la plus couramment utilisée pour ces modèles, offrant une référence robuste et reproductible pour l’évaluation de nouvelles molécules. L’emploi de souris transgéniques exprimant la cytokine humaine IL-26 permet d’explorer le rôle spécifique de cette voie dans la physiopathologie colique et d’évaluer la pertinence de cibles thérapeutiques humaines. Ces modèles combinent pertinence biologique et transposabilité clinique, tout en minimisant le recours à d’autres espèces plus sensibles ou complexes à gérer. Leur taille, leur cycle de reproduction court et la disponibilité d’outils analytiques adaptés en font le choix le plus approprié pour atteindre les objectifs scientifiques du projet tout en respectant le bien-être animal. Les expériences seront réalisées exclusivement sur des souris adultes de souche C57BL/6 et sur des souris transgéniques exprimant la cytokine humaine IL-26, âgées de 8 à 12 semaines, correspondant à un stade physiologique stable et à une pleine maturité du système immunitaire. Ce choix permet de limiter la variabilité biologique liée au développement et d’assurer une réponse homogène aux inducteurs de colite (DSS ou TNBS) ainsi qu’aux traitements testés. Les souris plus jeunes, non sevrées ou en croissance, présentent une immaturité immunitaire et métabolique pouvant modifier la réponse inflammatoire et la tolérance aux traitements, tandis que les animaux âgés développent des altérations spontanées du microbiote et des tissus intestinaux susceptibles de biaiser les résultats. Aucune procédure ne sera réalisée sur des embryons, des fœtus ou des individus en gestation. Le recours à des animaux adultes garantit donc la pertinence scientifique, la comparabilité inter-groupes et le respect du bien-être animal.

Perfusés jusqu'à six heures par un cathéter implanté dans la veine saphène, ou gavés, 1 800 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont placés au préalable jusqu'à quinze minutes dans une enceinte à 38 degrés pour faciliter l'injection, et tous sont tués après un prélèvement sanguin terminal suivi d'une nécropsie. L'objet est de vérifier la tolérance de produits avant les études d'efficacité, en identifiant les doses qui provoquent apathie, prostration, convulsions, œdème sévère ou perte de poids d'au moins 20 %. Le dispositif d'accès vasculaire est présenté comme un progrès du raffinement parce qu'il évite six heures de contention en tunnel, alors qu'il permet précisément des perfusions de six heures.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer la tolérabilité de produits administrés par voie orale et intraveineuse chez le rat, en administration aiguë et répétée. L'objectif est de déterminer les effets potentiels sur les paramètres cliniques, le comportement, la mortalité, et les organes cibles, afin de garantir la sécurité des composés avant leur développement.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à sécuriser les études d’efficacité en amont, en évaluant la tolérabilité des produits testés chez le rat, en administration aiguë et répétée. Lors de ces études, il est essentiel de s’assurer que les doses administrées ne génèrent pas d’effets indésirables non anticipés. L’objectif est de mieux cibler les plages de doses à utiliser dans les protocoles d’efficacité, en identifiant les seuils de tolérance et les éventuelles toxicités liées à la formulation ou à la voie d’administration. Cette approche permet d’éviter l’exposition inutile des animaux à des doses potentiellement délétères, tout en garantissant la robustesse des résultats obtenus dans les études suivantes. Les données générées permettront également d’optimiser les plans expérimentaux, de réduire les risques d’échec liés à une mauvaise tolérabilité, et de renforcer la qualité des dossiers réglementaires associés au développement des produits. Justification scientifique et éthique de l’usage du VAB : L’utilisation du VAB permet une administration intraveineuse sans contention physique prolongée. En méthode traditionnelle, les animaux doivent être maintenus dans un tunnel de contention pendant au maximum 6 heures, ce qui génère un stress important. Ce stress est d’autant plus problématique dans les protocoles à administration répétée, où il serait réitéré plusieurs fois. Avec le VAB, les animaux restent libres de leurs mouvements, ce qui réduit significativement le stress et améliore leur bien-être. Cette approche est donc scientifiquement pertinente pour garantir des données fiables, et éthiquement justifiée pour respecter les principes du raffinement dans l’expérimentation animale.

Procédures

Dans le cadre des administrations intraveineuses, deux modalités sont envisagées : Administration aiguë : chaque injection est réalisée sur un animal vigile après passage dans une enceinte thermostatée à 38°C avec une durée maximale de 15 minutes, la durée de l'administration est courte, généralement comprise entre 5 et 10 secondes. Perfusion lente : l’administration est réalisée sur animaux implantés , qui leur permettent d'avoir une totale liberté de mouvement, ell peut durer jusqu’à 6 heures. Pour les procédures par gavage, les administrations sont brèves, inférieures à 10 secondes. Fin de procédure : À l’issue des expérimentations, les animaux seront anesthésiés profondément. Un prélèvement sanguin terminal sera alors réalisé, suivi d’une euthanasie sans réveil, conformément aux recommandations éthiques et réglementaires en vigueur.

Impact sur les animaux

Les études de tolérabilité visent à identifier les effets délétères liés à l’administration de composés, immédiats ou après expositions répétées. Bien que supposés bien tolérés, certains effets peuvent survenir selon la dose, la formulation ou la voie d’administration. Les injections IV peuvent provoquer des réactions locales (érythème, œdème, hématome, croûte), notamment en cas d’irritation liée au véhicule. Les administrations orales peuvent entraîner des troubles digestifs, une baisse de consommation alimentaire ou une perte de poids. Ces effets seront surveillés quotidiennement. Le traitement est interrompu en cas de signes cliniques sévères : apathie, prostration, yeux fermés, décubitus latéral, piloérection, tremblements, convulsions, œdème sévère, perte de poids ≥ 20 %, ou absence d’alimentation (liste non exhaustive). Ces critères permettent de limiter la douleur sans compromettre les résultats. Lors d’administrations répétées, l’évolution clinique sera suivie avec attention. Une adaptation des doses ou de la durée pourra être envisagée en cas de toxicité. Les injections seront réalisées dans les règles de l'art. La couleur de la peau (pâleur) et le comportement seront observés le lendemain pour détecter toute atteinte physiologique. Afin de faciliter l’injection IV et éviter le passage en périveineux, les animaux sont placés au maximum 15 minutes dans une enceinte thermostatée à 38°C. Chez les animaux porteurs de VAB implantés à la veine saphène, des effets indésirables spécifiques peuvent apparaître : réactions locales (érythème, œdème, croûtes, hématomes), gêne ou douleur à la manipulation, risque d’infection ou de déplacement du dispositif. Une surveillance renforcée est mise en place : inspection du site, suivi du comportement et de l’état général, mesures d’hygiène strictes. Toute anomalie est évaluée par le porteur de projet ou le personnel du bien-être animal, et peut conduire au retrait de l’animal de l’étude.

Devenir

À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort de manière éthique et réglementaire, après un prélèvement sanguin terminal réalisé sous anesthésie profonde. Ce prélèvement a pour objectif de détecter d’éventuels effets indésirables ou toxiques du composé testé, notamment par l’analyse de biomarqueurs spécifiques. Par ailleurs, une nécropsie sera systématiquement effectuée afin d’identifier, par observation macroscopique, d’éventuelles altérations des organes cibles, permettant ainsi une évaluation complète de l’impact du traitement.

Remplacement

Avant toute expérimentation in vivo, plusieurs tests de toxicité cellulaire sont réalisés afin d’évaluer la cytotoxicité, les effets mutagènes et les interactions métaboliques des composés. Ces tests permettent d’éliminer les produits les plus toxiques et d’éviter des expositions trop fortes ou inappropriées chez l’animal. Cependant, malgré leur utilité, ces modèles in vitro présentent des limites importantes. Ils ne permettent pas de reproduire les interactions complexes d’un organisme entier, notamment les effets systémiques, les réactions immunitaires, les compensations physiologiques ou les effets secondaires liés à la voie d’administration. De plus, certains effets indésirables ne se manifestent qu’en contexte multi-organes ou après plusieurs jours d’exposition. C’est pourquoi l’expérimentation animale reste indispensable pour confirmer la tolérabilité des produits dans des conditions proches de leur usage clinique. Les études in vivo permettent de valider les doses sûres, d’identifier les seuils de toxicité, et de garantir la sécurité des protocoles d’efficacité à venir.

Réduction

Les études de tolérabilité sont conçues pour être réalisées sur un nombre restreint d’animaux, tout en permettant une évaluation fiable des effets potentiels des produits testés. Chaque protocole est optimisé pour limiter les effectifs tout en assurant la détection des signes de toxicité, qu’ils soient liés à la dose, à la formulation ou à la voie d’administration. Ces études préalables permettent d’éviter l’administration de doses potentiellement toxiques dans les protocoles d’efficacité, qui mobilisent un nombre d’animaux plus important. En ciblant précisément les plages de tolérance, elles contribuent à réduire significativement le nombre total d’animaux utilisés dans l’ensemble du programme de recherche. Cette approche est pleinement conforme au principe de réduction des 3R, en évitant les expositions inutiles, les traitements non pertinents, et en affinant les plans expérimentaux grâce aux données obtenues. Les effectifs sont définis à partir de données bibliographiques, de tests in vitro, et d’études pilotes, permettant le calcul de puissance statistique et l’ajustement des groupes en fonction de la réponse observée.

Raffinement

Les études de tolérabilité ont été conçues pour limiter au maximum les nuisances potentielles tout en garantissant la qualité des observations. Contrairement aux modèles pathologiques, les produits testés dans ce protocole ne sont pas censés induire de symptômes sévères. Toutefois, des effets liés à la formulation, à la voie d’administration ou à la dose peuvent survenir et seront surveillés avec attention. Ces signes sont considérés comme des atteintes de points limites et entraînent la mise à mort éthique de l’animal concerné, ainsi qu’un réajustement des paramètres expérimentaux (dose, durée, formulation). Les procédures sont réalisées avec un hébergement adapté au bien-être des animaux, incluant un enrichissement du milieu (tunnels, éléments de nidification, bois à ronger). Les injections intraveineuses sont réalisées, dans les règles de l’art, afin d’éviter les réactions locales ou les erreurs techniques. Les observations sont renforcées dans les heures suivant l’administration, et une attention particulière est portée à la couleur de la peau et au comportement des animaux. Ce niveau de raffinement permet de garantir une expérimentation respectueuse, conforme aux exigences réglementaires et éthiques, tout en assurant la fiabilité des données générées.

Choix des espèces

Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour de reproduire de manière fiable les mécanismes physiopathologiques ciblés par nos produits, notamment ceux liés à des atteintes systémiques ou métaboliques. Les modèles murins, tels que le rat et la souris, présentent une homologie génétique d’environ 90 % avec l’humain, ce qui en fait des espèces de choix dans les études pharmacologiques. Le choix d’utiliser à la fois le rat et la souris repose sur le fait que nos modèles d’efficacité ont été développés spécifiquement dans l’une ou l’autre de ces espèces. Il est donc pertinent, avant de procéder aux tests d’efficacité, de vérifier l’innocuité des produits dans l’espèce concernée par le modèle utilisé. Les animaux utilisés dans ce projet seront des individus jeunes adultes, âgés de 8 à 10 semaines. Ce stade de développement est choisi car il correspond à une période où les animaux sont suffisamment matures sur le plan immunologique et physiologique, tout en étant encore dans une phase de stabilité métabolique. Cela permet d’obtenir des données fiables et reproductibles sur la tolérabilité des composés testés, tout en limitant les biais liés à l’âge ou au développement.

Chaque macaque subit une trentaine d'anesthésies, autant de prélèvements sanguins et jusqu'à quatre ponctions de moelle osseuse. Ils sont 16 au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et reçoivent jusqu'à cinq injections de vaccins candidats contre l'hépatite C. Le dossier déclare les 16 animaux réutilisés, le porteur indiquant qu'ils pourraient être gardés en vie sur avis vétérinaire et versés à d'autres projets, alors que les anesthésies et prélèvements répétés peuvent entraîner anémie, hématomes, infections cutanées et pertes de poids. Le choix du macaque tient, selon le porteur, à sa proximité avec l'humain, qui permettrait une transposition "rapide et fiable" des résultats au design des essais cliniques.

Objectifs

L’infection par le virus de l’hépatite C (VHC) est une menace importante pour la santé publique mondiale, avec environ 300 000 décès chaque année. Le VHC entraîne 1,5 million de nouvelles infections par an, et en l’absence de vaccin, ce chiffre continue d’augmenter malgré l’existence de traitements antiviraux très efficaces. C’est pourquoi le développement d’un vaccin est essentiel. Le VHC est très variable. Cela rend difficile la création d’un vaccin capable de protéger contre tous les sous-types du virus. Les anticorps neutralisants à large spectre (bNAbs) ont la capacité de bloquer l’infection par un grand nombre de souches différentes du VHC. Dans le cadre d’un projet international, nous cherchons donc à développer un vaccin contre le VHC capable d’induire de tels anticorps. Pour cela, plusieurs stratégies sont utilisées. Les antigènes vaccinaux sont conçus en combinant une approche basée sur l’analyse de la structure des protéines du virus et une modélisation informatique. Le but du présent projet est d’étudier l’innocuité et l’immunogénicité des meilleurs candidats vaccins, identifiés in-vitro dans un modèle pré-clinique proche de l’humain.

Bénéfices attendus

A court terme, les résultats permettront de justifier la poursuite du développement du ou des meilleurs candidats vaccins en essais cliniques chez l’humain. A long terme, un vaccin contre le VHC permettrait d’épargner de nombreuses vies. Il permettrait aussi de diminuer l’impact économique lié à la prise en charge thérapeutique actuelle de l’infection par le VHC qui est très coûteuse.

Procédures

Les interventions prévues dans ce projet sont : - Administration de vaccins candidats (jusqu’à 5 administrations, tous les animaux, 10 minutes) - Anesthésie des animaux (30 fois environ, 30 minutes, tous les animaux) - Prélèvements sanguins sur animaux anesthésiés (30 fois environ, 5 minutes, tous les animaux) - Prélèvements de moelle osseuse sur animaux anesthésiés (4 fois maximum, 10 minutes, tous les animaux)

Impact sur les animaux

Nuisances suite à l’administration des vaccins (peu attendu) : Réaction locale, suppuration, démangeaisons/douleur, légère fièvre transitoire dans les heures/jours suivant l’injection. Nuisances suite aux prélèvements de sang, de moelle osseuse et aux anesthésies répétées : Dysorexies avec plus ou moins des pertes de poids mineures, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement.

Devenir

Dans ce projet, les modèles animaux n’étant pas infectés, ils pourraient être gardés en vie sur avis vétérinaire et être inclus dans d’autres projets compatibles avec la procédure suivie dans notre projet, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Remplacement

L’étude et la caractérisation de la réponse immunitaire induite lors de l’immunisation avec les vaccins candidats contre l’infection par le VHC nécessitent l’exploration de fonctions physiologiques et d’interactions à l’échelle de l’organisme entier. A ce jour, il n’existe pas d’alternative à l’utilisation d’animaux. Les systèmes expérimentaux in silico et in vitro basés sur l’étude de cellules ou de tissus isolés ne permettent pas de construire des modèles pertinents de la mise en place et de la persistance de la réponse immunitaire induite par une vaccination.

Réduction

Le nombre d’animaux dans chaque groupe est réduit au minimum nécessaire avec 4 animaux par groupes. Comme il s’agit d’une étude de preuve de concept, il est prévu de détecter uniquement des différences importantes entre les groupes. L’effectif de 4 animaux permettra 1) de s’assurer qu’un vaccin est immunogène tout en prenant en compte une certaine variabilité interindividuelle et 2) de comparer la réponse immunitaire induite par les différents vaccins candidats au moyen de tests statistiques non paramétriques adaptés aux petits échantillons

Raffinement

Anesthésies: Toutes les interventions seront réalisées sous anesthésie. En cas de problème de prises alimentaires suite aux anesthésies répétées, une diversification /complémentation alimentaire sera instaurée (fruits secs, fruits frais additionnels etc.). Prélèvements: Les volumes de sang et de moelle osseuse prélevés seront réduits au minimum. Si apparition de réaction locale un traitement symptomatique pourra être instauré. Immunisation: . Mise en place de point limite pour limiter au maximum la douleur suite aux immunisations.

Choix des espèces

Le macaque est le modèle animal retenu car il est le plus efficace pour prédire la sécurité des vaccins et la réponse immunitaire induite par les vaccins chez l’humain. Sa proximité avec l’humain permet en effet une transposition rapide et fiable des résultats au design des études cliniques. La réponse immunitaire induite chez l’humain adulte par la vaccination est un des paramètres majeurs étudié dans ce projet, nous utiliserons donc des animaux disposant d’un système immunitaire mature âgés d’au moins 3 ans.

4 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection intraveineuse unique d'un mélange de vecteurs viraux, puis quatre prélèvements sanguins sur animal vigile, douze pesées et sept prises de température rectale, parfois en chaise de contention. La mise à mort sert à prélever le cœur, le foie, le muscle et le cerveau pour y mesurer la diffusion des vecteurs. Le porteur affirme que ces études de biodistribution sont "indispensables" au développement des thérapies géniques et que seul le primate fournit des données transposables à l'humain.

Objectifs

Les virus adéno-associés recombinants (AAV) sont devenus la référence pour le transfert génique, en raison de leur efficacité, de leur sécurité favorable, de la capacité de production à grande échelle et de leur capacité à assurer une réponse durable. Cependant, certains défis, tels que le coût élevé de fabrication, parfois une faible spécificité pour la cible d’intérêt et les barrières immunitaires, continuent de limiter l’accessibilité, l’efficacité et la sécurité des traitements. De plus, la population est régulièrement exposée aux AAV. Elle peut ainsi développer une immunité dirigée contre ces AAV via la production d’anticorps neutralisants capable de détruire les produits construits avec des AAV, les empêchant d’être efficaces. La présence de ces anticorps excluent une grande partie des patients des thérapies géniques actuellement disponibles. L’objectif de cette étude est d’évaluer la biodistribution de plusieurs vecteurs AAV conçus pour éviter la réponse immunitaire chez des animaux séronégatifs ou faiblement séropositifs pour les AAV ciblés. En évaluant la transduction dans différents organes d’intérêt (muscle, le cœur, le foie, le cerveau, etc.), et en combinant ces données avec celles obtenues précédemment (non publiées) sur les capacités de production, l’efficacité de transduction et l’évitement des anticorps in vitro, le projet permettra de selectionner les candidats les plus prometteurs sur la base de l’ensemble de ces propriétés. Si les résultats s’avèrent concluants, ces vecteurs pourraient constituer une approche thérapeutique pertinente pour le traitement des maladies génétiques notamment les troubles musculosquelettiques, avec des améliorations significatives en termes d’accessibilité, de sécurité, de spécificité et d’efficacité.

Bénéfices attendus

En cas de succès, le vecteur pourra être utilisé comme « moyen de transport » pour apporter du matériel génétique dans les cellules cibles et ainsi traiter des maladies génétiques et notamment celles liées aux troubles musculosquelettiques. Le projet permettra de selectionner les candidats les plus prometteurs sur la base de l’ensemble des proriétés évaluées (ten particulier la transduction dans les tissus cibles).

Procédures

Tous les animaux du projet auront la même procédure. Les animaux seront acclimatés à leur environnement (volières, personnel, congénères) durant plus d’un mois et ils bénéficieront d’une période d’habitation (training aux actes techniques et manipulations) d'environ 2 semaines avant le début du projet. Les animaux vigiles recevront une administration unique du pool de vecteurs par voie IV (moins de 1 minutes si bolus ou moins de 30 min si IV lente sur siège). Les animaux auront également 4 prélèvements de sang de moins de 3 ml, pour un volume total prélevé de 12 ml sur 4 semaines. Les animaux seront vigiles lors des prélèvements de sang. Chaque prélèvement dure entre 3 à 15 minutes (contention et prélèvement compris). Le suivi des poids (12 fois) et de la température corporelle (7 fois) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Pour le confort des animaux, certains prélèvements et suivis pourront être réalisés simultanément (ce qui diminuera le nombre de manipulations et de contentions). Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance.

Impact sur les animaux

La réalisation de prélèvements sanguins et les administrations par voie intraveineuse pourront provoquer un stress, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou oedème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction ou d'injection. Durant les administrations, les animaux pourront être placés sur des chaises à contention ce qui a pour conséquence de réduire leurs mouvements. Les pesées (12 fois) ainsi que les mesures de température rectale (7 fois) peuvent également engendrer un stress léger chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet dans le but de récolter les organes et de mesurer la transduction des transgènes dans différents organes

Remplacement

Les études de biodistribution chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles thérapies. En effet, celles-ci permettent de déterminer la localisation des AAV dans les tissus après administration et ainsi déterminer le lieu de distribution d'un futur transgène thérapeutique ainsi que le taux de transduction. Cette étude aura lieu chez le primate car cette espèce apporte les meilleures données transposables à l’homme notamment concernant la transduction avec les vecteurs AAV et l’évitement de la réponse immunitaire. Ceci ne pourrait être obtenu in vitro et justifie le recours à des animaux.

Réduction

Le nombre estimé d'animaux utilisés dans ce projet a été défini à 4 primates répartis en 2 lots (1 lot séronégatif et un lot légèrement séropositif). Il a été réduit au minimum afin de tout de même obtenir des résultats fiables interprétables. Le choix d’inclure deux animaux par groupe nous permettra d’apprécier la variabilité interindividuelle tout en gardant le statut préliminaire de l’étude. L’utilisation de deux animaux par groupe permet également de distinguer un effet lié au traitement d’un événement isolé ou accidentel, limitant ainsi le risque de devoir refaire l’étude et, in fine, à l’utilisation d’un plus grand nombre d’animaux.

Raffinement

Un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie comprenant: - Des enrichissements structuraux permettant aux PNH d'évoluer dans un environnement tridimensionnel ; - De la litière pour leur permettre de fourrager ; - Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent ; - Des friandises et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; - De la musique d'ambiance est diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation specifique au projet d’environ 40 jours sera mise en place avant le début de l’étude incluant un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (prise de température rectale, chaise à contention si besoin). Durant les administrations, les animaux pourront être assis sur des chaises à contention. Pour limiter leur stress et l’ennui, un personnel formé veillera à interagir avec les animaux, leur distribuer des friandises ou encore leur projeter un documentaire/dessin animé sur une tablette électronique par exemple. Des points limites seront mis en place afin de detecter précocément tout signe de stress ou de douleur.

Choix des espèces

Les singes cynomolgus constituent un modèle animal privilégié pour l'optimisation des protocoles d'administration de gènes par les vecteurs viraux avant les essais cliniques chez l’homme. En effet, la proximité anatomique, physiologique et immunologique des primates avec l’être humain signifie que les profils de biodistribution, de tropisme des tissus, de réponse immunologique aux capsides AAV et d’efficacité de transduction sont plus prédictifs de ce qui pourrait être observé chez l’humain, comparés aux modèles rongeurs. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses post mortem. Sachant que des prélèvements d’organes seront réalisés post-mortem dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux. Aussi l’utilisation d’animaux jeunes est justifiée par une probabilité plus élevée de séronégativité ou faible séropositivité vis-à-vis des virus adéno-associés (AAV). En effet, l’exposition naturelle aux AAV et le développement d’anticorps neutralisants augmentent avec l’âge, ce qui rend les animaux plus âgés plus susceptibles d’être séropositifs.