Recherche appliquée

1 420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux mois de régime carencé en graisses, protéines, vitamines ou minéraux précèdent une irradiation destinée à détruire leur moelle osseuse, puis l'injection de cellules leucémiques et de lymphocytes T, jusqu'à quatre prélèvements de sang à la mâchoire et jusqu'à trois ponctions dans l'os du fémur. Le porteur annonce un amaigrissement, une paralysie des membres postérieurs empêchant l'animal de se déplacer et de s'alimenter, une prostration, voire une embolie pulmonaire. L'effectif de 1 420 souris n'est justifié que par la mention d'études antérieures du laboratoire et de "tests statistiques appropriés", sans autre précision.

Objectifs

Les leucémies aigües myéloïdes (LAM) sont des maladies affectant la moelle osseuse puis d’autres organes par la suite comme la rate ou le foie. Afin de freiner cela il existe le traitement par chimiothérapie qui peut permettre une rémission complète mais souvent va progresser vers une leucémie récidivante pour lesquelles de nouvelles tentatives de chimiothérapie ne fonctionnent pas. En plus de la chimiothérapie il est possible d’effectuer des greffes de moelle osseuse, provenant d’un donneur compatible. Ce traitement entraîne une réponse dans la moelle osseuse contre la leucémie (Greffon contre la leucémie, GvL) afin d’éliminer les cellules leucémiques restantes. Cependant, la greffe ne permet pas toujours de guérir le patient (i) lorsqu’il n’y a pas une réponse suffisamment forte de l’organisme contre la leucémie ou (ii) lorsqu’il y a une réaction de la partie greffée contre les cellules normales du patient. De plus, le mode de vie des patients recevant cette greffe ou des donneurs sains, notamment le régime alimentaire n’est que très peu étudié. Le projet vise donc à comprendre l’impact du régime alimentaire sur la réponse GvL dans les LAM. Pour cela un modèle a été mis en place, en injectant des cellules sanguines (ou blastes) leucémiques provenant de souris malades, suivi de lymphocyte T (globule blanc qui jouent un rôle dans la réponse immunitaire) reconnaissant les blastes (cellules immatures de la moelle osseuse qui peuvent se différencier). Nous avons pu valider la réponse bénéfique GvL dans deux modèles de la maladie chez la souris, de par l’amélioration de la survie des souris recevant cette double transplantation. Les deux modèles étant un modèle de souris ayant été irradié : processus permettant de « faire de la place » dans la moelle osseuse et aux cellules leucémiques de s’y développer. Après l’étude de nombreux gènes chez la souris, nous avons pu identifier des gènes qui modifient la réponse GvL dans les LAM, incluant des gènes jouant un rôle dans le métabolisme (l'ensemble des réactions chimiques qui se déroulent dans l'organisme). Nous souhaitons à présent identifier quels régimes alimentaires pourraient améliorer l’efficacité de la réponse GvL.

Bénéfices attendus

L’effet thérapeutique de la greffe de moelle osseuse est compromis dans plus de 40% des cas de patients atteints de leucémie aiguë myéloïde (LAM) avec une réponse immunitaire s’appelant : greffon contre la leucémie (GvL) insuffisante. Une meilleure compréhension des différents mécanismes est donc indispensable pour concevoir des immunothérapies (traitements) rationnelles et efficaces pour un traitement à long termes des LAM. Notre projet se propose d’identifier et de caractériser les potentiels rôles de différents régimes alimentaires sur l’effet GvL afin d’optimiser la réponse immunitaire du greffon médiée par les lymphocytes T toxiques vis-à-vis des cellules leucémiques.

Procédures

Les animaux vigiles (c’est-à-dire non endormi) disposeront tout d’abord d’une période d’adaptation à leur régime alimentaire spécifique, pendant environ 2 mois. Les régimes alimentaires étudiés ont des compositions bien définies permettant d'avoir des carences en graisses, protéines, vitamines, minéraux... Une fois les souris adaptées à leur régime alimentaire spécifique, elles seront irradiées afin d’éliminer les cellules de la moelle osseuse afin de pouvoir injecter en une seule fois les cellules leucémiques par voie intraveineuse de quelques secondes dans la veine de la queue. Trois à 5 jours après injection des blastes, les souris seront injectées en une seule fois les cellules T immunitaires par voie intraveineuse de quelques secondes dans la veine de la queue. Des prélèvements de sang au niveau de la mâchoire de moins de 1 minute espacés d’au moins 1 semaine (4 au maximum) seront réalisés pour évaluer l’évolution de croissance tumorale. Nous ferons également une ponction de cellules dans l’os du fémur d’environ 5 minutes (8 à 10 jours après l'injection des cellules cancéreuses et au maximum 3 prélèvements sur la durée de la procédure expérimentale) ; les animaux étant placés sous anesthésie et analgésie adaptée.

Impact sur les animaux

Lorsqu’ils sont greffés, manipulés pour le suivi de prise de greffe, les animaux pourraient être confrontés à des effets indésirables tels que du stress et/ou une perte de poids. De plus, la greffe de cellules leucémiques va, comme attendu, permettre l’établissement de la maladie et donc entrainer au bout de quelques semaines un amaigrissement , une paralysie des membres postérieurs empêchant l’animal d’être mobile et de s’alimenter, une perte d’activité, une prostration, une déshydratation et/ou une hypothermie ou aller jusqu’à une embolie pulmonaire. De manière plus exceptionnelle, en cas de ponction osseuse, les animaux peuvent ressentir une gêne temporaire au niveau de la mobilité. De manière additionnelle, certains régimes alimentaires peuvent avoir un impact sur les souris telles que, la prise de poids, le risque de développement de maladies cardiovasculaires, d’atteinte rénales ou encore le développement de diabète.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélever la moelle osseuse et observer la réponse contre la leucémie des lymphocytes T (catégorie de globules blancs) qui jouent un rôle dans la réponse immunitaire.

Remplacement

Pour identifier les acteurs qui permettent une réponse contre la leucémie, des tests chez l’animal sont nécessaires car il n’existe pas de modèles in vitro permettant de regrouper de façon fidèle l’évolution du cancer au sein d’un organisme entier. Bien que certains modèles in vitro permettent d’obtenir des informations importantes sur le développement de la leucémie, ils ne sont pas suffisants car ils ne tiennent pas en compte de l’environnement dans lequel se multiplie les cellules cancéreuses, ce qui peut modifier leur comportement et l'effet des traitements.

Réduction

Le nombre minimum de souris nécessaires par groupe a été établit grâce aux études antérieures du laboratoire et notamment à l’utilisation de tests statistiques appropriés.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement et le milieu sera enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer le bien-être. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l'animal, en optimisant le mode et le volume d'injection et la durée de traitement. Les animaux seront anesthésiés et une analgésie sera effectuée lors des ponctions osseuses car il y a un risque plus important de gêne ou de douleur liée à cette procédure. De plus, les études antérieures ont permis de mieux appréhender les points limites et d’établir d’une liste de différents points limites qui seuls ou cumulés vont nécessiter l’euthanasie de l’animal. Une surveillance visuelle quotidienne des animaux et le suivi clinique réalisé une fois par semaine après la greffe des cellules leucémiques permettent de recenser les différents points limites.

Choix des espèces

Le modèle souris est à la base de la compréhension du cancer. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, il intègre les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à la compréhension des étapes jalonnant la leucémogenèse. De plus, le métabolisme murin se rapproche de celui de l’homme. Dans cette étude, nous utiliserons des modèles de souris auxquelles nous injecterons des cellules leucémiques ainsi que des lymphocytes T, reconnaissant spécifiquement un antigène de ces blastes leucémiques. Nous utiliserons des souris âgées de 3 à 16 semaines. En effet, la mise sous alimentation spéciale sera fait dès le sevrage (à 3 semaines) et les modèles de greffe seront mis en place chez des souris adultes âgées d'au moins 8 semaines (âge permettant d'avoir une bonne prise de greffe des cellules leucémiques).

Toutes les souris subissent une chirurgie préliminaire de vingt minutes, puis deux séances de trente minutes de vidéo-oculographie sur animal éveillé pour mesurer leurs réflexes de stabilisation du regard. 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin de protocole. Beaucoup sont sourdes et tournent en rond sans arrêt, ce que le porteur classe en "phénotype dommageable" tout en affirmant qu'elles sont "parfaitement capables de se nourrir et de se reproduire normalement" et ne demandent pas de soins particuliers. Le projet ne poursuit pas de question scientifique propre, il met une plateforme de mesure à disposition d'équipes extérieures qui y font phénotyper leurs lignées de souris sourdes ou vestibulaires.

Objectifs

Ce projet porte sur la quantification comportementale des réflexes vestibulaires et de souris présentant des suspicions de troubles vestibulaires et auditifs. Les pathologies vestibulaires sont caractérisées par des épisodes imprévisibles de vertiges accompagnés de déséquilibres oculomoteurs et posturaux. Les pathologies vestibulaires chroniques sont très invalidantes et conduisent à un isolement psychologique et social. La prévalence des vertiges en clinique est très importante, de l'ordre de 20 à 30%, et augmente avec l'âge. Les vertiges vestibulaires peuvent être liés à des atteintes du système nerveux périphérique et notamment des organes vestibulaires de l'oreille interne ou du nerf cochléo-vestibulaire. Les pathologies touchant l’oreille interne ont souvent des conséquences auditives et vestibulaires. Alors que les surdités partielles ou totales sont facilement identifiées et mesurées expérimentalement chez la souris, les troubles vestibulaires sont difficiles à identifier et rarement quantifiés. Chez l’homme, le meilleur test consiste à mesurer les réflexes vestibulo-oculaires par vidéo-oculographie, une pratique réalisée dans la plupart des centres ORL. Chez la souris, cette même technique qui permet la quantification des troubles vestibulaires est une expertise rare qui demande du matériel couteux. De nombreuses équipes travaillant sur des pathologies ORL nous contactent donc afin de bénéficier de notre expertise et de notre plateforme intégrée de vidéo-oculographie permettant de réaliser des tests comportementaux vestibulaires. Ce projet générique destinée à permettre le phénotypage de différentes souris sur notre plateforme expérimentale utilisera un total maximum de 720 souris sur 5 ans. Ce nombre permettra de couvrir les besoins d'au moins 7 études sur la période.

Bénéfices attendus

Les pathologies vestibulaires sont très invalidantes. De nombreuses pathologies congénitales d'origine génétiques conduisent chez l'enfant à des surdités qui sont détectées et traitées par des implants cochléaires, et depuis peu par thérapie génique. Dans la plupart des cas, seule la partie auditive de ces pathologies est prise en compte par l'entourage et les médecins, les aspects vestibulaires étant imparfaitement diagnostiqués et évalués. Alors que de nombreux modèles murins sont développés pour mimer les pathologies humaines et font l'objet de tests de thérapie génique, il est essentiel d'évaluer si ces thérapies peuvent également fonctionner sur les organes vestibulaires et permettre in fine une récupération des fonctions sensorimotrices et cognitives associées à ces déficits congénitaux.

Procédures

Tous les animaux (n=720) seront soumis à des chirurgies préliminaires d'une durée de 20 minutes sous anesthésie gazeuse. Les animaux sont phénotypés à l'aide de tests sensorimoteurs: les réflexes de stabilisation du regard sont mésurées par vidéo-oculographie afin de mesurer précisément les fonctions vestibulaires et oculomotrices. Ces tests durent 2 fois 30 minutes et sont effectués chez la souris éveillée. Des tests locomoteurs et posturaux d'une durée totale de 6 minutes sont également effectués 2 fois chez la souris éveillée, afin de mesurer leur équilibre.

Impact sur les animaux

Les souris génétiquement déficientes vestibulaires présentent parfois des hyper activités ou locomotion anormales (circling) ce qui constitue des nuisances les classant en phénotype dommageable. Elles sont également fréquemment sourdes ou mal entendantes. Elles sont cependant parfaitement capables de se nourrir et de se reproduire normalement et ne nécessitent pas de soins particuliers. Ces déficits auditifs et locomoteurs constitent un point d’attention pour la gestion et le cas échéant le suivi plus particulier de ces animaux. Le traitement spécifique pour réduire ces nuisances consiste en une restauration de la fonction vestibulaire par thérapie génique qui fait l'objet d'une partie de l'étude de phénotypage, mais qui ne s'appliquera qu'à une partie des lots.

Devenir

Les souris, le plus souvent mutants génétiques et sujets de thérapie génique, doivent être euthanasiées en fin de protocole. Le cas échéant, après la mise à mort, des analyses post-mortem validant les effets des traitements seront réalisés.

Remplacement

Afin d'évaluer les déficits sensorimoteurs associés à des pathologies de l'oreille interne et de tester l'efficacité de thérapie génique, il est nécessaire de travailler sur un animal vivant et éveillé. Il s’agit d’un projet de Neurophysiologie intégrative qui ne peut être conduit que sur animal vivant.

Réduction

Des tests statistiques seront effectués en cours de protocole afin de réduire le nombre nécessaire d’animaux au minimum nécessaire pour atteindre des différences significatives entre les différents groupes testés. Le nombre de souris estimé l’a été en considérant que 20% des souris pourraient ne pas compléter l'ensemble des tests. Le nombre de souris correspond à une estimation du maximum de souris qui pourraient être nécessaires, et une estimation des capacités maximales de tests offertes par notre plateforme, il est donc susceptible d'être revu à la baisse au cours du projet.

Raffinement

Les souris sont maintenues par groupes de 4. Les cages sont enrichies avec des roues et rouleaux. Les animaux sont suivis individuellement, leur poids est controlé régulièrement pendant les phases de tests. Chaque animal bénéficie tout au long de l’étude d’une attention et de soins de qualité par du personnel qualifié, afin d’assurer un bien-être optimal. Des traitements antalgiques et anesthésiques adaptés sont utilisés. Des points limites objectifs sont définis afin le cas échéant d’adapter les soins ou de mettre fin à l’expérimentation.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle reconnu pour les expériences de neurophysiologie intégrative visant à mieux comprendre le fonctionnement du cerveau des mammifères, c'est le modèle animal privilégié pour les études génétiques et la mise au point de traitement de thérapie génique. L'utilisation de lignées génétiquement altérées permet de reproduire les pathologies génétiques conduisant à des surdités et pathologies vestibulaires congénitales chez l'homme, afin de développer des thérapies ciblées. Les tests sensorimoteurs sont effectués sur des animaux plus âgés que 6 semaines. Les réflexes oculomoteurs et locomoteurs étudiés se développent en effet au cours des 4 premières semaines de développement post-natal, et sont considérés comme acquis et matures chez l'ensemble des individus après 6 semaines.

Dépourvues de système immunitaire fonctionnel pour ne pas rejeter des tumeurs humaines, 2 500 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un fragment de tumeur prélevé chez un patient est greffé sous leur peau, la tumeur est laissée croître jusqu'à 1 200 mm3, et l'animal peut être gardé jusqu'à un an. Le projet ne cherche aucun résultat scientifique propre, il alimente une banque de tumeurs congelées destinée à des études pharmacologiques autorisées séparément. Chaque tumeur récoltée sur une souris tuée est découpée en fragments regreffés sur de nouvelles souris, jusqu'à cinq passages successifs, et le porteur évalue la possibilité de greffer deux tumeurs par animal.

Objectifs

Le cancer est une maladie qui touche des millions de personnes à travers le monde. Il s'agit d'une prolifération anormale de cellules qui peuvent envahir les tissus environnants et se propager à d'autres parties du corps. Selon l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS), il y a environ 18 millions de nouveaux cas de cancer chaque année dans le monde, et ce chiffre est en augmentation. En France, environ 400 000 nouveaux cas sont diagnostiqués chaque année. L’objectif de ce projet est de constituer une banque de tumeurs solides d’origine humaine. Pour se faire, les tissus biologiques initialement prélevés en de très petites quantités chez le patient seront amplifiés chez la souris afin de disposer rapidement de matériel tumoral congelé ou frais pour réaliser des études in vitro ou greffer des souris en vue d’études pharmacologiques. Ce projet s’inscrit dans un large programme de recherche de nouvelles thérapies visant à cibler spécifiquement les cellules cancéreuses. Il s’agit d’un projet dédié uniquement à l’amplification et au maintien de tumeurs solides « in-vivo ». Pratiquement, l'échantillon du patient est greffé sur la souris. La tumeur obtenue est ensuite prélevée, découpée en fragments puis greffée à nouveau sur de nouveaux animaux. Ce process permet d'amplifier le matériel tumoral permettant ainsi de congeler des échantillons tumoraux en quantité suffisante pour réaliser une banque ou pour greffer des animaux afin de réaliser une étude pharmacologique si un besoin est identifié. Ces études de pharmacologie font l’objet d’une autre autorisation de projet.

Bénéfices attendus

Malgré les progrès dans le traitement du cancer, certains restent difficiles à traiter et des patients ne répondent pas ou deviennent résistants aux traitements existants. La recherche contre le cancer reste encore un défi majeur de santé publique. Les avancées médicales, incluant la recherche de nouvelles thérapies, sont cruciales pour réduire l'impact de cette maladie et offrir de meilleures perspectives aux patients. Les PDX (Patient Derived Xenograft ou xénogreffes dérivées de patients) offrent des modèles proches du patient d’origine. Ces modèles sont généralement utilisés en phase préclinique avancée pour consolider la connaissance des maladies, vérifier l'efficacité des thérapies chez la souris et ainsi en augmenter la transposabilité chez l'homme. Une banque de PDX est constituée de modèles de tumeurs humaines implantées chez des animaux, ici des souris. Ces modèles sont créés en greffant des échantillons de tumeurs prélevés chez des patients sur des souris immunodéficientes permettant une tolérance à la greffe la plus optimale possible. Ces banques sont importantes dans la recherche sur le cancer pour plusieurs raisons : -Représentation fidèle des tumeurs humaines : Les PDX conservent les caractéristiques des tumeurs originales. -Validation des cibles thérapeutiques : Les PDX sont utilisés pour confirmer la pertinence et l'efficacité des nouvelles cibles thérapeutiques. -Recherche et développement de nouveaux traitements : Les banques de PDX offrent des modèles précieux et pertinents pour tester de nouveaux médicaments et thérapies. -Compréhension des mécanismes de résistance : Les PDX permettent d'étudier la résistance aux traitements en analysant les changements génétiques et biologiques. En intégrant des modèles PDX répondant aux besoins des projets dans notre infrastructure de recherche, nous pourrons renforcer nos capacités de développement de nouveaux traitements anticancéreux et améliorer les chances de succès clinique, tout en contribuant à des avancées scientifiques significatives dans le domaine de l'oncologie. Ces banques visent à répondre aux problématiques de nos projets in-vivo et in-vitro pour la recherche de candidats médicaments. Les échantillons générés pour ces banques pourront également être utilisés à des fins de développement de nouvelles méthodes pour cultiver in vitro des PDX ouvrant ainsi la possibilité de disposer de nouveaux modèles alternatifs ou préalables aux études chez l’animal.

Procédures

Chirurgie unique pour implantation d’un fragment tumoral sous la peau de la souris sous anesthésie gazeuse (durée maximale d’environ 10 minutes) Les souris reçoivent deux administrations d’anti-douleur, préalablement et consécutivement à la chirurgie (contention de 30s et administration d’environ 10s).

Impact sur les animaux

Une potentielle source de stress et/ou de douleur peut provenir des deux administrations de l’anti-douleur en couverture de la chirurgie. Les phases d’administration des antidouleurs peuvent générer un stress et une douleur légère de très courte durée. L’implantation sous la peau par chirurgie du fragment tumoral peut générer une douleur légère au réveil et en période post-opératoire. La croissance de la tumeur peut dans certains cas engendrer une perte de poids. Elle peut également, selon la nature du fragment tumoral créer des métastases. Les souris implantées seront conservées sur une durée maximale d’un an. Afin de favoriser la pousse des tumeurs humaines issues de patients, des souris immunodéprimées sont utilisées. Elles possèdent un système immunitaire très restreint et peu fonctionnel qui limite le rejet de la souris envers un élément considéré comme du « non-soi ». Ces souris immunodéprimées présentent un phénotype que l’on peut considérer comme dommageable, mais qui est maitrisé grâce à des conditions d’hébergement strictes qui permettent de protéger ces animaux fragiles de l’environnement extérieur.

Devenir

A l’issue de chaque procédure les souris seront euthanasiées pour différentes utilisations : - Prélèvement (Tumeurs, sang…) à des fins d’analyses histologiques ou ex-vivo (pour caractériser les modèles). - Prélèvement de la tumeur pour en préparer des fragments soit pour la réimplantation (à des fins d’amplification pour le prochain passage ou d’études de pharmacologie) soit pour de la congélation (à des fins de stockage pour de futures études de pharmacologie ou analyses)

Remplacement

Les biopsies tumorales humaines collectées en très petites quantités chez le patient nécessitent une étape d’amplification in vivo, aucune méthode in vitro ne permettant de conserver les propriétés tumorales les plus natives. La croissance ainsi effectuée dans un organisme vivant complexe permet de maintenir les conditions natives les plus proches des caractéristiques de progression du cancer chez le patient et ainsi de bénéficier d’un matériel le plus pertinent possible pour les études dédiées à la recherche de candidats traitements. Cette approche in vivo utilisant des souris est également nécessaire pour la croissance de tumeurs ne pouvant être implantées directement à partir des approches classiques de lignées cellulaires cultivées in-vitro. En effet, certaines tumeurs nécessitent un fragment pour amorcer leur croissance. Dans ce cas, la tumeur doit être préalablement amplifiée et maintenue chez des animaux en réalisant des passages successifs (5 au maximum) au préalable de la préparation d’études pharmacologiques. Enfin, ce projet dédié à amplifier et constituer des banques de tissus tumoraux proches du patient vise à préparer des études pour évaluer l’activité et l’efficacité de nos composés. Malgré de nombreux modèles in vitro qui vont permettre de sélectionner en amont les candidats médicaments les plus prometteurs, ces études ne peuvent à l’heure actuelle être menées que dans un modèle intégrant toute sa complexité biologique et physiologique, afin de pouvoir mettre en évidence un effet fonctionnel et confirmer le potentiel anti-tumoral ou anti-métastatique d’un composé. Il est donc essentiel que le modèle de souris mime au mieux la pathologie cancéreuse.

Réduction

La première implantation de fragments tumoraux chez des souris immunodéficientes se fait sur 1 à 5 animaux puis une amplification est faite dans le but de congeler le plus rapidement un nombre conséquent de fragments et de tester la condition congelée permettant de lancer plusieurs études pharmacologiques et de collecter des échantillons pour des analyses ultérieures ou in vitro. À chaque passage, des caractérisations biochimiques sont réalisées pour vérifier la qualité du tissu tumoral. L’amplification est arrêtée en cas de dérive importante (génétique, morphologique, expression de certaines protéines…). La congélation des fragments tumoraux est évaluée dès les premiers passages pour permettre des arrêts dans l’amplification. Le projet prévoit de greffer 500 souris par an (soit 5 PDX), représentant 2500animaux sur 5 ans. Ces phases d’amplification permettent de définir les conditions optimales de greffe et la croissance tumorale, en vue d’études d’efficacité et de pharmacodynamie. Cela contribue à réduire le nombre d’animaux utilisés en optimisant les protocoles expérimentaux. Le département biostatistique déterminera le nombre d’animaux nécessaires pour chaque étude d’efficacité ou de pharmacodynamie ultérieure (demande d’autorisation de projet différente). L’opportunité de réaliser deux greffes par animal (approche bilatérale) sera évaluée lors des premières phases d’amplification, avec l’accompagnement de la SBEA et des expérimentateurs. Cette analyse visera à prendre en compte simultanément les risques potentiels pour le bien-être animal et les bénéfices attendus en termes de réduction du nombre d’animaux utilisés. Les résultats permettront de statuer de manière argumentée sur la pertinence ou non de mettre en œuvre cette approche. La souche de souris choisie sera la plus immunodéprimée possible pour maximiser la prise de greffe de cellules humaines, sans tester différentes souches de souris, ce qui réduit le nombre d’animaux par modèle tumoral. Enfin, le matériel tumoral issu de ces amplifications servira à développer des modèles in vitro (2D/3D), permettant de valider leur potentiel comme méthodes alternatives à l’expérimentation animale pour la sélection de candidats médicaments et de modèles tumoraux pertinents. À terme, cela permettra, nous l’espérons, de réduire significativement le nombre de modèles testés in vivo.

Raffinement

Le suivi de la croissance tumorale par pied à coulisse est une méthode non invasive pour l’animal et sans douleur. Elle permet une mesure rapide et régulière au cours du temps chez la souris vigile. Les tumeurs sont mesurées plusieurs fois par semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais également pour limiter la souffrance et appliquer les points limites si nécessaire. Pour des raisons scientifiques et de qualité du tissu qui est amplifié, la tumeur en cas de greffe unique sera récoltée à un volume maximum inférieur aux standards classiquement appliqués, soit 1200mm3 au lieu de 2000mm3 et/ou si application d’un point limite. La technique de chirurgie pour l’implantation du fragment tumoral sous la peau de la souris est choisie pour être une technique peu douloureuse et peu invasive. Elle est réalisée sous anesthésie générale avec la mise en œuvre de conditions per-opératoires (antidouleurs en particulier) qui permettent de réduire la douleur ressentie par les souris. Les souris font l’objet d’une observation clinique et de soins adaptés le cas échéant, tout au long de l’étude, particulièrement dès les 1ers signes de croissance tumorale. Des points limites sont définis et seront appliqués tout au long du projet. Afin de favoriser la pousse des tumeurs humaines issues de patients, des souris immunodéprimées (système immunitaire quasi inexistant) seront utilisées. Ces souris fragiles et sensibles sont protégées des pathogènes de l’environnement extérieur grâce à des conditions d’hébergement strictes.

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de souris est largement décrite dans les publications en recherche pré-clinique : les tumeurs PDXs sont davantage déployées chez la souris que chez le rat. Les souris sont utilisées à partir de 4 semaines et jusqu’à l’âge de 13 mois correspondant à la durée maximale d’une étude. Il est préférable d’utiliser de jeunes souris lors de l’implantation des fragments car il a été démontré qu’elles acceptent mieux la greffe (moins de risques de rejets). De plus, cela permet d’assurer une période d’observation pour la croissance tumorale plus longue (jusqu’à 13 mois) sans atteindre un âge avancé pour la souris. Ces modèles tumoraux d’amplification de PDX permettent de déterminer des paramètres in vivo (taux de prise, effet de la tumeur sur l’état général de la souris etc…) et ainsi définir les conditions optimales de greffe.

Tuées pour que leurs yeux soient prélevés et l'innervation de leur cornée examinée, 189 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un vecteur viral leur est injecté dans la glande lacrymale et dans la cornée, avec des sutures posées dans la joue, puis un mois plus tard la surface de leur œil est abrasée ou le nerf cornéen sectionné pour mimer une blessure. Le porteur indique que les souris se frottent et peuvent perdre deux ou trois points de suture par joue, ce qui augmente le risque d'infection, et compare la douleur des 72 heures suivant l'abrasion à celle d'un grain de sable dans l'œil. Il conclut que la souris est "le seul modèle" permettant d'explorer cette maladie rare dans son ensemble.

Objectifs

L'œil est protégé par une surface transparente : la cornée. Il s’agit du tissu contenant le plus de nerfs du corps humain. L’extrémité des nerfs se trouve à la surface de la cornée afin de capter les stimulations et agressions extérieures. Ces nerfs confèrent une grande sensibilité à la cornée qui est elle-même protégée par les larmes (rendant la surface de l'œil en permanence humide). Tous ces éléments fonctionnent ensemble formant un équilibre fragile. La moindre atteinte de cet équilibre peut entraîner des défauts de la cornée pouvant eux-mêmes rendre aveugle le patient. Cette situation se déroule typiquement dans la maladie que l’on appelle la kératite neurotrophique, une maladie neurodégénérative rare touchant 5 personnes sur 10 000 en Europe. Elle entraîne la mort des nerfs et donc à terme une perte de sensibilité et de vision. A l’heure actuelle, les traitements disponibles sont limités (gouttes) et les formes sévères de la maladie nécessitent une greffe de cornée. Or, la greffe reste une intervention lourde avec un taux de rejet élevé en plus d’une efficacité souvent temporaire. On se trouve en impasse thérapeutique où le manque de thérapies innovantes constitue un frein majeur à l’avancée scientifique. L’objectif du projet serait donc d’aider à la croissance de ces nerfs contenus dans la cornée qui auront été altérés par la maladie. Or, la repousse des nerfs une fois altérés est un processus long (plusieurs semaines). Le but ici est d’accélérer ce processus en se focalisant sur le facteur responsable de la repousse des nerfs. L’hypothèse de l’équipe repose sur la stimulation de la production d’un facteur particulier déjà contenu dans les larmes mais en quantité limitée. Pour atteindre une production satisfaisante et un effet bénéfique sur les nerfs de la cornée, la technique utilisée est l’injection du facteur en question dans la glande lacrymale (responsable de la production des larmes) ainsi que l’injection de son récepteur dans la cornée. Ainsi, en produisant les larmes, la glande lacrymale produira une grande quantité du facteur d’intérêt qui sera contenu dans les larmes. Ces dernières, une fois à la surface de l'œil, permettront au facteur de se lier directement à son récepteur qui aura été injecté au préalable dans la cornée. On parle donc de double injection (ou de double thérapie génique).

Bénéfices attendus

Dans ce contexte, notre approche innovante de thérapie génique ciblant à la fois la glande lacrymale et l’innervation de la cornée vise à induire la repousse des nerfs de la cornée. Ce travail pourrait ainsi ouvrir la voie à une stratégie thérapeutique curative pour la kératite neurotrophique (KN), en s’attaquant directement au manque d’innervation à l’origine de la maladie rare. Enfin, ce travail devrait aboutir à des publications scientifiques dans des revues à comité de lecture, et potentiellement à un ou plusieurs dépôts de brevet, assurant ainsi une valorisation scientifique et technologique du projet.

Procédures

Un vecteur viral est comme une petite « enveloppe » qu’on utilise pour transporter un message (le gène qu’on veut introduire) vers une cellule afin de soigner une maladie. Celui-ci va être injecté dans un organe cible, c’est ce qu’on appelle la thérapie génique. Dans notre cas, on réalise une injection dans la glande lacrymale, qui sécrète les larmes, couplée à une injection dans la cornée, communément réalisée chez l’Homme avec des antibiotiques. Pour cela, les animaux seront anesthésiés puis recevront une dose d’antidouleur. Les injections se réalisent en une fois pour une durée totale de 7 minutes environ. Les animaux sont surveillés jusqu’à leur réveil. Un mois après l’injection, on vient réaliser une blessure sur l’œil afin de mimer une maladie ou un accident : l’abrasion ou l’axotomie. Ces deux techniques (5min environ) ne traversent par la barrière protectrice de l'œil, elles restent donc des méthodes n’impliquant pas de défauts profonds à l'œil. Celles-ci sont réalisées en une seule fois sur animaux également endormis ayant à leur tour reçu une dose d’antidouleur. Les souris sont suivies de façon journalière après les procédures afin de prévenir les risques. Les prélèvements de larmes et la mesure de la sensibilité cornéenne sont effectués en amont et en aval des chirurgies. Le test de sensibilité est réalisé 3 jours consécutifs afin d’avoir une moyenne la plus juste. Ces procédures réalisées sur animaux vigiles sont rapides (1-2 min maximum) et n’occasionnent que le stress de la contention.

Impact sur les animaux

Des résultats antécédents au projet ont montré que l’injection dans la cornée n'entraîne pas de traumatisme au niveau de la cornée. Toutefois, la qualité des injections peut varier en fonction de l’expérimentateur ; les souris seront donc scrupuleusement surveillées dans les jours suivant la chirurgie. En revanche, les sutures effectuées au niveau de la joue de la souris peuvent entraîner des sensations de tiraillement, malgré la réalisation minutieuse des points. Il arrive que les souris se frottent, ce qui peut provoquer la perte de deux ou trois points par joue, augmentant ainsi le risque d’infection de la plaie. C’est précisément pour cela que les animaux sont sous surveillance pendant les jours qui suivent l’opération. La modélisation d’une blessure de la cornée chez la souris pourra impliquer une douleur passagère dans les 72h suivant la manipulation, douleur comparable à une sensation d’irritation causée par la présence d’un grain de sable dans l'œil. Aussi, le stress d’être manipulé peut être retenu. L’axotomie quant à elle ne détruit pas la surface de la cornée, la dégénérescence des fibres au centre de la cornée n’induit pas de douleur mais au contraire une perte de sensibilité. Pour le test de sensibilité cornéenne, les souris sont contentionnées pendant 1 à 2 min, une fois par jour, pendant 3 jours consécutifs sur plusieurs semaines afin d’évaluer la régénération de l’innervation (4 +/- 1 semaines).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélever des yeux afin d’étudier l’effet des procédures sur l’innervation de la cornée.

Remplacement

La souris comme modèle de pathologie humaine, telle que la kératite neurotrophique, est un excellent système intégrant la complexité des interactions entre les différents éléments de la cornée (nerfs, cellules de surface et larmes). Ces intéractions, à l’origine de l’équilibre naturel de l’œil, se mettent en place durant des mois, et impliquent de nombreux types de cellules, elles ne peuvent donc pas être mimées in vitro (hors organismes vivants, c'est-à-dire dans des boîtes de pétri). Seuls les mammifères présentent la diversité des échanges cellulaires et moléculaires entre les structures de l'œil. Le modèle souris présentant une atteinte des nerfs de la cornée est donc le seul modèle qui permet d’explorer la maladie de la KN dans son ensemble (morphologie, aspect, chimie…). Le modèle vivant demeure donc une étape requise pour étudier la complexité du projet et la pathologie. Le modèle murin présente l’avantage d’être peu coûteux et de se développer rapidement. Les souris que nous utiliserons présentent une forte variabilité génétique, reflétant celle observée chez les patients humains.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux et de respecter la règle des 3R, un calcul est réalisé à l’aide d’un logiciel. Cette analyse nous permet d’optimiser la quantité d’animaux (ici 189 souris) tout en garantissant un nombre suffisant de souris par condition pour effectuer par la suite les tests statistiques nécessaires. Cette estimation rigoureuse vise à assurer la robustesse des résultats tout en évitant la reproduction inutile des expériences.

Raffinement

Pendant la période d’acclimatation, les procédures habituelles seront appliquées : contacts et observations quotidiens par les soigneurs, hébergement en groupe d’au moins deux individus, et mise en place d’un environnement adapté et enrichi. La durée et la répétition des expérimentations sont rigoureusement réfléchies, afin de limiter au maximum les contraintes pour les animaux, notamment en évitant toute anesthésie répétée. Puisque les animaux seront soumis à des manipulations et contentions journalières rapides (≤2min) nécessaires aux expérimentations, nous mettrons en place une période d’habituation afin de limiter l'angoisse et familiariser les animaux aux expérimentateurs. L’état général, le poids, et le comportement des animaux seront suivis régulièrement pour détecter toute altération. Si nécessaire, un animal présentant des signes de souffrance sera retiré de l’expérimentation et pris en charge conformément aux recommandations vétérinaires. L’animal sera placé sous anesthésie générale durant toute la durée des injections, de l’abrasion cornéenne, et de l’axotomie avec l’administration de médicaments anti-douleur et anesthésiques appropriés. Un suivi quotidien avec la grille de scoring permettra qu’en cas de douleur l’animal soit immédiatement pris en charge. L'œil est formé de telle manière qu’une abrasion superficielle comme celle-ci n’impactera en rien l’intégrité de l'œil, mais simplement la couche la plus superficielle de la cornée. Nos précédentes expériences ont montré qu’une marge supplémentaire de 5 % est nécessaire afin de pallier les pertes potentielles liées à l’anesthésie, ainsi qu’aux complications post-opératoires telles que le développement d’ulcères cornéens. Les animaux développant de telles complications sont retirés de l’étude, les points limites sont décrits dans la procédure. Les animaux en sus seront intégrés aux expérimentations en cours, permettant ainsi d’augmenter la puissance statistique des analyses.

Choix des espèces

La lignée de souris utilisée présente une grande variabilité génétique en raison de l’absence de consanguinité, ce qui en fait un modèle proche des humains. Nous étudions des souris âgées de 12 semaines car c’est à cet âge que la cornée est mature et que l’animal a dépassé la puberté.

376 souris génétiquement modifiées pour développer un glaucome vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque jour pendant 28 jours, elles reçoivent un collyre conservateur dans les yeux, avec des prélèvements de larmes et des mesures de sensibilité cornéenne répétées trois jours de suite sur animaux vigiles, puis elles sont tuées pour que leurs yeux soient analysés. Leurs yeux peuvent grossir jusqu'à empêcher la fermeture des paupières, et l'animal est alors tué immédiatement. Le porteur affirme que les cultures cellulaires ne suffisent pas et que l'action du conservateur doit être observée sur un œil complet et fonctionnel, ce qui rend selon lui ces expériences "indispensables".

Objectifs

Les collyres, ou gouttes pour les yeux, sont très utilisés pour traiter certaines maladies comme le glaucome. On y ajoute souvent des conservateurs pour que le produit reste efficace et sans danger plus longtemps. Le glaucome est une maladie fréquente après 40 ans, qui touche jusqu’à 10 % des personnes après 70 ans. Elle abîme lentement le nerf optique, ce qui réduit le champ de vision, jusqu’à la cécité si elle n’est pas traitée à temps. Le traitement repose sur l’usage quotidien de collyres dont beaucoup contiennent des conservateurs. Mais au bout de quelques mois, beaucoup de patients ressentent une gêne : la surface de l’œil devient moins sensible, et les opérations deviennent plus difficiles à cause d’une inflammation. Nos recherches ont montré que les conservateurs peuvent abîmer les nerfs de la cornée, la surface transparente de l'œil, ralentissant la régénération naturelle de cette zone fragile. Cela rend l’œil plus vulnérable, et peut aller jusqu’à former des plaies (ulcères), nécessitant parfois une greffe de cornée : une opération lourde, avec des résultats souvent temporaires. Notre objectif est de mieux comprendre les effets de ce conservateur sur la cornée dans un contexte de glaucome. Pour cela, nous utilisons un modèle de souris qui développe la maladie de façon naturelle et progressive, comme chez l’humain. Nous mesurerons différents indicateurs, comme la sensibilité de la cornée, la pression dans l’œil, ou encore la qualité des larmes. D’autres examens, comme des photos du fond de l’œil ou des tests de réponse à la lumière, permettront de suivre l’évolution de la maladie. Grâce à cette étude, nous espérons mieux évaluer les effets secondaires des collyres avec conservateurs et, à terme, améliorer les traitements pour les patients atteints de glaucome.

Bénéfices attendus

Dans le glaucome, surtout lorsque les patients sont traités avec des collyres contenant des conservateurs, la perte de vision peut évoluer lentement. Cela donne un certain délai pour agir, mais une fois les lésions installées, elles sont irréversibles. Aujourd’hui, les options de traitement restent limitées : certains collyres permettent de contrôler la pression dans l’œil au début de la maladie, mais quand celle-ci progresse, la vision peut être fortement altérée. Dans certains cas, les collyres irritants abîment aussi la surface de l’œil, ce qui complique les soins. Cela peut mener à des atteintes de la cornée graves, parfois nécessitant une greffe. Mais cette solution reste lourde, avec un risque de rejet et un bénéfice souvent temporaire. Notre projet vise à mieux comprendre les effets des conservateurs présents dans les gouttes et du glaucome sur la cornée. En identifiant les changements précoces au niveau cellulaire, nous espérons ouvrir la voie à de nouveaux traitements plus ciblés et mieux tolérés. Ces recherches pourraient donner lieu à des publications scientifiques et peut-être à des dépôts de brevets, valorisant les résultats du projet à l’échelle médicale et technologique.

Procédures

Les souris génétiquement modifiées sont génotypées à l'aide d'un morceau de queue de moins de 2mm prélevé avant l’âge de 10 jours, le prélèvement dure environ 1min. Le projet implique ensuite l’administration quotidienne de gouttes (pendant 28 jours), ainsi que la réalisation de prélèvements de larmes et la mesure de la sensibilité cornéenne avant et après traitement, sur des animaux vigiles. La mesure de la sensibilité se fait sur 3 jours afin de faire une moyenne des résultats. Ainsi, ces procédures sont de courte durée. Les souris sont contentionnées pendant 1 à 2 minutes maximum par animal, mais leur caractère répété nécessite une attention particulière. Afin de limiter le stress induit par la contention, les souris seront habituées progressivement à la manipulation dès le sevrage. Cette habituation permet de réduire considérablement les réactions de défense, en favorisant une meilleure tolérance aux gestes techniques. Les traitements oculaires sont appliqués de manière non-douloureuse, avec une goutte de collyre déposée délicatement sur chaque œil pendant 30 secondes. Les manipulations seront réalisées par du personnel expérimenté, afin d’assurer une gestuelle rapide et précise, minimisant l’impact sur les animaux. Les animaux seront mis à mort pour prélever les yeux qui seront ensuite analysés. Aucun prélèvement invasif ne sera effectué sur animaux vivants.

Impact sur les animaux

Le glaucome est une maladie chronique de l’œil qui évolue lentement et peut entraîner une perte totale de la vue s’il n’est pas traité. Dans le cadre de ce projet, nous étudierons un modèle de souris génétiquement modifié qui présente une mutation sur le gène jouant un rôle essentiel dans le développement de l’œil. Ce modèle est bien connu grâce à des recherches précédentes. Les souris glaucomateuses présentent une perte progressive de la vue, mais cela n’affecte ni leur santé générale ni leur espérance de vie. Chez la souris, la vue n’est pas le sens principal, et cette baisse de vision n’a pas de conséquences visibles sur leur comportement : elles continuent à manger, interagir normalement et prendre soin de leurs petits. Les souris peuvent développer une augmentation anormale de la taille des yeux, comme cela peut arriver chez les personnes atteintes de glaucome. Si les yeux deviennent tellement gros que l’animal ne peut plus fermer les paupières, il ne poursuivra pas l'expérimentation et sera euthanasié immédiatement pour éviter toute souffrance. Les traitements utilisés lors de cette étude sont couramment utilisés chez l’humain, agissant uniquement sur l’œil et n’étant pas douloureux. Toutes les expériences seront menées sur des animaux jeunes (moins de 5 mois), avant que la perte de vision ne devienne importante. Les souris recevront quotidiennement des collyres et seront manipulées brièvement pour ces soins. Ces gestes peuvent générer un peu d’angoisse, mais un programme d’habituation est prévu pour qu’elles s’y adaptent en douceur. Les manipulations seront aussi espacées et limitées dans le temps, afin d’éviter un stress inutile ou des anesthésies répétées, en accord avec les bonnes pratiques en matière de bien-être animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélever des yeux afin d’étudier l’effet du conservateur sur les différentes structures du segment antérieur (cornée, iris, cristallin).

Remplacement

Il est encore très difficile de reproduire toute la complexité d’un organe comme l’œil en laboratoire, notamment ses différentes structures et leur fonctionnement coordonné. C’est pourquoi les tests uniquement réalisés « in vitro » (c’est-à-dire sur des cellules en culture) ne suffisent pas pour étudier certaines maladies oculaires. Dans notre projet, nous utilisons un modèle animal qui développe le glaucome. Ce modèle est essentiel car il permet de mieux comprendre comment la maladie évolue dans un organisme vivant. De plus, les conservateurs présents dans les collyres peuvent avoir des effets secondaires sur l’œil. Pour les étudier de manière fiable, il est nécessaire d’observer leur action dans un contexte réel, c’est-à-dire sur un œil complet et fonctionnel, avec tous ses mécanismes de défense, d’irrigation et de régulation. C’est pour cela que les expérimentations doivent se faire sur un organisme vivant : elles sont indispensables pour comprendre précisément l’impact de ces substances dans un cadre pathologique comme celui du glaucome.

Réduction

Le nombre de souris utilisées pour ce projet a été soigneusement réfléchi. Il a été calculé à l’avance afin d’avoir assez d’animaux pour obtenir des résultats fiables sur le plan scientifique, tout en évitant de multiplier inutilement les tests. Cela permet de limiter le nombre d’animaux tout en garantissant que les expériences n’auront pas besoin d’être répétées. Les analyses prévues permettront de comparer les différents groupes traités de manière rigoureuse, en utilisant des méthodes statistiques adaptées. Au total, sur toute la durée du projet (42 mois), un maximum de 376 souris sera utilisé, avec une petite marge de sécurité de 16 animaux supplémentaires, pour pallier d’éventuelles pertes imprévues. Par ailleurs, des souris mâles et femelles seront incluses afin d’assurer une bonne représentativité dans les résultats.

Raffinement

Pendant la période d’adaptation, les souris seront suivies chaque jour par les soigneurs, logées par petits groupes (au moins deux par cage) et bénéficieront d’un environnement confortable et stimulant. La mise en place de points limite permet de retirer les animaux de l'expérimentation afin d'éviter toute forme de souffrance (physique et psychique). Pour les examens comme le fond d’œil, la mesure de la pression oculaire, les animaux seront endormis grâce à une anesthésie générale. Ils ne ressentiront donc ni douleur ni gêne pendant les procédures. De plus, les souris ne seront pas gardées au-delà de 16 semaines, ce qui permet d’éviter les effets tardifs du glaucome, notamment la perte de vision qui apparaît habituellement vers 8 mois.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris pour ce projet car c’est un modèle bien connu, couramment utilisé en recherche médicale, notamment pour les maladies de l’œil. Sa petite taille, sa reproduction rapide et le fait qu’elle partage de nombreuses similarités génétiques avec l’être humain en font un outil précieux pour mieux comprendre certaines pathologies. Dans notre étude, nous utilisons des souris transgéniques porteuses d’une mutation connue pour provoquer un glaucome, une maladie oculaire fréquente chez l’humain. Ce modèle a déjà été bien étudié et permet de reproduire les signes du glaucome de manière fiable. Les expériences seront réalisées sur des souris jeunes, âgées de moins de 16 semaines. À cet âge, les animaux sont en bonne santé, ne présentent pas encore de perte de vision liée à la maladie, et les examens seront effectués sans douleur, sous anesthésie. Ce choix permet également de limiter le stress et d’éviter toute souffrance liée à l’évolution de la maladie. Ainsi, ce modèle permet d’étudier de manière précise l’impact de certains traitements sur l’œil, dans un cadre contrôlé, tout en garantissant des conditions éthiques et respectueuses du bien-être animal.

Mesurer si l'exposition des parents à une eau chaude se répercute sur leur descendance conduit ici à chauffer l'eau de 26 à 33 °C, par paliers d'un degré toutes les deux heures. 96 poissons medaka, 56 femelles et 40 mâles, vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour prélever leurs ovaires et leurs testicules. Le porteur attend un stress thermique léger, avec réduction de l'exploration, repli dans les coins et nage désorganisée, tout en indiquant que les études antérieures du centre n'ont jamais rapporté de tels changements. Il qualifie de "non invasive" la collecte de sperme obtenue en pressant l'abdomen des mâles anesthésiés, geste répété au début puis à la fin du projet.

Objectifs

Au cours des dernières décennies, le changement climatique et le réchauffement global ont eu des impacts profonds et étendus sur les écosystèmes aquatiques, affectant particulièrement la physiologie et la biologie moléculaire des poissons. De nombreuses études ont démontré que l'augmentation de la température de l'eau peut compromettre le succès reproductif des poissons en perturbant l'axe hypothalamo-hypophyso-gonadique et en modifiant la signalisation hormonale. Cependant, des hypothèses émergentes suggèrent que l'exposition parentale au stress avant la fertilisation pourrait influencer la descendance par des mécanismes d'héritage non génétique. Ces mécanismes, qui n'impliquent pas de modifications de la séquence ADN ni de transmission d'allèles génétiques, pourraient jouer un rôle significatif dans la transmission de traits à la fois avantageux et délétères à la génération suivante. Les recherches chez les mammifères, notamment les rongeurs, ont fortement appuyé ce concept en démontrant que le stress paternel peut engendrer des effets durables sur le comportement et la physiologie de la descendance via un héritage non génétique.

Bénéfices attendus

Ce projet explorera comment l’exposition des poissons parents à des températures élevées durant le développement des gamètes affecte le succès reproductif. Nous étudierons ces effets à la fois aux niveaux phénotypique et moléculaire, en mettant l’accent sur l’héritage non génétique — notamment les modifications de la composition et de l’expression des petits ARN dans les œufs, qui agissent comme des médiateurs clés des signaux environnementaux à travers les générations chez les vertébrés aquatiques. Les objectifs principaux du projet sont : 1. Évaluer la capacité du poisson medaka à s’adapter de manière transgénérationnelle aux températures élevées et identifier les vulnérabilités possibles dans la reproduction ; 2. Identifier les signaux moléculaires sensibles à la chaleur et les facteurs régulateurs chez les parents qui sont transmis via les gamètes à la génération suivante ; 3. Fournir des preuves mécanistiques démontrant comment les petits ARN contribuent à la transmission des effets environnementaux à la génération suivante ; 4. Identifier les voies moléculaires et épigénétiques induites par la température qui impactent la reproduction. Les résultats amélioreront notre compréhension de l’impact du réchauffement climatique sur l’écologie reproductive et la dynamique des populations aquatiques, tout en proposant des stratégies pratiques de gestion thermique en aquaculture. En définitive, en explorant la transmission épigénétique de l’information environnementale, notamment via les miARN, ce projet vise à améliorer les prévisions du potentiel d’adaptation chez les espèces aquatiques et à soutenir le développement de pratiques d’élevage plus résilientes face au réchauffement global.

Procédures

Dans ce projet, les animaux seront soumis à plusieurs types d’interventions : augmentation progressive de la température de l’eau pour les animaux des lots exposés: la température de l’eau passera progressivement de 26–27 °C à 32–33 °C, avec une augmentation d’environ 1 °C toutes les deux heures. Transfert des poissons entre les réservoirs : Le transfert des poissons du réservoir principal vers d’autres réservoirs d'une durée inférieure à 2 secondes. Collecte de sperme (1 fois au début du projet et une fois en fin de projet): pour l’échantillonnage du sperme, les mâles reproducteurs seront d’abord anesthésiés. Ensuite, en appliquant une pression douce sur la région abdominale, un petit volume de sperme (environ 1 à 2 microlitres) sera prélevé. Cette procédure est très brève (moins d’une minute) et non invasive. Prélèvement des gonades (testicules et ovaires): À la fin de l’expérience, tous les poissons de chaque groupe de température seront d’abord anesthésiés puis euthanasiés. Leurs testicules et ovaires seront soigneusement prélevés et conservés pour des analyses histologiques et moléculaires.

Impact sur les animaux

Le stress, de manière générale, peut entraîner des modifications du comportement chez les poissons. Dans ce projet, les poissons exposés à une température de l’eau de 32 à 33 °C peuvent présenter un stress thermique léger par rapport à ceux maintenus à la température témoin de 26 à 27 °C. Ce stress thermique peut influencer le métabolisme énergétique, la prise alimentaire, ou une modification du niveau de curiosité et d’activité. Par « modification de la curiosité et de l’activité », on entend l’apparition de comportements tels qu’une réduction de l’exploration de l’environnement, un repli dans les coins, ou une nage désorganisée, qui peuvent être interprétés comme des indicateurs d’un niveau accru de stress thermique ou d’anxiété comportementale. Ces comportements seront suivis systématiquement tout au long de l’étude, à titre d’indicateurs observables de stress thermique. Ces mesures ont un caractère préventif, car les études précédemment menées sur le medaka dans ce centre, en réponse à une augmentation progressive de la température, n’ont jamais rapporté de modifications comportementales associées à un stress thermique.

Devenir

la réalisation d’analyses moléculaires et histologiques, des échantillons d’ovaires et de testicules sont nécessaires. Par conséquent, après l’évaluation du phénotype reproducteur, tous les poissons seront euthanasiés afin de prélever leurs ovaires et testicules.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets non génétiques de l’augmentation de la température de l’eau sur les réponses transgénérationnelles. Il est donc essentiel d’utiliser un modèle animal capable de répondre directement aux variations de température. Les poissons, en tant qu’organismes poïkilothermes (c’est-à-dire dont la température corporelle varie en fonction de l’environnement et qui ne peuvent pas réguler leur température interne), présentent des fonctions physiologiques et comportementales très sensibles aux changements de température environnementale. Cette caractéristique rend les poissons plus pertinents que les mammifères homéothermes (animaux à sang chaud capables de maintenir une température corporelle relativement constante, tels que les souris ou les lapins) pour l’étude des effets des variations de température. De plus, l’étude des effets transgénérationnels nécessite des espèces avec un cycle reproductif court, permettant l’observation de plusieurs générations dans un délai raisonnable. Les espèces poissons comme le medaka sont adaptées en raison de leur maturation rapide. À ce jour, aucune alternative adéquate, tels que les modèles in vitro, ne peut pleinement aborder l’impact de la température élevée sur les phénotypes au niveau de l’organisme, tels que le succès reproductif, ainsi que les aspects transgénérationnels de cette étude avec une pertinence et une exhaustivité comparables.

Réduction

Un total de 96 poissons (56 femelles et 40 mâles) sera utilisé pour évaluer les phénotypes reproducteurs sous deux conditions de température. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés dans la recherche, le sperme et les oeufs seront d’abord prélevés chez les poissons reproducteurs mâles et femelles afin d’évaluer leur phénotype reproducteur. Après cette étape, les mêmes poissons reproducteurs seront utilisés pour le prélèvement des ovaires et des testicules Le nombre d’animaux a été déterminé afin de garantir une puissance statistique suffisante pour détecter des différences significatives entre les groupes, en utilisant des tests appropriés tels que le test t.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans des conditions optimales spécifiques à l’espèce, incluant une photopériode appropriée, une qualité de l’eau adaptée, une densité contrôlée et une gestion sanitaire rigoureuse. La seule exception concernera le groupe exposé à 32–33 °C, température qui, selon la littérature, n’induit pas de mortalité chez le medaka. Afin d’améliorer le bien-être animal, les aquariums seront enrichis avec des plantes artificielles. Les poissons seront maintenus dans des aquariums de 10 litres avec une densité maximale de 24 poissons par bac. Toutes les manipulations animales — y compris l’induction de la ponte, la collecte des œufs et du sperme — seront réalisées par du personnel compétent avec soin et rapidité afin de minimiser le stress. Le personnel portera des gants en nitrile et les poissons seront transférés à l’aide d’épuisettes de petite taille, en limitant au maximum le temps de manipulation. La collecte des œufs sera effectuée de manière douce, rapide et non invasive. La collecte du sperme et des gonades (ovaires et testicules, prélevés en fin d’expérience), qui nécessite une manipulation précise, sera réalisée sous anesthésie afin de limiter l’inconfort. Les animaux seront observés quotidiennement par du personnel formé de l’animalerie pour surveiller leur état de santé et leur comportement. Tout poisson présentant des signes d’infection ou des troubles de santé sera examiné par la personne responsable désignée du laboratoire, qui déterminera les soins appropriés, incluant l’euthanasie si nécessaire. Par ailleurs, l’unité est dotée d’une structure Bien-Être Animal de l’établissement, et qui est consultée pour chaque demande d’autorisation de projet garantissant l’application continue des techniques de raffinement les plus récentes. Celles-ci comprennent notamment l’enrichissement de l’environnement, comme l’ajout de plantes artificielles, afin d’optimiser les conditions d’élevage. Toutes les procédures seront effectuées par du personnel qualifié, formé spécifiquement pour l’espèce et mettant régulièrement à jour ses compétences afin de maintenir des standards élevés de soins aux animaux.

Choix des espèces

Le poisson medaka (Oryzias latipes) a été choisi comme espèce modèle en raison de ses avantages biologiques et expérimentaux en accord avec les objectifs du projet. Le medaka possède un temps de génération court (environ 3 mois), ce qui permet une évaluation rapide des effets intergénérationnels et épigénétiques. Sa reproduction continue et quotidienne offre un accès répété à des œufs à différents stades, idéal pour les analyses moléculaires et phénotypiques. La fécondation et le développement embryonnaire externes permettent un contrôle strict de l’environnement après la fécondation, réduisant les effets maternels confondants et favorisant une investigation précise des facteurs pré-fécondation. De plus, le medaka bénéficie d’un génome entièrement séquencé et de ressources moléculaires importantes (par exemple, bases de données bioinformatiques), ce qui en fait un modèle puissant pour l’étude des interactions gène-environnement. Ces caractéristiques rendent le medaka un modèle fiable, reproductible et éthiquement gérable pour les études multigénérationnelles. Dans cette étude, les poissons sont à l’état adulte afin d’évaluer précisément le phénotype reproducteur, de collecter les œufs et de réaliser les analyses moléculaires nécessaires.

La moitié des animaux repart vers d'autres études et l'autre moitié est tuée pour que les tissus au contact du dispositif implanté soient examinés au microscope. 200 porcs, 200 chiens, 200 lapins et 200 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections le plus souvent sans anesthésie, se font implanter sous la peau des dispositifs comme une pompe à insuline lors d'une opération d'environ trente minutes, et portent parfois un cathéter permanent pour les prélèvements sanguins répétés, avec des risques de douleur post-opératoire de trois à cinq jours, d'infection, d'hématome et d'hypoglycémie. Le porteur écrit que l'utilisation d'animaux est "requise par la réglementation" et qu'aucune méthode ne permet aujourd'hui de se passer d'un "organisme entier" pour suivre l'élimination d'un produit.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer la façon dont des molécules (l’insuline par exemple dans des cas de traitement du diabète) agissent sur le corps et en combien de temps ces molécules sont éliminées par le corps. De plus, certains composants doivent être implantés sous la peau (par exemple : pompe à insuline). Dans cas-là, une analyse au niveau des tissus est réalisée, pour savoir comment les tissus réagissent en contact de ce composant qui a été implanté sous la peau.

Bénéfices attendus

Ce projet permet d'obtenir dans différents modèles animaux des données de pharmacocinétique (devenir du produit dans l’organisme) et pharmacodynamie (action du produit sur l’organisme) des produits de santé. Ces études permettront le développement de nouveaux traitements et d’améliorer le confort des patients par optimisation des modalités d’administration des traitements. Ainsi, il est possible d'analyser ces produits en vue de répondre aux exigences des autorités réglementaires dans l'obtention d'une autorisation de mise sur le marché.

Procédures

Les animaux seront mis en contact avec la molécule à tester par injection. Ces injections durent quelques secondes et sont faites sur animaux non-anesthésiés la plupart du temps ou sur animal anesthésié dans le cas d’injection d’un produit visqueux par exemple. De plus une implantation sous la peau peut être réalisée pour certains type de dispositifs (environ 30 minutes -pompe à insuline par exemple). Une fois la molécule mise en contact avec l’animal, des prélèvements sanguins seront réalisées afin de pouvoir évaluer la présence de la molécule dans le sang. Un cathéter permanent ou temporaire pourra être mis en place en cas de prélèvements répétés. Tout au long des périodes de prélèvement, les animaux sont observés afin de détecter les points limites précoces. A la fin des prélèvements les animaux sont soit gardés en vie, soit mis à mort afin de réaliser une analyse sur les tissus qui étaient en contact avec le dispositif afin de voir si ce dernier est bien toléré dans le corps.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont, selon les procédures, les suivants : - douleur et stress liés à la chirurgie (maximum 3 à 5 jours (le plus souvent 1 à 2 jours)). (Implantation de cathéters ou implantation/injection du produit à tester) - perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie et/ou de la chirurgie, pendant maximum 3 à 5 jours (le plus souvent 1 à 2 jours). (nuisance légère) - risque infectieux lié à la chirurgie, dans la semaine qui suit l’implantation des cathéters. - hématome ou œdème au niveau du site opératoire/de prélèvement dans la semaine qui suit l’implantation des cathéters. - Nuisance en cas d’effet secondaire du produit à tester (par exemple : risque d’hypoglycémie après injection d’insuline) pendant quelques heures après injection du produit.

Devenir

Les animaux n’ayant pas d’évaluation de la tolérance du tissu dans le corps pourront être ré-utilisés. Les animaux pour lesquels une évaluation de la tolérance doit être effectué seront mis à mort, car cette analyse est une analyse post-mortem avec analyse histologique des tissus.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est requise par la réglementation. A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer de pharmacocinétique (devenir du produit dans l’organisme) et pharmacodynamie (action du produit sur l’organisme) des produits de santé. De plus pour l’évaluation du devenir du produit, au vu des phénomènes physiologiques en jeu (par exemple l’élimination dans les urines), avoir recours à un organisme entier est nécessaire.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux inclus en étude, il est possible d'utiliser un même groupe "contrôle" (produit dont l'effet est déjà connu) pour plusieurs groupes "test" recevant des produits à tester différents. Des études préliminaires peuvent permettre également de sélectionner un produit test qui présente le plus d'intérêts à être développé, réduisant de ce fait le nombre de tests sur des produits ayant un intérêt moindre avant de lancer des études réglementaires a plus grandes échelles et devant répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc). Le fait de coupler les études de pharmacocinétique (devenir du produit dans l’organisme) et pharmacodynamie (action du produit sur l’organisme) et les évaluations de la tolérance locale permet de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Des mesures sont mises en place pour limiter : - Le stress des animaux : avant la chirurgie, si nécessaire, une période d’habituation aux actes spécifiques est réalisée, pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations. - Les enrichissements présents dans l’environnement des animaux sont renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires…), si cela n’impacte pas les résultats de l’étude. En cas de besoin, ajout d’aliments de soutien (gel, pâtée,…). - La douleur des animaux : en phase post-opératoire, les suivis sont renforcés. La présence d'un vétérinaire sur site permet également la réalisation de soins post-opératoires spécifiques et adaptés. Des points limites précoces sont mis en place.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie est définie dans le(s) texte(s) de référence. Les produits de petite taille/miniaturisés seront testés préférentiellement chez le rat et le lapin. Les produits de taille importante seront préférentiellement testés chez les porcs/miniporcs et chiens. Lorsque plusieurs espèces répondent aux critères, le choix est arbitré par la durée de l’essai et par la quantité de sang nécessaire à l’analyse (pour une étude sur le long terme, utilisation d’espèces à longue durée de vie). Les critères pris en considération dans le choix du stade de développement sont les suivants : 1.Suivi des recommandations des textes de référence Le stade de développement est exprimé en âge ou en poids. Dans la plupart des cas, l’utilisation d’animaux adultes est recommandée. 2.Propriétés intrinsèques du produit à tester En l’absence de recommandation particulière dans le(s) texte(s) de référence et si la nature du produit le requière (exemple : molécule à destination pédiatrique), le stade de développement est pertinemment sélectionné. En l’absence d’exigence particulière, l’utilisation d’animaux au stade adulte est privilégiée. 3.Cas particulier des porcs domestiques Pas de recommandation spécifique réglementaire d’où le choix d’utiliser des porcs domestiques en croissance (âgés d’au moins 8 semaines). Etant donné les conditions d’hébergement, le comportement social, la taille et le poids, et la manipulation des animaux, l’utilisation de porcs domestiques en croissance est la plus appropriée dans ce projet. En cas de besoin d’utilisation d’animaux non-adultes pour le projet (hormis pour les porcs), le groupe en charge du bien-être animal au sein de notre structure (Structure du Bien Être Animal).