Recherche appliquée

Exposés à de la lumière bleue la nuit dès le sevrage, à trois semaines, 558 rongeurs diurnes reçoivent des injections dans l'œil, subissent des électrorétinographies d'une heure et des chirurgies cérébrales, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun vit seul en cage à partir de vingt jours et jusqu'à la fin des procédures. Le porteur range cet isolement parmi les nuisances attendues, puis parmi ses mesures de raffinement, en précisant que les animaux se voient et s'entendent d'une cage à l'autre. Six tests comportementaux qu'il dit validés sont annoncés sans être nommés, et l'espèce n'est jamais précisée, désignée seulement comme un rongeur diurne de laboratoire, avant que tous soient tués pour prélever la rétine et le cerveau.

Objectifs

Le cycle lumière/obscurité de 24 heures de l’environnement synchronise l’horloge biologique du cerveau. La lumière exerce à la fois des effets positifs et négatifs en fonction de ses caractéristiques (moment d’exposition, durée, intensité spectre, etc…). La littérature montre qu’une exposition aberrante à la lumière, c’est-à-dire une exposition la nuit notamment dans la région bleue du spectre, altère les rythmes de l’organisme et induit des états dépressifs chez l’animal et chez l'humain. Un candidat clé pour la médiation des effets de la lumière sont les cellules à mélanopsine localisées dans la rétine. En effet, la lumière pénètre dans l’organisme à travers la rétine et est captée par un type de cellules particulier : les cellules photoréceptrices à mélanopsine. Ces cellules permettent la conversion du signal lumineux en un signal biochimique, transmissible alors à d’autres cellules. Ici, le signal sera transmis jusqu’aux structures du cerveau qui régulent les rythmes biologiques et l’humeur. Les adolescents présentent un risque particulier à l’exposition nocturne à la lumière bleue car l'apparition de la plupart des maladies mentales survient avant l'âge de 25 ans et ils présentent une sensibilité plus importante à la lumière. Nous émettons l’hypothèse que l'exposition à la lumière bleue la nuit de manière chronique, et ce dès l’adolescence, va contribuer au développement de troubles affectifs et visuels sur le long terme. Afin de vérifier cette hypothèse, notre étude sera réalisée sur un modèle de rongeur diurne la rendant plus pertinente que celles menées habituellement sur les modèles de rongeurs nocturnes utilisés en laboratoire tels que les rats ou les souris. Les objectifs sont de déterminer : 1) Impact de l’exposition à la lumière bleue nocturne sur l'humeur à l'aide de différents tests comportementaux validés. 2) Conséquences de l’exposition à la lumière bleue nocturne sur la rétine, son fonctionnement et ses projections vers le cerveau. 3) Caractérisations des effets de la lumière bleue dans les régions cérébrales cibles des cellules à mélanopsine, régulant l'humeur. Cette analyse multidimensionnelle, allant de la cellule au comportement de l’animal, aura des résultats déterminants aux niveaux fondamental et clinique.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de décortiquer l’impact de l'exposition aberrante à la lumière bleue de manière chronique et sur le long terme, sur le développement direct de troubles affectifs et visuels chez un rongeur diurne. En effet, les études actuelles se concentrent davantage sur l’étude de la lumière bleue en se basant sur des modèles de rongeur type souris ou rat, en débit de leur physiologie nocturne et donc, éloignée de celle de l’humain. Les données obtenues sur le modèle diurne pourront donc permettre une réflexion translationnelle plus pertinente.

Procédures

Afin de définir l'impact d'une exposition nocturne à la lumière bleue, notre projet comporte différents types d'interventions. Dans un cas, les animaux seront soumis à 6 tests comportementaux validés permettant d'étudier l'effet de la lumière sur leur humeur. La durée d'un test est variable, mais dure environ 10 minutes pour un animal. Afin d'étudier les effets de l’exposition lumineuse sur les cellules à mélanopsine de la rétine, les animaux seront soumis à des injections oculaires, qui se feront sous anesthésie générale et analgésie. L’exploration de la fonction visuelle se fera par électrorétinographie (ERG), sous anesthésie. Les ERG durent environ 1h et auront lieu à 3 reprises : avant l’exposition, et à 2 âges post-nataux pertinents pour les cinétiques des autres expériences : P50 et P80. Enfin, afin de vérifier l'implication d'une structure cible du cerveau impliquée dans la régulation de l'humeur, nous allons réaliser une chirurgie sur animaux anesthésiés, La totalité de la procédure dure environ 1h. Une chirurgie terminale sera réalisée sous anesthésie générale afin de prélever les tissus d'intérêts.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent être soumis à différentes interventions, susceptibles de causer des nuisances listées ci-dessous : 1) Impact généré par l'exposition à la lumière : nous nous attendons à une altération du système circadien et de l’humeur (objet même de la question). 2) A partir de 20 jours d'âge et jusqu’à la fin des procédures, les animaux seront placés individuellement dans des cages. L’isolement de l'animal sur une longue période est susceptible d’induire du stress chez les rongeurs, hébergés habituellement en groupes. 3) Pour étudier l’impact de la lumière sur l’humeur, les animaux seront soumis à différents tests comportementaux susceptibles d’induire du stress. 4) Les animaux seront soumis à des anesthésies, des injections dans l'oeil, ainsi qu'à des chirurgies cérébrales susceptibles d’induire une douleur modérée, un risque infectieux et/ou inflammatoire, une perte de poids, etc. Les animaux seront également soumis à une technique d'électrorétinographie (ERG - permettant d'évaluer la fonction visuelle) susceptible d’induire des anomalies oculaires dans certains cas (inflammation, infection, rougeur, opacité…)

Devenir

Suite à l'ensemble des procédures les animaux seront mis à mort, les organes tels que la rétine et le cerveau seront prélevés afin de réaliser des analyses post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet est d’évaluer l’impact d’une exposition aberrante à la lumière à partir de l’adolescence et sur le long terme chez l’adulte, sur l’humeur et la vision. A ce jour, il n’est pas possible de modéliser informatiquement les différentes structures du cerveau sur lesquelles reposent ces fonctions, ni de reconstruire l’ensemble des structures impliquées, de la rétine aux régions cérébrales cibles, ce qui nécessite donc d’avoir recours au modèle animal. Le projet nécessite la réalisation d’expériences dans un environnement intégral, à l’échelle de l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé par méthode mathématique à l'aide de logiciels conçus à cet effet et sur la base de notre connaissance du modèle de rongeur utilisé, des techniques mentionnées et de nos expériences à ce sujet, ainsi que sur la littérature scientifique actuelle. De plus afin de réduire le nombre total d'animaux: - Nous utilisons certaines approches non invasives (tests comportementaux) ne conduisant pas à la mise à mort de l'animal. - Plusieurs prélèvements de tissus ainsi que certaines mises au point techniques seront réalisés chez le même animal. L’effet sur la vision sera évalué par une approche longitudinale à différents stades de l’exposition à la lumière. L'effet délétère de la lumière bleue sera évalué entre les groupes par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Des mesures seront mises en oeuvre pour optimiser le bien-être des animaux tout au long des procédures. - Durant toute la durée des procédures les animaux seront placés individuellement dans des cages dans une pièce avec d'autres animaux isolés. Les animaux peuvent se voir et ont accès aux odeurs et bruits générés par leurs congénères. Ils restent ainsi en contact visuel et olfactif avec leurs congénères hébergés dans la même pièce. De plus, pour pallier à l'isolement des animaux, un enrichissement est apporté dans chaque cage (matériel de nidification, tunnel et bâton à ronger). Les procédures considérées comme invasives seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Durant ces procédures la température de l’animal sera maintenue à l’aide d’un tapis chauffant. Les animaux sont ensuite suivis tous les 2 jours à l’aide d’une grille de score permettant d’objectiver différents paramètres (apparence, poids, examen clinique, comportement, état des yeux) et d’établir des points limites permettant d’interrompre les procédures et donc de soustraire l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

Le choix de notre modèle animal s'est porté sur un modèle de rongeur diurne de laboratoire. En effet, notre étude multi-échelle (allant du comportement à la cellule) vise à identifier les effets délétères à long terme d'une exposition aberrante à la lumière bleue commençant dès l’adolescence, afin in-fine, d'élaborer de nouvelles stratégies pour limiter son impact. Il semble donc plus pertinent d'utiliser un modèle diurne (période d'activité le jour, période de repos la nuit), comparable à la physiologie de l'humain. L’objectif du projet est d’exposer les animaux à de la lumière bleue nocturne à l’adolescence (dès le sevrage, c'est à dire à 3 semaines) et d’évaluer ensuite les conséquences de cette exposition sur l’humeur et la fonction visuelle.

216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées par deux injections de cyclophosphamide, elles reçoivent dans la cuisse une injection de Klebsiella pneumoniae multirésistante, puis développent rougeur, gonflement et boiterie, sous une surveillance des signes locaux toutes les six à huit heures. Le muscle infecté est prélevé après la mise à mort pour compter les bactéries. Aucun traitement n'est évalué ici, le porteur mettant au point un modèle d'infection qu'il décrit comme une étape "obligatoire et règlementaire", et affirmant qu'aucune alternative ne reproduit la diffusion des antibiotiques dans les tissus.

Objectifs

La résistance des bactéries aux antimicrobiens (AMR) représente actuellement un problème majeur de santé publique, et menace notre capacité à traiter des infections potentiellement mortelles telles que les infections à Klebsiella pneumoniae, dont le taux de mortalité peut atteindre 50 %. Il s’agit d’une espèce bactérienne fréquemment retrouvée en milieu hospitalier et le traitement de ces infections requiert souvent l’usage d’antibiotiques de dernière ligne. Toutefois, l’activité de ces antibiotiques est largement compromise par le fait que les bactéries produisent des facteurs (appelés MBL pour certains) et capables de détruire ces antibiotiques, les rendant ainsi inefficaces. Dans ce cadre, des stratégies thérapeutiques innovantes sont attendues. Certains laboratoires s’intéressent au développement de médicaments capables de s’attaquer aux mécanismes de résistance des bactéries et ainsi de restaurer l’activité des antibiotiques disponibles. Aussi, de façon à évaluer ultérieurement l’activité in vivo de ces médicaments, il convient, dans un premier temps, de développer le modèle d’infection optimal et surtout requis par les autorités de santé, permettant de répondre à la question. Pour cela, l’objectif de la présente étude consiste à développer un modèle prédictif d’infection musculaire (cuisse) à Klebsiella pneumoniae multi-résistante chez la souris. Ce modèle servira, par la suite, à l’évaluation de l’efficacité de nouveaux composés anti-infectieux en développement.

Bénéfices attendus

Les infections bactériennes dues à des espèces multi-résistantes comme Klebsiella pneumoniae constituent un challenge pour les professionnels de santé, en raison de leur capacité à produire des facteurs capables de détruire les antibiotiques. L’étude de ces infections est donc primordiale. Le projet permettra de mettre à disposition un modèle d’infection à K. pneumoniae précieux, utile à l’évaluation de l’efficacité de composés anti-infectieux en développement, particulièrement attendus en thérapeutique.

Procédures

- Deux injections d’immunosuppresseur (5 secondes maxi) - Une instillation intramusculaire sous anesthésie

Impact sur les animaux

Avant l’infection, les souris seront immunodéprimées selon un protocole bien défini (150 mg/kg de cyclophosphamide à J-4 et 100 mg/kg à J-1). Ce protocole a déjà été utilisé dans plusieurs études et n’a montré aucun effet indésirable sur les animaux (injection de 5 secondes maximum en intrapéritonéal). A J0, l’administration intramusculaire de la suspension bactérienne sera réalisée par du personnel compétent et expérimenté (temps d’infection 15 secondes maximum, sous anesthésie volatile). Suite à l’infection, la principale nuisance sera associée à des signes locaux au niveau du site infectieux et à un tableau inflammatoire local (rougeur, gonflement, boiterie). Des expériences antérieures menées sur un modèle similaire n’ont pas montré de signes d’infection grave à 24h de suivi post-infection.

Devenir

A l’issue de la procédure, le tissu musculaire sera prélevé, de façon à quantifier la charge bactérienne

Remplacement

Actuellement, le recours au modèle murin est justifié par l’absence d’alternatives expérimentales capables de reproduire de manière pertinente la complexité des infections multi-résistantes, intégrant l’infection et la diffusion intratissulaire des antibiotiques. Même si d’autres essais in vitro dynamiques sont en cours, le recours à des animaux est une étape obligatoire et règlementaire dans le développement de molécules à visée thérapeutique.

Réduction

Le nombre d’animaux a été strictement limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement robustes, tout en respectant la variabilité biologique inhérente à ce genre d’étude. Aussi, des expériences précédentes sur des modèles similaires nous permettent de dire que 6 animaux par groupe (au lieu de 10) et par temps sont suffisants pour cette phase de mise au point de modèle.

Raffinement

Les injections intramusculaires seront réalisées par du personnel compétent et expérimenté et sous anesthésie volatile. Un programme d’enrichissement de l’environnement sera mis en place pour prévenir les comportements anormaux et problèmes de santé lié au stress de l’animal. Les animaux seront hébergés à 6 par cage. La principale nuisance sera liée à l’installation et à la progression de l’infection localement. Une surveillance accrue des signes locaux (toutes les 6-8h) sera réalisée tout au long des études. En fonction de ce score, l’administration d’un antalgique sera appliquée.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle de choix pour la mise au point de ces modèles d’infection bactérienne (largement décrit dans la littérature) ainsi que pour l’évaluation de thérapies antibiotiques ultérieures. Des souris de 8 semaines seront utilisées de façon à avoir un poids corporel d’environ 20-22g (même poids que pour les précédents modèles).

Une ligature est posée chaque semaine autour des molaires supérieures de 90 souris, avec deux injections dans la gencive par semaine pendant quatre semaines, pour leur provoquer une parodontite. Elles reçoivent en parallèle, cinq jours par semaine, une injection d'un agent qui épaissit leur peau et peut fibroser leurs poumons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs organes, l'objet étant de vérifier si une maladie des gencives favorise la sclérodermie systémique, une maladie auto-immune rare dont la cause reste inconnue. Le porteur affirme que ces gestes ne sont pas douloureux et ne justifient donc aucun antalgique, et retient la souris parce que les outils d'analyse immunitaire et parodontale y sont, écrit-il, très développés.

Objectifs

La sclérodermie systémique est une maladie autoimmune rare qui touche près de 10 000 personnes en France, principalement les femmes. La cause n’est pour le moment pas connue. Les patients atteints de sclérodermie systémique présentent fréquemment une parodontite, qui est une pathologie inflammatoire très répandue dans la population mondiale, puisqu’elle touche plus de 50% de la population âgée de plus de 50 ans. Elle est due à une dysbiose du microbiote parodontal et se caractérise par une inflammation des tissus de soutien des dents appelé parodonte, qui comprend la gencive, l’os alvéolaire et le ligament alvéolodentaire. La parodontite aboutit au déchaussement, voire à la perte des dents. Notre hypothèse est que la parodontite pourrait constituer un facteur de risque et avoir un impact sur le développement de la sclérodermie systémique. L’objectif de ce projet est de développer un modèle de souris permettant d'étudier l'impact de la parodontite dans le développement de la sclérodermie systémique.

Bénéfices attendus

La cause de la sclérodermie systémique n’est pour le moment pas connue, mais les facteurs environnementaux, et notamment la dysbiose du microbiote, jouent un rôle dans le déclenchement de la maladie. La mise en évidence de l’implication de la parodontite dans la physiopathologie de cette maladie autoimmune rare permettra ainsi d’améliorer la compréhension de la sclérodermie systémique, ce qui nécessaire pour pouvoir développer de nouveaux traitements dans le futur. Il n’existe en effet pour le moment pas de traitement permettant de guérir cette pathologie, qui a un fort impact sur la qualité de vie et la survie des patients

Procédures

Les animaux recevront une injection d’une molécule induisant une fibrose cutanée permettant de reproduire les caractéristiques de la sclérodermie systémique. Les premières injections seront réalisées sur animal anesthésié, puis, après une phase d’habituation et la mise en place d’un système de récompense, elles seront effectuées sur animal vigile. Ces injections, réalisées cinq jours par semaine, nécessitent moins de deux minutes. Les animaux subiront une pose d’une ligature autour des molaires supérieures (une fois par semaine, durée de 10 minutes) et deux injections gingivales (deux fois par semaine, durée de 5 minutes), toutes réalisées sur animal anesthésié, pendant une période de quatre semaines. Les animaux subiront trois prélèvements de sang, réalisés sur animal anesthésié, d'une durée d’environ 5 minutes chacun.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables liés à l’anesthésie générale sont le refroidissement corporel et une respiration un peu modifiée. Pour limiter ces effets, les souris seront placées sur une plaque chauffante et surveillées en continu jusqu’à leur réveil complet. L’anesthésie gazeuse peut être légèrement désagréable pour les animaux au moment de l’induction (du fait de l’odeur désagréable), mais elle reste moins stressante que de réaliser les gestes alors qu’ils sont éveillés. L’injection de l’agent fibrosant provoquera une fibrose (épaississement de la peau) au niveau du haut du dos, mais cela n’aura pas d’impact sur la mobilité des souris. Une réaction locale peut apparaître juste après l’injection, mais elle est généralement légère et disparaît rapidement. L’agent fibrosant peut également entraîner une fibrose au niveau des poumons, mais les signes cliniques restent en général très faibles. L’induction de la parodontite par la pose de ligatures et des injections gingivales entraînera une inflammation gingivale locale pouvant provoquer un inconfort transitoire. Toutefois, la durée limitée du protocole n’entraînera pas de mobilité ni de perte dentaire, et n’altèrera pas l’alimentation ou l’hydratation des animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux utilisés dans les procédures sera mis à mort à la fin des procédures (prélèvement post mortem de différents organes afin de réaliser les différentes analyses) ou en cas d'atteinte des points limites.

Remplacement

La règle du remplacement n'est pas applicable dans le cas de ce projet. En effet, nous devons avoir recours à un modèle in vivo afin d'étudier l’impact de la parodontite sur l’évolution de la sclérodermie systémique. Nous étudions notamment les réponses immunitaires, qui mettent en jeu la coopération de nombreuses cellulaires dans les organes tels que la rate et les ganglions. Pour ces raisons, nous ne pouvons avoir recours à l'utilisation de modèles in vitro. En ce qui concerne les modèles in vivo, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire ainsi que les mécanismes physiopathologiques parodontaux, car les connaissances et les outils d’analyse chez la souris sont très développés dans les domaines de l'immunité et de la parodontologie.

Réduction

Afin de respecter pleinement le principe des 3R, une réduction du nombre d’animaux utilisés a été mise en œuvre. Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été déterminé à partir de protocoles déjà bien établis dans la littérature et sur la base de calculs de puissance statistique. Ce travail a permis de définir, pour chaque question scientifique, le nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats robustes.

Raffinement

Nous porterons une attention particulière au bien-être animal notamment via le raffinement des conditions d’hébergement. Les souris seront maintenues en groupes sociaux dans des cages expérimentales équipées d’un couvercle filtrant avec enrichissement (tubes en polycarbonate rouge translucides, nids, frisures de carton...) sur des portoirs ventilés deux semaines avant le début des procédures, afin de réduire au maximum le stress animal. Une habituation à la manipulation sera réalisée de façon quotidienne après la première semaine d’acclimatation, jusqu’au début de la procédure. La plupart des gestes sera réalisée sous anesthésie générale. Des soins péri- et post-opératoires seront également réalisés. Les souris anesthésiées seront placées sur une plaque chauffante afin de maintenir leur température corporelle jusqu’à leur réveil de l'anesthésie. Une application de gel ophtalmique sera réalisée à intervalles réguliers jusqu’au réveil pour lubrifier la surface des yeux et de prévenir la déshydration. La pose des ligatures au niveau des molaires doit être réalisée sous anesthésie générale car elle nécessite le maintien d’une ouverture buccale de la souris pendant quelques minutes. Les gestes réalisés ne sont pas des gestes douloureux et ne nécessitent pas la mise en place d'un traitement antalgique. Les animaux seront pesés et évalués cliniquement à l'aide d'une grille de scores définissant des points limites, afin de les soustraire à la souffrance.

Choix des espèces

La souris est un modèle couramment utilisé en immunologie, en particulier dans le domaine de l'auto-immunité, le système immunitaire des souris étant proche du système immunitaire humain. Nous disposons de nombreuses techniques d'analyse du système immunitaire chez la souris et de l'expérience requise pour le suivi des réponses immunitaires chez la souris, ce qui nous permet de limiter le nombre d'animaux utilisés. Nous utiliserons des souris âgées entre 8 et 12 semaines, qui sont des souris avec système immunitaire complètement mature et chez qui la croissance osseuse du maxillaire et la physiologie du parodonte sont établies.

Les tests sont interrompus dès qu'une souris cherche à s'échapper. 864 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une sécheresse oculaire leur est provoquée chimiquement par instillation d'un conservateur, une à deux fois par jour pendant cinq semaines, avec jusqu'à neuf tests de sensibilité oculaire sous contention et six anesthésies générales par animal. Le porteur présente ce travail comme la preuve de concept qu'exige la phase de prématuration d'une molécule déjà brevetée, conçue pour faire sécréter de l'eau par les glandes lacrymales.

Objectifs

La sècheresse oculaire (Dry Eye Disease ou DED) est l’un des premiers motifs de consultation en ophtalmologie. Sa prévalence varie de 5 à 35 % chez des sujets âgés de plus de 50 ans. Cette pathologie du segment antérieur de l’œil est caractérisée par des sensations de douleur variables en intensité, allant du simple inconfort à une douleur oculaire prononcée. Les douleurs oculaires sont très difficiles à traiter et leurs mécanismes physiopathologiques demeurent peu connus. Nous avons récemment conçu une molécule qui induit la sécrétion d’eau à partir des glandes lacrymales. Notre projet a pour but d’apporter la preuve de concept nécessaire pour proposer cette molécule comme thérapie de la sécheresse oculaire en recherchant 1) si la composition des larmes induites est équilibrée et stable au cours du temps et 2) si, en induisant cette sécrétion naturelle, la molécule prévient l’inflammation et réduit l’activation des nocicepteurs responsables de la douleur oculaire. Nous utiliserons un modèle pharmacologique de souris validé pour l’étude du DED, permettant d’étudier la mise en place et la progression du syndrome. Les effets de la molécule d’intérêt (sous brevet) seront analysés dans le modèle in vivo en utilisant différents tests (nociception, volume des larmes et aspect de la cornée) et post mortem par des techniques de biologie cellulaire et histologie. Cette étude chez l'animal est un prérequis pour évaluer de manière intégrée le potentiel thérapeutique de notre molécule pour le DED.

Bénéfices attendus

La sécheresse oculaire est à l’origine d’une douleur oculaire chronique, fréquemment associée à des troubles visuels et à une hypersensibilité à la lumière, et constitue l’un des principaux motifs de consultation en ophtalmologie. Elle altère significativement la qualité de vie, près de 60 % des patients rapportant une gêne dans leurs activités quotidiennes, et demeure insuffisamment prise en charge, 80 % des patients estimant que leur douleur est sous-évaluée. Malgré une prévalence croissante, liée notamment au vieillissement de la population, à l’usage accru des écrans et à la chirurgie réfractive, les options thérapeutiques actuelles restent limitées, peu efficaces et souvent invasives, faisant de la sécheresse oculaire un véritable désert thérapeutique. Dans ce contexte, nos travaux visent au développement d’une solution thérapeutique originale et plus performante que les traitements actuellement disponibles. Le projet proposé a pour objectif de contribuer à une amélioration significative de la prise en charge de la sécheresse oculaire et d’ouvrir la voie au développement d’un futur médicament.

Procédures

Les animaux seront soumis à des applications oculaires de solutions liquides, réalisées sur animaux vigiles sous contention légère, consistant en l’instillation de petites gouttes dans chaque œil. Tous les animaux inclus dans les procédures expérimentales recevront des applications oculaires quotidiennes, une à deux fois par jour selon les groupes et la procédure considérée, pendant une durée maximale de cinq semaines. Chaque application durera environ une minute. Dans la procédure n°1, les mêmes animaux sont suivis tout au long de l’étude. En plus des applications oculaires, ils participeront à des tests fonctionnels oculaires non invasifs réalisés à l’état vigile, sous contention douce, afin d’évaluer la sensibilité oculaire. Ces tests pourront être réalisés jusqu’à neuf fois par animal (habituation comprise) sur une période maximale de six semaines, avec une durée de trois à cinq minutes par session. À chaque temps de mesure, ces mêmes animaux subiront ensuite des examens oculaires non invasifs réalisés sous anesthésie générale brève par inhalation, sans intervention chirurgicale. Chaque animal pourra être anesthésié jusqu’à six fois au cours de la procédure n°1, avec une induction inférieure à deux minutes et une durée totale n’excédant pas quinze minutes. Les examens dureront environ une à deux minutes par œil. La procédure n°1 ne comporte pas de mise à mort systématique : les animaux sont réveillés après chaque anesthésie et retournent dans leurs cages. En fin de suivi de la procédure n°1 (J42), une partie des animaux sera réutilisée dans un objectif de réduction du nombre total d’animaux. Ces animaux subiront alors une seule fois une anesthésie générale brève permettant la réalisation de prélèvements biologiques oculaires, immédiatement suivis de la mise à mort. La procédure n°2 est distincte de la procédure n°1 et réalisée sur des animaux dédiés, utilisés une seule fois à un temps expérimental donné (J7, J14, J21, J28 ou J35). Les animaux sont brièvement anesthésiés afin de permettre la collecte d’échantillons biologiques oculaires, puis immédiatement mis à mort. Il n’y a pas de suivi longitudinal des mêmes animaux et les résultats obtenus ne sont pas appariés.

Impact sur les animaux

Inconfort voire douleur d’intensité légère à modérée résultant de la sécheresse oculaire induite chimiquement par l’application d’un conservateur traditionnellement utilisé dans les gouttes pour les yeux et le nez chez l’Homme. Très léger inconfort produit par les contentions nécessaires aux gestes expérimentaux, léger inconfort lors du test comportemental de douleur, très léger inconfort résultant d’une anesthésie générale. Ce modèle murin sera donc soumis, de par la génération du syndrome des yeux secs et des procédures appliquées, à des nuisances/effets indésirables d’intensité légère à modérée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses histologiques post mortem.

Remplacement

De précédents travaux ont permis de caractériser et de breveter la molécule d'intérêt, de déterminer sa structure et son mode d'action dans différentes cultures cellulaires sur le transport de chlore. Cette phase de prématuration du projet exige maintenant un système biologique intégré tel qu’un organisme vivant pour caractériser précisément et quantifier les effets de la molécule in vivo. Le syndrome de sécheresse oculaire est d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Son apparition et sa gravité résultent donc de l’intégration de plusieurs défauts (neuro-inflammation etc) et les études sur l’animal intact sont essentielles et ne peuvent être remplacées. Ceci ne peut malheureusement pas être modélisé in vitro à ce stade du projet. Néanmoins, nous mènerons en parallèle des analyses protéomiques sur des cultures immortalisées de cellules de l'oeil.

Réduction

Les effectifs minimaux permettant d’obtenir des résultats fiables et robustes ont été calculés selon la méthode statistique de référence. Nous avons utilisé le programme GPower 3.1 : F-tests ANOVA 2 ways : Fixed effects, special, main effects and interactions. Effects size (medium) : 0.25 alpha err prob : 0.05 Power (1-beta err prob) : 0.8 . Le nombre de prélèvements effectués par animal a été maximisé afin de limiter les effectifs d’individus nécessaire à la collecte des données.

Raffinement

Notre expertise nous permet de mettre en œuvre des mesures de raffinement directement liées aux procédures expérimentales de ce projet, afin de limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux. Des séances d’habituation sont mises en place en amont des tests afin de familiariser les animaux avec l’expérimentateur, la contention manuelle douce et les gestes expérimentaux. Cette habituation progressive permet de réduire les réactions de stress lors des manipulations et d’améliorer la tolérance des procédures répétées. Les évaluations fonctionnelles oculaires réalisées à l’état vigile sont choisies pour leur caractère non invasif et sont systématiquement interrompues dès l’apparition d’un comportement d’échappement, permettant de limiter l’inconfort des animaux. Lorsque cela est nécessaire, les examens oculaires sont réalisés sous anesthésie générale brève par inhalation d’isoflurane, afin d’éviter toute douleur ou stress liés à l’immobilisation. Cette anesthésie est utilisée pour la réalisation des tests de Schirmer, du temps de rupture du film lacrymal (tBUT) et du marquage cornéen à la fluorescéine. L’état des animaux est évalué tout au long de la procédure sur la base de critères cliniques et comportementaux, permettant une adaptation immédiate des manipulations, l’espacement des tests ou la mise en œuvre de points limites précoces lorsque cela est nécessaire.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle d’étude en raison de ses similarités génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. Le modèle murins reproduisant le syndrome de l’oeil sec (DED, Dry Eye Disease) est un modèle validé et classiquement utilisé dans la littérature. Des animaux âgés de 3 à 5 mois seront utilisés. A cet âge les animaux sont de jeunes adultes, ce qui nous permet de déterminer l'efficacité de notre molécule sur la physiologie oculaire en nous affranchissant de biais potentiels liés au vieillissement.

306 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie d'entre elles, dépourvues de système immunitaire et non anesthésiées, reçoit d'abord 90 secondes de rayons X, puis toutes sont injectées dans la veine de la queue avec des cellules leucémiques humaines et suivies trois mois durant par douze séances d'imagerie, chacune précédée d'une injection dans l'abdomen. Quand l'imagerie n'est pas possible, le suivi passe par quatre prélèvements de moelle osseuse dans les pattes postérieures et neuf prises de sang à la joue sur animal éveillé. Le porteur affirme avoir mené le maximum d'expériences sur cellules, puis conclut que le recours à un "organisme vivant entier" est "indispensable" pour reproduire les conditions observées chez l'être humain.

Objectifs

La Leucémie Aiguë Lymphoblastique (LAL-T) et le lymphome T sont des cancers du sang caractérisés par la multiplication incontrôlée d'un type particulier de cellules sanguines de la famille des globules blancs appelées cellule T. Ces cellules une fois entrées dans ce processus de multiplication incontrôlé, ne remplissent plus leur fonction protectrice. Les traitements actuels reposent principalement sur la chimiothérapie et la greffe de moelle osseuse. Bien qu’ils aient permis d’améliorer la survie des patients, certains malades répondent mal à ces approches. Avec les avancées technologiques actuelles, de nouvelles stratégies thérapeutiques ont été mises en place. Elles ont pour objectif de réorienter les défenses immunitaires spécifiquement contre les cellules cancéreuses. Dans notre projet, nous modifions les globules blancs afin qu’ils expriment à leur surface des molécules spécialement conçues pour reconnaître et éliminer les cellules tumorales. Ces molécules sont capables de cibler deux marqueurs importants présents sur les cellules cancéreuses. En combinant ces deux molécules à la surface d’un même globule blanc, nous visons à rendre le traitement plus efficace et plus spécifique, tout en réduisant les risques d’effets indésirables. Cette approche pourrait ainsi offrir une nouvelle option thérapeutique pour les patients résistants aux traitements classiques.

Bénéfices attendus

Notre projet consiste à développer une nouvelle approche d’immunothérapie cellulaire ciblant deux types de cancers du sang (LAL-T et Lymphome T). Ce type de traitement a déjà montré de très bons résultats dans d’autres types de cancer, notamment chez des patients qui avaient rechuté après les traitements habituels. Avec ce projet, nous souhaitons offrir de nouvelles solutions plus sûres et plus efficaces, afin d’améliorer la prise en charge et les chances de guérison des personnes touchées par ces maladies.

Procédures

Pour mettre en place les modèles d’étude, une partie des souris dépourvues de système immunitaire et non anesthésiées seront d’abord soumises à un prétraitement par rayon X de 90 secondes afin de réduire le nombre de cellules sanguines murines et faciliter la greffe, survie et prolifération des cellules humaines injectées. L’ensemble des souris seront injectées avec soit des cellules cancéreuses humaines ou des cellules souches humaines en une fois par voie intraveineuse dans la veine de la queue de la souris non anesthésiée (durée : 30 secondes). Le traitement avec les cellules immunitaires modifiées est administré à l’ensemble des animaux en une fois par voie intraveineuse dans la veine de la queue de la souris non anesthésiée (durée 10 secondes). Pour suivre le développement du cancer et l’efficacité des traitements (3 mois de suivi), les cellules cancéreuses auront été modifiées génétiquement afin de pouvoir convertir en lumière une molécule (non toxique) qui sera administrée aux souris au moment du suivi par imagerie. Ces sessions d’imagerie sont non invasives et réalisées sur souris anesthésiées (nombre de session : 12 ; durée de la session : 10 min ; fréquence : tous les 7 jours). Les souris recevront une injection (1 injection par session soit 12 injections pour un suivi de 3 mois, durée 10s) dans la cavité abdominale d’une molécule permettant la visualisation des cellules cancéreuse. Dans le cas où le suivi de la maladie ne pourra pas se faire par imagerie (impossibilité de modifier génétiquement des cellules cancéreuses), des prélèvements de moelle osseuse au niveau des pattes postérieures seront réalisés sous anesthésie et analgésie (4 prélèvements en alternant la patte prélevée, durée : 5 minutes,1 fois toutes les 3 semaines) et par des prélèvements de sang au niveau de la veine de la joue des souris éveillées (9 prélèvements en alternant le site de prélèvement, durée 10s, 3 fois par mois). Pour le suivi du développement d’un système immunitaire humain et évalué la toxicité des traitements chez la souris (lot de souris exclusivement utilisé pour cette évaluation), 3 prélèvements de sang (durée :10s) au niveau de la veine de la joue des souris éveillées seront réalisés sur la totalité de l’étude soit 6 semaines.

Impact sur les animaux

Le prétraitement par rayon X des souris peut provoquer des diarrhées et une perte de poids. Il rend aussi la souris encore plus fragile aux infections. Les différentes sessions d’injection et de prélèvements sanguins sur souris éveillées peut causer une douleur légère et brève au niveau des sites d’injections et de prélèvements. Les prélèvements de moelle osseuse peuvent entrainer sur une très courte durée et dans des cas très rares une perte de mobilité partielle. Les animaux pourront ressentir un stress : - lors des différents changements d’environnement (passage de leur salle d’hébergement aux salles de manipulation), les souris peuvent ressentir un mal-être au cours du développement de la maladie se manifestant par une modification de leur comportement, de leur apparence physique d’une perte de poids, et dans certains cas l’apparition de paralysie.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure. Nous analyserons à partir de la moelle osseuse et de la rate prélevées en post-mortem, les différentes populations de cellules du système immunitaire et les traces de cellules tumorales résiduelles après traitement.

Remplacement

Nous avons réalisé le maximum d'expériences sur les cellules en laboratoire, afin de valider l'efficacité de nos cellules thérapeutiques. Cependant ces tests ne nous permettent pas d'évaluer à long terme ces cellules thérapeutiques. L’utilisation d’un organisme vivant entier est donc indispensable afin de reproduire les conditions observables chez l’Homme dans le cadre de leur utilisation en thérapie. De plus, il est nécessaire de vérifier ces résultats dans un modèle vivant entier, car celui-ci intègre la plupart des caractéristiques de ces pathologies humaines telles que l’existence de tissus sains, la présence de barrières limitant l'efficacité des traitements.

Réduction

Nous avons réduit le nombre d’animaux utilisés au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. Plusieurs groupes de souris seront analysés simultanément permettant de n’avoir qu’un seul groupe d’animaux « contrôle ». L’utilisation de l’imagerie sur animaux vivants permet également de réduire le nombre d’animaux utilisés grâce à l’analyse d’une même souris sur toute la durée de l’expérience.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Tout d'abord, les souris sont hébergées dans une structure répondant aux normes sanitaires requises avec de l’eau et de la nourriture à volonté. Des enrichissements sont mis en place (papier kraft pour la fabrication de nid, buchette en bois à ronger) afin que les animaux puissent répondre à leurs besoins primaires. Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Nous veillerons, par ailleurs, à réduire au minimum l’intensité et la durée des souffrances ressenties par les animaux. Un suivi hebdomadaire de signes cliniques renforcés sera réalisé à l’aide d’une grille d'évaluation comprenant différents critères comme l'apparence physique, le poids et le comportement des animaux. Les critères sont répartis en 4 catégories allant de 1 à 4. En fonction de la présence et de la catégorie du critère observé différentes actions seront mises en place. (Augmentation du suivi clinique 2 fois par semaine puis quotidien, accessibilité de la nourriture facilité, réhydratation de l’animal avec des injections de sérum physiologique et euthanasie de l’animal en cas d’attente de point limites). De plus le suivi hebdomadaire de la croissance des cellules cancéreuses, est une donnée prédictive précieuse qui nous permet d’agir en amont de l’apparition des signes cliniques délétères pour l’animal (exemple paralysie).

Choix des espèces

L’espèce animale choisie dans ce projet est la souris. Cette espèce présente l’avantage d’être un petit mammifère dont le comportement et les signes de bien-être clinique sont bien connus. Ainsi, l’évaluation du bien-être et du mal-être liés à l’expérimentation peut être effectuée aisément permettant une prise en charge rapide et adaptée. De plus, les modèles de cancer du sang sur des souris adultes dépourvues de système immunitaire sont bien décrits dans la littérature scientifique et reste le meilleur modèle pour la greffe de cellules humaines (cancéreuse ou saine). C'est pourquoi, nous utilisons des souris adultes âgées de 2 à 3 mois.