Recherche appliquée

Deux macaques à longue queue vont être utilisés, tous deux tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun subissant onze prélèvements sanguins en cinq semaines et des contentions de trois à quinze minutes sur animal vigile. Une perfusion de trente minutes leur administre un candidat anticancéreux à ARNm encapsulé, à une dose dix fois plus faible qu'une étude précédente où les paramètres sanguins avaient signalé une réaction inflammatoire. Quinze jours après l'injection, ils sont tués sous anesthésie pour le prélèvement de leurs organes. Le porteur explique que deux animaux suffisent parce que l'étude est préliminaire et non réglementaire, donc dispensée de tests statistiques, la comparaison se faisant entre les deux individus.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer la toxicité et le profil de sécurité d’un candidat thérapeutique oncologique. Après administration, l'élément d'essai entraîne la production de cellule immunitaire dans la circulation générale. Cet élément d'essais a déjà été évalué lors d’une étude préalable, conduite à une dose dix fois supérieure à celle prévue ici. Cette étude avait révélé une augmentation de certains paramètres sanguins, suggérant un événement associé à une réaction inflammatoire augmenté. Dans la présente étude, l'élément d'essai sera administré à une concentration dix fois plus faible. L’objectif est de démontrer que les effets observés précédemment étaient liés à la dose élevée – susceptible d’avoir induit une réaction inflammatoire importante – et non à la composition de l'élément d'essai lui même. Le profil de sécurité de cet élément d'essai sera donc évalué à des doses alignées avec celles envisagées pour le développement clinique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont à terme la validation et la mise sur le marché du traitement innovant en oncologie. Ce médicament permettrait de cibler un type cellulaire précis et de d’augmenter l’activation immunitaire anticancéreuse proche des tumeurs. Cela permettrait d’améliorer significativement la qualité de vie des patients avec un traitement plus ciblé, qui permettrait d’injecter des doses plus faibles et de ce fait permettrait de réduire les effets secondaires.

Procédures

Après plus de deux semaines d’acclimatation et d’habituation, les 2 animaux inclus dans le projet recevront une injection lente de l’élément d’essais (perfusion durant 30 minutes). Des prélèvements de sang seront réalisés avant et après administration sur animal vigile afin d'étudier la concentration de l’élément d’essais dans le sang au cours du temps et de mesurer certains paramètres physiologiques des animaux (11 prélèvements sanguins seront réalisés sur une période de 5 semaines). Le temps de contention nécessaire à la réalisation de ces prélèvements est compris entre 3 et 15 minutes. Le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Une pesée sera réalisée chaque semaine. La température corporelle sera mesurée 1x/jour 3 jours avant administration, 2x le jour de l’administration, et 1x/jour 3 jours après administration. Le projet prendra fin 15 jours après administration de l’élément d’essais et les 2 animaux impliqués seront mis à mort sous anesthésie afin de récolter leurs organes.

Impact sur les animaux

L’administration intra-veineuse par perfusion lente peut provoquer un stress léger, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple). Les prélèvements de sang pourront provoquer un stress léger, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple). Les pesées et les mesures de température rectale peuvent également engendrer un stress léger chez les animaux.

Devenir

Les 2 animaux utilisés dans le cadre de ce projet seront mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter leurs organes pour déterminer la toxicologie éventuelle de l’élément d’essais.

Remplacement

En l’état actuel des connaissances, l’évaluation du profil de sécurité d’un candidat thérapeutique en oncologie nécessite des études in vivo, car seule l’expérimentation animale permet de reproduire la complexité des réponses immunitaires, inflammatoires et systémique attendues, ainsi que de satisfaire les exigences réglementaires nécessaires à un développement clinique. Ceci ne pourrait être obtenu in vitro, car les modèles cellulaires utilisés en laboratoire restent trop simplifiés : ils ne reproduisent qu’une partie d’un organe isolée du reste du corps. Or, la biodistribution, la pharmacodynamie et la pharmacocinétique dépendent d’un grand nombre de facteurs qui interagissent en temps réel dans un organisme vivant complexe (exemples : le débit sanguin, les échanges entre les tissus, le fonctionnement du foie et des reins, les barrières biologiques, …). Seul un organisme complet, où tous les organes sont en interaction constante, permet de répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé dans ce projet a été réduit au minimum sans compromettre les objectifs scientifiques du projet. En effet, 2 animaux seront utilisés. Les deux animaux recevront l’élément d’essais, le nombre de deux permettra une comparaison. Le suivi longitudinal de chaque animal (analyses biologiques et suivi métabolique avant et après administration) permettra de recueillir un maximum de données à partir de chaque individu, réduisant ainsi le besoin d’animaux supplémentaires. Cette étude étant préliminaire et non règlementaire, elle ne nécessite pas d’utiliser de grandes cohortes d’animaux pour réaliser des tests statistiques.

Raffinement

Un programme d'enrichissement complet sera mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprendra des enrichissements structuraux, de la litière pour permettre aux primates de fourrager, des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine, des friandises (ex: céréales, fruits secs) et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs), de la musique d'ambiance diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Les animaux seront acclimatés à leur environnement (volières, personnel, congénères) durant minimum deux semaines avant le début du projet. Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur au sein de l’établissement utilisateur. Les prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigile car l'anesthésie modifie les paramètres physiologiques étudiés et engendre un stress et un risque plus important pour l'animal que la procédure elle-même. Cependant, une sédation pourra être envisagée en cas de besoin. Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire. L’arrêt du protocole sera envisagé si l’animal ne répond pas au traitement ou si son état se dégrade (sous la responsabilité du vétérinaire).

Choix des espèces

L’utilisation du primate non humain est nécessaire car il s’agit de la seule espèce capable de reproduire fidèlement les réponses immunitaires, inflammatoires et physiologiques humaines requises pour évaluer la sécurité d’un candidat thérapeutique oncologique. Leur système immunitaire réagit de façon très semblable au nôtre, ce qui permet de prévoir d’éventuelles défenses du corps contre l'élément d'essai. Leur grande proximité génétique et physiologique avec l’Homme les rend aussi très utiles pour étudier comment l'élément d'essai agit et dans quels organes il se diffuse. Ainsi, son emploi est indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. De jeunes adultes seront utilisés dans ce projet. À ce stade de développement, les animaux présentent un système immunitaire pleinement fonctionnel, comparable à celui d’un patient adulte, ce qui est indispensable pour évaluer la réponse du corps vis-à-vis de l'élément d'essai testé. Leur organisme a atteint la maturité physiologique et métabolique, mais ne subit pas encore de variations néfastes liées au vieillissement. L’utilisation de jeunes adultes permet de réduire les facteurs associés à des pathologies liées à l’âge qui pourraient interférer dans l’analyse des résultats et la qualité des échantillons prélevés. Sachant que des prélèvements d’organes seront réalisés post-mortem dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.

L'automutilation, les vocalisations ou l'agression des petits par la mère déclenchent l'arrêt du protocole et la mise à mort. 806 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès les vingt-quatre premières heures de vie, les ratons passent quatorze jours en atmosphère hyperoxique pour reproduire l'hypertension pulmonaire des grands prématurés, leurs mères échangées tous les jours pour épargner à elles seules la toxicité de l'oxygène, avant des échographies cardiaques, des mesures de pression et une pléthysmographie invasive sous anesthésie. Le porteur justifie la cotation modérée par le fait que les animaux ne seront pas soumis à l'effort, seule situation où la gêne respiratoire s'exacerbe selon lui.

Objectifs

La dysplasie broncho-pulmonaire (DBP) est la principale complication liée à la grande prématurité. La DBP peut se compliquer d’une hypertension pulmonaire (HTP-DBP) responsable d’une mortalité importante dans les 2 ans suivant le diagnostic, par défaillance cardiaque droite. Par ailleurs, les altérations pathophysiologiques présentes pendant la période néonatale persistent dans le temps chez les grands prématurés survivants, augmentant leur risque de développer des maladies respiratoires et cardiovasculaires sévères à l’adolescence et à l’âge adulte. Les mécanismes physiopathologiques à l’origine de l’HTP-DBP sont encore méconnus et il n’existe, à l’heure actuelle, aucun traitement préventif ni curatif de cette maladie. La recherche est donc très active dans l’identification de nouvelles cibles afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Pour cela, des modèles animaux pertinents sont indispensables. Ainsi, dans ce projet, nous utiliserons un modèle animal (rats) d’HTP-DBP expérimentale induite par hyperoxie, classiquement décrits dans la littérature et utilisés au laboratoire de façon à pouvoir s’appuyer sur de nombreuses données déjà acquises. Ces modèles animaux sont les modèles qui reproduisent le mieux la pathologie humaine. Dans ces modèles, nous étudierons de manière longitudinale, l’évolution des altérations pathophysiologiques de l’HTP-DBP à différents âges (J15 etJ60 chez les animaux, ce qui correspond chez l’humain à la période de l’enfance (

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mettre en évidence l’effet thérapeutique de deux molécules pharmacologiques ciblant cible thérapeutique. L’efficacité de traitements préventifs versus curatifs sera comparée ainsi que d’éventuels effets secondaires. Si les études sont positives, des études cliniques pourront être envisagées à plus long terme avec un rapport bénéfice- risque minimum pour les patients.

Procédures

Un groupe sera exposé à l’air ambiant (groupe contrôle) et un 2ème groupe sera maintenu en hyperoxie dans les 24h suivant la naissance, pour une durée de 14 jours (J). Un échange des mères entre les groupes sera effectué toutes les 24h, afin d’éviter l’effet toxique lié à l’oxygène chez ces mères. Des substances pharmacologiques dirigées vers la cible thérapeutique seront injectées soit en intranasal soit en intrapéritonéal pour le protocole préventif et pour le protocole curatif. Après 14 jours, une partie des ratons sera anesthésiée afin de réaliser des échographies cardiaques (10 minutes/animal), des mesures de pressions cardiaques (10-15 minutes/animal) et des mesures de la fonction respiratoire par pléthysmographie invasive (5-10 minutes/animal) pour diagnostiquer la présence d’une HTP-DBP et en évaluer la sévérité. Tous les animaux auront ces différentes mesures avant l’extraction du tissu. Les animaux seront euthanasiés pour l’extraction du tissu. Des prélèvements de sang pourront être effectués sur certains animaux juste après l’euthanasie et avant de récupérer le tissu. L’échographie, les mesures hémodynamiques et les mesures de fonction respiratoire permettront également d’évaluer l’efficacité des traitements thérapeutiques. L’autre partie des animaux sera placée en normoxie seule, en présence d’une mère allaitante jusqu’au sevrage puis en condition d’hébergement classique jusqu’à l’âge de 60 jours. Durant cette période, les animaux auront une échographie cardiaque sous anesthésie générale aux différents temps d’évaluation, y compris ceux qui poursuivent le protocole jusqu’à J60. Ainsi, les animaux explorés à J60 auront au total 2 échographies cardiaques durant le protocole. A l’issue du protocole, les animaux seront anesthésiés afin de réaliser des échographies cardiaques, des mesures de pressions cardiaques, des mesures de la fonction respiratoire et des prélèvements de sang.

Impact sur les animaux

L’HTP-DBP n’induit pas de souffrances élevées mais plutôt une gêne respiratoire exacerbée lors d’un effort. Etant donné que les animaux ne seront pas soumis à l’effort, la souffrance est considérée comme modérée dans ce type de protocole d’induction d’une maladie. Nous avons une grande expérience du suivi notamment respiratoire des animaux sous des atmosphères en oxygène variées au laboratoire et nous serons particulièrement attentifs aux points limites qui constitueront un arrêt des protocoles. Bien qu’il n’y ait pas de perte de poids, il y a une prise de poids moindre lors de la survenue de l’HTP-DBP chez les animaux. Les points d’injection des substances et/ou solvants à tester peuvent développer une inflammation locale. Ils seront donc contrôlés. Etant donné que les substances pharmacologiques sont déjà utilisées en clinique, on ne s’attend pas à l’observation d’effets secondaires importants. Globalement, les nuisances suivantes seront surveillées par les expérimentateurs ou les animaliers : Anesthésies répétées Concentrations potentiellement toxiques en oxygènes Points d’injections à répétition Prise de poids ralentie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés de façon à récupérer les tissus pour faire diverses analyses.

Remplacement

Il est indispensable de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans cette maladie afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, et seules des expérimentations in vivo chez l’animal pourront permettre d’atteindre ce but. Il est très difficile d’obtenir du tissu de patient souffrant d’HTP-DBP mais des études pourront être réalisées sur des cellules de poumons humains fœtaux en culture, exposées ou non à l’hyperoxie. Ce remplacement du modèle animal par un modèle in vitro permettra d’élucider certains mécanismes intracellulaires sans utiliser d’animaux. Les cellules en culture nous apportent des informations qui doivent être vérifiées in/ex vivo ou in vitro sur des cellules ou des tissus fraichement isolés car le phénotype des cellules change avec les conditions de culture. Par ailleurs, cette pathologie implique plusieurs organes et plusieurs types cellulaires pulmonaires qui interagissent entre eux et seul l’animal entier permet les interactions entre ces différents organes et cellules.

Réduction

Pour limiter le nombre d'animaux, une partie des utilisateurs utilisera le poumon droit et l’autre partie le poumon gauche, une planification des expériences sera établie pour optimiser au mieux les techniques réalisées sur chaque animal et enfin des études seront réalisées sur des cellules d’artères pulmonaires humaines fœtales en culture exposées à l’hyperoxie in vitro pour simuler l’HTP-DBP. Quatre chercheurs/enseignant-chercheurs statutaires (et leurs étudiants) travaillent sur le modèle de ratons HTP-DBP donc l’utilisation des animaux contrôles pourra être optimisée en concertation avec tous les utilisateurs lors de nos réunions d’équipe hebdomadaires afin d’utiliser tous les tissus disponibles. Des précautions seront prises pour éviter les biais expérimentaux (travail en aveugle, partage des tissus et/ou cellules issues de ces tissus). Nous avons besoin de 6 lots différents par condition car les expériences doivent être réalisées sur différentes lots et nos expériences nécessitent de conditionner les poumons différemment, de plus étant donné la petite taille des poumons, nous avons besoin de plusieurs poumons pour réaliser toutes les expériences avec un nombre d’expériences entre 6 et 9 en fonction des expériences. L’estimation du nombre d’animaux est basée sur les analyses des études préalablement menées au laboratoire et en accord avec les données de la bibliographie. Le nombre d’animaux sera ensuite réduit si les résultats obtenus sont statistiquement significatifs (ou résolument non significatifs) avant la fin de la totalité des séries prévues.

Raffinement

Selon la condition, 12 ratons et 1 rate seront placés soit dans l’enceinte à hyperoxie soit dans une cage classique. L’enceinte à hyperoxie et la cage classique contiendront une couche de litière suffisante pour absorber l’humidité, des éléments de nidification (coton, papier kraft) et du matériel d’enrichissement (un tunnel rouge et buchettes de bois). L’accès à l’eau et la nourriture sera ad libitum. Les paramètres ambiants (hygrométrie, température) seront contrôlés quotidiennement par les expérimentateurs ou les animaliers et conservés sur un registre. Un cycle jour/nuit de 12h sera également appliqué. Les signes cliniques de souffrance seront surveillés quotidiennement. Différents paramètres physiologiques (courbe de poids, piloérection, détresse respiratoire) seront surveillés. Un arrêt de la courbe de croissance ou une baisse de poids corporel prolongé dans le temps et non réversible, un comportement anormal des animaux (vocalisation, comportement malveillant vis-à-vis des bébés, automutilation) ou des signes de détresse respiratoire conduiraient à un arrêt du protocole et à la mise à mort de l’animal. L’enceinte d’hyperoxie sera ouverte tous les jours pour l’échange des mères. A cette occasion, les animaux seront observés et seront pesés tous les deux jours. En cas de détection de signe de douleur, dans un premier temps, une administration d’antalgique sera réalisée. En cas de souffrance ou de détresse persistante une procédure d’euthanasie sera mise en œuvre. Une grille de scoring pour le suivi des animaux sera mise en place pour chaque animal. L’ensemble des expérimentations in vivo sera réalisé sous anesthésie générale. Pour les mesures hémodynamiques, un tapis chauffant sera utilisé pour préserver la température corporelle constante durant toute la procédure. Le degré d’anesthésie sera vérifié par l’absence de réflexe palpébral et/ou de retrait de la patte au pincement. Des modifications des paramètres physiologiques et notamment la fréquence cardiaque indiquant une souffrance ou une détresse de l’animal conduiraient à une procédure d’euthanasie.

Choix des espèces

Le rat est une espèce classiquement utilisée pour le développement de modèles d’HTP-DBP. De plus, le laboratoire utilise ces espèces depuis plusieurs années, et dispose donc de nombreuses données sur lesquelles s’appuie le présent projet. De plus, le rat est particulièrement adapté pour modéliser la DBP car au moment de la naissance leurs poumons sont au stade de développement pulmonaire qui correspond au stade de maturation des poumons de nouveau-nés grands prématurés humains et les expérimentations pourront être menées chez des rats nés à terme et ne nécessiteront pas d’induire une naissance prématurée de ces animaux.

Cinquante-six xénopes arrivent dans ce projet en ayant déjà subi une ou deux laparotomies lors d'un projet précédent. 80 femelles adultes au total vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 58 tuées à l'issue et 22 transférées vers un projet suivant. Chacune peut être ouverte au ventre jusqu'à six fois, sous anesthésie et à un an d'intervalle, pour prélever ses ovocytes, avec à chaque fois une douleur post-opératoire de vingt-quatre heures, une semaine d'isolement le temps de la cicatrisation et un risque d'infection des sutures. Le porteur affirme que la modélisation informatique rend mal compte de la membrane cellulaire et qu'il est "indispensable" de travailler sur cellules vivantes, tout en reconnaissant utiliser aussi des lignées cellulaires, moins robustes selon lui.

Objectifs

Les neurones, cellules du cerveau, communiquent entre eux par le biais de protéines appelées récepteurs. Ces récepteurs jouent un rôle central dans les processus tels que l’apprentissage et de la mémoire. La dysfonction de ces récepteurs est impliquée dans de nombreuses maladies neurologiques et psychiatriques (épilepsie, retard mental, autisme, schizophrénie). Il est donc important de comprendre comment ces récepteurs changent de forme pour s’activer et se désactiver, et comment ces mouvements sont affectés par des petites molécules appelées modulateurs. La compréhension de ces mécanismes est en effet une étape cruciale pour la conception de médicaments ciblant les maladies neurologiques et psychiatriques avec une meilleure efficacité et moins d’effets secondaires. De telles études requièrent l’utilisation de modèles cellulaires in vitro, permettant la caractérisation des récepteurs en conditions contrôlées, mais dans un environnement proche de leur environnement natif. Le projet consiste à utiliser les ovocytes de Xénope comme modèle cellulaire in vitro pour étudier les propriétés moléculaires et pharmacologiques d’une famille de récepteurs du cerveau. De par leur grand nombre, leur grande taille, leur robustesse et leur grande capacité à synthétiser des protéines membranaires, les ovocytes de Xénope sont en effet un modèle très puissant pour l’étude des récepteurs du cerveau. Ce projet devrait permettre des avancées scientifiques sur le fonctionnement de ces récepteurs, ainsi que sur la mise au point de nouveaux agents d’intérêt thérapeutique en neurologie et psychiatrie.

Bénéfices attendus

Les troubles anxieux sont des troubles psychiatriques très répandus qui constituent une préoccupation croissante pour la santé publique mondiale. Une grande majorité de ces troubles s’expliquent par un mauvais fonctionnement des récepteurs neuronaux. Actuellement, un grand nombre de molécules développées pour cibler ces récepteurs échouent en phase clinique à cause d’effets indésirables (somnolence, problèmes de mémoire, hallucinations, toxicité). Une meilleure compréhension des mécanismes induisant un mauvais fonctionnement de ces récepteurs, ainsi que de l’influence de l’environnement chimique de ces récepteurs sur leur fonctionnement permettrait d’améliorer l’efficacité des traitements et limiter les effets secondaires. En outre, ce projet permettra le développement de nouvelles molécules à visée thérapeutique ciblant les récepteurs du cerveau.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie abdominale pour prélèvement d’ovocyte sous anesthésie générale d’une durée d’environ 30 minutes. A la suite de cette procédure, les animaux seront hébergés individuellement durant 7 jours afin de contrôler la bonne récupération/cicatrisation. Cet acte pourra être réalisé au maximum 6 fois par animal avec une période de repos d’au moins une année entre deux actes.

Impact sur les animaux

Nous anticipons les nuisances suivantes sur les xénopes : (i) Hypothermie durant la période d’anesthésie ; (ii) Douleur post-opératoire dans les 24h suivant la laparotomie ; (iii) Inconfort (tiraillements) lié à la cicatrisation de la plaie pour une durée d’environ 7 jours post-chirurgie ; (iv) Dans de très rares cas, éventuelle infection des points de suture ; (v) Léger stress et inconfort lié à la manipulation lors des transferts de l’animal entre les bacs d’hébergement et les bacs d’expérimentation ; (vi) Léger stress lié à l’hébergement individuel post-chirurgie, le temps que la plaie cicatrise.

Devenir

58 animaux seront euthanasiés à l’issue du nombre maximal d’interventions chirurgicales fixé ou avant si leur état de santé ou la taille de leurs sacs ovariens ne permet pas d’atteindre ce nombre. 22 animaux n’auront pas le nombre maximal de chirurgies à la fin du projet et seront donc utilisés dans un projet ultérieur dans le cadre d’une utilisation continue.

Remplacement

Des expériences de modélisation moléculaire in silico seront réalisées pour prédire certaines propriétés moléculaires des récepteurs du cerveau ainsi que les modes de liaisons des composés pharmacologiques s’y liant. Ceci permettra de limiter le nombre d’expériences à réaliser sur les ovocytes de Xénope. Les études in silico ne prennent néanmoins pas en compte la complexité du milieu biologique. En particulier, elles prennent mal en compte la complexité de la membrane cellulaire dans laquelle les récepteurs sont intégrés, et qui joue un rôle fondamental dans le fonctionnement des récepteurs du cerveau. Il est donc indispensable de réaliser des études sur des cellules vivantes pour pouvoir étudier les récepteurs dans un environnement proche de leur environnement natif. Lorsque cela est possible, nous réaliserons aussi des expériences sur lignées de cellules in vitro. Cependant, nous avons constaté au laboratoire que nos récepteurs d’intérêt étaient beaucoup moins toxiques pour les ovocytes de xénopes que pour les lignées cellulaires. Le système ovocyte de Xénope permet donc d’obtenir dans notre cas une meilleure robustesse statistique et une meilleure reproductibilité des résultats scientifiques. En outre, du fait que chaque animal possède un grand nombre d’ovocytes, le modèle xénope implique l’utilisation d’un faible nombre d’animaux pour obtenir la quantité d’ovocytes nécessaires aux expériences.

Réduction

Les sacs ovariens récupérés lors des laparotomies seront divisés en plusieurs lots, conservés à 4 degrés et traités en fonction des besoins pour augmenter la durée de vie des ovocytes. A l’issue du traitement des sacs ovariens, plusieurs centaines d’ovocytes sont récupérés et mutualisés pour les différents projets scientifiques de l’équipe. Ces procédures permettent de limiter la fréquence des interventions. Nous estimons avoir besoin de faire 52 laparotomies par an (1 par semaine), soit 260 laparotomies sur toute la durée du projet. Cette fréquence des laparotomies a été établie sur la base de notre utilisation d’ovocytes au cours des dernières années : nous utilisons les ovocytes de xénopes en continu toute l’année et la durée de survie des ovocytes extraits est d’environ 7 jours. En considérant 56 animaux en utilisation continue depuis un projet précédent ayant subi 1 ou 2 laparotomies et un pourcentage d’animaux dont la procédure s’arrête avant le nombre maximal de laparotomies, nous estimons que le nombre d’animaux utilisés pour ce projet est de 80: 22 animaux resteront en utilisation continue pour un futur projet avec le même projet scientifique et impliquant la même procédure.

Raffinement

Hébergement : Les xénopes sont maintenus en groupes d’individus dans une pièce dont la luminosité et la température sont contrôlées. Les animaux sont hébergés dans un système de recirculation d’eau dont les paramètres de l’eau sont constamment surveillés et ajustés si nécessaire. L’état des animaux (appétit, mobilité, aspect général, état de la peau) est surveillé quotidiennement. Des tubes en plastique servant de cachettes sont mis dans les bacs comme enrichissement de leur milieu de vie. Les animaux sont nourris 3x par semaine avec des granulés pour truite et amphibiens et du cœur de bœuf. Tout animal présentant une altération de son état général est hébergé individuellement dans un bac d’eau saline, hors du système de recirculation pour éviter toute contamination aux autres animaux. Il est traité le cas échéant selon les recommandations du vétérinaire référent, et remis avec ses congénères lorsque son état s’est amélioré. Durant cette période l’état général des animaux hébergés dans le même bac que l’animal malade est surveillé étroitement. Procédure : L’anesthésique utilisé a un effet analgésique, permettant son utilisation unique durant la procédure de chirurgie. D’après nos observations, les xénopes présentent une mobilité normale dès leur réveil sans perte d’appétit ni altération de leur état général dans les jours qui suivent la chirurgie, suggérant une douleur post-opératoire limitée. Un analgésique sera néanmoins appliqué en cas de signes de douleurs post-opératoires. Des mesures non médicamenteuses seront utilisées pour limiter une éventuelle douleur post-opératoire : (i) récupération à l’anesthésie dans un bac avec une faible profondeur d’eau (ne couvrant pas les narines) pour éviter à l’animal de se lever pour respirer; (ii) récupération à l’anesthésie dans une eau saline de concentration proche du milieu interne du xénope, lui permettant de récupérer plus facilement. L’état général du xénope est régulièrement surveillé durant cette période et évalué selon une grille de cotation. Des points limites ont été établis. La taille du groupe de xénopes disponibles dans notre animalerie permet de limiter la fréquence des laparotomies pour chaque animal à une fois par an en moyenne (et maximum 1 fois tous les 6 mois), limitant ainsi les nuisances induites à chaque animal.

Choix des espèces

Le système d’expression en ovocytes de xénopes est très largement utilisé en laboratoire du fait de la grande taille et robustesse des ovocytes facilitant ainsi leur manipulation, et permettant la production de quantité importante de protéines. Le grand nombre d’ovocytes produit par chaque femelle et la robustesse des résultats expérimentaux issus de ce système permettent en outre une grande reproductibilité des expériences tout en utilisant un faible nombre d'animaux. Nous utiliserons des xénopes femelles adultes. Il est nécessaire d’utiliser de tels animaux pour prélever les ovocytes au bon stade de maturation.

Pour étudier comment le cerveau perçoit le temps, 512 souris sont entraînées une à trois semaines dans des enceintes expérimentales, motivées par des récompenses alimentaires obtenues au prix d'une réduction contrôlée de leur ration. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour que leur cerveau soit prélevé. Jusqu'à deux chirurgies de deux heures sous anesthésie générale servent à implanter le système d'imagerie que les animaux portent ensuite pendant les tests, encombrement dont le porteur reconnaît l'inconfort. Les souris qui ne peuvent pas être incluses dans les tests comportementaux seront, écrit le porteur, "valorisées" dans une expérience de mise au point d'outils d'analyse.

Objectifs

Dans notre vie quotidienne, nous évaluons constamment le temps : combien de temps avant que le feu passe au vert ? Quand avons-nous voyagé la dernière fois ? Ces processus sont fondamentaux pour notre mémoire, nos prises de décision et nos capacités d’adaptation. En effet, la perception du temps est une fonction cognitive essentielle permettant aux organismes d’interagir efficacement avec leur environnement. Que ce soit pour anticiper un événement imminent ou pour structurer des actions ou des expériences vécues sur des périodes étendues, la capacité à percevoir et encoder le temps joue un rôle clé dans la survie et l’adaptation. Des perturbations de ces processus peuvent altérer les capacités d’adaptation face au stress et contribuer à des troubles psychiatriques tels que la dépression, les troubles anxieux et de stress post-traumatique. La manière dont le cerveau représente et stocke les informations temporelles reste encore mal comprise. La perception et l’encodage du temps reposeraient sur des réseaux cérébraux complexes impliquant des régions comme l’hippocampe et le striatum. Cependant, ces régions n’encodent pas le temps comme un simple chronomètre : leur activité fluctue, se transforme au fil du temps et s’adapte en fonction de l’expérience, de l’apprentissage et de l’âge. Il est donc crucial de mieux comprendre les mécanismes associés, ceux permettant notamment d’estimer la durée de stimuli ou l’horodatage et les caractéristiques temporelles des expériences vécues. Ainsi, ce projet a pour objectif d’étudier les mécanismes cérébraux impliqués dans la perception du temps, à des échelles courtes (dizaines de secondes) et longues (heures à semaines), à travers l’étude du comportement des animaux dans différentes situations expérimentales . En outre, nous testerons dans une dernière expérience, les effets d’un mélange gazeux d'oxygène et de protoxyde d'azote, utilisé pour ses effets analgésiants, qui est actuellement développé comme alternative thérapeutique à action rapide dans certaines pathologies psychiatriques comme la dépression. Il est établi que le mélange gazeux affecte les états de conscience mais ses effets immédiats et différés sur la perception et l’encodage du temps ne sont pas connus alors qu’ils pourraient avoir un rôle important à jouer dans ses effets bénéfiques comportementaux et thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le premier objectif de ce projet est d’apporter des connaissances essentielles sur les mécanismes cérébraux sous-tendant l’encodage du temps à court-terme et dans la mémoire à long terme. Une meilleure compréhension de ces processus fondamentaux est cruciale pour comprendre les bases neuronales de la mémoire et les capacités d’adaptation cognitive. L’approche par imagerie calcique offre une précision inatteignable pour observer en temps réel le fonctionnement des populations neuronales du cerveau lors de la réalisation de tâches liées à la perception du temps et à la mémoire, permettant d’analyser des mécanismes auparavant inaccessibles. Ces découvertes seront d’autant plus précieuses que les zones du cerveau impliquées jouent un rôle central dans de nombreuses autres fonctions cognitives et sont affectés dans troubles comme la dépression, l’anxiété et les troubles de stress post-traumatiques. En outre, ce projet implique également l’évaluation des effets d’un mélange gazeux d’oxygène et protoxyde d’azote actuellement utilisé pour ces propriétés analgésiantes mais en cours de développement et d’évaluation comme alternatives thérapeutiques à action rapide dans la dépression.

Procédures

Les animaux seront soumis à des phases d’entrainement et de tests comportementaux sur des périodes allant de 1 à 3 semaines, selon l’expérience concernée. Ces phases correspondent à des explorations libres ou dirigées quotidiennes, dans différentes enceintes expérimentales (avec des récompenses alimentaires), d’une durée comprise entre 10 et 30 minutes par session et qui pourront être répétées selon l’expérience. Afin de maintenir la motivation pour la récompense alimentaire, certaines phases expérimentales incluront un contrôle alimentaire léger, consistant en une réduction contrôlée de l’apport alimentaire avant la session expérimentale sur une période de 1 à 3 semaine. La distribution est quotidienne et ajustée individuellement. Dans certaines expériences, les souris seront également soumises au maximum à 2 interventions chirurgicales, chacune d’une durée approximative de deux heures, réalisées sous anesthésie générale. Les animaux pourront être hébergés en cage individuelle de manière ponctuelle, notamment après les interventions chirurgicales (pendant 24 à 72 heures) et lors des périodes nécessitant un contrôle alimentaire individualisé (1 à 3 semaines)

Impact sur les animaux

Les différentes manipulations/contentions ainsi que l’hébergement isolé en cage, l’isolement lors des tests de comportement et la restriction alimentaire peuvent engendrer du stress pour l’animal. L’intervention chirurgicale peuvent induire des douleurs post-opératoires légères avec un impact réduit dans le temps (quelques jours) sur le bien-être animal. Les injections peuvent engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection. Les souris seront encombrées d’un système d’imagerie lors des tests, ce qui peut engendrer de l’inconfort.

Devenir

La totalité des animaux de l’étude seront mis à mort. Pour les besoins de l’étude, nous devons prélever le cerveau pour vérification histologique et investigation de l’expression de protéines d’intérêt.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode in vitro n’est disponible pour répondre à la problématique posée : l’étude des bases comportementales et neurales de la perception et l’encodage du temps et de leur mémoire à différentes échelles d’analyse. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale de fonction cognitive complexe comme dans notre étude repose sur l’observation directe du comportement de l’animal et de ses performances mnésiques tout en effectuant l’enregistrement de l’activité neuronale lors de la réalisation de ces tâches comportementales et de mémoires.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés par une approche statistique permettant une réduction des effectifs optimisée selon les recommandations éthiques.

Raffinement

Les chirurgies sont réalisées par du personnel formé et expérimenté, sous anesthésie générale afin de garantir l’absence d’inconfort pendant les gestes réalisés. Des constantes physiologiques sont suivies pendant l’intervention et des précautions sont prises pour maintenir l’animal dans les meilleures conditions. Des mesures sont mises en place avant et après les interventions afin d’assurer un confort et une récupération rapide des animaux. Les animaux font l’objet d’une surveillance régulière pendant plusieurs jours afin de vérifier leur bon état général et leur reprise d’activité normale Les expériences comportementales incluent une phase d’habituation progressive à l’expérimentateur, aux dispositifs et conditions de test afin de réduire le stress. Les manipulations ne nécessitent pas de contentions. Lorsqu’un hébergement individuel est requis, il est limité dans le temps. Des enrichissements supplémentaires sont apportés (matériel de nidification, abris, des tubes et objets à mordiller). Les animaux sont regroupés dès que les conditions le permettent. Les animaux ne pouvant pas être inclus dans les expériences comportementales seront valorisés, en intégrant une expérience permettant la création de nouveaux outils d’analyses sans recourir à des animaux supplémentaires.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par la similarité entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, espèce modèle dans le domaine des études des bases neurobiologiques de la mémoire, de la formation des souvenirs et de dysfonctions de la mémoire. Les souris utilisées seront des individus adultes, l’étude ayant comme objectif d’améliorer la compréhension des mécanismes normaux sous-tendant l’association temporelle de souvenirs et sa mise en mémoire dans des conditions normales. Il n’est pas nécessaire d’utiliser des stades plus spécifiques du développement par rapport à l'objectif scientifique de l'étude.

400 souris reçoivent une implantation chirurgicale de cellules tumorales dans le pancréas, dix minutes d'opération, puis huit injections dans l'abdomen réparties sur quatre semaines. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour des prélèvements terminaux. Le porteur affirme qu'aucun effet indésirable n'est attendu des traitements, la croissance tumorale et la perte de poids figurant en revanche parmi les conséquences annoncées, sans qu'aucun seuil de taille de tumeur ne soit indiqué. Le bénéfice espéré, une inhibition totale de la tumeur grâce à un organisme unicellulaire produisant des molécules d'immunothérapie, reste au conditionnel.

Objectifs

L’adénocarcinome pancréatique (PDAC) est l'un des cancers les plus agressifs, présentant un très mauvais pronostic et étant prévu pour devenir la deuxième cause principale de décès liés au cancer dans la prochaine décennie. L'échec des traitements standards ou des études cliniques récentes à guérir la majorité́ des patients est dû (i) à un diagnostic tardif, (ii) à l’hétérogénéité de la tumeur et (iii) à la présence d’un micro-environnement riche et dense. Notre équipe cherche de nouvelles stratégies thérapeutiques pour contourner cette résistance aux traitements notamment en ciblant les cellules du mico-environnement.

Bénéfices attendus

Nous espérons obtenir une inhibition totale du développement tumoral en associant la chimiothérapie déjà utilisée en clinique avec un organisme unicellulaire qui sécrétera une ou plusieurs molécules immunothérapeutiques d’intérêt contre le carcinome pancréatique. Ceci laisse envisager une nouvelle issue thérapeutique pour les patients.

Procédures

Tous les animaux serons soumis à une procédure chirurgicale, afin d'implanter des cellules tumorales, d'environ 10 minutes par animal. Les traitements se déroulent sur 4 semaines à raison de deux injections dans l’abdomen par semaine (d'une durée d'une trentaine de secondes environ).

Impact sur les animaux

La manipulation des animaux peut générer du stress et de l'inconfort. Effets indésirables directs : - douleur associée à une injection dans l’abdomen lors des traitements ou associé à la chirurgie lors de l'implantation de cellules en intra-pancréatique. Effets indésirables indirects, conséquence des produits injectés : - croissance tumorale - perte de poids. Les nuisances qui pourront être engendrées par la croissance tumorale chez ces animaux seront parfaitement surveillées et maîtrisées afin de limiter toute souffrance animale. Concernant les traitements, de nombreuses études ayant déjà été élaborées, les doses administrées aux animaux sont maîtrisées et de ce fait aucun effet indésirable dû au traitement est attendu.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements terminaux.

Remplacement

Toutes les alternatives sans recours aux animaux comme les modèles 2D, les modèles 3D ou organoïdes ont été explorés. L’utilisation de ces derniers reste très complexe et limitée en termes de données obtenues (car ne reproduisent pas encore totalement la complexité de la tumeur). La suite du travail nécessite maintenant d’utiliser un modèle vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en conservant une puissance statistique suffisante pour le traitement du résultat. L’analyse statistique sera réalisée en collaboration avec une unité de biométrie. Les différentes analyses statistiques seront réalisées à l’aide d’un logiciel. D’après nos expériences précédentes et la littérature, la variabilité de prise de greffe nécessite des groupes de 10 animaux.

Raffinement

La première mesure prise afin de limiter le stress chez nos animaux est une semaine de stabulation à leur arrivée sur la plateforme. Ceci afin de les habituer à leurs nouvelles conditions d'hébergement (5 souris par cage de 484 cm2, le milieu est enrichi à l’aide de litière mélangée à des copeaux, ainsi que de briques de peuplier et dôme en plastique opaque). Les animaux sont hébergées en portoir ventilé et l'équipe gérant la zone surveilleront quotidiennement les animaux. Une grille de scoring ayant été établi, tous les soins nécessaires pour apaiser le stress ou la douleur seront mis en place, jusqu’à l’euthanasie si besoin.

Choix des espèces

Le modèle d’implantation/développement de tumeur est déjà établi et maîtrisé chez la souris qui est un modèle adapté à la greffe de cellules tumorales syngéniques. De plus, tous les outils immunologiques sont disponibles pour étudier la réponse immunitaire chez la souris. Age 6-7 semaines, âge ou l’on observe une forte incidence de prise de greffe et une forte homogénéité.

Maintenus par contention manuelle, 250 chiens reçoivent des administrations par voie orale ou injectable, puis jusqu'à seize prises de sang en vingt-quatre heures, dans la limite de vingt-deux par semaine. Une semaine de récupération au moins suit chaque série, avant la molécule suivante, sur les cinq ans que le porteur annonce pour le projet. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, et la modification déposée y ajoute deux administrations destinées à homogénéiser le pH gastrique des animaux. Aucun chien n'est tué à l'issue: tous restent en vie, disponibles pour les études suivantes.

Objectifs

MODIFICATION: UNE ADMINISTRATION SUPPLEMENTAIRE POURRA ÊTRE REALISEE AVANT ET APRES L'ADMINISTRATION DE L'ELEMENT TEST. CELA EST NECESSAIRE POUR HOMOGENEISER LE PH GASTRIQUE DE TOUS LES ANIMAUX POUR EVITER DES BIAIS DANS LES RESULTATS DE L'ETUDE ET METTRE TOUS LES ANIMAUX DANS LES MÊME CONDITIONS. L'objectif de ce projet est de pouvoir tester différents principes actifs ainsi que différents excipients chez le chien et d'obtenir des données pharmacocinétiques et pharmacodynamiques. La pharmacocinétique et la pharmacodynamie sont des disciplines qui étudient le devenir de la molécule dans l’organisme. Le devenir du médicament selon les doses utilisées et sa voie d'administration sont étudiés chez l'animal: son absorption, sa distribution par la circulation sanguine, son métabolisme, son élimination. Les chiens sont régulièrement utilisés pour la recherche biomédicale dans les domaines de santé animale (espèce cible) mais aussi dans les domaines de santé humaine.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir identifier de nouveaux principes actifs candidats pour de futurs médicaments, de déterminer les paramètres pharmacocinétiques des l'éléments tests et de montrer que cela n'a pas eu d'impact au niveau clinique en suivant certains paramètres hématologiques, biochimiques impact sur la pharmacodynamie. Ce projet est nécessaire pour trouver de nouveaux principes actifs pour de futurs médicaments vétérinaires.

Procédures

Les animaux seront soumis a des administrations. Pour cela les animaux auront une contention manuelle légère. la durée d'un administration est inférieure à la minute. LES ANIMAUX POURRONT AVOIR DEUX INJECTIONS SUPPLEMENTAIRES AU MAXIMUM. DUREE DES ADMINISTRATIONS INFERIEURES A LA MINUTE AVEC UNE CONTENTION LEGERE. Il y aura des prélèvements sanguins. Dans ce cas le nombre de prélèvements sanguins sera limité à 22 maximum par semaine (environ 1 mL prélevé) et une période de récupération sera respectée ( à minima 1 semaine). Les volumes de sang prélevé seront généralement de 1 mL environ. Aprés un total d'environ 16 prélèvements sanguins sur 24h une période de récupération d'au minimum 7 jours sera respectée. Dans tous les cas, le volume des prélèvements sera réduit au minimum pour chaque protocole, sans jamais dépasser 15% du volume sanguin de l’animal, et une période de récupération adaptée sera respectée : 1 semaine suite à un prélèvement de 7.5% du volume sanguin, 2 semaines pour 10%, 4 semaines pour 15%. La durée d'un prélèvement sanguin est inférieur à la minute. La période de récupération pourra être allongée si nécessaire. Les animaux peuvent être soumis à un recueil d'urine. Soit cela se fera par miction spontanée (aucun geste n'est fait à l'animal), soit prélèvement urinaire par cathétérisation urétral ( contention manuelle légère). Durée de l'ordre de la minute. Une seule cathétérisation maximum pour les chiens males sur une semaine. Dans le cadre de recueil d'urine l'animal sera dans des conditions d'hébergement individuel pour une durée maximale de 24h avec de l'enrichissement autant que possible et un contact visuel et auditif entre ses congénères. Les protocoles avec collecte d'urine sont trés peu fréquents. Généralement les animaux sont mis en condition individuelle pour de l'observation, en box avec contact visuel et auditif entre les animaux, avec présence de tablette systématiquement , et jouets autant que possible.

Impact sur les animaux

Les gestes techniques réalisés dans ce projet seront: - des administrations : cela peut engendrer du stress lié à la contention et peut être une gêne au niveau du site d'injection, OU PETITE DOULEUR juste aprés administration. LES ADMINISTRATIONS SUPPLEMENTAIRES (MAXIMUM 2 ) ENGENDRENT UNE AUGMENTATION DE LA MANIPULATION DES ANIMAUX QUI PEUT ENGENDRER DU STRESS - Des prélèvements sanguins. Cela pourra engendrer du stress à la contention. Il peut y avoir également des douleurs au niveau du site de prélèvement. Le recueil d'urine par miction spontannée doit se faire via l'utilisation de cage à métabolisme, cela peut engendrer un incorfort de l'animal, un stress lié à l'hébergement.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de cette procédure.

Remplacement

Pour les études rentrant dans le scope de ce projet, le responsable de chaque étude s'assurera qu'il n'y a pas de methode de remplacement possible. Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal entier. Les essais in vitro sont des tests de cinétique de dissolution et de désagrégation d'un produit. Les essais ex vivo sont des tests qui s'effectuent directement sur des organes ou tissus isolés. Ces techniques de remplacement ne peuvent pas être appliquées dans ce projet.

Réduction

250 animaux sont inclus dans ce projet pour une durée de 5 ans. cela représente environ 50 animaux par an. On calculera pour chaque produit à tester le nombre d’animaux nécessaire, il sera, pour chaque protocole, toujours réduit au minimum, en tenant compte de la variabilité des résultats attendus. Il n'y a pas d'approche statistique prévue.

Raffinement

Les chiens seront hébergés par groupe entre 2 et 4 animaux par groupe. De l'enrichissement (exemple: tablettes, jouets: balles, cordage) sera présent dans chaque box autant que possible. Un suivi quotidien (voir plusieurs fois par jour) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (observation de l'état de santé général, observation des sites de prélèvement, observation du comportement de l'animal...) Toute intervention sur l'animal sera effectuée par une personne habilitée et expérimentée afin de réduire au minimum le stress. Des points limites sont mis en place, il peut s'agir de : - problème de comportement général. Cela peut être des secousses au niveau de la tête, des temblements, des troubles de la fréquence cardiaque, de la prostration. En fonction de l'intensité et de la fréquence du ou des signes observés l'animal sera exclu du projet et un traitement ( antispasmodique, antiarythmique par exemple) pourra être prescrit par le vétérinaire responsable. - forte fièvre ( à partir de 40 °C) Possibilité d'administrer des antipyrétiques - douleur au niveau des sites de prélèvements. De la glace pourra être appliquée si besoin. La période de repos entre 2 phases pourra être augmentée. - forte diarrhée et vomissement à répétition seront considérés comme points limites. Possibilité d'administrer des antivomitifs ou antidiarrhéiques.

Choix des espèces

Espèce cible pour les médicaments vétérinaires Pour les produits humains, l'utilisation des chiens est bien décrite et caractérisée dans la littérature et leur utilisation est conseillée pour les essais de produits pharmaceutiques. Chiot, jeune adulte ou adulte cela dépendra de la molécule à tester et de la cible thérapeutique.