Recherche appliquée

Immunodéficientes pour accepter la greffe de cellules humaines tumorales et immunitaires, 205 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent d'abord une chirurgie sous anesthésie, puis une semaine plus tard l'injection des cellules humaines, puis une injection de Rose Bengale dans la tumeur suivie d'une illumination de dix minutes, une immunothérapie hebdomadaire et un prélèvement sanguin par semaine. La croissance des tumeurs est suivie au pied à coulisse sur animal vigile ou par imagerie sous anesthésie. Le porteur écrit que la maîtrise de la douleur implique pour les animaux de ne pas en subir, et annonce par ailleurs que chez les groupes témoins la tumeur continuera de croître jusqu'au point limite critique.

Objectifs

Le mélanome est un cancer agressif fortement immunogène dont l’incidence et la mortalité demeurent inquiétantes. Le traitement de 1ère intention repose sur des immunothérapies et des thérapies ciblées. Cependant certains patients échappent au traitement. La thérapie photodynamique (PDT), utilisée de manière courante en dermatologie, consiste en l’illumination de cellules tumorales préalablement photosensibilisées par un agent pharmacologique. En présence d’oxygène, et suite à une exposition à une lumière appropriée, l’agent photosensibilisateur (PS) génère des espèces réactives de l’oxygène responsables de la mort tumorale associée à une réponse immunologique permettant d’accentuer l’effet antitumoral de la PDT. La PDT antitumorale émerge comme une nouvelle modalité de traitement efficace avec un nombre croissant d’essais cliniques de faisabilité sur divers modèles d’études dont le mélanome. Le Rose Bengale (RB) est un PS déjà employé en clinique, mais pour de la PDT, or il est un bon candidat pour des lésions cutanées comme le mélanome. Notre projet vise donc à tester l’efficacité in-vivo de la PDT au Rose Bengale dans le mélanome ; à vérifier l’effet immunogène de ce traitement dans un modèle simple et grâce à un modèle à deux tumeurs pour estimer le potentiel abscopal (à distance de la lésion traitée) du traitement. Le positionnement de la PDT dans la stratégie de traitement sera également estimé en associant la PDT-RB à une immunothérapie spécifique ou sur un modèle de cellules résistantes aux thérapies ciblées.

Bénéfices attendus

Il s'agit pour nous d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements dirigés contre le mélanome humain. Les paramètres de PDT-RB testés auront préalablement été sélectionnés sur un ensemble d'expériences réalisées sur les modèles cellulaires en laboratoire. Il s'agira donc de confirmer l'efficacité de la PDT-RB dans le cadre d'un être vivant complet humanisé. Le bénéfice à long terme sera de pouvoir mettre sur le marché de un nouveau traitement, de le positionner dans la stratégie thérapeutique et ainsi d'aider dans la lutte contre le mélanome. L'analyse de l'importance de la réponse immunitaire sur leur mode d'action fait que ces futurs traitements pourraient s'intégrer dans des programmes adaptés à chaque patient au bénéfice d'une médecine personnalisée.

Procédures

Toutes les procédures ont en commun la mise en place du modèle et pour cela les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale (10 min entre l’endormissement et le réveil). La cicatrice pourrait également être l'objet de démangeaison légère sur les 5 premiers jours. Une semaine après, les animaux subiront l’injection de cellules humaines à la fois immunitaires et tumorales, ce qui pourrait engendrer un léger stress de courte durée. Le modèle en place permettra de tester les traitements. Pour la PDT, les animaux auront une injection intratumorale du Rose Bengale (RB) et seront illuminées (extracorporel) 2h après l'injection pendant 10 min. L'injection pourra être la source d'un stress léger de courte durée. L’immunothérapie sera ajoutée par une injection qui sera répétée toutes les semaines (1 fois par semaine); là encore un stress legéer de courte durée pourrait etre generé à chaque injection. Pour le suivi immunologique, un prélèvement de sang sera réalisé préalablement à tout traitement, puis une fois par semaine. Chaque prélèvement pourra être source d'un stress léger de courte durée. Le suivi de la croissance se fera par 2 méthodes. Il s'agira, soit d’utiliser les propriétés du modèle cellulaire qui exprime une enzyme responsable de la création de lumière et de faire un suivi par imagerie. Ce dernier nécessite l’endormissement sous anesthésie gazeuse des animaux, puis l’injection du substrat lumineux. Soit, d'utiliser un modèle n’exprimant pas l’enzyme responsable de la création de lumière et la mesure de la croissance tumorale se fera au moyen d’un pied à coulisse sur animal vigile (contention et mesures) ; toutes les souris auront également le suivi régulier de la croissance par le pied à coulisse.La contention et l'injection du produit d'illumination, de même qu eles anesthésie pourraient être la source d'un stress léger de courte durée mais répété. En fin de protocole, l’ensemble des animaux sera mis à mort, le sang, la tumeur et les organes vitaux seront récupérés pour analyses complémentaires.

Impact sur les animaux

La maîtrise de la douleur et le respect des règles éthiques implique pour les animaux de ne pas subir de douleur. Néanmoins, la procédure expérimentale engendrera inévitablement un stress , là encore, il sera réduit au strict minimum par divers leviers (visite et manipulations régulières, anesthésies gazeuses préalables). L'emplacement des tumeurs est étudié pour ne gêner en rien la locomotion ou l'alimentation des animaux.

Devenir

Tous les animaux auront reçu l'injection d'une masse tumorale suivie ou non d'un traitement expérimental. Selon l'efficacité des traitements, la croissance de la tumeur sera ralentie voire disparaitra, dans le cas contraire et pour les groupes témoins, la tumeur continuera de croitre jusqu'au point limite critique pour son bien-être. Nous pouvons ajouter également que pour des raisons scientifiques, nous devons procéder à la récupération des tissus (sang, tumeur, organes vitaux) qui nous serviront à confirmer l'efficacité du traitement et confirmer son mode d'action. L'ensemble de ces nécessités, éthiques et scientifiques, justifient la mise à mort des animaux en fin de procédure.

Remplacement

Notre objectif est de tester de l’efficacité anti tumorale de notre thérapie (qui de plus est immuno-activatrice) seule ou en combinaison avec des immunothérapies (réduction des mécanismes immunorégulateurs). Des travaux préalables ont été réalisés sur les modèles de lignées cellulaires. Ces résultats mettent en évidence la faisabilité du projet au travers de la validation de l'application de notre thérapie et/ou des immunothérapies in-vitro; dont plusieurs paramètres ont été ainsi fixés. Cependant, s'agissant de développer une nouvelle approche thérapeutique, il est primordial que celle-ci soit également évaluée dans un système physiologique complet, en ce sens un modèle in-vivo est le plus adéquat, voire nécessaire. Le suivi par bioluminecence permet de diminuer le nombre d'animaux, néanmoins, une validation de l'efficacité nécessite d'emblée que plusieurs groupes expérimentaux soient présents, notamment les groupes contrôles, non traités, et traitement unique ou traitement combiné de manière à limiter quantitativement les expérimentations. Dans la mesure où la modélisation expérimentale cellulaire ou in-silico est trop imparfaite, ce type de modèle demeure indispensable à la validation de ces futurs traitements.

Réduction

Grâce à notre experience nous bénéficions de protocoles déjà approuvés ce qui permet de ne pas avoir à faire de mise au point. L'ensemble des animaux ne servira uniquement que pour l'étude de l'effet des traitements. Néanmoins, dans un souci de conservation de la fiabilité des résultats et pour ainsi éviter d'avoir à refaire les expériences, nous réaliserons des groupes d'étude suffisamment solides d'un point de vue biostatistique (validé grâce à un outil d'évaluation en ligne). Ainsi, pour des modèles humanisés des groupes de 5 souris pour 5 reconstitutions seront suffisants. Le suivi de croissance tumorale se fera de manière externe sans nécessité de recours à une dissection, permettant ainsi un suivi longitudinal optimisé sans mise à mort. Enfin, il s'agira de ne tester que les molécules déjà présélectionnées pour leur efficacité dans les modèles précliniques in-vitro.

Raffinement

Nous avons cherché à optimiser l'expérimentation en mettant en place une méthodologie d'étude courte et efficace : suivi de tumeur sur un temps limité (4 semaines maximum), tout en minimisant les douleurs ou détresse. Nous avons ainsi choisi des modèles de souris dont nous connaissons les comportements et la capacité de prise de greffe. Les animaux plus jeunes, seront manipulés régulièrement et ainsi habitués en vue d'une réduction du stress. En cours d'expérimentation, nous avons choisi de faire les greffes tumorales uniquement sous-cutané (au flanc arrière) de manière à ne gêner en rien la vie de l'animal (locomotion, alimentation), le suivi sera ainsi facilité par mesure manuelle externe sur animal vigile (mesure au pied à coulisse), ou grâce à un système d'imagerie par bioluminescence (l'animal sera alors sous anesthésie dans l'appareil à +37°C). Aucune mesure invasive ne sera ainsi faite. Enfin, l'étude préalable du nombre d'animaux strictement nécessaires, nous permettra d'obtenir des résultats en quantité suffisante pour ne pas avoir à réitérer des lots expérimentaux.

Choix des espèces

Les souris sont des petits rongeurs qui permettent de réaliser des groupes cohérents et limités pour l'étude efficace des effets des molécules thérapeutiques testées en faible quantité. Nous utilisons des souris immunodéficientes pour permettre la xenogreffe de cellules humaines (tumorales et immunitaires).

240 souris femelles adultes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur abdomen est ouvert sous anesthésie pour implanter des cellules de cancer colorectal dans la paroi du cæcum, puis elles sont transportées vers un second établissement pour recevoir un traitement trois fois par semaine pendant trois semaines, avec suivi des métastases par imagerie deux fois par semaine. Le porteur signale que la chirurgie peut entraîner souffrance, perte de poids ou infection, et que les métastases hépatiques peuvent causer des gênes, tout en précisant que le foie est un organe "silencieux" qui ne fait pas mal lorsqu'il est colonisé. Sur le remplacement, il indique avoir réalisé les expériences possibles in vitro et devoir maintenant valider ces fonctions dans un "organisme entier".

Objectifs

Le cancer colorectal (CCR) est le troisième cancer le plus fréquent et la troisième cause de décès par cancer. Bien que la plupart des patients atteints de CCR survivent à une chirurgie de la tumeur primitive, la principale cause de décès est la dissémination des cellules cancéreuses dans l’organisme. Lorsque le CCR est détecté à un stade précoce et localisé, le taux de survie à cinq ans est d'environ 90 % ; cependant, après l'apparition de métastases, ce taux chute à moins de 12 %. Le principal organe cible est le foie. Environ 20 à 25 % des patients atteints de CCR présentent des métastases hépatiques au moment du diagnostic, et au moment du décès, jusqu'à 70 % des patients atteints de CCR présentaient des métastases hépatiques. L’objectif de notre recherche est de comprendre les mécanismes métastatiques dans le CCR. Nous nous intéressons en particulier au rôle d’une protéine de choc thermique, HSP110. HSP110 possède un rôle essentiel dans la prolifération des cellules cancéreuses de CCR et leur résistance aux agents chimiothérapeutiques, cependant son rôle dans le développement des métastases hépatiques n’est pas connu. Nous utiliserons un composé chimique inhibiteur spécifique de HSP110 ayant déjà montré son efficacité sur le ralentissement de la croissance tumorale de CCR lors de greffes sous-cutanées non-métastatique. Nous envisageons de tester l’efficacité de ce composé sur l’inhibition de la formation des métastases de CCR, seul et en association avec la chimiothérapie standard et des traitements plus novateurs appelés immunothérapie. Cela constituera une étape préclinique supplémentaire pour ce candidat médicament. En résumé, nous souhaitons explorer dans ce projet le rôle de HSP110 dans la formation des métastases et étudier l’impact de son inhibiteur seul ou associé aux traitements chimiothérapeutiques standards et aux immunothérapies sur ces métastases. Le projet se déroulera entre 2 etablissemnts utilisateurs (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Les mécanismes moléculaires mis en jeu par la protéine HSP110 dans la croissance tumorale sont maintenant bien connus in vitro. Cependant, il est nécessaire d’étudier le rôle de HSP110 dans un contexte in vivo pour évaluer son impact dans la formation de métastases hépatiques. Ce projet nous permettra d’évaluer l’efficacité de l’inhibiteur spécifique de HSP110 in vivo dans la prévention des métastases et d’identifier la meilleure combinaison thérapeutique avec une immunothérapie innovante. A terme, ce projet est une condition de la validation pré-clinique de l’utilisation de cet inhibiteur d’HSP110 dans le cancer colorectal dans une perspective d’essai clinique à long terme

Procédures

Les modèles nécessiteront l’utilisation d’une procédure chirurgicale (sous anesthésie gazeuse) afin d’implanter les cellules tumorales. Cet acte (15 min/souris) implique l’ouverture de la cavité abdominale, l’implantation des tumeurs (cellules) la fermeture de la cavité abdominale. Ce développement de modèles tumoraux aura lieu dans l’établissement utilisateur 1. Les souris seront alors transférées dans l’établissement utilisateur 2 (5 minutes de trajet) pour réaliser les traitements (1 minutes par souris) 3 fois par semaine 7 jours après la chirurgie et pendant 3 semaines. La progression tumorale sera alors suivie par imagerie (sous anesthésie gazeuse) après injection intrapéritonéale de l’agent imageant (1-2 min/souris) deux fois par semaine. Les souris seront conservées encore 2 mois si régression totale de la tumeur qui sera vérifiée 1X par semaine par imagerie.

Impact sur les animaux

Les modèles animaux mimant la formation de tumeurs primaires coliques et métastatiques d’origine colique nécessitent un acte chirurgical. L’ouverture de la cavité abdominale des souris, l’injection des cellules tumorales dans la paroi du caecum sont des interventions pouvant entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales. L’apparition des métastases peuvent également être à l’origine de souffrance et de gênes, principalement en raison de la perturbation de la fonction hépatique. A noter que le foie est un organe « silencieux » qui ne fait pas mal lorsqu’il est colonisé par des métastases.

Devenir

Les souris ayant été porteuses de tumeurs, elles seront toutes mises à mort à la fin de l’expérience.

Remplacement

Nous avons réalisé les expériences possibles in vitro (capacité de migration en présence ou absence de HSP110 et mécanisme d’action de HSP110) et nous devons valider ces fonctions maintenant dans un organisme entier. Nous continuerons à explorer les mécanismes moléculaires dans le modèle in vivo.

Réduction

Nous utiliserons le plus petit nombre d’animaux possibles. Pour chacune des combinaisons thérapeutiques réalisées lors de nos expérimentations in vivo, nous utiliserons des groupes de 5 souris ce qui correspond à la taille d’échantillon minimum nécessaires à nos tests statistiques. Les expériences seront réalisées 3x pour contrer la variabilité inter-individus et la possible non prise métastatique. De plus, nous étudierons plusieurs éléments sur un même groupe de souris dès que cela est possible (réduction) et nous réaliserons seulement les expériences les plus indispensables sur les modèles murins.

Raffinement

Limitation du stress. Pour limiter le stress, les souris sont placées par groupe de 5 à 10 dans des cages agrémentées d’éléments en plastique leur permettant de se regrouper (nid). Elles seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée. Les séances d’imagerie seront réalisées sous anesthésie. Les animaux seront transférés rapidement pour éviter un stress de l’EU1 à l’EU2 dans un sac de transport (temps de trajet de 5 minutes). Procédures d’étude non invasives (imagerie) : Le gène de la luciférase exprimée par les cellules tumorales injectées permettra d’évaluer par émission de lumière la présence de métastases sur animaux vivants. Procédure d’injection des cellules tumorales : Les souris seront anesthésiées. Elles recevront du gel ophtalmique (évite le dessèchement des yeux) et injection de burpénorphine et application lidocaine. L’imagerie et la chirurgie abdominale sont réalisées sous anesthésie suivie d’un réveil sous lampe chauffante ou couveuse (réduction inconfort pour raffinement de l’étude). Au cours d’opération, un contrôle de la profondeur d’anesthésie (pincement de la patte, contrôle de la respiration), la déshydratation (pli de peau) et l’hypoxie (couleur des muqueuses) seront contrôlées. Des tapis chauffants seront utilisés pendant l’expérimentation afin de prévenir l’hypothermie. Un suivi (réveil et post anesthésique) sera mis en place après injection des cellules tumorales pour vérifier le retour à une activité normale (confort, vivacité). Les injections de molécules d’intérêt thérapeutique se feront sur animaux vigiles. Surveillance de l’état général des animaux : Les animaux bénéficieront d’une réhydratation per- et post-opératoire et une prise en charge antalgique adaptée en pré- et post-opératoire 2X/jour pendant 3 jours. Un système facilitant la prise alimentaire et la prise de boisson sera installé (nourriture gélifiée). Nous avons une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Le développement des tumeurs (taille et nombre) sera estimé de manière non-invasive par imagerie de la bioluminescence après injection de luciférine. Au cours des différentes étapes de la procédure et pour chaque animal, la masse pondérale des animaux ne devra pas dépasser ± 20 pour cent de leur poids initial. En cas de dépassement de cette limite de poids, ils seront sacrifiés.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles utilisés pour faire de la chirurgie. Nous utiliserons des souris immunocompétentes, nous permettant d’implanter des cellules tumorales murines possédant le même fond génétique. Ces souris sont largement utilisées lors de la greffe sous-cutanée ou orthotopique de ces cellules cancéreuses. Nous utiliserons des souris femelles de 8-14 semaines car elles sont considérées comme adulte. En effet, dans le cadre de notre étude, nous avons besoin que les animaux aient atteints l’âge adulte et soient dotées d’un système immunitaire fonctionnel. Les souris seront hébergées en groupe afin de diminuer le stress induit par l’isolement.

Ouverts pour l'implantation d'un dispositif cardiovasculaire, parfois après une première intervention destinée à léser un vaisseau, 2 500 moutons, 500 cochons, 150 chiens et 100 bovins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour nécropsie et examen histologique. Ce volet est le second des deux établissements déclarés pour le même projet, chacun annonçant le même effectif de 3 250 animaux. Le porteur écrit que le nombre d'animaux a été réduit au minimum nécessaire, tout en précisant qu'aucune approche statistique n'a été réalisée. Il présente l'anesthésie générale comme évitant "tous stress et douleur", et annonce par ailleurs une douleur postopératoire pouvant durer plusieurs jours.

Objectifs

L’évaluation des nouveaux dispositifs et techniques pour les affections cardiaques structurelles en chirurgie cardiaque et des gros vaisseaux par des méthodes de chirurgie standard et mini-invasives nécessitent une phase de recherche pré-clinique et de développement qui permet de mettre au point le dispositifs et vérifier leur sécurité. La chirurgie cardiaque et des vaisseaux s’est développée depuis la deuxième moitié du XXème siècle, permettant de sauver des millions de personnes par an, avec l’avènement de nouvelles technologies comme la circulation extracorporelle (CEC) permettant la déviation du sang du coeur et des gros vaisseaux. Il est possible dès lors de travailler sur des cavités du coeur pendant que la machine coeur poumons assure la survie du patient durant l’intervention. Les techniques de chirurgie cardiaque s’intéressent à la réparation / remplacement de pathologies cardiovasculaire structurelles telles que par exemple les pathologies valvulaires, des cavités et parois cardiaques ainsi que des gros vaisseaux. Les limites des techniques actuelles est leur invasivité, la nécessité de recours à la machine coeur poumons, ainsi que la durabilité des dispositifs et des matériaux utilisés qui peuvent être mal tolérés par l’organisme. L'objectif de ce projet est l'évaluation de l'efficacité et de la sécurité de nouveaux dispositifs et techniques pour le traitement des affections cardiaques par des méthodes de chirurgie standard et mini-invasives. Ce projet se déroulera dans 2 Etablissements Utilisateurs EU 1/2 et EU 2/2.

Bénéfices attendus

L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patients, une amélioration de la durabilité, de l’efficacité et de la sécurité des implants pour éviter leur rejet et ainsi les ré opérations parfois multiples des patients, pour réduire les temps de cicatrisation et le traumatisme tissulaire, corollaires de ces interventions et qui handicapent les patients, ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections grâce au recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins de faible volume à des fins de biologie médicale sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. Les fréquences maximales des prélèvements pouvant être d’un prélèvement par jour sur une courte période de quelques jours à une semaine ou d’un prélèvement par semaine jusqu’à 6 mois. - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. - Préalablement aux anesthésies générales, les animaux seront mis à jeun pour une durée de 12 heures pour les porcs, 12 à 16 heures pour les ovins/bovins, de 6 à 12 heures pour les chiens. - Le nombre maximal d’examens d’imagerie par animal pourra aller jusqu’à 12 sur une période de 6 mois. - Des procédures chirurgicales d'implantation de dispositif cardio-vasculaire avec ou sans procédure chirurgicale de création de modèle lésionnel préalable. Chaque animal du projet ne subira qu'une seule chirurgie d'implantation de dispositif associée ou non à une chirurgie de création de modèle antérieur soit une seule et parfois deux interventions chirurgicales par animal dont une mini-invasive pour la création de modèle lésionnel. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet. Dans ce projet, les actes d'imagerie pourront être réalisés dans les EU 1/2 et 2/2. Les actes chirurgicaux d'implantation de dispositif et/ou d'évaluation de technique chirurgicale avec ou sans réveil seront réalisés dans l'EU 1/2. Le suivi clinique et fonctionnel des animaux après les procédures chirurgicales pourront être réalisées dans les EU 1/2 et 2/2. Pour les études chroniques, les évaluations finales avec euthanasie pourront être réalisées dans les EU 1/2 et 2/2.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - La faim ,lors de la mise à jeun (12 heures pour les porcs, 12 à 16 heures pour les ovins/bovins, de 6 à 12 heures pour les chiens) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - En fonction des besoins et préalablement à la procédure d'évaluation du dispositif, l'induction d'une lésion à la faveur d'une intervention chirurgicale mini-invasive de type lésion vasculaire, création d'un defect tissulaire, ligature ou occlusion de vaisseaux par exemple - La douleur en phase postopératoire : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique, pour ces derniers points, des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple le recours systématique à l'anesthésie générale, l'usage systématique de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur opiacés, la protection des plaies, la mise en place d'un suivi clinique quotidien des animaux).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, auniveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des examens d'imagerie, scanners, IRM par exemple), par l'interrogation des dispositifs, et enfin au niveau tissulaire par laréalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs médicaux implantables et des méthodes techniques innovantes dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. Le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes afin de reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients est indispensable. En effet leur utilisation in fine chez les patients représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en oeuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Un suivi de la température est réalisé pendant toute la procédure d'implantation chirurgicale et des dispositifs de maintien de la normothermie tels que le système de couverture de réchauffement Bair Hugger© ou des tapis chauffants sont utilisés. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, des protocoles de prises en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (anti-inflammatoires non stéroïdiens et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques sont appliqués tout au long du projet. Les transports d'animaux réalisés entre les 2 EU (35 km) seront réalisés à l'aide de véhicules de types camionnettes fermées, autorisés par la Direction Départementale de la Protection des Population, ventilés, climatisés et spécialement équipés pour le transport des animaux vivants ( dispositifs d'abreuvement, tapis et revêtements antidérapants, suivi et enregistrement des températures lors des trajets, système de surveillance vidéo des animaux). Les personnels en charge sont formés et titulaires du certificat de convoyeur (CCTROV). Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.

Choix des espèces

Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie semblable à celle de l’Homme avec les mêmes dimensions. Les modèles utilisés ont fait l'objet d'études similaires et sont considérés comme appropriés à cette fin. - Le système vasculaire du mouton, du porc et du chien reproduisent fidèlement les réactions vasculaires humaines et le processus de cicatrisation des vaisseaux est similaire à celui observé chez l'homme. - La taille relative de ces modèles animaux permet une visualisation à l'aide d'équipements angiographiques et échographiques standards. - Chez l'ovin, la taille des veines iliaques externes est comparable à celle des humains. - Le modèle porcin est pertinent pour l'évaluation de la thrombogénicité des dispositifs. - Les débits et les volumes dans la veine cave inférieure ou les veines jugulaires du canidé peuvent être similaires à ceux des veines fémorales humaines, la structure hémodynamique des veines est similaire à celle des veines fémorales humaines. - Le modèle veau est pertinent pour les endoprothèses aortiques complexes. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.

Valider des prothèses et des techniques de chirurgie cardiaque avant leur mise sur le marché mobilise ici 2 500 moutons, 500 cochons, 150 chiens et 100 bovins, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une ou deux interventions chirurgicales pouvant durer plusieurs heures, jusqu'à douze examens d'imagerie sur six mois, des prélèvements sanguins pouvant aller jusqu'à un par jour et un jeûne de six à seize heures avant chaque anesthésie. Une lésion est créée au préalable chez une partie d'entre eux, par ligature ou occlusion de vaisseaux ou par création d'un défaut tissulaire. Le porteur affirme que l'expérimentation sur "l'organisme entier" est "incontournable" et qu'elle relève d'une obligation réglementaire pour les dispositifs médicaux implantables.

Objectifs

L’évaluation des nouveaux dispositifs et techniques pour les affections cardiaques structurelles en chirurgie cardiaque et des gros vaisseaux par des méthodes de chirurgie standard et mini-invasives nécessitent une phase de recherche pré-clinique et de développement qui permet de mettre au point le dispositifs et vérifier leur sécurité. La chirurgie cardiaque et des vaisseaux s’est développée depuis la deuxième moitié du XXème siècle, permettant de sauver des millions de personnes par an, avec l’avènement de nouvelles technologies comme la circulation extracorporelle (CEC) permettant la déviation du sang du coeur et des gros vaisseaux. Il est possible dès lors de travailler sur des cavités du coeur pendant que la machine coeur poumons assure la survie du patient durant l’intervention. Les techniques de chirurgie cardiaque s’intéressent à la réparation / remplacement de pathologies cardiovasculaire structurelles telles que par exemple les pathologies valvulaires, des cavités et parois cardiaques ainsi que des gros vaisseaux. Les limites des techniques actuelles est leur invasivité, la nécessité de recours à la machine coeur poumons, ainsi que la durabilité des dispositifs et des matériaux utilisés qui peuvent être mal tolérés par l’organisme. L'objectif de ce projet est l'évaluation de l'efficacité et de la sécurité de nouveaux dispositifs et techniques pour le traitement des affections cardiaques par des méthodes de chirurgie standard et mini-invasives. Ce projet se déroulera dans 2 Etablissements Utilisateurs EU 1/2 et EU 2/2.

Bénéfices attendus

L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patients, une amélioration de la durabilité, de l’efficacité et de la sécurité des implants pour éviter leur rejet et ainsi les ré opérations parfois multiples des patients, pour réduire les temps de cicatrisation et le traumatisme tissulaire, corollaires de ces interventions et qui handicapent les patients, ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections grâce au recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins de faible volume à des fins de biologie médicale sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. Les fréquences maximales des prélèvements pouvant être d’un prélèvement par jour sur une courte période de quelques jours à une semaine ou d’un prélèvement par semaine jusqu’à 6 mois. - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. - Préalablement aux anesthésies générales, les animaux seront mis à jeun pour une durée de 12 heures pour les porcs, 12 à 16 heures pour les ovins/bovins, de 6 à 12 heures pour les chiens. - Le nombre maximal d’examens d’imagerie par animal pourra aller jusqu’à 12 sur une période de 6 mois. - Des procédures chirurgicales d'implantation de dispositif cardio-vasculaire avec ou sans procédure chirurgicale de création de modèle lésionnel préalable. Chaque animal du projet ne subira qu'une seule chirurgie d'implantation de dispositif associée ou non à une chirurgie de création de modèle antérieur soit une seule et parfois deux interventions chirurgicales par animal dont une mini-invasive pour la création de modèle lésionnel. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet. Dans ce projet, les actes d'imagerie pourront être réalisés dans les EU 1/2 et 2/2. Les actes chirurgicaux d'implantation de dispositif et/ou d'évaluation de technique chirurgicale avec ou sans réveil seront réalisés dans l'EU 1/2. Le suivi clinique et fonctionnel des animaux après les procédures chirurgicales pourront être réalisées dans les EU 1/2 et 2/2. Pour les études chroniques, les évaluations finales avec euthanasie pourront être réalisées dans les EU 1/2 et 2/2.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - La faim ,lors de la mise à jeun (12 heures pour les porcs, 12 à 16 heures pour les ovins/bovins, de 6 à 12 heures pour les chiens) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - En fonction des besoins et préalablement à la procédure d'évaluation du dispositif, l'induction d'une lésion à la faveur d'une intervention chirurgicale mini-invasive de type lésion vasculaire, création d'un defect tissulaire, ligature ou occlusion de vaisseaux par exemple - La douleur en phase postopératoire : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique, pour ces derniers points, des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple le recours systématique à l'anesthésie générale, l'usage systématique de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur opiacés, la protection des plaies, la mise en place d'un suivi clinique quotidien des animaux).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, auniveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des examens d'imagerie, scanners, IRM par exemple), par l'interrogation des dispositifs, et enfin au niveau tissulaire par laréalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs médicaux implantables et des méthodes techniques innovantes dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. Le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes afin de reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients est indispensable. En effet leur utilisation in fine chez les patients représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en oeuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Un suivi de la température est réalisé pendant toute la procédure d'implantation chirurgicale et des dispositifs de maintien de la normothermie tels que le système de couverture de réchauffement Bair Hugger© ou des tapis chauffants sont utilisés. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, des protocoles de prises en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (anti-inflammatoires non stéroïdiens et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques sont appliqués tout au long du projet. Les transports d'animaux réalisés entre les 2 EU (35 km) seront réalisés à l'aide de véhicules de types camionnettes fermées, autorisés par la Direction Départementale de la Protection des Population, ventilés, climatisés et spécialement équipés pour le transport des animaux vivants ( dispositifs d'abreuvement, tapis et revêtements antidérapants, suivi et enregistrement des températures lors des trajets, système de surveillance vidéo des animaux). Les personnels en charge sont formés et titulaires du certificat de convoyeur (CCTROV). Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.

Choix des espèces

Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie semblable à celle de l’Homme avec les mêmes dimensions. Les modèles utilisés ont fait l'objet d'études similaires et sont considérés comme appropriés à cette fin. - Le système vasculaire du mouton, du porc et du chien reproduisent fidèlement les réactions vasculaires humaines et le processus de cicatrisation des vaisseaux est similaire à celui observé chez l'homme. - La taille relative de ces modèles animaux permet une visualisation à l'aide d'équipements angiographiques et échographiques standards. - Chez l'ovin, la taille des veines iliaques externes est comparable à celle des humains. - Le modèle porcin est pertinent pour l'évaluation de la thrombogénicité des dispositifs. - Les débits et les volumes dans la veine cave inférieure ou les veines jugulaires du canidé peuvent être similaires à ceux des veines fémorales humaines, la structure hémodynamique des veines est similaire à celle des veines fémorales humaines. - Le modèle veau est pertinent pour les endoprothèses aortiques complexes. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.

285 souris âgées de quatre semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant une greffe de tumeur osseuse directement dans le tibia, puis des séances de compression du membre trois fois par semaine sous anesthésie. Entre le septième et le dix-huitième jour s'ajoutent deux injections hebdomadaires de doxorubicine ou d'un agoniste TLR4, et trois poses de cathéter dans la veine de la queue pour l'IRM. Toutes sont tuées pour récupérer tumeurs et poumons. Le porteur chiffre à moins de 2 % le risque de douleur lié aux compressions, renvoie les retombées pour les patients à des biomarqueurs d'imagerie encore à identifier, et fixe les points limites sur le volume tumoral, les troubles de la marche et l'apparition de métastases pulmonaires.

Objectifs

L'ostéosarcome est un cancer des os dont le pronostic reste sombre, avec une survie à 5 ans qui chute à 25% chez les patients résistants à la chimiothérapie. Actuellement, les médecins classent les patients comme "bons" ou "mauvais répondeurs" selon l'analyse de la tumeur après chirurgie, mais cette classification ne prédit pas toujours l'évolution réelle de la maladie. Notre hypothèse est que les contraintes mécaniques subies par le membre malade, comme le port d'un plâtre ou la marche, modifient la structure de la tumeur et sa résistance aux traitements. L'objectif principal de ce projet est donc de déterminer si les sollicitations mécaniques appliquées sur une tumeur d'ostéosarcome modifient sa structure, sa vascularisation et sa réponse aux traitements de chimiothérapie. Pour atteindre cet objectif, notre étude se décompose en plusieurs étapes complémentaires. Dans un premier temps, nous développerons les outils d'analyse nécessaires en mettant au point des séquences d'IRM adaptées au suivi de l'ostéosarcome murin et en identifiant les moments clés du développement tumoral. Nous optimiserons ensuite notre dispositif de sollicitation mécanique en déterminant les paramètres optimaux - force, fréquence et durée - pour modifier efficacement la tumeur, puis nous validerons l'efficacité de ce dispositif par un suivi longitudinal. Enfin, nous évaluerons l'impact thérapeutique de ces sollicitations mécaniques en comparant l'efficacité de la doxorubicine et d'un inhibiteur TLR4 sur des tumeurs sollicitées versus non sollicitées. Cette approche nous permettra d'identifier de nouveaux marqueurs d'imagerie prédictifs de la réponse au traitement. Cette étude vise ainsi à améliorer la prise en charge des patients en proposant de nouveaux biomarqueurs non-invasifs et en apportant une meilleure compréhension de l'influence des contraintes mécaniques sur l'évolution tumorale.

Bénéfices attendus

Cette étude apportera une compréhension nouvelle de l'influence des contraintes mécaniques sur le développement des tumeurs osseuses. Elle établira pour la première fois un lien direct entre sollicitations biomécaniques et évolution tumorale dans l'ostéosarcome, comblant un manque important dans la littérature scientifique. L'identification de nouveaux biomarqueurs prédictifs de la réponse aux traitements permettra aux cliniciens de mieux personnaliser les thérapies. Cette approche pourrait améliorer le taux de survie des 2000 nouveaux cas d'ostéosarcome diagnostiqués chaque année en Europe, particulièrement les 75% de patients actuellement classés comme "mauvais répondeurs". La compréhension des mécanismes biomécaniques ouvrira la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques intégrant la dimension mécanique dans la prise en charge. Cela pourrait conduire au développement de protocoles de rééducation ou de dispositifs médicaux innovants pour optimiser la réponse aux traitements.

Procédures

Jour 0 : Analgésie préventive par administration sous-cutanée (buprénorphine), greffe tumorale orthotopique intratibiale sous anesthésie (isoflurane) (total 10 minutes) Entre J7 et J18 : Test de sollicitation mécanique (3x/semaine) sous anesthésie (isoflurane) (total 10-15 minutes) Traitement agoniste TLR4 (2x/semaine) sous anesthésie (isoflurane) (total 10 minutes) + contrôle Traitement sérum physiologique sous anesthésie. Traitement doxorubicine (2x/semaine) sur animal vigile, injection intrapéritonéale (total 5 minutes) Jours 14, 16, 18 : Un cathéter intraveineux sera placé au niveau de la veine caudale permettant l’injection d’un produit de contraste : une détersion ainsi qu'une application de xylocaïne sont préalablement réalisées sur la queue, puis le cathéter intravéneux

Impact sur les animaux

Nuisances liées aux anesthésies et aux imageries Les anesthésies répétées à l'isoflurane (3 fois par semaine pour les sollicitations mécaniques plus séances d'IRM) peuvent provoquer un stress physique et thermique temporaire. Le risque d'hypothermie pendant l'anesthésie est faible (moins de 5%) grâce aux tapis chauffants utilisés. Les IRM nécessiteront la pose d’un cathéter veineux caudal qui peut engendrer une légère douleur au réveil. Nuisances spécifiques aux sollicitations mécaniques Bien que calibrées pour reproduire le poids physiologique de l'animal, les compressions répétées peuvent induire une fatigue musculaire temporaire ou un inconfort mineur. Le risque de douleur ou de lésion est très faible (estimé à moins de 2%) car les forces appliquées restent dans les limites physiologiques. Nuisances liées au développement tumoral Le développement de l'ostéosarcome peut provoquer une douleur liée à la lyse osseuse, se manifestant par une claudication. En cas d'apparition de métastases pulmonaires, une gêne respiratoire peut survenir avec une fréquence respiratoire irrégulière.

Devenir

La mise à mort est nécessaire pour la récupération et l’analyse de tumeurs et poumons. Ces analyses sont indispensables pour apprécier l’influence des sollicitations mécaniques sur la formation des tissus et les populations cellulaires.

Remplacement

Nous avons analysé des tumeurs d’ostéosarcome de souris d’études précédentes pour confirmer l’efficacité de nos logiciels de traitement d’image. Tout le matériel de sollicitations mécaniques, ainsi que les techniques d’analyse des tissus ont été testé sur des pattes de souris imprimées en 3D ou bien des pattes greffées de souris surnuméraires. La modélisation numérique a été utilisée pour confirmer l’intérêt de la bague de serrage et pour tenter d’anticiper le comportement in vivo d’une patte compressée. Le maximum a été donc fait en amont n’utiliser des animaux qu’au moment crucial de préciser nos protocoles et de tester les traitements.

Réduction

Notre méthode est divisée en plusieurs étapes : d'abord, nous mettons au point les techniques d'IRM, ensuite, nous paramétrons les aspects mécaniques, et enfin, nous affinons ces choix en étudiant le développement de la tumeur sous ces conditions et sur le temps. Cette approche nous permet de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs à chaque étape, en ajustant les étapes suivantes en fonction des résultats intermédiaires. Tous les animaux utilisés dans ces procédures contribueront à nos résultats, car toutes les tumeurs seront collectées et analysées, et tous les individus seront suivis par IRM. Les jours où les animaux seront sacrifiés correspondent à trois moments clés identifiés dans des études précédentes, que nous souhaitons approfondir avec notre étude mécanique, ainsi qu'à deux jours intermédiaires choisis pour leur intérêt dans le développement tumoral. Le nombre d'animaux sacrifiés à chacun de ces jours est le minimum nécessaire pour obtenir des statistiques pertinentes à un instant donné de l'étude.

Raffinement

Avant de commencer l'étude, les souris auront une semaine pour s'habituer à leur nouvel environnement (pièce, cage, etc.). Elles seront placées ensemble pour maintenir un environnement social et réduire le stress. Les souris ne seront déplacées de leur cage que pour les procédures sous anesthésie (comme l'IRM, les tests mécaniques, la mesure du volume tumoral, la coupe des griffes, la pesée, etc.), qui se dérouleront dans une salle spécialement prévue à cet effet. Les cages utilisées sont standard, avec de la nourriture et de l'eau disponibles à volonté, de la litière, du matériel de nidification, ainsi que des tunnels, des promontoires et des bûchettes pour enrichir leur environnement. Toutes les précautions seront prises lors de la manipulation des souris, et des interactions fréquentes avec le personnel aideront à réduire leur stress pendant les procédures. Les tests seront espacés d'au moins une journée de repos. Bien que les tests mécaniques soient légers, de l'ordre du poids de l'animal sur une patte et réalisés sous anesthésie, de la nourriture sera placée dans la cage pour limiter la fatigue et le stress. Les souris testées seront surveillées plus particulièrement après leur réveil. L'anesthésie se fera sur un tapis chauffant pour éviter l'hypothermie. Les procédures susceptibles d'induire douleur, stress ou immobilisation prolongée sont réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie, avec des mesures de soutien et une surveillance adaptée afin de limiter l'inconfort des animaux. Des points limites précoces sont définis sur la base de l'évolution du volume tumoral, de l'apparition de troubles de la marche, de changements de comportement et de signes de douleur, ainsi que de la présence de métastases. Les animaux bénéficient d'un suivi clinique renforcé qui permet une prose en charge précoce et adaptée de tout mal être des animaux.

Choix des espèces

Le modèle de souris utilisé combiné au modèle de cellules tumorales que nous greffons permettent d’avoir des résultats répétables et déjà renseignés dans la littérature et par nos études précédentes. Cela permet par ailleurs la validation de protocoles répétables à l’avenir sur des souris communément utilisées dans les études précliniques sur des modèles vivants. Ces souris maintiennent de plus un système immunitaire fonctionnel pendant le développement tumoral, ce qui permet de reproduire fidèlement l’évolution naturelle de l’ostéosarcome humain, incluant le développement de métastases pulmonaires. L'anatomie des pattes de souris, avec un tibia facilement accessible et une taille compatible avec notre dispositif de compression, permet l'application contrôlée de contraintes mécaniques reproductibles. Le rapport poids/taille de la souris facilite la calibration des forces appliquées en équivalent du poids corporel, transposable aux contraintes physiologiques humaines. Les souris sont utilisées à l'âge de 4 semaines, correspondant à une phase de croissance osseuse active. A ce stade, le tissus osseux présente des propriétés mécaniques suffisantes pour les procédures expérimentales tout en conservant une capacité de remodelage. Ce stade de développement est pertinent pour l'étude de la croissance tumorale osseuse et permet un suivi expérimental complet sur la durée des procédures.

Une lésion détruisant environ 30 % du volume ventriculaire est provoquée au cœur de 75 poissons sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après l'opération, les poissons passent douze heures dans un aquarium cloisonné puis retournent en hébergement collectif. Le porteur indique qu'ils ressentiront une douleur aiguë immédiatement après la lésion, tout en qualifiant l'atteinte fonctionnelle de transitoire et limitée à la première heure. Tous sont tués pour des analyses post-mortem, l'espèce téléostéenne retenue mais jamais nommée existant sous deux formes naturelles, l'une capable de régénérer son cœur, l'autre non.

Objectifs

Les crises cardiaques sont la principale cause de décès dans le monde. Une blessure au cœur humain entraîne la perte de millions de cellules cardiaques et est remplacée par une cicatrice raide qui limite les battements du cœur. Il n’existe actuellement aucune option thérapeutique pour guérir une crise cardiaque. Le poisson en revanche, peut se remettre efficacement d’une lésion cardiaque. L’objectif général du projet est donc d’identifier et de comprendre comment le poisson peut régénérer son cœur après une blessure.

Bénéfices attendus

Le cœur humain réagit mal à une crise cardiaque. Il n’existe actuellement aucun traitement pour traiter la cause de la maladie, mais uniquement les symptômes et les complications dus à la blessure. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies pour améliorer les résultats pour les patients. Ce projet examine comment le poisson peut régénérer son cœur de manière robuste après une blessure. Le projet identifiera les facteurs responsables de cette guérison réussie après une blessure. Ces facteurs identifiés peuvent potentiellement être utilisés dans le contexte humain pour développer de nouvelles thérapies pour traiter les patients atteints de crise cardiaque. Ce projet améliorera nos connaissances sur la façon dont le poisson peut régénérer naturellement et avec succès son cœur. Ces connaissances permettront d’expliquer pourquoi le cœur humain a une capacité de régénération très limitée. Les chercheurs bénéficieront directement de ce projet puisqu’il peut constituer la base de futures études scientifiques et peut être appliqué au domaine de la cardiologie, de la régénération tissulaire chez le poisson et de la régénération dans d’autres modèles animaux. Ce sera également un avantage à court terme. Le bénéfice à long terme sera la contribution des connaissances à la science médicale. Les résultats précliniques du projet pourraient fournir de nouvelles stratégies de traitement visant à améliorer la régénération du cœur humain blessé. De plus, ces connaissances pourraient être utilisées pour améliorer davantage les stratégies diagnostiques et thérapeutiques actuelles.

Procédures

Poissons subissent une blessure cardiaque sous anesthésie. La phase chirurgicale proprement dite dure environ 30 secondes, tandis que la procédure complète, incluant l’anesthésie et la récupération, s’étend sur quelques minutes. Après récupération, les poissons sont placés pendant 12 heures dans un grand aquarium compartimenté par des cloisons perforées. Ce dispositif permet un hébergement individuel sans isolement, facilitant la surveillance postopératoire, limitant d’éventuels comportements agressifs et favorisant une bonne cicatrisation de l’incision. Au terme de cette période, les séparations sont retirées et les poissons nagent ensemble en hébergement collectif à densité et conditions d’alimentation standards

Impact sur les animaux

Les poissons lésés ressentiront une douleur aiguë immédiatement après la lésion. La phase chirurgicale proprement dite dure environ 30 secondes, tandis que la procédure complète, incluant l’anesthésie et la récupération, s’étend sur quelques minutes. Cette intervention entraîne une altération fonctionnelle transitoire au cours de la première heure suivant l’opération. Par la suite, les poissons retrouvent un comportement normal (nage, alimentation, interactions sociales). La lésion provoque des dommages tissulaires affectant environ 30 % du volume ventriculaire.

Devenir

Les poisson sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Des études très en amont ont porté sur des cœurs de porc issus d’abattoirs. Cependant, la régénération est une interaction complexe entre les éléments moléculaires, cellulaires et environnementaux. Ceci ne peut pas être transposé dans les cellules et il n’existe pas d’alternative non animale. Les cellules cardiaques humaines cultivées dans une boîte sont une bonne source de cellules cardiaques pures. Cependant, elles se comportent comme des cellules cardiaques de bébés. Puisque les crises cardiaques sont presque exclusivement observées chez les patients adultes, il est difficile pour ces cellules cardiaques de modéliser la situation des adultes.

Réduction

Certaines expériences utiliseront tout le cœur et ne pourront donc pas être réutilisées. Lorsque les expériences n’utilisent pas la totalité du cœur, le cœur restant sera conservé indéfiniment au congélateur pour de futures expériences. Ainsi, le tissu peut être utilisé au maximum et éviter tout gaspillage inutile. Les femelles et les mâles seront utilisés pour des expériences Le nombre d'animaux requis est basé sur l'expérience antérieure et la littérature publiée. Ces chiffres sont désormais largement utilisés dans le domaine de la régénération cardiaque à des fins d’analyse statistique.

Raffinement

Le chercheur se tiendra au courant de la littérature pour s’assurer que la technique est appliquée de la manière la plus précise et humaine possible. Les techniques utilisées dans ce projet ont été bien documentées, décrites et publiées. Par conséquent, les taux de mortalité, les comportements et la santé globale du poisson sont connus. Ceux-ci serviront de base au suivi et aux soins postopératoires. Une grille de score permettra de suivre objectivement l’état des animaux. En cas d’atteinte d’un point-limite, l’animal sera mis à mort Pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l'angoisse de l'animal, ce dernier sera anesthésié durant toute les procédures expérimentales. L'anesthésie utilisée est également analgésique. Le chercheur se tiendra au courant de la littérature et modifiera les procédures si nécessaire.

Choix des espèces

Les poissons présentent une réponse robuste et naturelle à la lésion cardiaque. Identifier les signaux qui permettent cette régénération sera précieux pour comprendre et potentiellement appliquer ces connaissances à la situation humaine, dans laquelle les patients sont incapables de se rétablir après une telle atteinte. Pour les études de régénération, des poissons adultes âgés de six mois seront utilisés. Cet âge correspond à la maturité physiologique chez le poisson. et peut être comparé au stade de vie chez l’humain où les lésions cardiaques commencent généralement à apparaître. L'utilisation de cette espèce de poisson téléostéen offre un avantage unique car elle existe sous deux formes naturelles : l'une capable de régénérer son cœur après une blessure, et l'autre ayant perdu cette capacité. La comparaison de ces deux formes dans des conditions expérimentales identiques permet d'établir un contraste direct entre les réponses régénératives et non régénératives au sein du même patrimoine génétique.

Pour vérifier la tolérance de médicaments, de produits d'hygiène et de compléments alimentaires vendus pour les animaux domestiques, 350 chats et 450 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réintégrés à la colonie de l'établissement. Ils reçoivent les produits testés à la dose recommandée mais aussi en surdosage ou sur une durée prolongée, avec injections de tranquillisant, prélèvements sanguins et deux ponctions d'urine par cystocentèse sous anesthésie. Le porteur précise que le chiffre déclaré ne correspond pas au nombre réel d'individus, un même animal entrant dans plusieurs études étant compté plusieurs fois. Il affirme que les protocoles sont conçus pour que les animaux n'encourent aucune lésion dommageable, alors que l'objet même des essais est de chercher des effets indésirables au-delà de la dose d'emploi.

Objectifs

Ce projet a pour but d'évaluer la sécurité des produits pharmaceutiques, d'hygiène et des compléments alimentaires destinés aux animaux domestiques, notamment chez le chien et le chat. Ces études, de nature répétitive, sont essentielles pour garantir l'absence de toxicité potentielle et la marge de sécurité des produits. Elles répondent aux questions scientifiques sur le produit et fournissent les réponses aux questions des autorités nationales des pays dans lesquels le produit est commercialisé. Le projet respecte les directives et lignes directrices européennes, notamment le règlement (UE) 2019/6 du Parlement européen et du Conseil du 11 décembre 2018 relatif aux médicaments vétérinaires et la ligne directrice VICH GL43. Les essais évaluent la tolérance systémique et locale des produits selon les conditions d'utilisation recommandées (dose et voie d'administration), mais aussi en surdosage et/ou sur une période de traitement prolongée pour identifier d'éventuels effets indésirables. Dans certains cas, des études préliminaires sont également menées pour sélectionner des formulations ou des doses pour des produits en développement. Les animaux sont suivis régulièrement et des examens complémentaires sont effectués. Le protocole est adapté réglementairement, scientifiquement et éthiquement à chaque étude, en justifiant le choix de l'espèce, le nombre d'animaux, la voie d'administration et la dose.

Bénéfices attendus

Les analyses d'innocuité des produits d’essai sont menées dans le respect des recommandations éthiques en vigueur pour la manipulation animale, ont pour but premier de documenter la toxicité éventuelle du produit, les effets potentiellement dangereux ou indésirables dans les conditions d'emploi prévues chez l'animal. les protocoles sont conçus de manière à ce que les animaux de l'étude n'encourent aucune lésion dommageable. En conséquence, les protocoles sont conçus de manière à ce que les animaux de l'étude n'encourent aucune lésion dommageable. Par ailleurs, pour les tests exploratoires, l’approche séquentielle sera réalisée afin de déterminer s’il y a des effets indésirables sur un faible nombre d’animaux. Les bénéfices directs majeurs sont: • De garantir la santé et le bien-être de l'espèce animale cible • D'établir la marge de sécurité thérapeutique • De définir une posologie sûre et bien tolérée • De fournir des données importantes qui orienteront les essais cliniques ultérieurs. • Les bénéfices s'étendent à la santé publique et environnementale L’analyse rétrospective indique que nos produits sont testés à un stade avancé et maîtrisé de développement. Aucun effet dommageable n’a été observé au cours des précédents projets.

Procédures

Prélèvements sanguins : Deux prélèvements sanguins sont prévus, un en début d'étude et un en fin d'étude (Une minute chacune). Des prises de sang additionnelles pourront être réalisées, si nécessaire, afin de surveiller l'état de santé de l'animal (Une minute, en respect des recommandations éthiques). Limitation éthique : Ces prélèvements ne devront pas dépasser les recommandations éthiques, soit un volume maximal de 7,5% du VTC (Volume Total Circulant) par période de 3 jours. Anesthésie/Sédation : Injection d'un tranquillisant (une à deux injections par animal, durée 30 secondes), d'un anesthésique et éventuellement un analgésique. Prélèvements d'urines : Deux prélèvements d'urines seront effectués au cours de l'étude par cystocentèse (Durée 15 minutes). Si des prélèvements complémentaires sont réalisés, elles se feront en respect des recommandations éthiques. Administration du produit d'essai : Le produit peut entre-autres, être administré par injection (2 à 3 minutes selon la nature du produit).

Impact sur les animaux

Nuisances transitoires Ces nuisances sont temporaires (quelques heures au plus) et inhérentes à la manipulation et au suivi de base. Contrainte de Manipulation et Stress lié à la contention, à la séparation transitoire avec les congénères (dans les laboratoires pour les manipulations, ou lorsque l’on veut évaluer la prise alimentaire de l’animal et qu’il est isolé durant le moment de l’alimentation). Administration du Produit et inconfort ou irritation temporaire et localisée au moment de l'administration. Prélèvements biologiques ( prises de sang, prise d’urines) Inconfort lié à la piqure, soit lors de l’administration du produit ou pour l’injection du produit anesthésique ou antalgique (notamment pour les prélèvements d’urine qui sont réalisées sur animaux anesthésiés) Stress lié au prélèvement sanguin de manière vigile Nuisances persistantes Elles sont potentiellement imputables au produit d'essai, elles durent quelques jours tout au plus. Elle peuvent causer un inconfort modéré à l'animal mais ne mettent pas en cause l'état général de celui-ci. Exemples: rougeurs, irritation temporaire liée à l'administration du produit.

Devenir

Les animaux ré-intègrent la colonie de l’établissement utilisateur Le nombre indiqué dans la demande ne représente pas le nombre réel du projet, car les animaux qui entrent dans plusieurs études sont comptabilisés plusieurs fois dans la procédure.

Remplacement

La mise en place de la procédure expérimentale se justifie préalablement, soit par l’absence avérée de méthode alternative équivalente, soit par une obligation règlementaire et éventuellement pour ces deux raisons simultanément. Nos protocoles sont réalisés sur des animaux en bonne santé et représentatifs de l'espèce cible du produit d'essai, conformément à la ligne directrice VICH GL 43.

Réduction

Le principe de la Réduction du nombre d’animaux visant à minimiser le nombre d'animaux utilisés tout en garantissant la validité statistique des résultats est mis en place. 1. Concrètement, une justification préalable du nombre d'animaux nécessaire est réalisée avant chaque procédure 2. La réutilisation des animaux dans les limites éthique et en respect du bien-être animal est appliquée Le nombre d'animaux déclarés ne correspond pas au nombre d'animaux réellement impliqués dans les procédures. Un animal peut être réutilisé dans le cadre du projet, sous réserve d'une évaluation rigoureuse de la sévérité réelle encourue lors des dernières études. De plus, le choix de l'animal pour une procédure sera soumis à l'évaluation d’un vétérinaire de l’établissement utilisateur, en se basant sur des critères spécifiques tels que le cumul des procédures déjà effectuées, la réaction et le comportement général de l'animal au sein de la colonie et le délai nécessaire pour évacuer la molécule testée lors des dernières études.

Raffinement

Toutes les mesures visant à minimiser la douleur, la souffrance, la détresse et l'inconfort des animaux tout au long de leur vie dans le cadre du projet ont été mises en place. Ceci se traduit comme suit: Préparation et Procédures · Acclimatation & Habituation : Mise en place de l'acclimatation des animaux et habituation progressive aux gestes techniques avant les procédures, dès que cela est possible · Renforcement Positif : Utilisation des systèmes de récompenses pour faciliter la coopération lors des actes techniques. · Gestion de la Douleur : Assurer l'application systématique de méthodes d'analgésie et d'anesthésie si un acte provoque un inconfort. · Points Limites : Appliquer des points limites spécifiques dans chaque étude pour arrêter l'expérience avant tout signe de souffrance. Environnement et Soins · Enrichissement : Assurer la présence d'enrichissements et prévoir des périodes de jeux/activités sociales selon nos procédures internes Éthique · Réhabilitation : Pour tous les animaux éligibles après la fin de leur utilisation.

Choix des espèces

Conformément aux exigences réglementaires, les études sont menées sur l'espèce de destination, à la posologie préconisée ou des multiples de celle-ci allant au maximum jusqu’à 5x la dose. L'analyse rétrospective des cinq dernières années et les prévisions de développement des prochains produits confirment que les besoins pour la présente demande d'autorisation de projet ne concerne exclusivement que les espèces chien et chat. Ce sont des animaux dont le stade de développement varie du jeune sevré à l’animal adulte, l’âge sera dépendant du type de test et du produit d’essai envisagé.