Cancers

Renvoyés à leur animalerie d'origine après l'irradiation et comptés comme réutilisés dans d'autres projets, 2 250 souris et 250 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est irradié seul sous anesthésie générale, quelques secondes avec le FLASHKNIFE ou jusqu'à vingt minutes avec le CLINAC, sans prélèvement ni chirurgie sur cette plateforme. Le porteur indique que les nuisances relevant de ce projet se limitent au stress de la préhension pour l'injection de l'anesthésique, et que les autres effets de l'irradiation "se feront sentir au retour dans l'animalerie d'origine". Cette autorisation couvre une prestation d'irradiation pour des projets autorisés ailleurs, ce qui laisse hors de son périmètre les atteintes provoquées par les rayonnements.

Objectifs

Le projet vise à utiliser un irradiateur de dernière génération pour étudier les effets de l’irradiation sur les tissus et les organes de manière très précise. Les chercheurs veulent comprendre comment la radiothérapie à très haut débit de dose (appelée « FLASH ») affecte les cellules saines et tumorales, afin de développer des traitements plus efficaces et moins toxiques pour l’homme. Chaque institut ou laboratoire gestionnaire des animaux doit disposer de ses propres autorisations réglementaires pour les recherches qu’il souhaite mener. L’irradiation des animaux sur la plateforme ne peut avoir lieu que si ces demandes d’autorisation sont dûment validées et en cours de validité. La plateforme ne réalise pas d’irradiation sur des animaux dont le projet n’a pas été autorisé. Le nombre d’animaux accueillis varie selon les projets et est précisé dans chaque demande d’autorisation de projet.

Bénéfices attendus

Les connaissances acquises grâce à ce projet devraient aider à améliorer la sécurité et l’efficacité des traitements radiothérapiques pour les patients, limiter les effets secondaires sur les tissus sains, accélérer le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre certains cancers difficiles à traiter, et préparer l’utilisation future de la radiothérapie FLASH chez l’homme, après validation complète par des études précliniques.

Procédures

Tous les animaux accueillis sur la plateforme seront soumis à une irradiation ciblée à l’aide du FLASHKNIFE ou du CLINAC, réalisée sous anesthésie générale) afin de prévenir toute douleur ou stress. Chaque animal est placé individuellement dans l’irradiateur pour une courte période : quelques secondes pour le FLASHKNIFE et 10 à 20 minutes maximum pour le CLINAC. Après l’irradiation, les animaux sont remis dans leur cage d’origine et retournent dans leur animalerie par transporteur agréé pour poursuivre leurs conditions normales de vie. Aucun prélèvement invasif ni chirurgie n’est prévu dans le cadre de cette plateforme. Le transport entre l’animalerie et la plateforme se fait en cages spécifiques avec couvercle filtrant et nourriture gélifiée, les animaux étant maintenus en groupe social pendant tout le transfert.

Impact sur les animaux

Pendant la durée de la procédure concernée par ce projet plateforme dans lequel les animaux sont reçu uniquement pour irradiation, les nuisances potentielles découleront du stress de la préhension pour injection d'anesthésique général. Ce stress sera léger et de courte durée. Les autres effets de l'irridation se feront sentir au retour dans l'animalerie d'origine.

Devenir

Tous les animaux imagés retournent dans leur animalerie d’origine après la réalisation de l’imagerie pour poursuite des expérimentations

Remplacement

Aucune méthode de substitution, comme les expériences sur cellules en culture (in vitro) ou les modèles informatiques (in silico), ne permet de reproduire la complexité du corps vivant. Les interactions entre organes, la circulation sanguine, les réponses immunitaires et les réactions aux irradiations ne peuvent être évaluées que dans des animaux vivants. C’est pourquoi la plateforme utilise des modèles murins pour étudier les effets de l’irradiation FLASH.

Réduction

La plateforme accueille uniquement les animaux nécessaires aux expériences autorisées dans d'autres établissements de recherche. Le nombre d’animaux est planifié en fonction des besoins scientifiques de chaque projet et des autorisations de projet. Les expériences sont conçues pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, par exemple en suivant plusieurs paramètres sur un même animal.

Raffinement

Toutes les procédures sont conçues pour minimiser l’inconfort et le stress des animaux. L’irradiation FLASH ou CLINAC est réalisée sous anesthésie chimique (Zolétil/xylazine), et la durée dans l’irradiateur est très courte. Les animaux sont surveillés avant, pendant et après l’irradiation, et tous les signes d’anomalie sont immédiatement signalés au vétérinaire. Aucun prélèvement invasif ni chirurgie n’est pratiqué sur cette plateforme, et les animaux retournent toujours dans leur animalerie d’origine après la procédure.

Choix des espèces

La radiothérapie FLASH est réalisée sur des souris et des rats, des animaux très utilisés en recherche biomédicale car leur organisme présente de nombreuses similitudes avec celui de l’être humain sur le plan anatomique, physiologique et génétique. Leur petite taille, leur coût modéré et leur cycle de reproduction rapide en font des modèles particulièrement adaptés pour tester de nouvelles approches thérapeutiques. Les animaux utilisés sont des souris âgées de plus de 8 semaines et des rats adultes de 300 à 450 g, correspondant à un stade de développement adulte, afin d’obtenir des résultats fiables. La radiothérapie FLASH permet d’étudier les effets de doses très élevées délivrées en très peu de temps sur des tissus ou des zones tumorales ciblées, dans le but de mieux comprendre la réponse des tissus et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Tous les animaux sont anesthésiés chimiquement pour leur confort, et ils sont remis dans leur animalerie après la procédure.

Toutes seront tuées à l'issue des projets dans lesquels elles seront versées, et aucune ne sera élevée en surnombre. 2 000 souris immunodéprimées vont être élevées et utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Aucun geste expérimental n'est décrit au-delà de l'hébergement en armoires ventilées et de la manipulation sous hottes filtrantes, la contrainte tenant au déficit immunitaire lui-même, qui expose ces souris à une infection mortelle en quelques jours si les barrières sanitaires cèdent. L'élevage interne est justifié par la disponibilité de souris hôtes d'âge et de sexe voulus, à synchroniser avec les cultures de cellules tumorales humaines à greffer, condition que le porteur qualifie d'"indispensable".

Objectifs

L’objectif est d’entretenir et de gérer des lignées de souris immunodéprimées utilisées pour les travaux sur un plateau technique dédié cancérologie. Ces souris, fragiles en raison de leur déficit immunitaire, servent surtout à greffer des cellules tumorales, ici des tumeurs solides. Leur élevage nécessite des soins particuliers et un hébergement adapté pour éviter que leur fragilité ne s’exprime. La mise en place d’un élevage interne est justifiée par des contraintes expérimentales. Elle permet d’assurer la disponibilité de souris hôtes en nombre, d’âge et de sexe précisément définis, condition indispensable à la synchronisation avec les manipulations cellulaires réalisées en amont et les analyses prévues en aval. Par ailleurs, l’élevage interne garantit la maîtrise des conditions d’élevage et d’hébergement et permet d’assurer une traçabilité individuelle complète des animaux utilisés, tant sur le plan sanitaire qu’expérimental.

Bénéfices attendus

L’utilisation de souris immunodéficientes en cancérologie permet le développement de modèles expérimentaux pertinents pour l’étude de la tumorigenèse humaine. L’absence ou l’altération de la réponse immunitaire chez ces animaux autorise l’implantation et la croissance de cellules tumorales humaines, permettant ainsi l’analyse des mécanismes biologiques impliqués dans l’initiation, la progression et la dissémination tumorales. Ces modèles constituent un outil essentiel pour l’évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques, notamment l’étude de l’efficacité et de la toxicité de traitements anticancéreux, dans un contexte in vivo contrôlé. Ils contribuent également à l’identification de biomarqueurs pronostiques ou prédictifs de réponse aux traitements. Enfin, le recours à ces modèles permet de limiter le nombre d’animaux utilisés grâce à une meilleure reproductibilité des protocoles expérimentaux et à une réduction de la variabilité biologique.

Procédures

La manisfestation du phénotype dommageable d'immunodéficience soumet les souris à un risque d'infection par des agents pathogènes extérieurs. En conséquence, elles sont hébergées dans des cages ventilées et manipulées sous hottes filtrantes pour garantir les barrières sanitaires afin de les protéger de ce risque.

Impact sur les animaux

L’immunodéficience de ces souris les rend plus sensibles aux infections que les souris classique dites "immunocompétentes", c'est à dire capable de se défendre contre un agent pathogène par le biais du système immunitaire. Un risque rare, mais possible, de développer des infections peu apparaitre. Ce risque est présent en cas de mise en défaut des mesures barrières sanitaires lors de l’hébergement de ces lignées (Dysfonction du système de filtration des armoires ventilées, de la hotte de change, rupture de la stérilité de l'aliment ou de l'eau de boisson etc.). Dans ce cas, les animaux seraient exposés à des agents pathogènes et développeraient un syndrome infectieux qui conduiraient à leur mort en quelques jours.

Devenir

Tout les animaux seront mis à mort en fin de procédure dans les DAP dans lesquelles ils seront inclus. Tous les animaux générés seront utilisés.

Remplacement

Malgré le développement de technique in vitro sur cellules permettant de limiter l’utilisation des animaux, il est impossible à ce jour de remplacer totalement le modèle animal car celui-ci nous permet de comprendre les interactions entre les cellules tumorales et le microenvironnement dans toute sa complexité.

Réduction

La reproduction n’est utilisée que pour produire le nombre d’animaux prévu dans les projets autorisés. Cette production est basée sur les besoins expérimentaux établis de façon statistiques pour chaque projet. Les caractéristiques de reproduction propres à chaque lignée (nombre de petits par portée, nombre de modifications génétiques, …) sont prises en compte pour planifier la fréquence et le type de croisements dans le but de ne produire aucun animal superflu et se limiter au nombre d'animaux requis pour chaque étude.

Raffinement

Afin d’éviter toute contamination, les animaux sont hébergés en armoires ventilées dans un secteur spécifique pour les animaux à risque d'infection. Des contrôles sanitaires réguliers (tests bactériologiques sur gélose une fois par an) sont réalisés, l’eau est autoclavée, la nourriture est irradiée, l’air des enceintes d’hébergement est filtré, nous réalisons un change de tenue et protections individuelles réguliers concernant le personnel en contact avec les aniaux. Les animaux sont surveillés tous les jours pour vérifier l’absence d’atteintes des points limites. Les points observés sont les suivants : -Hyperactivité ou hypoactivité -Isolement et indifférence au milieu extérieur -Modifications des périodes de sommeil (Hyperactivité en période diurne) -Tout comportement inhabituel (activité stéréotypée, déplacement erratique, passivité à l'environnement, interaction sociale modifiée...). -Dos vouté, yeux enfoncés, poils hérissés -Perte de poids (supérieur à 10% pendant plus de 24h). Lors des reproductions, le nid est également enrichi par des frisottis et du coton pour accompagner les femelles durant leur gestation. Pour limiter le stress, le nid parental est conservé pendant le change. Afin de faciliter l’accès à la nourriture aux petits lors des sevrages, des croquettes sont mises directement dans la cage. Dans le but de limiter le risque d’infection par des agents opportunistes, la fréquence des changes est augmentée et l’ensemble du matériel d’hébergement est autoclavés (cages, biberons, grilles, enrichissements...). Les animaux seront hébergés à raison de 2 à 5 par cages.

Choix des espèces

Les souches de souris élevées sont choisies en fonction des besoins des projets de recherche autorisés. Grâce à la bonne connaissance de ces souches d'un point de vue biologique, leur utilisation en cancérologie est très standardisée. Ce sont des modèles étudiés depuis longtemps, avec beaucoup de données scientifiques disponibles, ce qui permet de préparer les expériences avec précision et de prévoir leurs réactions grâce aux données accumulées dans la littérature. Les souris seront mises en accouplement entre 6 et 24 semaines (période de capacité de reproduction optimale) pour une durée correspondant aux recommandations spécifiques de chaque souche, en fonction des objectifs de production pour nos projets. Le phénotype dommeageable d'immunosensibilité n'a pas d'impact sur la reproduction puisque les animaux sont maintenus en condition stérile qui empêche sa manisfestation.

Pour vérifier qu'une bactérie intestinale, Bacteroides fragilis, affaiblit la réponse immunitaire contre le cancer, puis l'éliminer par des virus qui l'infectent, 2 072 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever peau, tube digestif, foie et organes immunitaires. Elles reçoivent des injections de cellules cancéreuses ou immunitaires dans la veine de la queue sur animal éveillé, une irradiation détruisant leur système immunitaire, puis jusqu'à cinq gavages de bactéries ou de bactériophages sur 28 jours. Aucun analgésique n'est prévu, le porteur indiquant avoir fixé des critères assez précoces pour tuer l'animal avant que la douleur ne justifie un traitement.

Objectifs

Ce projet repose sur des données publiées ayant montré que la composition du microbiote digestif des patients ayant reçu une greffe de moelle pour le traitement d’un cancer du sang était associée à une augmentation du risque de rechute chez les patients dont le tube digestif était colonisé par une bactérie commensale, c’est-à-dire naturellement présente dans notre organisme, appelée Bacteroides Fragilis. Les objectifs de ce projet sont : (1) de confirmer que cette bactérie diminue la réponse immunitaire anti cancéreuse dans des modèles de souris porteuses de tumeur ou ayant reçu une greffe de moelle pour le traitement d’un cancer du sang, (2) et de montrer qu’il est possible d’utiliser un traitement sûr et spécifique pour éliminer la bactérie du microbiote digestif en administrant par voie orale un cocktail de virus, les bactériophages, qui infectent uniquement les bactéries mais qui sont sans effet sur les mammifères. Actuellement, ce type d’approche est déjà utilisé chez l’humain pour le traitement d’infections bactériennes résistantes aux antibiotiques, en utilisant des bactériophages capables de détruire les bactéries pathogènes, provoquant des maladies pour l’humain, et leur sécurité a déjà été établie.

Bénéfices attendus

Ce projet démontrera le lien entre certaines bactéries intestinales et la diminution de l’immunité anticancéreuse, ainsi que la preuve de concept qu’une thérapie par les bactériophages peut restaurer cette immunité et réduire les rechutes après une greffe de moelle osseuse ou traitement anticancéreux. En montrant pour la première fois que des bactériophages permettent de moduler très spécifiquement le microbiote pour renforcer la réponse antitumorale, il fournira le rationnel nécessaire au lancement d’essais cliniques chez l’humain. Cette approche répond à un besoin non couvert, les antibiotiques ou autres traitements anti-infectieux n’agissant pas à l’échelle d’une seule espèce microbienne et pouvant altérer l’immunité. Le bénéfice direct sera la mise en place des premiers essais cliniques utilisant des bactériophages ciblés pour réduire le risque de rechute après la greffe de cellules, conformément au brevet européen déposé sur cette indication.

Procédures

Le projet consiste à déterminer s’il existe des mécanismes d’interactions entre certaines espèces de bactéries commensales et la réponse immunitaire anti-tumorale afin de cibler et diminuer les risques de rechutes dans les cancers du sang. Pour cela, nous utiliserons plusieurs modèles expérimentaux consistant tous en l’injection de cellules (cancéreuses ou immunitaires) par voie intraveineuse (veine de la queue, durée d’environ 2 min comprenant la contention sur souris éveillée). Pour l’un des modèles, une injection sous cutanée (zone dorsale, durée moins d’une minute sur souris éveillée) de cellules cancéreuses sera réalisée. En amont des injections par voie intraveineuse, et en fonction du modèle expérimental, les souris subiront une irradiation permettant l’élimination du système immunitaire et donc cela permettra la prise de greffe des cellules à l’origine de toutes les cellules du sang (hématopoïétique). Une fois les modèles expérimentaux de cancer établis, les souris recevront par gavage oral sans anesthésie des solutions de bactéries commensales et/ou de virus dirigé contre ces bactéries (de un à cinq fois maximum sur 28 jours selon la procédure d’une durée d’environ 3min). De plus les fèces de ces souris seront récupérés afin d’étudier les micro-organismes présents. L’ensemble des procédures aura une durée d’environ 28 jours, à la suite desquelles les animaux seront mis à mort selon la réglementation en vigueur.

Impact sur les animaux

Trois procédures sont susceptibles d’être associées à des effets indésirables chez la souris : - l’injection de tumeur, par voie intraveineuse ou sous cutanée, en induisant une croissance tumorale, peut être source d’inconfort ou de douleur chez la souris. - l'apparition de la maladie de l'hôte contre le greffon peut entrainer une douleur chez la souris - enfin, la procédure de gavage utilisée pour la colonisation microbienne du tube digestif peut s’accompagner d’un stress temporaire pour l’animal. Dans de rares cas, une lésion du tube digestif pourrait être observée.

Devenir

Euthanasie des animaux pour permettre la récupération des différents organes associés au système immunitaire et les organes cibles de la maladie (peau, tube digestif et foie) et leur analyse en post-mortem

Remplacement

L’objectif du projet est de déterminer les mécanismes d’interactions entre certaines espèces de Bactéroïdes et la réponse immunitaire antitumorale afin de pouvoir les moduler et ainsi diminuer les risques de rechute. Les modèles cellules ne peuvent mimer l’ensemble des phénomènes mis en jeu dans un organisme vivant entier.

Réduction

Grâce à des analyses statistiques, les groupes expérimentaux ont été conçus de façon à réduire à son minimum le nombre d’animaux utilisés. Nous optimiserons nos expériences en réalisant le plus grand nombre possible d'analyses et de prélèvements d’organes sur un même animal

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel de l’animalerie. Pendant les expérimentations, les animaux seront évalués tous les jours selon une grille d’évaluation comprenant différents aspects cliniques. Cette surveillance étroite permettra de détecter rapidement toute anomalie et de prendre les mesures nécessaires pour assurer le confort et la santé des animaux. Aucune utilisation d’analgésique n’est prévue car nous avons défini des critères suffisamment précoces qui conduiront à l'euthanasie de l'animal avant que la douleur ressentie ne nécessite une prise en charge avec un anti-douleur. Par ailleurs, dès qu’un affaiblissement d’une souris est observé, de la nourriture sera ajoutée dans la cage pour faciliter sa prise alimentaire. En cas de souffrance, la souris sera euthanasiée.

Choix des espèces

L’espèce animal choisie dans ce projet est la souris. Ces dernières ont une génétique et une physiologie (organes, tissus) très comparables avec l’Homme, ce qui permet de mieux comprendre les processus biologiques et les maladies chez l’humain. Et, le comportement de ce mammifère est bien connu, de ce fait, l’évaluation du bien-être ainsi que de la douleur liée à l’expérimentation peuvent être effectuées aisément (perte et aspect du poils, posture, comportement et isolement) permettant une prise en charge adaptée et rapide. Les souris utilisées dans ce projet sont des animaux de 8 à 10 semaines au début de la procédure. Ce stade de développement correspond à des jeunes adultes chez l’humain.

3 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous anesthésie, une irradiation de dix minutes en état vigile, puis trois injections de médicament, avec pour nuisances attendues la perte d'appétit, la perte de poids et la prostration liées à la tumeur. L'objectif déclaré est d'augmenter l'efficacité de la radiothérapie en déclenchant le "cannibalisme cellulaire", un mécanisme déjà criblé in vitro sur tous les modèles tumoraux retenus. Le porteur affirme malgré ce criblage qu'il est "maintenant indispensable" de tester ces molécules sur l'animal, seul un organisme "vivant, entier" permettant selon lui d'étudier l'immunité antitumorale.

Objectifs

L'objectif du projet est de développer des nouvelles approches thérapeutiques pour augmenter l’efficacité de la radiothérapie en favorisant le déclenchement de la destruction des cellules tumorales par des cellules immunitaire.

Bénéfices attendus

L’ensemble de ce projet nous permettra d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques combinant la radiothérapie à un inducteur du cannibalisme cellulaire. Il nous permettra d’identifier les processus et acteurs impliqués dans la régression tumorale.

Procédures

Les animaux auront une injection de cellules tumorales sous anesthésie générale (durée 1 minute). Il auront ensuite une irradiation vigile, durée 10 minutes. Enfin, ils recevront 3 injections de médicament, sous anesthésie locale, durée 1 minute.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues chez les animaux sont celles liées aux symptômes tumoraux après greffe de tumeur : perte d'appétit, perte de poids et prostration des animaux. Des nuisances transitoires légères sont attendues (stress et douleur), liées au rasage du flanc droit de la souris, et aux injections.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour caractériser et définir la réponse immunitaire associée à la régression tumorale induite par les traitements.

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier l’immunité anti tumorale dans sa globalité avec toutes les interactions nécessaires (système immunitaire, voies hormonales, médiateurs physiologiques). Cet environnement est impossible à reproduire dans toute sa complexité et sa régulation in vitro ou ex vivo (un de nos objectifs étant de comprendre les mécanismes immunitaires mis en place contre les cellules entotiques). Etant donné que la détection du cannibalisme cellulaire et de la sénescence dans des cancers du sein semble prédire in vitro la réponse clinique des patients aux traitements neo-adjuvants (article actuellement soumis et en évaluation à Nature) il est maintenant indispensable de tester l'effet anti-tumoral de ces modulateurs in vivo sur des modèles murins .

Réduction

Tous les modèles des tumeurs solides qui seront utilisés dans ce projet sont déjà criblés et validés in vitro pour leur grand potentiel d’induire le cannibalisme cellulaire en réponse à la radiothérapie et en combinaison avec les molécules radio-sensibilisantes. Les nombres d'animaux par lots ont été déterminés par calcul de puissance. Des tests statistiques non paramétriques seront utilisés pour les comparaisons entre groupe témoin et les groupes traités (analyses des résultats).

Raffinement

Les animaux seront pesés une fois par semaine et examinés quotidiennement pour observer leur comportement.Les injections de cellules tumorales seront réalisées sous anesthésie générale. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. En cas de douleur, les animaux recevront un antalgique. En cas de perte d'appétit ou d'amaigrissement, les animaux auront un aliment adapté, appétent, plus riche et plus préhensile. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Les lignées de souris ont été choisies pour leur capacité à développer rapidement et efficacement des tumeurs murines ou à partir de cellules humaines, et pour l’homogénéité et donc la fiabilité des résultats que l’on peut générer avec ce modèle (souris congéniques, avec recul important sur les données antérieures). Ces modèles font partie des modèles les plus utilisés dans la recherche en cancérologie Nous allons utiliser des animaux à maturité sexuelle. Age 8-12 semaines. Nous étudions le système immunitaire adulte. Nous savons que les animaux trop jeunes n’ont pas atteint une maturité immunologique; de plus les animaux trop vieux ont un système immunitaire moins performant.

Une tumeur atteignant 1 500 mm3, une baisse de mobilité, un isolement : ces signes marquent la fin de l'étude pour les souris concernées, surtout dans les groupes témoins non traités. 440 souris de sept semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever organes et tumeurs. Chacune reçoit une greffe tumorale au flanc, sept injections intrapéritonéales, jusqu'à cinq prélèvements sanguins sous anesthésie, neuf pesées et une quinzaine de mesures de tumeur sur cinq semaines. L'enjeu est de départager plusieurs candidats immunocytokines et d'en retenir un, dont le développement industriel et réglementaire sera poursuivi en vue d'essais cliniques.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser et développer une nouvelle immunocytokine destinée au traitement de différents types de cancers, dans le but d’améliorer la réponse thérapeutique chez les patients qui échappent aux traitements actuel. Les molécules testées ont déjà montré in vitro leur capacité à augmenter fonctionnalité des cellules humaines anti-tumorales en présence du traitement actuel. Dans un premier temps, plusieurs candidats seront comparés à travers une étude pharmacocinétique, afin de sélectionner la molécule la plus prometteuse. Ensuite, le candidat retenu sera évalué, sur la base de son profil dose-réponse et de sa compatibilité avec les traitements déjà existants, permettant de reproduire plus fidèlement la réponse immunitaire et de valider son potentiel thérapeutique.

Bénéfices attendus

Le meilleur candidat sera validé et son développement industriel et règlementaire sera poursuivi en vue de la réalisation d’essais cliniques. Ces nouvelles thérapies, capables de cibler plus spécifiquement les cellules tumorales, présentent une efficacité supérieure aux traitements actuels et pourraient offrir une alternative thérapeutique aux patients réfractaires au traitement actuel.

Procédures

Mesure de la masse corporelle sur animal vigile (9 pesées, 1 minute maximum chacune, soit 9 minutes au total). Implantation de la tumeur sur animal vigile : 1 injection, maximum 1 minute/ animal Injection intrapéritonéale candidat ou traitement actuel sur animal vigile (7 injections, 1 minutes maximum chacune, soit 7 minutes au total). Prélèvement de sang sur animal anesthésié (5 prélèvements max, 2 minutes maximum chacune, temps de mise en boîte de contention + prélèvement, soit 10 minutes au total). Mesure de la tumeur tous les 2/3 jours sur environ 5 semaines (15 mesures, maximum 1 minute / animal = 15 minutes)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont principalement : le stress et la douleur liés aux manipulations, comprenant les traitements, les prélèvements sanguins, les pesées, ainsi que la contention nécessaire lors des injections (sous-cutanées pour l’implantation tumorale puis intrapéritonéales pour l’administration des traitements). L’injection de cellules tumorales entraîne la formation d’une tumeur au niveau du flanc des animaux. Des effets indésirables (tumeur qui atteint 1500mm3, hypomotilité, isolement) peuvent apparaître en fin d’expérimentation, en particulier chez les groupes témoins non traités par les candidats ou le traitement de référence, en raison de la progression tumorale.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés afin de permettre la réalisation de prélèvements des organes et tumeurs.

Remplacement

Les immunocytokines (notre molécule thérapeutique) agissent dans un environnement biologique complexe (réseau immunitaire, cellules stromales, microenvironnement tumoral, vascularisation), or ces interactions ne peuvent être correctement reproduites dans un système in vitro (culture cellulaire, organoïdes) ou simulées par modélisation informatique. Les paramètres essentiels (pharmacocinétique, biodistribution, élimination, effets immunitaires systémiques) nécessitent un organisme entier pour être évalués.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés tient compte des contraintes statistiques. De plus, nous conserverons tous les prélèvements de sang, d’organes et tissus pour des analyses ultérieures. Notre savoir-faire sur les modèles tumoraux, nous a permis d’optimiser les injections, les prélèvements et d’ainsi de diminuer le nombre d’animaux par groupe. Ainsi, 10 animaux par groupe permettent d’obtenir une puissance statistique suffisante pour détecter des différences significatives de croissance tumorale ou de survie entre groupes , en tenant compte de la variabilité biologique inhérente aux modèles tumoraux syngéniques.

Raffinement

Nous assurons une surveillance quotidienne des animaux par l’expérimentateur, en complément de celle réalisée par le personnel animalier. Des points limites précoces ont été définis et seront systématiquement appliqués. Lorsqu’un point limite est atteint, plusieurs mesures peuvent être mises en œuvre selon la situation : adaptation du suivi, retrait de l’animal de l’étude, ou mise à mort lorsque cela est nécessaire. Pour les injections (cellules tumorales ou traitements), nous appliquons de la lidocaïne sur le site d’injection quelques minutes avant la procédure. Les animaux sont anesthésiés localement pour les injections sous-cutanées et intrapéritonéales, et par isoflurane lors des prélèvements sanguins.

Choix des espèces

L’utilisation d'une première souche de souris est essentielle pour étudier la durée de vie et l’élimination de nos candidats, car elles portent une partie d’anticorps humaine. Chez la souris normale, ces mécanismes sont différents de ceux de l’être humain. Le modèle choisi reproduit le fonctionnement humain et permet donc d’obtenir des résultats plus proches de la réalité. Les souris de la deuxieme souche utilisée sont, elles, nécessaires pour tester l’efficacité de nos traitements lorsqu’ils sont associés au traitement actuel, un médicament qui agit uniquement sur la version humaine d’une protéine. Ce modèle permet donc de vérifier si notre traitement fonctionne comme prévu chez l’homme. Enfin, les lignées tumorales utilisées permettent d’évaluer nos candidats dans deux types de cancers : l’un résistant et l’autre sensible à ce médicament. Les souris seront utilisées à l’âge de 7 semaines (20g environ), correspondant à la phase jeune adulte. À cet âge, le système immunitaire est pleinement mature, la croissance corporelle stabilisée et la prise tumorale reproductible. Cela limite la variabilité interindividuelle et assure la pertinence des résultats obtenus.

Immunodéficientes pour accepter la greffe de cellules humaines tumorales et immunitaires, 205 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent d'abord une chirurgie sous anesthésie, puis une semaine plus tard l'injection des cellules humaines, puis une injection de Rose Bengale dans la tumeur suivie d'une illumination de dix minutes, une immunothérapie hebdomadaire et un prélèvement sanguin par semaine. La croissance des tumeurs est suivie au pied à coulisse sur animal vigile ou par imagerie sous anesthésie. Le porteur écrit que la maîtrise de la douleur implique pour les animaux de ne pas en subir, et annonce par ailleurs que chez les groupes témoins la tumeur continuera de croître jusqu'au point limite critique.

Objectifs

Le mélanome est un cancer agressif fortement immunogène dont l’incidence et la mortalité demeurent inquiétantes. Le traitement de 1ère intention repose sur des immunothérapies et des thérapies ciblées. Cependant certains patients échappent au traitement. La thérapie photodynamique (PDT), utilisée de manière courante en dermatologie, consiste en l’illumination de cellules tumorales préalablement photosensibilisées par un agent pharmacologique. En présence d’oxygène, et suite à une exposition à une lumière appropriée, l’agent photosensibilisateur (PS) génère des espèces réactives de l’oxygène responsables de la mort tumorale associée à une réponse immunologique permettant d’accentuer l’effet antitumoral de la PDT. La PDT antitumorale émerge comme une nouvelle modalité de traitement efficace avec un nombre croissant d’essais cliniques de faisabilité sur divers modèles d’études dont le mélanome. Le Rose Bengale (RB) est un PS déjà employé en clinique, mais pour de la PDT, or il est un bon candidat pour des lésions cutanées comme le mélanome. Notre projet vise donc à tester l’efficacité in-vivo de la PDT au Rose Bengale dans le mélanome ; à vérifier l’effet immunogène de ce traitement dans un modèle simple et grâce à un modèle à deux tumeurs pour estimer le potentiel abscopal (à distance de la lésion traitée) du traitement. Le positionnement de la PDT dans la stratégie de traitement sera également estimé en associant la PDT-RB à une immunothérapie spécifique ou sur un modèle de cellules résistantes aux thérapies ciblées.

Bénéfices attendus

Il s'agit pour nous d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements dirigés contre le mélanome humain. Les paramètres de PDT-RB testés auront préalablement été sélectionnés sur un ensemble d'expériences réalisées sur les modèles cellulaires en laboratoire. Il s'agira donc de confirmer l'efficacité de la PDT-RB dans le cadre d'un être vivant complet humanisé. Le bénéfice à long terme sera de pouvoir mettre sur le marché de un nouveau traitement, de le positionner dans la stratégie thérapeutique et ainsi d'aider dans la lutte contre le mélanome. L'analyse de l'importance de la réponse immunitaire sur leur mode d'action fait que ces futurs traitements pourraient s'intégrer dans des programmes adaptés à chaque patient au bénéfice d'une médecine personnalisée.

Procédures

Toutes les procédures ont en commun la mise en place du modèle et pour cela les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale (10 min entre l’endormissement et le réveil). La cicatrice pourrait également être l'objet de démangeaison légère sur les 5 premiers jours. Une semaine après, les animaux subiront l’injection de cellules humaines à la fois immunitaires et tumorales, ce qui pourrait engendrer un léger stress de courte durée. Le modèle en place permettra de tester les traitements. Pour la PDT, les animaux auront une injection intratumorale du Rose Bengale (RB) et seront illuminées (extracorporel) 2h après l'injection pendant 10 min. L'injection pourra être la source d'un stress léger de courte durée. L’immunothérapie sera ajoutée par une injection qui sera répétée toutes les semaines (1 fois par semaine); là encore un stress legéer de courte durée pourrait etre generé à chaque injection. Pour le suivi immunologique, un prélèvement de sang sera réalisé préalablement à tout traitement, puis une fois par semaine. Chaque prélèvement pourra être source d'un stress léger de courte durée. Le suivi de la croissance se fera par 2 méthodes. Il s'agira, soit d’utiliser les propriétés du modèle cellulaire qui exprime une enzyme responsable de la création de lumière et de faire un suivi par imagerie. Ce dernier nécessite l’endormissement sous anesthésie gazeuse des animaux, puis l’injection du substrat lumineux. Soit, d'utiliser un modèle n’exprimant pas l’enzyme responsable de la création de lumière et la mesure de la croissance tumorale se fera au moyen d’un pied à coulisse sur animal vigile (contention et mesures) ; toutes les souris auront également le suivi régulier de la croissance par le pied à coulisse.La contention et l'injection du produit d'illumination, de même qu eles anesthésie pourraient être la source d'un stress léger de courte durée mais répété. En fin de protocole, l’ensemble des animaux sera mis à mort, le sang, la tumeur et les organes vitaux seront récupérés pour analyses complémentaires.

Impact sur les animaux

La maîtrise de la douleur et le respect des règles éthiques implique pour les animaux de ne pas subir de douleur. Néanmoins, la procédure expérimentale engendrera inévitablement un stress , là encore, il sera réduit au strict minimum par divers leviers (visite et manipulations régulières, anesthésies gazeuses préalables). L'emplacement des tumeurs est étudié pour ne gêner en rien la locomotion ou l'alimentation des animaux.

Devenir

Tous les animaux auront reçu l'injection d'une masse tumorale suivie ou non d'un traitement expérimental. Selon l'efficacité des traitements, la croissance de la tumeur sera ralentie voire disparaitra, dans le cas contraire et pour les groupes témoins, la tumeur continuera de croitre jusqu'au point limite critique pour son bien-être. Nous pouvons ajouter également que pour des raisons scientifiques, nous devons procéder à la récupération des tissus (sang, tumeur, organes vitaux) qui nous serviront à confirmer l'efficacité du traitement et confirmer son mode d'action. L'ensemble de ces nécessités, éthiques et scientifiques, justifient la mise à mort des animaux en fin de procédure.

Remplacement

Notre objectif est de tester de l’efficacité anti tumorale de notre thérapie (qui de plus est immuno-activatrice) seule ou en combinaison avec des immunothérapies (réduction des mécanismes immunorégulateurs). Des travaux préalables ont été réalisés sur les modèles de lignées cellulaires. Ces résultats mettent en évidence la faisabilité du projet au travers de la validation de l'application de notre thérapie et/ou des immunothérapies in-vitro; dont plusieurs paramètres ont été ainsi fixés. Cependant, s'agissant de développer une nouvelle approche thérapeutique, il est primordial que celle-ci soit également évaluée dans un système physiologique complet, en ce sens un modèle in-vivo est le plus adéquat, voire nécessaire. Le suivi par bioluminecence permet de diminuer le nombre d'animaux, néanmoins, une validation de l'efficacité nécessite d'emblée que plusieurs groupes expérimentaux soient présents, notamment les groupes contrôles, non traités, et traitement unique ou traitement combiné de manière à limiter quantitativement les expérimentations. Dans la mesure où la modélisation expérimentale cellulaire ou in-silico est trop imparfaite, ce type de modèle demeure indispensable à la validation de ces futurs traitements.

Réduction

Grâce à notre experience nous bénéficions de protocoles déjà approuvés ce qui permet de ne pas avoir à faire de mise au point. L'ensemble des animaux ne servira uniquement que pour l'étude de l'effet des traitements. Néanmoins, dans un souci de conservation de la fiabilité des résultats et pour ainsi éviter d'avoir à refaire les expériences, nous réaliserons des groupes d'étude suffisamment solides d'un point de vue biostatistique (validé grâce à un outil d'évaluation en ligne). Ainsi, pour des modèles humanisés des groupes de 5 souris pour 5 reconstitutions seront suffisants. Le suivi de croissance tumorale se fera de manière externe sans nécessité de recours à une dissection, permettant ainsi un suivi longitudinal optimisé sans mise à mort. Enfin, il s'agira de ne tester que les molécules déjà présélectionnées pour leur efficacité dans les modèles précliniques in-vitro.

Raffinement

Nous avons cherché à optimiser l'expérimentation en mettant en place une méthodologie d'étude courte et efficace : suivi de tumeur sur un temps limité (4 semaines maximum), tout en minimisant les douleurs ou détresse. Nous avons ainsi choisi des modèles de souris dont nous connaissons les comportements et la capacité de prise de greffe. Les animaux plus jeunes, seront manipulés régulièrement et ainsi habitués en vue d'une réduction du stress. En cours d'expérimentation, nous avons choisi de faire les greffes tumorales uniquement sous-cutané (au flanc arrière) de manière à ne gêner en rien la vie de l'animal (locomotion, alimentation), le suivi sera ainsi facilité par mesure manuelle externe sur animal vigile (mesure au pied à coulisse), ou grâce à un système d'imagerie par bioluminescence (l'animal sera alors sous anesthésie dans l'appareil à +37°C). Aucune mesure invasive ne sera ainsi faite. Enfin, l'étude préalable du nombre d'animaux strictement nécessaires, nous permettra d'obtenir des résultats en quantité suffisante pour ne pas avoir à réitérer des lots expérimentaux.

Choix des espèces

Les souris sont des petits rongeurs qui permettent de réaliser des groupes cohérents et limités pour l'étude efficace des effets des molécules thérapeutiques testées en faible quantité. Nous utilisons des souris immunodéficientes pour permettre la xenogreffe de cellules humaines (tumorales et immunitaires).

240 souris femelles adultes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur abdomen est ouvert sous anesthésie pour implanter des cellules de cancer colorectal dans la paroi du cæcum, puis elles sont transportées vers un second établissement pour recevoir un traitement trois fois par semaine pendant trois semaines, avec suivi des métastases par imagerie deux fois par semaine. Le porteur signale que la chirurgie peut entraîner souffrance, perte de poids ou infection, et que les métastases hépatiques peuvent causer des gênes, tout en précisant que le foie est un organe "silencieux" qui ne fait pas mal lorsqu'il est colonisé. Sur le remplacement, il indique avoir réalisé les expériences possibles in vitro et devoir maintenant valider ces fonctions dans un "organisme entier".

Objectifs

Le cancer colorectal (CCR) est le troisième cancer le plus fréquent et la troisième cause de décès par cancer. Bien que la plupart des patients atteints de CCR survivent à une chirurgie de la tumeur primitive, la principale cause de décès est la dissémination des cellules cancéreuses dans l’organisme. Lorsque le CCR est détecté à un stade précoce et localisé, le taux de survie à cinq ans est d'environ 90 % ; cependant, après l'apparition de métastases, ce taux chute à moins de 12 %. Le principal organe cible est le foie. Environ 20 à 25 % des patients atteints de CCR présentent des métastases hépatiques au moment du diagnostic, et au moment du décès, jusqu'à 70 % des patients atteints de CCR présentaient des métastases hépatiques. L’objectif de notre recherche est de comprendre les mécanismes métastatiques dans le CCR. Nous nous intéressons en particulier au rôle d’une protéine de choc thermique, HSP110. HSP110 possède un rôle essentiel dans la prolifération des cellules cancéreuses de CCR et leur résistance aux agents chimiothérapeutiques, cependant son rôle dans le développement des métastases hépatiques n’est pas connu. Nous utiliserons un composé chimique inhibiteur spécifique de HSP110 ayant déjà montré son efficacité sur le ralentissement de la croissance tumorale de CCR lors de greffes sous-cutanées non-métastatique. Nous envisageons de tester l’efficacité de ce composé sur l’inhibition de la formation des métastases de CCR, seul et en association avec la chimiothérapie standard et des traitements plus novateurs appelés immunothérapie. Cela constituera une étape préclinique supplémentaire pour ce candidat médicament. En résumé, nous souhaitons explorer dans ce projet le rôle de HSP110 dans la formation des métastases et étudier l’impact de son inhibiteur seul ou associé aux traitements chimiothérapeutiques standards et aux immunothérapies sur ces métastases. Le projet se déroulera entre 2 etablissemnts utilisateurs (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Les mécanismes moléculaires mis en jeu par la protéine HSP110 dans la croissance tumorale sont maintenant bien connus in vitro. Cependant, il est nécessaire d’étudier le rôle de HSP110 dans un contexte in vivo pour évaluer son impact dans la formation de métastases hépatiques. Ce projet nous permettra d’évaluer l’efficacité de l’inhibiteur spécifique de HSP110 in vivo dans la prévention des métastases et d’identifier la meilleure combinaison thérapeutique avec une immunothérapie innovante. A terme, ce projet est une condition de la validation pré-clinique de l’utilisation de cet inhibiteur d’HSP110 dans le cancer colorectal dans une perspective d’essai clinique à long terme

Procédures

Les modèles nécessiteront l’utilisation d’une procédure chirurgicale (sous anesthésie gazeuse) afin d’implanter les cellules tumorales. Cet acte (15 min/souris) implique l’ouverture de la cavité abdominale, l’implantation des tumeurs (cellules) la fermeture de la cavité abdominale. Ce développement de modèles tumoraux aura lieu dans l’établissement utilisateur 1. Les souris seront alors transférées dans l’établissement utilisateur 2 (5 minutes de trajet) pour réaliser les traitements (1 minutes par souris) 3 fois par semaine 7 jours après la chirurgie et pendant 3 semaines. La progression tumorale sera alors suivie par imagerie (sous anesthésie gazeuse) après injection intrapéritonéale de l’agent imageant (1-2 min/souris) deux fois par semaine. Les souris seront conservées encore 2 mois si régression totale de la tumeur qui sera vérifiée 1X par semaine par imagerie.

Impact sur les animaux

Les modèles animaux mimant la formation de tumeurs primaires coliques et métastatiques d’origine colique nécessitent un acte chirurgical. L’ouverture de la cavité abdominale des souris, l’injection des cellules tumorales dans la paroi du caecum sont des interventions pouvant entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales. L’apparition des métastases peuvent également être à l’origine de souffrance et de gênes, principalement en raison de la perturbation de la fonction hépatique. A noter que le foie est un organe « silencieux » qui ne fait pas mal lorsqu’il est colonisé par des métastases.

Devenir

Les souris ayant été porteuses de tumeurs, elles seront toutes mises à mort à la fin de l’expérience.

Remplacement

Nous avons réalisé les expériences possibles in vitro (capacité de migration en présence ou absence de HSP110 et mécanisme d’action de HSP110) et nous devons valider ces fonctions maintenant dans un organisme entier. Nous continuerons à explorer les mécanismes moléculaires dans le modèle in vivo.

Réduction

Nous utiliserons le plus petit nombre d’animaux possibles. Pour chacune des combinaisons thérapeutiques réalisées lors de nos expérimentations in vivo, nous utiliserons des groupes de 5 souris ce qui correspond à la taille d’échantillon minimum nécessaires à nos tests statistiques. Les expériences seront réalisées 3x pour contrer la variabilité inter-individus et la possible non prise métastatique. De plus, nous étudierons plusieurs éléments sur un même groupe de souris dès que cela est possible (réduction) et nous réaliserons seulement les expériences les plus indispensables sur les modèles murins.

Raffinement

Limitation du stress. Pour limiter le stress, les souris sont placées par groupe de 5 à 10 dans des cages agrémentées d’éléments en plastique leur permettant de se regrouper (nid). Elles seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée. Les séances d’imagerie seront réalisées sous anesthésie. Les animaux seront transférés rapidement pour éviter un stress de l’EU1 à l’EU2 dans un sac de transport (temps de trajet de 5 minutes). Procédures d’étude non invasives (imagerie) : Le gène de la luciférase exprimée par les cellules tumorales injectées permettra d’évaluer par émission de lumière la présence de métastases sur animaux vivants. Procédure d’injection des cellules tumorales : Les souris seront anesthésiées. Elles recevront du gel ophtalmique (évite le dessèchement des yeux) et injection de burpénorphine et application lidocaine. L’imagerie et la chirurgie abdominale sont réalisées sous anesthésie suivie d’un réveil sous lampe chauffante ou couveuse (réduction inconfort pour raffinement de l’étude). Au cours d’opération, un contrôle de la profondeur d’anesthésie (pincement de la patte, contrôle de la respiration), la déshydratation (pli de peau) et l’hypoxie (couleur des muqueuses) seront contrôlées. Des tapis chauffants seront utilisés pendant l’expérimentation afin de prévenir l’hypothermie. Un suivi (réveil et post anesthésique) sera mis en place après injection des cellules tumorales pour vérifier le retour à une activité normale (confort, vivacité). Les injections de molécules d’intérêt thérapeutique se feront sur animaux vigiles. Surveillance de l’état général des animaux : Les animaux bénéficieront d’une réhydratation per- et post-opératoire et une prise en charge antalgique adaptée en pré- et post-opératoire 2X/jour pendant 3 jours. Un système facilitant la prise alimentaire et la prise de boisson sera installé (nourriture gélifiée). Nous avons une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Le développement des tumeurs (taille et nombre) sera estimé de manière non-invasive par imagerie de la bioluminescence après injection de luciférine. Au cours des différentes étapes de la procédure et pour chaque animal, la masse pondérale des animaux ne devra pas dépasser ± 20 pour cent de leur poids initial. En cas de dépassement de cette limite de poids, ils seront sacrifiés.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles utilisés pour faire de la chirurgie. Nous utiliserons des souris immunocompétentes, nous permettant d’implanter des cellules tumorales murines possédant le même fond génétique. Ces souris sont largement utilisées lors de la greffe sous-cutanée ou orthotopique de ces cellules cancéreuses. Nous utiliserons des souris femelles de 8-14 semaines car elles sont considérées comme adulte. En effet, dans le cadre de notre étude, nous avons besoin que les animaux aient atteints l’âge adulte et soient dotées d’un système immunitaire fonctionnel. Les souris seront hébergées en groupe afin de diminuer le stress induit par l’isolement.