Recherche appliquée

1 536 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections destinées à faire exprimer un auto-antigène dans le foie, une vaccination dans les deux pattes arrière qui gonfle le muscle pendant douze à vingt-quatre heures, cinq injections en deux semaines sur animal éveillé et deux prélèvements de sang sous anesthésie. Le modèle actuel ne produit qu'une hépatite minime qui se résorbe vite, loin de la maladie humaine, et l'équipe veut donc invalider dans les cellules du foie les gènes de molécules immunitaires inhibitrices pour obtenir une auto-immunité qui dure. Foie, rate et sang sont prélevés après la mise à mort, le porteur affirmant qu'aucun système de remplacement pertinent n'existe et que les biopsies humaines sont rares et de petite taille.

Objectifs

L’hépatite auto-immune est une pathologie dont les causes restent méconnues. L’ L’hépatite auto-immune est caractérisée par une attaque immunitaire du foie conduisant à des niveaux élevés des enzymes hépatiques et des anticorps notamment des auto-antigènes. Les patients répondent pour la plupart bien aux traitements immunosuppresseurs non spécifiques; Toutefois, ces traitements à long terme ne sont pas sans effets délétères. Les cellules immunitaires sont classiquement considérées comme responsables des lésions hépatiques, mais les mécanismes cellulaires, notamment les antigène-spécifiques impliqués restent largement incompris. Notre équipe a mis en place des modèles murins ressemblant à l’hépatite auto-immune qui permettent d’étudier le rôle des cellules immunitaires spécifiques d’un antigène exprimé dans le foie. De nombreux outils sont disponibles pour l’expression et l’étude de cet antigène, permettant ainsi de suivre les réponses immunitaires spécifiques associée à l’antigène après expression de celui-ci dans le foie. Avec ce système, notre équipe a pu montrer que l’expression de l’antigène dans le foie des souris est tolérée et n’induit pas de réponse spécifique contre celui-ci, de plus que l’accumulation de cellules immunitaires dans le foie des souris dépend d’une immunisation préalable contre l’antigène et l’expression de celui-ci au niveau du foie. Nous avons également montré que les cellules immunitaires spécifiques de l’antigène ressemblaient aux cellules immunitaires auto-réactives chez les patients et que le blocage transitoire des molécules immunitaires inhibitrices perturbe le contrôle de cette réponse . Cependant, l’hépatite induite est peu détectable/minime et se résorbe rapidement ce qui diffère de la maladie chez l’homme. Notre hypothèse est que l’évolution chronique d’une auto-immunité dans le foie dépend d’une dérégulation de ces voies immunitaires inhibitrices sur le long terme. Dans cette mesure, nous souhaitons invalider, spécifiquement dans les hépatocytes, les gènes codant pour ces molécules inhibitrices et évaluer leur impact à court et long terme, ce qui permettrait une compréhension des mécanismes impliquées dans la maladie chez l’humain.

Bénéfices attendus

Nos travaux permettront de mettre en évidence comment l’environnement hépatique joue un rôle dans les réponses inflammatoires locales contre un auto-antigène hépatique, en identifiant des voies de signalisations essentielles au contrôle de ces réponses sur le long terme. Les résultats de nos travaux devraient apporter de nouvelles pistes thérapeutiques plus spécifiques contre la pathologie.

Procédures

Les animaux subiront plusieurs actes en fonction du protocole appliqué. Acte 1 : Les animaux recevront, des injections (durée de l’acte : 1 minute, animal anesthésié et analgésié localement). Cette injection sera réalisée dans tous les groupes une fois et un seul groupe recevra 3 injections supplémentaires une semaine après (1 jour d’intervalle/injection). Acte 2 : Les animaux recevront 5 injections (durée : 30 secondes, animal vigile), à 2 ou 3 jours d’intervalle. Acte 3 : Prélèvement sanguin (durée : 2 minutes, animal anesthésié et analgésié localement) une première fois durant le protocole et une dernière fois en fin de protocole.Acte 4 : Les animaux recevront, 1 injection / patte soit deux injections par souris (1 minute, animal anesthésié).

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, les animaux recevront des gestes plus ou moins douloureux au cours des différentes procédures. Une procédure d’injection répétée cinq fois en deux semaines pourra entrainer un inconfort local et transitoire au moment de l’injection dû au passage de l’aiguille dans la peau qui s’estompera 5 min après la procédure. . La vaccination des souris sera réalisée au niveau des deux pattes arrière qui entrainera un étirement local du muscle. Cette gêne temporaire associée à un gonflement du muscle durera entre 12h et 24h. La gêne disparait généralement 24h post injection. Lors des prélèvements sanguins un inconfort durant ces gestes est estimé à 1min correspondant au temps nécessaire à la réalisation du prélèvement. L’animal pourra également ressentir pendant 30 secondes une gêne lors de la réalisation du geste de compression pour arrêter le saignement éventuel post prélèvement. Les prélèvements et injections sont réalisées sous anesthésie gazeuse pouvant entrainer une phase de stress pour l’animal pendant environ 30 secondes avant la phase d’endormissement . De plus la phase de réveil avec le reprise de conscience sera également un facteur de stress qui durera environ 1min pour l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de récupérer différents tissus (sang, foie et rate) indispensables pour mener diverses analyses d’histologie, de biologie cellulaire, de biologie moléculaire, de biochimie et d’immunologie.

Remplacement

Dans ce projet, nous interrogeons les voies de régulations de l’auto-immunité dans le foie. Cet aspect ne peut être étudié chez le patient humain car le diagnostic de l’hépatite auto-immune est très tardif et les échantillons (biopsies) sont rares et de petites tailles. Par ailleurs, l’étude des mécanismes immunologiques dictant le développement de la pathologie n’est pas réalisable à l’échelle cellulaire et, à nos connaissances, il n’existe pas de système pertinent de remplacement. Ainsi, dans notre projet l’étude in vivo chez l’animal est indispensable car cela permet d’avoir accès à des échantillons de l’organe cible de la pathologie, le foie. Cela permet d’une part de mesurer les dommages hépatiques et d’autre part d’étudier l’environnement immunologique dans l’organe.

Réduction

Nous estimons que pour ce projet 1536 animaux seront étudiés. Les groupes expérimentaux seront constitués du minimum d’animaux nécessaire et suffisant pour permettre une analyse statistique robuste des effets observés. Pour cela, le calcul des effectifs a été réalisée par un calcul de puissance, basé sur des expériences préliminaires réalisées dans des conditions comparables. Durant le projet, une réduction du nombre d’animaux pourra être envisagée en fonction des résultats expérimentaux obtenus. Nous pourrons être amenés à manipuler moins d’animaux si l’effet de certains composés s’avère significatif au cours des premières expériences. A l’inverse, si l’effet d’un composé rejette l’hypothèse émise dès les premières expériences, le composé sera exclu des prochaines expérimentations afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Dans le but d’extraire le maximum de données de chaque animal, plusieurs tissues seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire).

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Afin de limiter le stress des animaux, un foisonnement à base de frisures de papier kraft sera mis dans les cages. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, si toutefois des souris paraissent agressives lors du protocole, une séparation pourrait être nécessaire avec le maintien d’un enrichissement de type tunnel rouge ou dôme. Les utilisateurs passeront régulièrement du temps avec les animaux avant les procédures et en dehors des jours d’expérimentation pour limiter leur stress et les habituer à être manipulés. Les animaux seront conditionnés afin de limiter le stress lors de la manipulation. Ainsi avant toute manipulation, un stimulus sonore (tapotement sur la cage) sera réalisé avant récupération pour les phases de manipulation. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale gazeuse et d’une analgésie locale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur un tapis chauffant. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un symptôme réversible sera signalé, l’animal recevra les soins nécessaires. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l'euthanasie de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

L’étude chez l’animal étant indispensable dans notre projet, nous travaillerons avec la souris (Mus musculus) qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. A nos connaissances, il n’existe pas de modèle pertinent pour étudier le développement de l’auto-immunité dans le foie utilisant une autre espèce animale. De plus, le modèle murin utilisé au cours de ce projet, et développé au sein du laboratoire, a déjà démontré sa pertinence pour étudier une réponse spécifique d’un antigène hépatique. Nous travaillerons avec des souris adultes de 8 à 12 semaines, car la croissance hépatique est achevée et le système immunitaire mature. A des âges plus avancés le système immunitaire ainsi que la capacité de prolifération du tissu hépatique peuvent varier, ce qui pourrait engendrer une plus grande variabilité au cours des expérimentations.

96 porcelets, sevrés à 28 jours et reçus à six ou huit kilos, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever foie, reins et tissus intestinaux. Ils subissent deux périodes de trois jours à six degrés au-dessus de leur zone de confort thermique, avec accélération de la respiration, baisse d'appétit, perte de poids et diminution de l'activité, ainsi que deux prises de sang à la jugulaire. L'aliment est complété en vitamine E, en polyphénols ou en métabolites de la vitamine D, pour voir si ces ajouts atténuent les effets de la chaleur du sevrage à l'engraissement. Le porteur présente ces stratégies comme un moyen d'améliorer "non seulement le bien-être animal, mais aussi les performances et la rentabilité des exploitations", et chiffre les pertes de productivité européennes de 5 à 15 %.

Objectifs

Le réchauffement climatique entraîne des températures plus élevées et des fluctuations de température plus importantes, ce qui rend difficile le maintien d'un environnement confortable pour les animaux, [[ leur santé et pouvant conduire à de la mortalité au cours des mises bas et pendant le transport]]. [[Les principales lignées de porcs utilisées pour la production mondiale]], sont particulièrement sensibles aux élévations de température en raison de leur nombre limité de glandes sudoripares et de leur zone thermo-neutre restreinte. Par conséquent, lors d’épisodes de températures élevées, les porcs peinent à réguler leur température corporelle. En réponse aux températures élevées, la fréquence respiratoire des porcs augmente, ce qui les expose à un stress oxydatif susceptible d’altérer leur immunité mais également de compromettre la qualité de la viande. De plus, sans stratégie de gestion de la chaleur, les porcs réduisent instinctivement leur consommation d'aliments pour minimiser la chaleur générée par la digestion, ce qui affecte négativement leurs performances de croissance.[[Aussi, la mise en œuvre de stratégies d’adaptation est nécessaire pour améliorer non seulement le bien-être animal, mais aussi les performances et la rentabilité des exploitations. Lorsque l’atténuation des effets de la chaleur par la ventilation des exploitations n’est pas suffisante, une approche nutritionnelle peut être considérée en plus avec l’apport de teneur plus élevée en vitamines d’extrait de substances naturelles comme les polyphénols]]. En effet, une supplémentation alimentaire en vitamine E, supérieure aux recommendations, a démontré son efficacité à atténuer le stress oxydatif chez les porcs exposés à des températures élevées. Par ailleurs, en plus de leurs propriétés antioxydantes, les polyphénols amélioreraient le fonctionnement du système immunitaire via des propriétés anti-inflammatoires, mais leur apport nécessite des études plus approfondies chez le porc. De plus, une supplémentation alimentaire en vitamine D (ou de ses métabolites) pour atténuer les perturbations induites par une élévation de température n'a pas été spécifiquement ou peu étudiée chez les animaux d’élevage.L’objectif de ce projet est d'évaluer l’ajout dans l’aliment de vitamine E, de polyphénols ou de différents métabolites de la vitamine D sur la prise alimentaire, la santé intestinale et les statuts oxydatif et immunitaire de porcelets et leur avantage en conditions de températures élevées.

Bénéfices attendus

[[Sans le développement de stratégies d’adaptation, le secteur porcins sera fortement vulnérable au changement climatique avec notamment des impacts sur la santé animale. L’alimentation constitue une stratégie d’adaptation pour faire face à l’augmentation des maladies liées à la chaleur, à l’altération de l’immunité, et aux risques de mortalité pendant le transport (les pertes pouvant atteindre 0.5% des animaux transportés en Europe) et la mise bas. La mise en place de stratégie permettra de réduire à court terme les pertes de productivité estimées de 5 à 15% au niveau européen. Aussi, ce projet permettra d’évaluer une stratégie d’adaptation alimentaire pour faire face aux impacts directs du changement climatique en déterminant]] : 1) si la vitamine D et ses métabolites, encore très peu étudiés, peuvent être utilisés comme stratégie nutritionnelle pour pallier aux changements physiologiques dus à une élévation de température chez le porcelet du post sevrage à l’engraissement, 2) dans quelle mesure les polyphénols, en tant qu'antioxydants, peuvent remplacer la vitamine E pour atténuer le stress oxydatif et l'alcalose respiratoire, tout en améliorant le bien-être des animaux et la qualité de la viande chez les porcelets, du sevrage à l'engraissement, dans des conditions de température élevée.

Procédures

Les animaux seront nourris avec un aliment standard répondant à leurs besoins nutritionnels. La moitié des animaux sera soumis à la procédure pour une durée de 5 semaines et l’autre de 14 semaines. Au cours des deux phases de la procédure, les animaux seront élevés en zone de confort thermique avec deux périodes de trois jours d’élévation de température pour la moitié des animaux. Les animaux seront soumis à des températures plus élevées (+6°C) par rapport à la zone de confort choisies de manière à déclencher les mécanismes de lutte contre la chaleur sur une courte durée de 3 jours, suffisante pour détecter des changements physiologiques sans induire de coup de chaleur ou de mortalité. Au cours de la procédure, les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins au niveau de la veine jugulaire. Les deux prélèvements sanguins seront réalisés avec une période de récupération inférieure à une semaine entre les deux. Pour chaque prise de sang, le temps de prélèvement ne dépassera pas 1 minute.

Impact sur les animaux

La durée de l’élévation de température de trois jours n’est pas assez longue pour enregistrer de la mortalité. Exposition d’une partie des animaux à deux périodes d’élévation de température avec une période de récupération de 9 semaines. Inconfort dû à la manipulation des animaux pour les pesées en phase 1 et en phase 2 de la procédure. Stress dû à la contention des animaux pour les prises de sang répétées. Augmentation de la fréquence respiratoire qui peut s’accompagner d’une diminution de l’appétit, d’une perte de poids et d’une diminution du niveau d’activité général.

Devenir

La moitié des animaux seront mis à mort pour le prélèvement d’échantillons biologiques (foie, reins, tissus intestinaux) à la fin de la phase 1 de la procédure et l’autre moitié à la fin de la phase 2 de la procédure.

Remplacement

La procédure expérimentale est nécessaire et ne peut pas être remplacée par une autre stratégie n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants. En effet la procédure vise à montrer l’impact d’une élévation de température sur les changements physiologiques chez l’animal qui sont complexes et nécessite de prendre en compte toutes les interactions cellulaires qui ont lieu afin de mieux appréhender le mode d’action des additifs alimentaires pour améliorer le bien-être des animaux.

Réduction

Des calculs statistiques détaillés ont été réalisés afin de déterminer le nombre d’animaux minimum a utilisé pour évaluer l’hypothèse de ce projet exploratoire. Le nombre d’animaux à utiliser permettra d’apporter des bonnes conditions d’élevage en favorisant une hiérarchie sociale essentielle au bien-être des animaux, et générer des données scientifiquement interprétables.

Raffinement

La manipulation des animaux en vue de leur pesée est réalisée dans le calme en évitant de claquer les portes des cages métalliques, en attrapant les porcelets par la patte arrière juste au-dessus du jarret et en le soulevant en plaçant l’autre main sous la poitrine pour les sortir. La conduite des animaux pour leur pesée individuelle (phase 2), est optimisée en limitant les sources de stress. Cela inclut le déplacement des porcs en groupe dans le calme, sans claquement des portes métalliques, et en tenant compte du point de balance de l’animal. L’opérateur doit porter une tenue de couleur sombre, et stimuler les animaux par la voix et la main afin de guider leur déplacement. Des panneaux de conduites sont autorisés pour la conduite des animaux. Le transfert des animaux, de la salle de croissance à la salle d’engraissement, se fera sans perturber la hiérarchie sociale en maintenant la composition des groupes. Lors des prises de sang en phase 1 et 2 de la procédure, l’inconfort et le stress dus à l’immobilisation des animaux sont réduits par une manipulation compétente et rapide des animaux par les applicateurs de la procédure, par un prélèvement de faibles volumes de sang en fonction de la volémie et par l’application d’un point de pression sur le site de prélèvement comme décrit dans le procédure interne qui définit le volume limite de prélèvement sanguin et les périodes de récupération nécessaires entre les deux prélèvements. A la fin de la prise de sang, l’animal peut être caressé au niveau du groin ou sous le cou.[[Les températures sont choisies de manière à déclencher les mécanismes de lutte contre la chaleur sur une courte durée de 3 jours. Les animaux qui passeront dans la phase 2 de la procédure subiront la deuxième élévation de température après une période de récupération de 9 semaines. Un rafraichissement des animaux sera effectué en aspergeant de l’eau dans la cage en cas de coup de chaleur prononcé.Les conditions d’hébergement des animaux sont définies de sorte que la densité des animaux par cage, ou encore les paramètres environnementaux (température et hygrométrie) procurent le maximum de confort, et restent en accord avec la législation en vigueur. Des enrichissements (jouets suspendus en caoutchouc ou à mâcher) sont mis en place dans toutes les cages.

Choix des espèces

L'évolution de l'industrie porcine vers des systèmes de production intensive à grande échelle a augmenté l'exposition des porcs aux facteurs de stress environnementaux et physiologiques. Les porcins constituent donc une cible privilégiée pour élaborer des stratégies efficaces de lutte et améliorer le bien-être et la santé des animaux en élevage. Procédure expérimentale réalisée en utilisant des porcelets sevrés à 28 jours d’âge au niveau de l’élevage et réceptionnés avec un poids vif de 6-8 kg en moyenne. Les animaux seront utilisés au stade de porcelets en post sevrage et conduit jusqu’au stade de l’engraissement afin dévaluer les stratégies alimentaires pour pallier les changements physiologiques dus à une élévation de température en fonction de l’âge des animaux.

Injection d'un vecteur viral dérivé de l'herpès dans le coussinet plantaire sous anesthésie gazeuse, anti-inflammatoire et antalgique le jour même puis le lendemain, gêne pour se déplacer pendant les deux heures qui suivent. 239 souris immunocompétentes sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Sur les études d'un an, chaque animal reçoit dix-sept administrations de luciférine suivies d'autant de séances d'imagerie sous anesthésie, que le porteur qualifie de non invasives et indolores, plus jusqu'à quatorze prélèvements de sang. Toutes sont tuées à l'issue pour quantifier l'expression du transgène dans les ganglions de la racine dorsale, la moelle épinière, le coussinet plantaire et le foie.

Objectifs

Le système nerveux périphérique fonctionne comme un réseau reliant le cerveau et la moelle épinière aux muscles, organes et tissus. Il contrôle les mouvements, les sensations (comme la chaleur ou le froid) et les réactions aux stimuli externes. Les troubles de ce système peuvent entraîner des altérations sensitives et motrices, responsables de pathologies telles des polyneuropathies, des douleurs chroniques, ainsi que des dysfonctionnements organiques comme la vessie neurogène, des troubles gastro-intestinaux (constipation ou diarrhée), des anomalies cardiovasculaires (hypotension orthostatique) ou des perturbations de la sudation. Une approche thérapeutique innovante consiste à utiliser des vecteurs viraux dérivés de l’herpès, modifiés pour être non pathogènes et non réplicatifs. Ces vecteurs modifiés exploitent la capacité naturelle du virus à remonter le long des nerfs, permettant une administration localisée au niveau des zones affectées. Ils sont conçus pour délivrer des gènes spécifiques aux neurones périphériques, notamment ceux situés dans les ganglions dorsaux, centres majeurs de ce réseau. Le projet vise à établir un modèle murin permettant d’analyser la distribution et l’expression d’un transgène transporté par ces vecteurs dans différents organes et sur des périodes prolongées. Pour suivre la localisation et l’efficacité des vecteurs, ceux-ci exprimeront un gène produisant une enzyme générant de la bioluminescence, détectable par imagerie non invasive chez la souris simplement anesthésiée. Cette méthode permettra de visualiser la présence et l’activité des vecteurs sans recourir à des techniques invasives. Ce projet inclut également l’évaluation de versions optimisées des vecteurs ainsi que la corrélation entre la bioluminescence et des marqueurs potentiellement détectables dans le sang. Si cette corrélation est confirmée, le suivi pourra être réalisé par prélèvements sanguins sans nécessiter de bioluminescence dans des projets ultérieurs.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de développer un modèle chez la souris permettant de suivre et d’analyser la pharmacocinétique des vecteurs viraux tout au long de la vie d’un même animal, en ciblant les neurones sensoriels ainsi que certains organes d’intérêt. Ce modèle vise à fournir des données essentielles pour comprendre la distribution, la durée d’action et l’efficacité de ces vecteurs en vue de futurs développements chez l'homme comme approche de thérapie génique contre des pathologies touchant le système nerveux périphérique. À court terme, le projet poursuit deux objectifs majeurs. Le premier consiste à définir les conditions optimales d’administration des vecteurs viraux afin d’obtenir une expression efficace et stable du transgène dans les organes cibles. Le second vise à évaluer l’impact de différents sites et modalités d’injection. Cette comparaison permettra de mieux comprendre le transport rétrograde des vecteurs, leur biodistribution dans les organes cibles tels que les ganglions dorsaux et la moelle épinière, ainsi que dans des organes non-cibles comme le foie. À long terme, ce modèle offrira la possibilité de prédire la durée d’action des traitements basés sur ces vecteurs viraux chez l’humain. Une meilleure compréhension de la pharmacocinétique et de la distribution des vecteurs tout au long de la vie d’un animal constituera ainsi un atout majeur pour le développement de thérapies géniques ciblées, plus efficaces et plus sûres chez l’homme Le projet donne l’opportunité d’évaluer l’activité des vecteurs par la mesure de biomarqueurs circulants en remplacement de la bioluminescence. Si cette approche s’avère concluante, ces analyses contribueront également à réduire le nombre d’animaux utilisés. Il permettra enfin l’identification de nouvelles cibles biologiques et d’ouvrir la voie à des indications supplémentaires pour lesquelles ces vecteurs pourraient être utilisés comme produits thérapeutiques, notamment dans le traitement de maladies chroniques.

Procédures

Administration de vecteur viraux dans le coussinet plantaire (unique ou double à 24h d’intervalle) ou dans le muscle de la patte (deux administrations contemporaines), chaque administration dure environ 30s sous anesthésie générale gazeuse. Administration d’anti-inflammatoire et d’antalgique en couverture de la ou des deux administrations de vecteur (20 minutes pré-administration, en fin de journée post-administration, suivies de deux administrations d’anti-inflammatoire le lendemain de l’injection) (contention de 30s et injection d’environ 10s). Administrations de luciférine (agent nécessaire à l’imagerie par bioluminescence) chez les souris vigiles, préalables aux imageries par bioluminescence (imagerie d’une durée de 20 min maximum par session réalisée sous anesthésie à l’isoflurane) : 7 fois sur la durée d’une étude de 28 jours et 17 fois sur une étude de longue durée (1 an). Prélèvements de sang chez la souris vigile avec contention d’une durée maximale de 2 min (moins de 30s) au maximum 14 fois (pour une étude d’une durée d’1 an) et dans le respect des volémies physiologiques et délais de récupérations.

Impact sur les animaux

− l’administration du vecteur viral (une ou deux fois maximum) sous anesthésie générale peut générer du stress et une douleur légère au réveil. − des prélèvements de sang au niveau de la veine marginale de la patte peuvent générer du stress et une douleur légère de courte durée. − des signes cliniques modérés observables associés à l’injection des virus (gène transitoire (moins de 2h) pour se mouvoir occasionnée par la localisation de l’injection dans le coussinet plantaire, inflammation potentielle autour du site d’injection (moins de 2h). - selon la voie d’administration du vecteur viral, les injections d’anti-inflammatoire et antalgique en aval et en couverture peuvent également générer du stress et une douleur légère. - stress et douleur légère liés aux mesures pour l’évaluation de la localisation des vecteurs viraux par de l’imagerie (répétées 7 fois pendant les études de 28 jours et 17 fois pendant les études de 1 an selon les procédures) et incluant l’administration de l’agent de bioluminescence préalable à chaque mesure - et l’anesthésie gazeuse d’une durée de 20 min maximum.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l’issue des études puisqu’il est nécessaire d’évaluer et de quantifier l’expression des vecteurs viraux dans les organes cibles comme les ganglions dorsaux, la moelle épinière, le coussinet plantaire et le foie. Des prélèvements d’organes d’intérêt et de sang seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, transcriptomique ou protéomique…).

Remplacement

Les méthodes in vitro ou in silico actuelles ne permettent pas de vérifier la migration des vecteurs viraux sur de longues distances dans les nerfs (plusieurs centimètres) ni de localiser précisément les vecteurs. En injectant le vecteur dans la patte de la souris, on peut suivre son trajet des terminaisons nerveuses localisées dans le site d’injection jusqu'aux noyaux de ces neurones localisés dans les ganglions de la racine dorsale (appelé transport rétrograde). Avant de tester sur les souris, des essais ont été faits en laboratoire sur des modèles de culture cellulaire. Les résultats en laboratoire sur des modèles de culture cellulaire ont montré des résultats encourageants mais il est maintenant indispensable de poursuivre ces recherches en utilisant un organisme complexe et entier pour pouvoir évaluer le transport rétrograde de ces vecteurs d’un organe donné jusqu’à un autre localisé à plusieurs centimètres de distance, ce qui est impossible dans les modèles in vitro car aucun dispositif in vitro ne mime à ce jour ce type de modèle.

Réduction

Un vecteur rapporteur utilisant la bioluminescence permet de suivre l'expression d'un gène d'intérêt qui lui est intégré. La création d'un modèle avec vecteur rapporteur facilite la vérification de la localisation de l'expression du transgène dans des organes cibles, comme les ganglions dorsaux, grâce à des techniques d'imagerie non invasive. Cela évite l'euthanasie des souris pour des mesures post-mortem à différents temps, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Cette méthode permet d'analyser la distribution et la pharmacocinétique sur une période prolongée chez un même animal, ce qui améliore la compréhension de la présence et de l'expression du transgène dérivé de vecteurs au fil du temps. À la fin de l'étude, tous les organes pertinents et des échantillons de sang sont collectés pour des analyses in vitro des gènes ou protéines cibles, optimisant ainsi les études et diminuant l’utilisation de souris supplémentaires pour obtenir des échantillons. Des études préliminaires sur des modèles animaux ont validé les conditions expérimentales, y compris les doses et les voies d'administration, nécessaires pour atteindre les objectifs du projet. La taille des groupes expérimentaux a été déterminée au strict minimum en fonction de ces données, pour permettre une analyse correcte des données d’étude, fixant le nombre final à huit souris par groupe traité et une souris par groupe témoin. Le nombre de souris par groupe pourra être réévalué au cours du projet si la variabilité observée est faible grâce aux conditions expérimentales établies. Les temps de cinétique pour l'euthanasie des groupes de souris, afin de corréler les données in vivo de bioluminescence et/ou de biomarqueurs sanguins avec les données ex vivo des organes cibles, ont été définis au minimum pour obtenir des données exploitables, contribuant à réduire le nombre d'animaux nécessaires. L'imagerie constitue une méthode non invasive et indolore, permettant un suivi régulier et longitudinal d'un même animal tout au long de l'étude. Un des objectifs de ce projet est de diminuer le nombre d'animaux requis pour les études futures en explorant la possibilité de suivre l'expression du vecteur viral sur de longues périodes uniquement par bioluminescence et/ou détection de l'activité du vecteur dans le sang, sans nécessiter l'euthanasie à différents temps pour des évaluations post-mortem.

Raffinement

La procédure d’injection dans le coussinet plantaire est réalisée selon les bonnes pratiques sous anesthésie générale gazeuse et sous couverture anti-inflammatoire et antalgique, avec un maintien de la température corporelle dès l’anesthésie jusqu’au réveil total de la souris. Une vigilance sera apportée sur la reprise de la marche et l’absence de signes de douleur pour l’animal post injection (suivi d’une potentielle gène). Des études en amont de ce projet déjà réalisées chez l’animal ont permis de confirmer l’absence de toxicité ou effets adverses liés à l’injection de ces virus. Les animaux font l’objet d’une observation clinique spécifiquement en post injection sur une durée de 24h puis tout au long des études, par les expérimentateurs et par les zootechniciens, pour s’assurer de leur rétablissement, de leur bien-être et de l’absence de signe clinique. En cas de signe clinique, le vétérinaire est alerté et les recommandations de la SBEA et les points limites seront appliqués. Le suivi de la localisation de l’expression du transgène à partir des vecteurs herpétiques non-réplicatifs par l’imagerie sous anesthésie gazeuse est une méthode non invasive pour l’animal et sans douleur qui permet de suivre un même animal tout au long de l’étude. Pour la seconde partie du projet, des prélèvements sanguins de petit volume vont être réalisés pour obtenir des informations supplémentaires, comme le profil d'exposition plasmatique et l’analyse de l’expression du vecteur rapporteur dans le sang. La validation de cette opportunité de mesure du vecteur rapporteur dans le sang permettra d’émettre l’hypothèse d’une expression du vecteur dans les organes cibles. Dans ce contexte, cela permettra de raffiner la procédure expérimentale en ne nécessitant plus le recours à des anesthésies répétées (une fois par mois/1 an) pour les études de longue durée.

Choix des espèces

Dans le cadre du projet, les souris seront utilisées. Il est crucial d'évaluer la pharmacocinétique du vecteur chez un animal doté d'un système immunitaire compétent. Le choix de cette espèce est basé sur des études antérieures qui ont permis de comprendre la biodistribution de premières générations du vecteur chez la souris immunocompétente et d’établir une transposabilité avec l’homme. En effet, tout comme chez l’homme, le système immunitaire de la souris permet le même comportement du vecteur dans l’organisme, incluant l’entrée en latence du vecteur et l’expression du transgène qu’il comporte. Dans le modèle murin, les mécanismes de transport rétrograde du vecteur viral sont conservés. Il est nécessaire de continuer à approfondir les connaissances sur cette même espèce et souche immunocompétente. Ainsi, dans le cadre de ce projet la souris constitue un modèle prédictif de l’homme. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 8 semaines. Il s’agit de l’âge d’utilisation classique des souris dans ce cas. L’innervation du coussinet plantaire par les neurones sensoriels provenant des ganglions de la racine dorsale est considérée bien établie et homogène entre les souris lorsqu’elles ont atteint l’âge de 8 semaines.

Jusqu'à douze séances d'imagerie sous anesthésie générale, chacune précédée d'une injection sur animal vigile, et six à sept prélèvements de sang sans anesthésie : 101 souris femelles dépourvues de système immunitaire vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules leucémiques humaines leur sont injectées, puis des cellules CAR-T dites universelles, cette version modifiée du projet doublant les injections du médicament qui facilite la prise de greffe. Le porteur annonce de probables maux de tête et nausées, et un déficit moteur des membres inférieurs si la tumeur atteint la moelle osseuse. Toutes sont mises à mort pour prélèvement de tissus, ou plus tôt si un point limite est atteint.

Objectifs

Notre corps possède des défenses naturelles contre les maladies : le système immunitaire. Celui-ci est constitué notamment de cellules tueuses, qui peuvent éliminer des cellules infectées ou anormales. Cependant lors d’un cancer, ces cellules n’ont pas forcément la capacité de reconnaître les cellules cancéreuses. Ainsi le cancer se propage. Une nouvelle approche de thérapie cellulaire, appelée CAR-T, améliore cette capacité à cibler les cellules cancéreuses. Les cellules tueuses issues d’un patient atteint d’un cancer sont modifiées génétiquement pour que celles-ci ciblent au mieux les cellules cancéreuses. Cependant, cette approche est 100% personnalisée : longue, coûteuse et incertaine. Pour contourner ces limites, nous développons une alternative : des cellules tueuses reprogrammées « universelles » issues d’un donneur sain et non pas d’un patient. Ces cellules universelles peuvent s’adapter au système immunitaire de chaque patient sans risque de rejet, rendant le traitement plus rapide et accessible. L’objectif de cette étude est de tester ces cellules universelles dans un modèle de souris afin d’observer leur comportement et leur efficacité contre le cancer. Nous voulons notamment vérifier si une modification spécifique améliore leur action anticancéreuse en bloquant un certain mécanisme biologique. À terme, ce projet pourrait ouvrir la voie à des thérapies plus efficaces et accessibles contre le cancer, en simplifiant la production des cellules CAR-T pour une utilisation en clinique.

Bénéfices attendus

Les résultats positifs de ce projet pourraient aboutir à la mise sur le marché d'un nouveau médicament de thérapie cellulaire pour les patients en impasse thérapeutique. Ce médicament sera à la fois plus puissant et plus sûr que les traitements actuels, produit à des coûts drastiquement diminués (puisqu'il s'agit d'une thérapie cellulaire universelle) et donc disponibles à l'ensemble des patients qui en ont besoin. De plus, cela permettra d’avoir un modèle de souris pertinent pour les études des cellules tueuses reprogrammées.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Injection de cellules tumorales par voie intraveineuse, sans anesthésie (1x/souris, durée ~5 minutes). Injection de cellules thérapeutiques matures ou immatures par voie intraveineuse, sans anesthésie (1x/souris, durée ~5 minutes). Injection d’un médicament afin de permettre la prise de greffe des cellules thérapeutiques immatures (1x/souris MODIFICATION : 2X/SOURIS, durée ~1 minutes). Imagerie sous anesthésie générale, jusqu’à 12 fois par souris (durée ~10 minutes par session, 1x/semaine), précédée de l’injection d’un agent de détection de la tumeur sur souris vigile (jusqu’à 12x/souris, durée ~1 minute). Prélèvements sanguins, réalisés sans anesthésie (6-7x/souris, ~1 minute, 1x/2semaines) soit sous anesthésie générale (1x/souris, ~5 minutes, pour le dernier prélèvement).

Impact sur les animaux

Stress : l’ensemble des manipulations, contentions et transports peut engendrer un stress chez les souris. Douleurs légères : potentiellement présentes après injection intraveineuse (de cellules CAR-T matures, non matures) ou abdominale et prélèvements sanguins sous antidouleur. Probables maux de tête et nausée par suite du traitement avec un médicament. Altération de l’état général : possible en lien avec le développement tumoral exemple : perte de poids. Déficit moteur des membres inférieurs : possible si la tumeur atteint la moelle osseuse des membres.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort car nous prélèverons des tissus post-mortem pour analyse ou si un point limite est atteint en cours de procédure.

Remplacement

Les cellules tueuses du cancer ont été étudiées en laboratoire. Cependant, la réponse du système immunitaire est très complexe, car elle implique différents types de cellules et des interactions spécifiques. Cela rend difficile d’étudier la réponse complète seulement en laboratoire. Pour cette raison, nous devons utiliser des souris pour ces recherches thérapeutiques, car on ne peut pas encore se passer d'un modèle préclinique avant les essais clinique chez l'Homme. De plus, on utilise des souris modifiées et disponibles à l'achat pour avoir un système immunitaire humain, ce qui permet de tester des cellules humaines directement applicables ensuite en essai clinique. Avant d'être testées chez la souris, les cellules ont été validées dans notre laboratoire selon nos meilleures connaissances. Nous obtenons ainsi des informations qui ne peuvent être obtenues que chez la souris et nous les utiliserons pour réduire encore davantage le recours aux expérimentations animales à l'avenir.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au minimum sans toutefois compromettre l’analyse statistique des résultats. En effet, un outil statistique a été utilisé pour calculer le bon nombre d’animaux à utiliser. Suivre les animaux au fils du temps par des analyses répétées comme l’imagerie (grossissement de la tumeur) et le contrôle du sang entraîne une meilleure analyse de l’effet biologique, ce qui permet des expériences à haute puissance avec un faible nombre de souris.

Raffinement

Tout au long de ce projet, nous serons attentifs au bien-être des animaux grâce à un suivi quotidien des animaux afin de d’observer leur comportement, leur apparence et tous signes qui permettraient d’identifier des indications révélatrices de souffrance animale. Des points limites clairs sont définis pour arrêter le projet afin de limiter la souffrance des animaux. Un tapis chauffant afin d’éviter l’hypothermie de l’animal sera mis en place et du gel hydratant oculaire sera appliqué afin d’éviter un dessèchement lors des séances d’imagerie. Les animaux seront placés sous anesthésie générale et auront des antidouleurs adaptés. De plus, ce projet fait suite à une étude bibliographique afin de raffiner au maximum les expériences, les injections et les prélèvements. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement.

Choix des espèces

Nous utiliserons exclusivement des souris femelles génétiquement modifiées dépourvues de système immunitaire. Ces modèles permettent la greffe de cellules humaines, le développement d’un système immunitaire humanisé, ainsi que la croissance de tumeurs humaines. En plus de leur grande sensibilité aux agents pathogènes, nécessitant des conditions d’élevage en milieu stérile, ces souris présentent une apparence et un comportement comparables à ceux de leurs congénères non modifiées. Le choix d’utiliser uniquement des femelles est motivé par nos observations expérimentales précédentes: chez les femelles, les tumeurs se développent de manière plus régulière, homogène et prévisible, ce qui améliore la reproductibilité et la fiabilité des résultats. Des souris âgées de 4-8 semaines sont utilisées, afin d’observer si le développement des cellules humaines s’effectue de manière plus optimale en l’absence d’interaction avec les cellules immunitaires de souris.

Chercher la dose maximale tolérée revient ici à administrer des candidats médicaments anticancéreux jusqu'à quatre fois par jour à des souris, saines ou porteuses d'une tumeur humaine greffée, pour repérer où apparaissent les effets toxiques. 880 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le porteur annonce des douleurs post-opératoires, un risque d'infection, des diarrhées et une perte de poids allant jusqu'à la cachexie et l'anorexie. Le projet vise à réduire les effets secondaires subis par les patients, en produisant délibérément ces mêmes effets chez 880 souris réparties sur vingt études.

Objectifs

Le but de ce projet est de tester la toxicité de nouveaux traitements contre le cancer sur l’organisme des souris. En effet, dans le cadre du développement de médicaments, il est essentiel d’identifier les doses de traitement tolérées par l’organisme et de mettre en évidence les effets secondaires potentiels. Ces analyses peuvent être effectuées sur des animaux sains, c’est-à-dire qui n’a pas développé de cancer, ou bien sur des animaux qui ont développé un cancer pour mettre en relation les effets du traitement et avec ceux du cancer. Pour les animaux ayant développé un cancer, nous utiliserons des modèles de tumeurs humaines implantés chez la souris. Ces modèles, appelés xénogreffes dérivées de patients (PDX), permettent de reproduire au mieux les caractéristiques des tumeurs humaines, comme leur morphologie, leurs mutations et leur comportement biologique. Grâce à cela, ils offrent un moyen fiable d’évaluer l’action de nouveaux médicaments avant qu’ils ne soient testés chez l’Homme. Notre collection de modèles PDX couvre la majorité des cancers solides (par exemple : sein, poumon, côlon, foie, rein, peau, pancréas, ovaire, vessie, cerveau ou prostate) et reflète la diversité des patients. Chaque modèle est soigneusement étudié afin de mieux comprendre ses particularités et de relier ces informations à la réponse observée aux différents traitements anticancéreux. Les 20 études prévues dans ce projet sont réalisées à un stade précoce du développement des médicaments, elles permettent d’obtenir des résultats francs sur la toxicité des nouveaux traitements. Elles consistent à tester une gamme de différentes doses d’un ou plusieurs traitements sur un nombre strictement nécessaire d’animaux, afin de mettre en évidence les effets secondaires associés à chaque dose, et d’identifier une dose maximale tolérée par l’organisme. Une fois la dose maximale déterminée, l’efficacité des traitements à cette dose sera étudiée sur de plus grands effectifs pour obtenir des données robustes sur l’effet antitumoral.

Bénéfices attendus

Chaque année, dans le monde, près de 20 millions de personnes sont diagnostiquées atteintes d’un cancer (tous types confondus) dont plus de 400 000 en France, et on recense plus de 10 millions de décès (1/6) dont plus de 150 000 en France. Le nombre de personnes atteintes d’un cancer est en constante évolution, mais les progrès en terme de développement de traitements depuis 25 ans ont permis d’observer une diminution de la mortalité. La recherche de nouvelles solutions thérapeutiques est essentielle pour espérer diminuer le taux de mortalité dû au cancer, ainsi que limiter les effets indésirables pour les cancers avec des taux de guérison les plus élevés. En effet, les traitements sont souvent nocifs pour l’organisme, par exemple le cisplatine est un traitement utilisé dans plusieurs types de cancers et qui provoque des effets toxiques sur les reins, la moëlle osseuse ou encore l’audition avec de nombreux enfants atteints de cancers devenant malentendants. Dans ce contexte, ce projet a pour objectif de déterminer la dose maximale de médicament tolérée, sans effet toxique, pour chaque médicament antitumoral en développement. Les tests sont réalisés sur des animaux n’ayant pas développé de tumeur pour observer de façon directe les effets toxiques, ou sur des animaux avec une tumeur en développement pour y associer les effets de la tumeur (elle peut modifier l’action des traitements). Les traitements les plus prometteurs, pour lesquels les effets indésirables et toxiques seront absents ou moindres à une certaine dose, seront sélectionnés afin de tester l’effet antitumoral de cette dose. A terme, ces travaux devraient permettre de proposer de nouvelles alternatives thérapeutiques aux patients pour lesquels les traitements actuels provoquent de nombreux effets secondaires. Ils participeront également à améliorer l’efficacité des traitements actuels ou identifier de nouveaux médicaments pour les patients pour lesquels les traitements sont inefficaces ou inexistants.

Procédures

Greffe (le cas échéant): implantation d’un fragment tumoral sous la peau. Le temps de chirurgie n’excèdera pas 10 minutes. Identification : des puces électroniques sont implantées en sous cutané ou un marquage aux oreilles est réalisé. Surveillance des animaux : observation quotidienne du comportement par déplacement et/ou ouverture des cages d’hébergement. Administration de médicament : préhension des animaux à une fréquence dépendant du schéma de traitement jusqu’à 4 administrations par jour. La durée de préhension n’excèdera pas 1 minute.

Impact sur les animaux

Stress dû à l’administration de molécules: nuisance transitoire (plusieurs minutes) de classe légère, jusqu’à 4 administrations par jour selon le schéma de traitement ; Douleurs post-opératoires: nuisance transitoire (plusieurs heures) de classe modérée ; Risque d’infection: nuisance transitoire (plusieurs jours) de classe modérée ; Perte de poids (cachexie, anorexie ou perte d’appétit): nuisance transitoire (plusieurs jours) de classe modérée ; Diarrhées: nuisance transitoire (plusieurs jours) de classe modérée.

Devenir

Les animaux porteurs de tumeur et non porteurs de tumeurs seront tous euthanasiés pour réaliser les analyses associées (biologiques) et compte tenu des nuisances occasionnées.

Remplacement

Le développement de nouveaux traitements permettant de lutter contre le cancer nécessite la réalisation de tests précliniques afin de valider leur absence de toxicité sur l’organisme et leur efficacité sur la croissance tumorale, avant une application chez l’Homme. Il existe des méthodes alternatives et préalables à la réalisation de tests sur les animaux (prédictions informatiques, in vitro …), permettant de tester rapidement un grand nombre de molécules, et de sélectionner celles qui semblent les plus efficaces. Cependant, ces méthodes réalisées en dehors du cadre d’un organisme vivant n’offrent pas la possibilité de lier les effets indésirables des traitements avec la complexité de l’organisme, par exemple elles ne prennent pas en compte l’effet de la circulation sanguine ou le rôle du foie dans la transformation et la distribution des médicaments. Cela limite la possibilité de prévoir comment un traitement agira réellement dans le corps d’un patient. C’est pourquoi, une fois les tests préliminaires terminés, et les molécules les plus prometteuses identifiées, il est nécessaire de poursuivre leur évaluation chez l’animal. Ces études sont réalisées sur un nombre strictement minimal pour obtenir des résultats francs sur la toxicité des molécules testées.

Réduction

Ce projet utilise le nombre d’animaux strictement nécessaire pour obtenir des résultats francs lors des étapes précoces d’évaluation des traitements. Les traitements évalués ont été sélectionnés au préalable par des études in vitro et/ou in vivo pour leur potentiel thérapeutique. Les expériences sont réalisées sur des groupes de souris de taille minimale pour observer l’effet toxique des médicaments testés en tenant compte des variations environnementales et des effets indésirables pouvant survenir indépendamment des traitements, avant de valider l’efficacité tumorale de ces médicaments et avant des essais cliniques chez l’Homme.

Raffinement

Pour prévenir l’hypothermie durant l’acte chirurgical (le cas échéant), les animaux seront placés sur un tapis chauffant. Pour la prévention de la douleur et la souffrance lors de l’acte chirurgical et lors de prélèvements invasifs (le cas échéant), les animaux recevront une anesthésie générale. Les produits d’anesthésie générale proposés sont suffisants pour obtenir un effet anti-douleur en plus de l’effet anesthésique profond pour le temps et le type d’intervention réalisée. Pour les soins, si une lésion ou une sécheresse sont observées au niveau de la sphère oculaire, une solution nettoyante et/ou protectrice sera appliquée. Si une lésion cutanée est observée, une solution antiseptique sera appliquée. En cas d’infection, des analyses bactériologiques et/ou virologiques pourront être effectuées pour instaurer une thérapie adéquate et l’animal pourra être isolé pour lui permettre de se rétablir sans la présence de ses congénères. Dans ce cas, divers matériaux ajoutés pour atténuer l’effet d’isolement et permettre la création d’un cocon. Après l’administration de molécules, l’animal sera observé pour détecter tout comportement inattendu. Aussi, un point de compression sera réalisé au site d’administration si nécessaire. Si ces points de raffinement ne sont pas suffisants, les mesures associées aux points limites de ce projet seront appliquées.

Choix des espèces

Nous utilisons des souches murines immunodéficientes qui sont classiquement utilisées pour des greffes de tumeurs humaines et dans le cadre d'évaluations pharmacologiques. Ces souris présentant un système immunitaire résiduel qui se développe avec l'âge et qui peut réduire le taux de prise de greffe, nous utiliserons des animaux âgés de 5 à 13 semaines en fin de période d'acclimatation, pour augmenter nos chances de succès. Afin d'homogénéiser les conditions entre les différentes études, nous utiliserons également des souches murines immunodéficientes pour les études sur souris non porteuses de tumeur, âgées de maximum 13 semaines en fin de période d'acclimatation.