Cancers

Des souris saines sont irradiées pendant dix minutes, sans anesthésie, pour détruire leurs propres cellules souches du sang avant de recevoir celles de souris porteuses de mutations de l'anémie de Fanconi. 540 souris vont ainsi être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent ensuite jusqu'à cinq prises de sang dans la veine de la joue, également sans anesthésie, et le porteur signale perte de poids, diarrhée, mobilité réduite, toilettage négligé et sensibilité aux infections, en particulier si une leucémie se déclare. Toutes sont tuées au plus tard vingt semaines après la greffe pour prélever rate et moelle osseuse, sans que le RNT indique la dose d'irradiation reçue ni la part des animaux qui développeront la leucémie recherchée.

Objectifs

L’anémie de Fanconi est une maladie héréditaire rare, caractérisée par des malformations dès la naissance, et un défaut de la production de cellules sanguines par la moelle osseuse, menant à une quantité réduite de globules rouges, globules blancs et plaquettes dans le sang. Par ailleurs tous les patients ont une tendance très importante à développer des cancers du sang (leucémie) et des cancers solides tels que ceux de la tête et du cou. Cette maladie est causée notamment par des mutations des gènes FANC, qui participent à la réparation de l’ADN. A ce jour, les mécanismes d’évolution de la maladie jusqu’à la leucémie chez les patients atteints d’anémie de Fanconi sont encore incomplètement compris. Nous disposons de plusieurs modèles de souris génétiquement modifiées présentant des mutations des gènes FANC ainsi que d’autres gènes associés à la maladie de Fanconi. L’objectif de notre projet est de développer de nouveaux modèles d’étude et ainsi démontrer que l’association de plusieurs anomalies génétiques liées à la maladie de Fanconi favoriserait une évolution en leucémie en donnant aux cellules Fanconi un risque accru à devenir des cellules cancéreuses.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’améliorer les modèles d’étude de la maladie de Fanconi chez la souris, les rendant encore plus proche de ce qui est observé chez l’Homme. Ces nouveaux modèles serviront à mieux comprendre les évènements responsables de l’apparition de cancer du sang chez les patients atteints de la maladie de Fanconi. A plus long terme, ils pourront également être utilisés pour tester des modalités de traitement à la fois de la maladie de Fanconi et de la leucémie qui apparaît chez les patients au cours de leur vie.

Procédures

La mise en place de nos nouveaux modèles d’étude consiste à réaliser des greffes de cellules souches hématopoïétiques (cellules qui lorsqu’elles se développent dans un organisme permettent de produire toutes les cellules sanguines) dans des souris saines. Pour cela, les souris saines seront irradiées (durée 10 min, sans anesthésie) afin d’éliminer toutes leurs cellules souches hématopoïétiques qui seront remplacées par celles issues de souris génétiquement modifiées (ayant des modifications au niveau de gènes impliqués dans l’anémie de Fanconi). Ces cellules souches hématopoïétiques de souris transgéniques seront injectées, quelques heures après l’irradiation, dans la veine de la queue, aucune anesthésie ou analgésie ne sera nécessaire (durée de l’injection : 30 s). Afin de suivre leur expansion et leur différenciation (production de toutes les cellules du sang à partir des cellules souches hématopoïétiques), nous réaliserons des prélèvements de sang au niveau de la veine de la joue une fois par mois (durée : 30s ; sans anesthésie). Sur la durée de l’expérience, chaque souris sera soumise à 5 prélèvements de sang au maximum.

Impact sur les animaux

L’irradiation des animaux, conduisant à l’ablation des cellules immunitaires, peut rendre les animaux plus susceptibles aux infections. Une perte de poids ainsi qu’une diarrhée au cours des 2 premières semaines peuvent être observées. Une perte de poids, une réduction de la mobilité et une négligence du toilettage peuvent être observés chez les animaux suite à la greffe des cellules souches hématopoïétiques issues de souris transgéniques Fanconi, en particulier si une leucémie se développe. Une douleur brève liée au prélèvement de sang réalisé au niveau de la veine de la joue peut être constatée lors des prélèvements mensuels, ainsi qu’un stress lié à la contention de la souris.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés au plus tard 20 semaines après la greffe. Les différents organes (rate, moelle osseuse notamment) seront prélevés afin de réaliser une analyse précise des cellules qui y sont présents.

Remplacement

Notre projet a pour but de développer un modèle murin de maladie de Fanconi, qui vienne reproduire les anomalies du sang (baisse de production, développement de leucémie) observé chez les patients de façon spontanée. D’une part, il n’existe pas aujourd’hui de modèle animal Fanconi reproduisant ces anomalies de façon spontanée. D’autre part, les études in vitro ne permettent pas de reproduire parfaitement les anomalies observées chez les patients. Les capacités très particulières des cellules souches produisant les cellules du sang, notamment leur capacité de divisions vers des cellules spécifiques de lignées (globules rouges, globules blancs ou plaquettes) ou à évoluer vers des cellules cancéreuses, dépendent notamment de leur interaction avec l’environnement où elles se développent. Il est donc indispensable d’utiliser un modèle animal vivant afin de reproduire ces conditions.

Réduction

Nous prévoyons d’utiliser le nombre minimal d’animaux nécessaire pour documenter les variations des paramètres sanguins étudiés. Ce nombre a été déterminé grâce à des analyses statistiques afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, nous optimisons au maximum nos expériences pour réaliser le plus d'analyses possibles sur les cellules obtenues à partir d'un même animal (récupération dans une seule expérience d’un grand nombre d’organes du système immunitaire afin de réaliser le maximum d’analyse et de conserver des prélèvements pour des études ultérieures).

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Tout d'abord, un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux sera réalisé, afin de s’assurer du bien-être des animaux, et du bon état de leur environnement de vie (propreté des cages, disponibilité d’eau et de nourriture, enrichissements avec papier kraft, tunnel, buchette de bois). De plus, un suivi clinique des souris sera également réalisé une fois par semaine pour détecter toutes modifications comportementales (interactions sociales, posture, mobilité, respiration) et de l’apparence (poids, pelage, présence de masse tumorale) et éviter les souffrances, douleurs et angoisses. Cela sera réalisé en s'aidant d'une grille d'évaluation du score clinique et des actions seront mises en place de manière graduée en fonction de l'apparition de signes de souffrance. L'administration d'un antalgique sera réalisée en cas de signes de douleur avant l'euthanasie de l'animal si son état se dégrade soudainement.

Choix des espèces

La souris est un mammifère de petite taille dont la génétique et le comportement sont parfaitement connus. Cela permet de mesurer très facilement le bien-être, la souffrance et l'angoisse des animaux et de pouvoir y remédier le cas échéant. De plus, il existe des souris génétiquement modifiées présentant les modifications au niveau de gènes connus pour être altérés chez les patients atteints de la maladie de Fanconi ; ce qui en fait un très bon modèle pour atteindre les objectifs scientifiques du projet proposé. Les souris seront des souris adultes afin de maximiser la prise de greffe comme cela a été décrit auparavant dans la littérature scientifique.

Une tumeur devenue trop grosse ou une perte de poids déclenchent la mise à mort immédiate de la souris. 70 souris de huit à dix semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Des cellules de cancer du poumon leur sont injectées sous la peau, la tumeur est mesurée deux fois par semaine, et un mois plus tard commencent des séances d'imagerie magnétique sous anesthésie réparties sur trois semaines. Le porteur qualifie l'inoculation de la tumeur de "souffrance ou angoisse légère de longue durée", et annonce comme finalité d'augmenter la survie des patients traités par radiothérapie et de conduire à une "rémission totale", quand l'objet immédiat se limite à suivre où vont des nanoparticules d'oxyde de fer.

Objectifs

La radiothérapie (RT) fait aujourd’hui partie intégrante de la lutte contre le cancer. Toutefois, et en dépit des nombreux progrès récents, la principale limitation de la RT réside dans son manque de sélectivité spatiale lors de l’irradiation de la zone cancéreuse. De récentes études ont mis en évidence des propriétés radiosensibilisantes pour les nanoparticules d’oxyde de fer (IONPs). Dans ce projet nous testerons ce type d’IONPs dans un modèle de cancer du poumon. Plus précisément, nous étudierons les profils de biodistribution des IONPs après leur administration en utilisant un imageur (appelé imageur par particule magnétique ; MPI) qui permet de détecter le signal magnétique des IONPs. Nous comparerons des IONPs non fonctionnalisées et des IONPs fonctionnalisées avec un peptide spécifique des tumeurs pulmonaires. L’utilisation de ces modèles murins nous permettrait d’étudier le potentiel de nos IONPs de façon bien plus pertinente qu’un modèle in vitro eu égard des contraintes de biodistribution. Ce projet vise à améliorer l’efficacité de nanomatériaux à caractère théranostique, c’est à dire qui permette à a fois le diagnostic des tumeurs tout en améliorant l’effet thérapeutique de la radiothérapie ; théranostique = thérapeutique + diagnostique. Elles pourraient permettre le suivi de la progression du cancer en imagerie à particule magnétique tout en améliorant son traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre du test de l’efficacité de nouveaux nanomatériaux à caractère théranostique (= thérapeutique + diagnostique) dans le cadre de la lutte contre le cancer. Il est attendu que ceux-ci auront un effet thérapeutique en augmentant l’efficacité des traitements par radiothérapie, tout en permettant le suivi du développement ou de la régression des tumeurs. Cet aspect nous semble particulièrement important au vu de la haute prévalence des traitements par RT en cancérologie moderne et de ses principales limitations (dont le manque de sélectivité spatiale lors de l’irradiation de la zone tumorale). À long terme, nous pouvons donc dire que la finalité de cette étude est donc d’augmenter la survie des patients traités par radiothérapie et de conduire à une rémission totale.

Procédures

Une inoculation de cellules tumorales sera réalisée par injection sous cutanée. Cette injection se fait sous anesthésie n’excédant pas 30 minutes. Au cours des semaines suivant cette injection, un suivi de la taille de la masse tumorale est réalisé 2 fois par semaine. Cette mesure rapide ne nécessite ni mesures de contention ni anesthésie. Une fois la tumeur développée, un mois après l’inoculation, les souris seront étudiées en imagerie par particule magnétique MPI. Pour cela les souris seront anesthésiées, un agent de contraste sera administré et les souris seront placé dans l’imageur sous anesthésie, en suivant la profondeur de l’anesthésie via la vitesse de respiration et le scan d’imagerie sera effectué. Dans la mesure où cette procédure est suivie d’une imagerie, l’animal sera anesthésié pendant l’injection (cette anesthésie a une durée estimée de moins d’une heure). Des examens d'imagerie des particules magnétique auront lieu périodiquement pendant un maximum de 3 semaines.

Impact sur les animaux

L’inoculation en sous-cutané des cellules tumorales peut entrainer une souffrance ou une angoisse légère de longue durée et avoir une incidence légère sur le bien-être ou l'état général de l’animal, nous surveillons pour cela que la taille de la tumeur et la présence de signe de souffrance. L’administration des particules d’oxyde de fer (IONPs) n’est pas associée à d’effets secondaires susceptibles de porter atteinte au bien-être de l’animal. L’évolution de la masse tumorale et de la biodistribution des IONPs seront évalués par des techniques d’imagerie non ionisante et non invasive. Par conséquent, l’inconfort généré lors de cette manipulation sera limité à l’anesthésie de l’animal. Il en découle que les animaux sont susceptibles d’éprouver un inconfort et une angoisse transitoire et de faible intensité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d'étudier précisément ex vivo la localisation des particules d'oxyde de fer au sein de la tumeur.

Remplacement

Des tests in vitro ont été réalisé sur les particules d’oxyde de fer afin de sélectionner en amont la meilleure synthèse de ces particules. A ce stade, nous devont étudier le dévenir des particules d’oxyde de fer après leur administration dans un organisme, leur intéraction avec un tissu tumoral et la capture par le système immunitaire qui impact la biodistribution. Il est impossible d’étudier ces aspects complexes d’interaction avec la biologie des particules d’oxyde de fer sans utiliser de modèle animal.

Réduction

La réduction du nombre d’animaux utilisés passe par l’utilisation d’un protocole d’induction et de suivi de la masse tumorale déjà mis en place et optimisé par l’équipe des chercheurs travaillant sur ce projet. Le caractère non-invasif et non-ionisant des méthodes d’imagerie in vivo employées permet de suivre le même animal au cours du temps, plutôt que de mettre un animal à mort à différent temps pos-injection. Le nombre total de souris nécessaire pour le projet a été calculé avec un test de puissance statistiques et en estimant la perte de certains animaux. Nous avons donc réduit au maximum le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir les informations nécessaires à l’étude de la biodistribution de nos particules d’oxyde de fer, et leur interaction avec un tissu tumoral.

Raffinement

Pendant les procédure d'inoculation des cellules tumorales en sous-cutanée, les souris seront maintenus sous anesthésie. Un analgésique est également administré 20 min avant le début de la procédure. La température de la souris est maintenue avec un tapis chauffant autorégulé à 37°C et un gel ophtalmique est appliqué sur les yeux. L’application d’analgésique local est également utilisé. Après la procédure, les animaux sont suivis régulièrement et une attention particulière est porté sur la présence de signe de souffrance ou de mal être de l’animal. Si des signes clairs de souffrance sont observés en terme de perte de poids, apparence ou comportement révélateur de mal être et taille de la tumeur trop importante, l’animal est mis à mort immédiatement afin de limiter au maximum la souffrance.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée dans le cadre de ce projet est la souris âgée de 8 à 10 semaines, correspondant au stade de jeune adulte. Ce choix est justifié par des considérations scientifiques, physiologiques et éthiques. La souris possède un système immunitaire et vasculaire relativement proche de l’homme et nous savons que les phénomènes de biodistribution et d’intéraction avec le système immunitaire observés seront très similaires chez l’homme. Le stade de souris jeune adulte permet une meilleure standardisation du modèle tumoral, en assurant une réponse homogène à l'inoculation tumorale et en limitant la variabilité interindividuelle. De plus, cet âge est le plus approprié pour tolérer l'anesthésie, la croissance tumorale contrôlée et les procédures répétées (manipulations, imagerie, etc.), sans entraîner de détérioration prématurée de l’état général.

10 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de sang et de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 8 640 reçoivent une injection sous-cutanée de cellules tumorales dans le flanc, 2 160 une chirurgie abdominale de quinze à vingt minutes pour injecter ces cellules dans le foie, et 1 620 un traitement au plasma froid de dix minutes répété jusqu'à sept fois. Le porteur indique que ce gaz appliqué sur la peau peut l'assécher jusqu'à la nécrose dans les cas extrêmes, et que le développement tumoral entraîne un inconfort croissant. L'efficacité du plasma froid sur le cholangiocarcinome reste à démontrer, le porteur la disant "prometteuse" d'après des travaux sur d'autres cancers, là où les tumeurs greffées et les chirurgies du foie, elles, figurent au protocole.

Objectifs

Les cholangiocarcinomes (CCA) sont un type de cancer rare qui atteint le foie et les voies biliaires. A ce jour, seule l’ablation chirurgicale apparaît comme une thérapie efficace mais elle n’est envisageable que dans 20 pourcents des cas, avec sur 5 ans un taux de survie estimé entre 15-40 pourcents. La majorité des patients ne pouvant bénéficier d’intervention chirurgicale reçoit alors une chimiothérapie. En cas de progression tumorale consécutive à cette première ligne de traitement, il n’existe à ce jour pas de thérapie complémentaire approuvée. Par conséquent, l’émergence de nouvelles approches thérapeutiques est plus qu’attendue. Les plasmas froids atmosphériques (PFA) sont des gaz faiblement ionisés, constitués d’électrons, d’espèces radicalaires et excitées et possédant des propriétés de champ électrique et de rayonnement. Les PFA constituent une stratégie physique innovante et prometteuse pour le traitement des carcinomes puisque leurs capacités à réduire la croissance tumorale a récemment été démontrée dans des études in vitro et in vivo. Cependant, le développement et l’efficacité d’une stratégie PFA sur les cholangiocarcinomes (CCA) n’ont pas encore été testés. La finalité du projet est donc d’évaluer l’efficacité de la thérapie PFA comme alternative à l’ablation chirurgicale ou comme approche complémentaire à des traitements conventionnels. L’utilisation PFA permet raisonnablement d’espérer une régression significative de la taille des tumeurs, voire même une régression importante en combinant cette approche innovante à l’approche conventionnelle de la chimiothérapie. Par ailleurs, on peut s’attendre à un « effet sélectif » du plasma, c’est-à-dire qu’appliqué sur une zone présentant des cellules tumorales et saines, le plasma pourrait favoriser la mort des cellules cancéreuses sans endommager les cellules saines. Les objectifs sont de tester l’efficacité antitumorale du PFA et de mieux comprendre les mécanismes d’action du PFA, en particulier sur le phénotype des cellules tumorales, les cellules du microenvironnement tumorale et sur les composants de la matrice extracellulaire (MEC), dans des modèles précliniques de CCA ectopique. La caractérisation des échantillons sera réalisée par des approches multiples de biologie moléculaire et cellulaire. Ce projet sera mené dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Les tumeurs des voies biliaires ou cholangiocarcinome (CCA) sont de très mauvais pronostiques et très agressives. Les traitements sont limités, seule la résection chirurgicale est efficace mais seuls 20 à 30 % des patients sont éligibles, les autres recevront une chimiothérapie palliative. La recherche sur traitements dit innovants dans un but de traiter localement la tumeur est nécessaire pour proposer de nouvelles options thérapeutiques pouvant être proposée seule ou en combinaisons avec des thérapies systémiques déjà en place. Dans son ensemble, ce projet est de tester dans des modèles expérimentaux murins, l’effet du plasma froid atmosphérique (PFA) sur le CCA. Les bénéfices attendus sont de démontrer un effet antitumoral du plasma froid atmosphérique dans des modèles bien décrits de CCA représentatifs de la maladie humaine. Si l’effet anti-antitumoral s’avérait efficace, ce projet pourrait permettre de développer un nouvel outil thérapeutique anti-cancéreux applicable en santé humaine dans le cadre des cancers des voies biliaires. Au-delà du cancer des voies biliaires, les PFA pourraient jouer un rôle important dans le développement de nouvelles applications médicales. Par exemple, les résultats pourraient orienter la création de nouvelles thérapies pour d’autres cancers ou d’autres applications comme la cicatrisation des plaies et l'ingénierie tissulaire.

Procédures

- Procédure 1 (EU1). 1. Injection sous cutanées des cellules (n=8640) sur souris vigiles, durée 10 secondes/animal - Procédure 2 (EU1). 1 chirurgie pour injecter dans le foie des cellules sur souris anesthésiées et sous analgésie (n=2160), durée 15-20 minutes/souris - Traitement au plasma froid atmosphérique (EU1/EU2) sur souris anesthésiées (n=1080 procédure 1 et n=540 procédure 2) 10 minutes/souris, répété 6 à 7 fois max. - Imagerie (EU2). Anesthésie + imagerie (4-5 fois sur même souris) (n=6480), durée 15 min/souris - Prélèvements sanguins (EU1/EU2) sur animal vigile (2-3 par souris) (n=6480), durée 10 min/souris - Prélèvement terminal (EU1/EU2). A l’issue des traitements, tous les animaux seront anesthésiés et analgésiés puis soumis à un prélèvement sanguin et tissulaire pour effectuer les analyses et ne durera pas plus de 10 minutes entre de début de l’anesthésie et l’euthanasie de l’animal.

Impact sur les animaux

-le développement des tumeurs : -le modèle ectopique implique une injection des cellules sous cutanée dans le flanc/dos de l’animal ce qui peut engendrer un stress à l’animal en raison de la contention et d’une douleur de courte durée lors de l’introduction de l’aiguille, et un inconfort au fur et à mesure du développement tumoral. -Le modèle orthotopique (injection dans le foie) implique une chirurgie abdominale pour injecter dans un lobe du foie les cellules tumorales, ce qui engendre donc des nuisances liées à l’anesthésie (stress thermique, risque d’arrêt cardio-respiratoire) et à la chirurgie elle-même (douleurs post-opératoires malgré la prise en charge réalisée, inflammation locale, risque de dessiccation de la plaie). - Le traitement par plasma froid. L’utilisation de ce gaz faiblement ionisé appliqué directement sur la peau de l’animal peut générer un assèchement de la peau pouvant aller jusqu’à la nécrose dans les cas les plus extrêmes (peu probable). - Pour les traitements administrés par injection au niveau de l’abdomen ou dans la veine de la queue ou par gavage, les nuisances pourraient être un éventuel durcissement abdominal ou de la queue, une inflammation de l’abdomen, queue ou gorges). Les contraintes liées au gavage sont la contention qui constitue un facteur de stress. - Les traitements seront effectués sous anesthésie (sauf pour le gavage) et impliqueront donc également les contraintes/risques liées à l’anesthésie elle-même.

Devenir

A l’issue des procédures, les animaux seront tous euthanasiés par des méthodes réglementaires afin de prélever le sang et les tissus pour réaliser différentes analyses biologiques. Ces analyses permettront d’évaluer l’impact « biologique » des différents traitements, en utilisant les différents marqueurs de progression de la pathologie.

Remplacement

Dans la mise en œuvre de ce projet, un organisme vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement et l’évaluation de thérapies innovantes anti-cancéreuses. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu dans le développement du cancer. Le modèle animal est donc indispensable dans le cadre de ce projet.

Réduction

Le projet impliquera un total de 10800 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique G*Power a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude qui est de 15 par groupe. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyses à effectuer (les différents types de tests donnant des résultats soit qualitatifs, soit quantitatifs). D’une façon générale, les modèles seront testés avec un seuil de validité de 5%. Lorsque ces conditions ne seront pas vérifiées, des tests non paramétriques seront effectués. En parallèle des animaux, nous développons des modèles in vitro en 3 dimensions afin de tester nos thérapies, ce qui permetra de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, enrichissement). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum, le milieu est enrichi. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie). Un analgésique, notamment la buprénorphine, sera utilisé en pré-opréatoire 20 minutes avant et post-opératoire pour limiter la douleur et garantir un bien-être optimal des animaux. Un protecteur oculaire en gel sera aussi utilisé lors de l'anesthésie pour éviter tout assèchement des yeux. Pour le transport des animaux, celui-ci est effectué dans le respect du bien-être animal (mise à disposition d'eau sous forme de gel et de nourriture) et est réalisé par un transporteur agréé.

Choix des espèces

Les cellules en culture ne permettent pas de tester des nouveaux traitements anti-cancéreux dans sa globalité. Aussi, la souris est utilisée pour mimer un cancer avec des caractéristiques de la maladie proche de celles observées chez l’homme. Plusieurs modèles animaux de cancers biliaires (ectopique ou orthotopique) existent chez la souris récapitulant les différentes formes observées chez l’homme. Les souris seront utilisées à l'âge adulte/jeune adulte : 5 à 8 semaines pour les animaux commerciaux dont 1 semaine d’acclimatation. Nous n'utilisons pas d'animaux trop vieux afin de nous affranchir des problèmes de prise de greffes dans le cas des xénogreffes ectopiques et modifications des fonctions hépatiques dues à l'âge dans le cas des greffes syngéniques orthotopiques qui pourraient interférer avec nos résultats.

À partir d'un score clinique de 6 sur la grille de suivi, la souris est tuée, et dès le score 3 dans le modèle de tumeur sous-cutanée. 6 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules cancéreuses humaines ou murines leur sont injectées dans le poumon après ouverture de la plèvre, puis viennent les traitements, jusqu'à cinq gavages par jour, des irradiations, des anesthésies gazeuses jusqu'à trois fois par semaine pour l'imagerie et jusqu'à dix prélèvements sanguins par jour par une incision de la queue, les difficultés respiratoires étant attendues puisque le poumon est opéré. Le porteur annonce environ 80 molécules testées grâce à ce projet, une partie des prélèvements dépendant des "demandes clients".

Objectifs

Ce projet consiste à évaluer de nouveaux traitements pour les cancers du poumon, dont les besoins sont non satisfaits, chez la souris dans des modèles orthotopiques (i.e. injection de cellules cancéreuses au site correspondant à celui de la tumeur d’origine). Pour ces modèles, des lignées cellulaires cancéreuses du poumon soit d’origine murine (syngénique) soit d’origine humaine (xénogreffe) seront inoculées directement dans le poumon par injection transpleurale. En fonction des cellules injectées, des souris immunocompétentes, immunodéficientes ou humanisées pour le système immunitaire seront utilisées. Les études consistent à administrer des traitements à potentiel thérapeutique à des souris porteuses de tumeur, puis à mesurer les niveaux de biomarqueurs, les concentrations sanguines ou tissulaires du composé d’intérêt et/ou la croissance tumorale. Les mesures de concentrations du composé permettront d’établir un modèle entre la pharmacodynamie et pharmacocinétique du composé, indispensable pour la détermination des doses à utiliser dans les études d’efficacité, de toxicologie réglementaire et enfin de prédire les doses des phases de preuve de concept en développement clinique chez l’homme. Le suivi de croissance tumorale permettra d’évaluer l’efficacité du ou des traitements Celui-ci sera réalisé par imagerie non-invasive de bioluminescence sur animal anesthésié. Des prélèvements tissulaires post-mortem pourront être réalisés pour des analyses ex vivo complémentaires (histologie, cytométrie en flux par exemple). Grâce à ce projet envron 80 molécules pourront être testées et aboutir à de nouvelles thérapies pour le cancer du poumon.

Bénéfices attendus

Le cancer du poumon est la principale cause de décès liés au cancer dans le monde, avec le taux de mortalité le plus élevé chez les hommes et les femmes. Avec près de 50 000 nouveaux cas et 30 000 décès par an en France, il est le 3ème cancer le plus fréquent et la première cause de mortalité par cancer. Le traitement du cancer pulmonaire repose aujourd’hui principalement sur la chirurgie (exérèse partielle) lorsqu’il est à un stade précoce, puis des chimiothérapies associées à des radiations. Malheureusement ce cancer est souvent diagnostiqué à un stade avancé lorsque les possibilités de traitement sont limitées. Le pronostic vital reste particulièrement défavorable, notamment pour les formes métastatiques (survie à 5 ans inférieure à 5%) comparé aux formes localisées (survie à 5 ans de 20%) ce qui souligne l’inefficacité des traitements actuels et la nécessité de développer de nouvelles thérapies. Les procédures qui constituent ce projet s’inscrivent dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes. A court terme, elles permettront de prédire l’efficacité de nouveaux candidats médicaments. A plus long terme, ces procédures constitueront la base pour un traitement applicable à l’Homme en déterminant les doses efficaces qui pourraient être administrées chez les patients.

Procédures

1) Les gestes techniques concernent tous les animaux :• Greffe des cellules tumorales par voie transpleurale : chirurgie d’une durée de 15 minutes incluant l’anesthésie, 1 seule fois pendant l’étude. • Mesure des tumeurs avec l’appareil de bioluminescence : durée 15 minutes sous anesthésie gazeuse maximum 3 fois par semaine. • Administrations des composés à potentiel thérapeutique - par voie orale (gavage à l'aide d'une sonde gastrique, (max5xjour), intrapéritonéale (max4xjour), sous-cutanée (max4xjour), intramusculaire (max2xjour) ou intradermique (1 injection/jour) : durée 30 secondes sur animaux vigiles, d’un seul traitement à plusieurs semaines de traitement selon la procédure réalisée. - par voie intraveineuse à la veine caudale : durée 2 minutes sur animaux vigiles, maximum 2 fois par jour pendant 3-4 jours (dépendant des veines de l’animal). L’installation d’un cathéter sera nécessaire pour des administrations plus longues. - par voie intranasale : durée 30 secondes sur animaux anesthésiés (anesthésie gazeuse flash) (max 1 fois par jour). - par voie intratracheale : durée 30 secondes sur animaux anesthésiés par anesthésie gazeuse ou à l’aide d’anesthésique systémique (max 1 fois/jour). • Traitement par irradiation pendant maximum 5 min une seule fois pendant l'étude. • Administration de produit pour imagerie de bioluminescence par voie intrapéritonéale : durée 30 secondes sur animaux vigiles (maximum 3 fois par semaine pendant une à plusieurs semaines selon la procédure réalisée). 2) Les gestes techniques concernant tous les animaux ou en partie (dépendra des demandes clients) : • Prélèvements de sang sur animal vigile - via la veine saphène : durée 30 secondes (max 4xjour) o via la veine mandibulaire : durée 30 secondes (max 2xjour) - via une incision de la veine latérale de la queue (1 seule incision d’environ 2 mm réalisée pour la totalité des prélèvements) durée 1 min (max 10xjour). • Prélèvements de sang sur animal anesthésié à l’isoflurane o via la veine sublinguale (max 1x/jour).

Impact sur les animaux

Nuisances des animaux : pour chacune des procédures, les animaux seront opérés pour pouvoir injecter les cellules tumorales directement dans le poumon sous anesthésie par injection intrapéritonéale d’un mélange de produits anesthésiques en addition d'analgésique pour éviter la douleur. Pour les procédures 2 et 3, les animaux seront traités avec des thérapies pendant quelques jours à plusieurs semaines qui peuvent parfois être mal tolérées (dose du traitement importante ou traitement à long terme). Ces effets apparaissent potentiellement au fur et à mesure de la croissance tumorale. Les animaux seront également soumis à des anesthésies gazeuses répétées (isoflurane) pour le suivi de la croissance tumorale par imagerie mais également lorsque les traitements nécessitent une anesthésie. Ils pourront également être sujets à plusieurs prélèvements sanguins durant les études. Effets indésirables : ces procédures peuvent engendrer une dégradation de l'état de santé de l'animal pouvant se traduire par une perte de poids, une hypo- ou hyperthermie, un comportement anormal (animal prostré, ne répondant pas aux stimuli), des vocalisations. Les animaux étant opérés du poumon, il est possible que les animaux présentent des difficultés respiratoires. Les traitements répétés par voie intra-trachéale pourraient également être irritant si la durée de traitement est importante. Les animaux sont observés quotidiennement à minima et jusqu’à 2 fois par jour lors des traitements pour réagir au plus vite à l’inconfort des animaux et y apporter des solutions (arrêt des traitements, réhydratation, raffinement).

Devenir

Les animaux utilisés pour le développement des modèles orthotopiques du poumon peuvent parfois être utilisés pour effectuer une étude de pharmacocinétique/pharmacodynamie (PK/PD) à la fin pour réduire le nombre d'animaux utilisés. Ces animaux seront mis à mort à la fin de cette 2ème procédure. Les animaux utilisés pour une étude de PK/PD ou d'efficacité seront mis à mort à la fin de leur procédure. Quelle que soit la procédure, des prélèvements de sang et de tissus pourront être réalisés et feront l’objet d’analyses ultérieures.

Remplacement

Deux approches sont principalement utilisées pour mimer les événements biologiques associés aux processus de cancer : une approche in vitro, basé sur l’utilisation de lignées cellulaires ou de cellules cancéreuses isolées et des approches in vivo, basées sur l’utilisation d’animaux de laboratoire, chez lesquels des cellules cancéreuses sont inoculées. Les modèles in vitro ne recréent ni la diversité de l’environnement des tumeurs, ni la difficulté pour une molécule testée d’atteindre les cellules cibles. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouvelles molécules antitumorale. De plus, à notre connaissance, il n’existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de modéliser la relation pharmacodynamique et pharmacocinétique dans un contexte tumoral. L’écosystème nécessaire pour la pharmacodynamie et la pharmacocinétique intègre de nombreux tissus et organes : système digestif, système circulatoire, système rénal, système immunitaire intégral, système nerveux périphérique et central. Seul un modèle animal peut permettre d’étudier les interactions entre des composés à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes.

Réduction

Dans le modèle orthotopique, la croissance tumorale sera suivie au cours du temps par imagerie de bioluminescence. L’utilisation de cette technique non-invasive permet d’observer au cours du temps un seul animal simplement anesthésié, là où l’information devait être obtenue par euthanasie et autopsie de multiples individus à chaque stade d’une seule étude permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux. De plus, d’une manière générale, les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in sillico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d’interaction du composé avec la cible d’intérêt (ex : un récepteur, une enzyme). En outre, le profil pharmacocinétique chez le rongeur aura aussi été déterminé. De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. La probabilité d’observer une activité sur les modèles de ce projet sera par conséquent élevée. Le nombre d’animaux prévu pour ce projet se base sur les données de la littérature et les données de mise en place des modèles, notamment des analyses de puissance statistique et des tests de détermination de la taille des groupes expérimentaux.

Raffinement

Les locaux d’hébergement font l’objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux, des systèmes d’hébergement et d’animaux sentinelles. Les animaux seront groupés dans des cages contenant de l’enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Le nombre de manipulations sur l’animal sera réduit au strict nécessaire. Les procédures générant douleur, inconfort ou stress se feront systématiquement sous anesthésie. Pour les anesthésies longues (instillation des cellules tumorales ou traitement des animaux) les animaux seront placés sur un tapis chauffant avec contrôle de la température corporelle pour éviter toute hypothermie. A noter qu’afin de protéger la sécheresse oculaire durant la phase d’anesthésie, du gel ophtalmique type Lacryvisc est déposé sur les yeux de l’animal à l’aide d’un coton-tige. Pour éviter l’apparition de potentielle douleur lors de l’instillation des cellules cancéreuses, une injection en sous-cutanée d'analgésique sera réalisée 30 minutes avant l’instillation des cellules. Cette injection sera répétée en cas d’apparition de signe de douleur. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de la procédure. Une fiche de suivi des signes cliniques a été mise en place spécifiquement pour ce modèle (évaluation de l’hématurie, de la capacité à uriner…). Elle permet d’établir un score pour évaluer l’état général de l’animal et en fonction du total des scores des mesures sont appliquées. Ainsi, à partir d’un total de 4, les animaux seront observés par un vétérinaire et à partir d’un total de 6, l’animal sera euthanasié. Dans le cas du modèle abscopal, une fiche de suivi de l’évolution de la tumeur sous-cutanée sera également utilisée. Dans ce cas, si le score 3 est atteint, l’animal sera euthanasié. De plus, si un animal atteint un des points limites établi, il sera immédiatement euthanasié.

Choix des espèces

La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez le rongeur. De nombreuses données sur les modèles orthotopiques de cancer du poumon chez la souris existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l’avancement des projets (doses de cellules, effets de molécules de références etc.). La souris est un modèle d’étude de choix car : 1/ sa petite taille facilite la manipulation en particulier pour le suivi de croissance tumorale avec l’imagerie in vivo (ou plusieurs souris peuvent être placées en même temps dans l’appareil d’imagerie), et 2/ la biodisponibilité des souris immunodéficientes (nécessaires pour l’utilisation de cellules humaines). Les données de la littérature indiquent clairement que les rongeurs adultes représentent des modèles fiables pour l’évaluation de l’efficacité de composés dans le domaine du cancer, c’est pour cela que nous utiliserons des souris adultes.

Génétiquement modifiés pour développer un cancer du pancréas, des souriceaux reçoivent par le lait de leur mère le produit qui déclenche la maladie, dès les premiers jours d'allaitement. 581 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent une biopsie de queue dans leur première semaine de vie, puis jusqu'à trois examens d'imagerie de deux heures sous anesthésie, pendant que les lésions précancéreuses évoluent vers le cancer avec perte de poids et baisse d'activité. Le pancréas est prélevé après la mise à mort, découpé en coupes fines et comparé aux images obtenues.

Objectifs

Le cancer du pancréas le plus fréquent et le plus grave s’appelle l’adénocarcinome canalaire pancréatique. Ce cancer se développe en plusieurs étapes : d’abord, des petites anomalies apparaissent dans le pancréas, puis elles évoluent en lésions précancéreuses avant de devenir un cancer. Aujourd’hui, il n’existe pas de moyen d’imagerie efficace pour repérer ces anomalies et lésions précancéreuses avant que la maladie ne soit trop avancée. De plus, ce cancer est très complexe, car il varie beaucoup d’un patient à l’autre, et donc la réponse au traitement varie également grandement. Les techniques d’imagerie actuelles ne sont pas assez précises pour décrire toutes les caractéristiques de l’adénocarcinome du pancréas. Il est donc très important de développer de meilleures techniques d’imagerie capable d’identifier précisément le type de tumeur pancréatique, et de renseigner sur toutes les caractéristiques tumorales, au niveau cellulaire et moléculaire mais aussi au niveau biophysique, comme la dureté du tissu ou la pression exercée sur l’environnement tissulaire. Ce projet cherche à valider deux nouvelles approches d’imagerie dans ce contexte : l’imagerie de diffusion, qui permet d’étudier la microstructure du tissu, et l’élastographie, qui permet d’étudier les propriétés biomécaniques.

Bénéfices attendus

L'adénocarcinome canalaire pancréatique est très difficile à diagnostiquer tôt, et les premières anomalies apparaissant dans le pancréas sont difficiles à observer chez le patient. Ce projet vise à utiliser des techniques d’imagerie pour mieux comprendre comment l’adénocarcinome se développe à partir des premières lésions précancéreuses, en utilisant un modèle animal. L’étude des premiers stades de ce cancer est impossible à réaliser chez l’homme, car les patients sont souvent diagnostiqués à un stade avancé.

Procédures

On donne aux souris femelles allaitantes un produit qui passe dans le lait afin que les souriceaux allaités reçoivent ce produit (1 fois par jour pendant 4 jours; injection dans l’abdomen ou gavage, sur souris éveillée, moins d’une minute par administration du produit). Ce produit permet d’induire l’activation de la modification génétique des souriceaux transgéniques, provoquant ainsi la maladie. Certains animaux seront soumis à un examen d’imagerie, au maximum trois fois pendant la durée du projet. L’examen est réalisé sous anesthésie et dure au maximum 2 heures.

Impact sur les animaux

Le traitement des souris allaitantes 1 fois par jour pendant 4 jours peut entrainer une légère perte de poids le jour suivant la première administration, mais le poids est ensuite récupéré. Un prélèvement d’un petit bout de queue (moins de 2 mm) est effectué sur les souriceaux dans leur première semaine de vie. La manipulation est très rapide et n’induit pas de modification du comportement du souriceau, et la queue cicatrise très rapidement à ce stade. Les modèles de souris utilisés développent des lésions précancéreuses puis un cancer du pancréas. Ceci peut entrainer une perte de poids et une diminution de l’activité de l’animal (alimentation, locomotion, toilettage). Le fait d’être maintenu immobile pour l’imagerie et le passage à l’intérieur d’un tunnel d'appareil d'imagerie avec un diamètre réduit peut être une source de stress pour l'animal. De plus, un stress peut être occasionné pour les animaux devant subir une succession de sessions d’imagerie durant l’expérience.

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront euthanasiés et les pancréas seront collectés. Des analyses d’histologie seront réalisées pour obtenir des informations sur la composition tumorale. Ces analyses consistent en des coupes fines de la tumeur qui seront passées au microscope pour quantifier les éléments (cellules, fibres de collagène, cellules immunitaires) qui composent la tumeur. Une partie du pancréas sera également destinée à des analyses des molécules présentes dans le tissu. Ces données seront corrélées avec les mesures obtenues en imagerie.

Remplacement

Bien qu’il existe des modèles de cellules mimant le cancer du pancréas, ils ne permettent pas de reproduire l’environnement tumoral ni les symptômes très précoces observés chez les patients. De plus, afin de valider les méthodes d’imagerie comme solutions de diagnostic non-invasives en clinique, il est plus approprié de mener les expériences sur des modèles animaux afin de recréer la physiologie de la maladie mais également afin d’utiliser ces méthodes telles qu’elles le seront sur les patients.

Réduction

Le nombre d’animaux défini pour les groupes a été déterminé de sorte que l’on puisse obtenir des résultats statistiquement significatifs avec un nombre d’animaux minimum. Pour cela, un test statistique a été réalisé. Des animaux des mêmes portées sont utilisés en tant que contrôles, pour éviter leur non-utilisation. Enfin, les séries de mise au point prévues seront stoppées dès que les données d'imagerie sont satisfaisantes, évitant ainsi d’utiliser plus d’animaux que nécessaire. Un groupe d’animaux sera soumis à plusieurs examens d'imagerie, pour bien comprendre la progression du cancer et choisir les temps d’examen suivants de manière raisonnée.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages de 5 souris maximum. Ces cages seront enrichies en matériau favorisant la nidification. En plus du suivi quotidien standard, un suivi clinique aura lieu une fois par semaine : l’état de l’animal sera noté à l'aide d'une grille de score, avec surveillance du poids, de son apparence et de son comportement. Selon le résultat, de la nourriture humidifiée pourra être ajoutée dans la cage et un analgésique (médicament supprimant la douleur) pourra être administré. Des critères à l'imagerie seront également notés pour évaluer le bien-être. Les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie, ce qui limitera le stress que l'examen peut engendrer. L’animal est surveillé et maintenu au chaud quand il est sous anesthésie, et la durée est limitée le plus possible, pour éviter d’éventuels effets indésirables de l’anesthésie tels que le refroidissement de l'animal et la diminution du rythme respiratoire.

Choix des espèces

La souris représente un modèle de cancer du pancréas qui reproduit fidèlement la pathologie observée chez l’homme. On peut donc s’attendre à ce que les propriétés biomécaniques et de diffusion mesurées chez la souris soient similaires à celles mesurées chez l’homme. De plus, la souris est une espèce dont le comportement est bien connu, ce qui facilite l’évaluation du bien-être et de la souffrance animale. Enfin, les dispositifs d’imagerie développés pour ce projet ont déjà été optimisés pour la souris. Nous utiliserons des souris à l’âge adulte pour les croisements. Pour les expériences, les souris entreront dans le protocole d’expérimentation dès leur naissance. Les analyses seront effectuées à différents stades du développement de la maladie connus dans les modèles de souris utilisés (5, 10, 16 semaines, ou 5 mois).