Cancers

960 souris vont être utilisées, toutes injectées de cellules cancéreuses puis tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des tumeurs poussent sur leurs flancs, avec un œdème possible au point d'injection qui peut gagner les pattes arrière et gêner la marche, et des métastases dont le porteur reconnaît ne pas savoir évaluer les effets sur les organes touchés. Elles reçoivent un traitement par la bouche cinq jours sur sept et une prise de sang à la queue chaque semaine sous anesthésie, pour tester une association de deux médicaments déjà approuvés contre les rechutes du cancer du poumon. L'effectif, lui, est calé sur "le nombre d'animaux communément accepté pour une publication".

Objectifs

Les cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC) présentent, chez environ 15% des patients, des altérations dites primaires de l'EGFR, un Récepteur du facteur de croissance EGF. Malheureusement, après traitement par thérapie ciblée, une récidive de la tumeur est observée avec apparition, dans plus de 50% des cas, d'une mutation secondaire de l'EGFR pour laquelle un inhibiteur de dernière génération a été développé, l'osimertinib. Finalement, de nouveaux mécanismes de résistance ont été constatés chez des patients traités plusieurs mois avec l'osimertinib, tels qu'une amplification d'autres récepteurs à activité tyrosine kinase, des mutations touchant des acteurs des voies de signalisation contrôlant la survie et la prolifération cellulaire, ainsi que l'apparition d'une mutation tertiaire de l'EGFR pour laquelle il n'y a pas encore de traitement spécifique utilisé en clinique. Par des méthodes de génie génétique, nous avons généré plusieurs modèles cellulaires de résistance du cancer bronchique humain en introduisant, dans une petite sous-population de cellules de CBNPC humaine, différentes mutations de l'EGFR décrites chez les patients. Sur ces modèles cellulaires, nous avons réalisé un criblage de molécules potentiellement capables d'inhiber l'émergence de clones résistants. Finalement, un inhibiteur déjà approuvés en clinique, le sorafenib, utilisé en combinaison avec l'osimertinib, s’est montré efficace in vitro pour limiter la croissance cellulaire des lignées arborant plusieurs mécanismes de résistance décrits chez les patients récidivant. Ces résultats ont aussi été obtenus in vivo sur l’inhibition de la pousse tumorale de ces lignées dans des souris immunodéprimées. Au vu de l'importance du contexte physiologique, de la toxicité des inhibiteurs utilisés en thérapie et du microenvironnement tumoral, nous avons créé un modèle syngénique murin de cancer du poumon qui n’existait pas. Nous avons généré 6 lignées cellulaires qui récapitulent les principaux mécanismes de résistances observés dans les CBNPC. Les études in vitro menées sur ces nouvelles lignées cellulaires ont révélé des caractéristiques de croissance et de résistance à la thérapie ciblée similaires à celles observées précédemment sur les lignées humaines. Ces nouveaux modèles murins vont nous permettre désormais d'étudier l'implication du système immunitaire dans la tumorigenèse et dans la réponse au traitement, avant d'envisager tout essai clinique.

Bénéfices attendus

Ces expérimentations permettront tout d’abord de déterminer la capacité de ces nouvelles lignées cellulaires à former des tumeurs chez l’animal ; il sera possible alors de comparer les résultats de croissance tumorales de ces lignées cellulaires murines à ceux déjà obtenus avec les lignées cellulaires humaines dans des souris immunodéficientes, et confirmer ainsi l'intérêt de ce nouveau modèle d’étude syngénique de cancer du poumon chez la souris. Dans la littérature, l’implication d’EGFR muté dans l’installation d’un microenvironnement tumoral immunosuppresseur reste controversé ; notre étude va nous permettre de mesurer et caractériser l’éventuelle infiltration des cellules immunitaires au sein des tumeurs en fonction des mécanismes de résistance mais aussi des traitements. La possibilité de mesurer la bioluminescence des cellules cancéreuses à l'aide d'un imageur du petit animal va nous premettre de détecter et suivre le développement de foyers tumoraux secondaires qu'il aurait été difficile de mettre en évidence par des méthodes d'analyses macroscopiques traditionnelles. Ces métastases pourront être mieux caractérisées (culture cellulaire, analyses génétique et moléculaire) et identifier d'éventuels nouveaux mécanismes de résistance. L'intérêt de notre étude est de mieux comprendre les mécanismes responsables de la rechute tumorale de la tumeur primaire et des métastases en fonction du contexte immunitaire et des traitements.

Procédures

Les animaux seront injectés avec une aiguille adaptée de petite taille et de petit diamètre et sous anesthésie et analgésie. Des prélèvements sanguins au bout de la queue seront réalisés sur animaux anesthésiés chaque semaine. Les animaux recevront 5 jours par semaine un traitement par voie orale. Cet acte est rapide et non douloureux pour l'animal.

Impact sur les animaux

Peu d'effets indésirables sont attendus sur les animaux injectés en sous-cutané. Il pourrait être observé cependant dans de rares cas des démangeaisons ou un œdème au point d’injection qui s’il s’étend aux pattes arrière pourrait perturber la locomotion quelques jours, le temps qu’il se résorbe. La croissance des tumeurs sur les flancs de la souris, ne perturbe pas la vie de la souris, il n'y a normalement pas de modification du comportement individuel ou social. Une nuisance possible serait que la tumeur, dans sa croissance, puisse gêner les déplacements de l’animal ou altérer sa souplesse entrainant un défaut d'alimentation ou de sa toilette. Concernant les animaux développant des métastases, il est difficile d'évaluer leurs effets sur la fonction des organes touchés, mais un suivi très régulier permettra de détecter le moindre signe clinique défavorable et de procéder à l'arrêt immédiat de l'expérimentation.

Devenir

La totalité des animaux de l'étude sera injectée avec des cellules cancéreuses puis mise à mort pour études.

Remplacement

L’utilisation des animaux est indispensable pour confirmer in vivo l’efficacité de la combinaison d’inhibiteurs identifiée in vitro sur les lignées humaines. Dans le protocole présenté ici, la souris est utilisée comme modèle préclinique obligatoire pour évaluer l'implication du système immunitaire dans la croissance tumorale. Ceci n’est pas possible autrement que chez l’animal vivant, et nécessaire avant toute évaluation chez l’Homme.

Réduction

Les transplantations de nos modèles cellulaires seront réalisées sur l'animal uniquement après obtention de résultats in vitro significatifs permettant de réduire au maximum le nombre d'animaux par groupe en fonction de l'importance de l'effet obtenu. L'objectif est de collecter un nombre suffisant de données pour respecter le nombre d'animaux communément accepté pour une publication, et appliquer des tests statistiques fiables et adaptés. Les traitements ne concerneront que les lignées cellulaires pour lesquelles une croissance tumorale significative aura été observée. A noter que s'il n'y a pas de différence statistique entre mâles et femelles, la taille des effectifs pourra être réduit à 6 au lieu de 10 animaux (3 mâles et 3 femelles).

Raffinement

Afin d'éviter toute souffrance ou stress, les animaux seront hébergés dans une zone exempte de germe pathogène, à 5 maximum par cage (530 cm2 au sol) dans un environnement enrichi (tube en polycarbonate rouge et Arbrocel Roll), et anesthésiés avant chaque intervention. Nous serons vigilants pour évaluer chaque jour l'apparition d'éventuels signes de souffrance (perte de poids, poils hérissés, prostration) et dans le cas de critères présents, une prise en charge analgésique appropriée sera mise en place ; et dans le cas d'une non amélioration des symptomes, l'animal serait mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour l'étude de la croissance tumorale car il permet de mimer les conditions de formation des tumeurs de manière assez proche de celles rencontrées chez l'Homme. La greffe récapitule les évènements se déroulant lors d'une tumorigenèse : croissance 3D, interaction avec le stroma et le système immunitaire, angiogenèse et métastase. Enfin la souris est le modèle d'étude le plus utilisé dans la communauté scientifique, cela permet des échanges à un niveau international. Les injections de cellules tumorales seront réalisées comme classiquement décrites dans la littérature sur des animaux âgés de 6 à 8 semaines.

Aucune souris ne sera gardée vivante au-delà de quatre-vingts jours après l'injection des cellules leucémiques, ni si son état atteint un point limite. 166 souris privées d'une partie de leur système immunitaire vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes reçoivent une irradiation du corps entier, puis des cellules leucémiques humaines dans la veine, une injection hebdomadaire dans le ventre et, pour 130 d'entre elles, trois prises de sang étalées sur neuf semaines, en restant éveillées à chaque fois. Le porteur attend une perte de poids et des tumeurs abdominales, et cherche à montrer qu'un type de cellules immunitaires modifiées s'épuise moins vite qu'un autre, une comparaison dont il renvoie les retombées cliniques à un second temps.

Objectifs

Ce projet porte sur l'utilisation des lymphocytes T natural killer invariant (iNKT), des cellules immunitaires capables de cibler et de détruire naturellement les cellules cancéreuses associées à la leucémie. En ajoutant une molécule ciblant la tumeur (le CAR) aux iNKT, on leur confère une meilleure capacité à cibler spécifiquement les cellules cancéreuses et à s'activer plus efficacement après le contact avec celles-ci. Dans le contexte de la leucémie aiguë myéloïde, où la greffe de moelle est le seul traitement curatif, mais malheureusement inaccessible à tous les patients, les approches de thérapie génique impliquant des cellules CAR sont en développement. Les premières études chez l'homme ont montré des réponses prometteuses mais de courte durée, nécessitant une optimisation. Une alternative envisagée est l'utilisation de cellules immunitaires moins susceptibles de s'épuiser dans le temps. Les lymphocytes iNKT se présentent comme des candidats potentiels dans ce contexte, offrant ainsi une piste intéressante pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre la leucémie.

Bénéfices attendus

Dans le contexte de la leucémie aiguë myéloïde (LAM), les thérapies génétiques sont toujours en développement. Cependant dans la leucémie aiguë lymphoïde (LAL) elles sont déjà utilisées en clinique avec des résultats très probants. Il est possible d'explorer de nombreuses voies d’optimisation de ces thérapies, notamment en changeant leur base cellulaire. L’utilisation d'un sous-type de lymphocytes rare et naturellement anti-tumoral, les iNKT, permettrait une meilleure action directe contre les cellules tumorales avec une double action : la modification génétique et l'efficacité naturelle de la cellule. De plus, les iNKT ont aussi un effet contre les cellules empêchant l'action du système immunitaire. Ils peuvent aussi activer ce dernier, par leur production importante de molécules d’activation. Le développement de CAR-iNKT serait une très bonne opportunité d’amélioration des approches par cellules CAR.

Procédures

-Une radiothérapie corporelle totale de faible dose (2 gy) de chaque animal soit 166 souris -Une injection intra-veineux (IV) sur animal vigile, une seule fois en début d’expérience pour 18 souris, deux injections pour 148 souris. -Une injection intra-péritonéal (IP) sur animal vigile, une fois par semaines pour toutes les souris soit 166. -Un prélèvement de sang sur animal vigile, pour les animaux des tâches 2 et 3 soit 130 animaux à J21, J42 et J63 après injection des cellules leucémiques.

Impact sur les animaux

La piqure d'aiguille pour l’injection et le prélèvement entraîne une douleur légère de courte durée. L'administration de cellules tumorales entrainera une diminution de l’activité, une perte de poids, et possiblement le développement de petites tumeurs en intra-abdominal dans les trois premières semaines sans traitement.

Devenir

Les souris étant partiellement dépourvu de système immunitaire et ayant reçu une injection de cellules humaines leucémiques, une progression tumorale va se développer. Afin d’éviter une souffrance à l’animale, les animaux ne seront pas conservés au-delà de 80 jours post injections, ni en cas de point limite atteint.

Remplacement

Nous continuons à réaliser des expériences en laboratoire sur des modèles cellulaires pour valider la fonctionnalité des cellules humaines, et de façon à limiter le nombre d’expériences chez l’animal. Le projet est essentiellement basé sur la recherche d’efficacité et des meilleures conditions d’administration des cellules, ce qui ne peut pas être déterminé sur cellules, et ce qui permettra de prévoir les conditions des essais cliniques.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris pour chaque étape du projet au minimum nécessaire pour les études statistiques, en se basant sur des expérimentations antérieurs ainsi que sur la littérature, et en calculant le nombre nécessaire sur la base de logiciel adequats. Nous avons aussi réuni des expérimentations afin de mutualiser les contrôles. Ainsi, au maximum 166 souris seront utilisées. L'utilisation de l'imagerie par bioluminescence avec anesthésie permet d'obtenir des données sur la progression tumoral sans sacrifice de l'animal. Suite à la mise à mort certains organes seront récupérer ainsi que du sang pour des analyses complémentaires.

Raffinement

Les souris seront dans une cage contenant de l’enrichissement (buchette en bois, frisure de papier Craft et coton) avec maximum 4 à 5 individus par cage dans un secteur spécifiquement adapté pour leur état immunitaire déficient. Leur état clinique sera surveillé quotidiennement et un score d’évaluation sera utilisé. Des points limites sont mise en place.

Choix des espèces

La souris permet l’élaboration d’un modèle de greffe de cellules humaines, car cette souris dépourvu de système immunitaire ne rejete pas les cellules humaines normales et leucémiques. Ce modèle murin est mondialement reconnu et indispensable pour valider toute étude pré-clinique de thérapie cellulaire humaine. Ce modèle permet d’une part d’étudier l’impact de nouvelles thérapies cellulaires sur le contrôle anti-leucémique, et d’autre part d’analyser les mécanismes d’action des cellules de thérapie cellulaire. Les résultats obtenus seront indispensables à l’élaboration d’essais cliniques chez l’homme dans un second temps. Les souris sont expérimentées entre 8 et 12 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe des cellules humaine est meilleure dans cette période de vie.

Irradiées éveillées pendant cinq minutes, puis injectées dans la veine de la queue avec des cellules leucémiques, 410 souris subissent ensuite une prise de sang à la joue chaque semaine pendant un mois et, si la maladie ne se voit pas dans le sang, une ponction d'aiguille dans le fémur. Certaines reçoivent en plus une à deux injections dans le ventre par jour pendant cinq jours. Ces procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré, alors que le développement attendu de la leucémie comprend un amaigrissement, une paralysie des membres postérieurs empêchant l'animal de se déplacer et de s'alimenter, une prostration, une déshydratation et une hypothermie. Toutes les souris sont tuées à la fin pour prélever leur moelle osseuse et leur rate, où logent les cellules leucémiques.

Objectifs

Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) à core-binding factor (CBF) sont un type particulier de cancer du sang qui est difficile à soigner. Des chercheurs ont remarqué que la façon dont les cellules cancéreuses s’organisent entre elles pourrait avoir un lien avec la façon dont les patients réagissent aux traitements. Mais on ne comprend pas encore très bien ce lien. Peut-être que cette organisation aide certaines cellules à résister aux médicaments, ou bien qu’elle montre juste qu’un autre problème plus profond est à l’origine de cette résistance. Dans notre laboratoire, on utilise des souris particulières pour essayer de mieux comprendre ce qui se passe. On veut vérifier si les changements dans les gènes des cellules cancéreuses sont bien responsables de la manière dont les cellules s’organisent entre elles et si cela les rend plus résistantes à la chimiothérapie (un traitement contre le cancer).

Bénéfices attendus

Les résultats de notre étude vont nous aider à confirmer s’il y a bien un lien entre l’état des cellules cancéreuses et la façon dont elles s’organisent dans ce type de leucémie. Plus largement, cela nous aidera à mieux comprendre comment le cancer se forme et pourquoi il peut résister aux traitements.

Procédures

Les souris, qui ne sont pas endormis au début, seront d’abord exposées à de faibles radiations pendant 5 minutes. Cela permet aux cellules cancéreuses qu’on leur injecte dans la veine de la queue de s’installer dans leur moelle osseuse. L’injection dure moins de 20 secondes. Ensuite, on leur prélèvera un peu de sang, au maximum une fois par semaine, en piquant une petite veine de la joue. Chaque prise de sang dure moins d’une minute et sera faite toutes les semaines, pendant 4 semaines. Cela nous permet de de voir si la maladie progresse et de récupérer du matériel pour faire des analyses plus tard. Si on ne trouve pas de cellules cancéreuses dans le sang, on ira en chercher dans l’os de la cuisse (le fémur) avec une petite aiguille. Pour cela, la souris sera endormie et ne ressentira pas de douleur. Cette opération dure moins de 5 minutes. Quand on est sûr que les cellules cancéreuses se développent, certaines souris recevront un traitement tous les jours pendant 5 jours. On leur fera une injection dans le ventre. Si on teste plusieurs médicaments en même temps, il peut y avoir deux injections par jour.

Impact sur les animaux

Les animaux traités avec les différentes molécules, greffés avec des cellules leucémiques ou prélevés en vue d’examens biologiques pourraient être confrontés à des effets indésirables (stress et/ou perte de poids). La greffe de cellules leucémiques va, comme attendu, permettre le développement de la maladie et donc entrainer au bout de quelques semaines un amaigrissement, une paralysie des membres postérieurs empêchant l’animal de se déplacer et de s’alimenter, une perte d’activité, une prostration, une déshydratation et/ou une hypothermie. De manière plus exceptionnelle, en cas d’introduction d’une aiguille dans la moelle osseuse pour récupérer de la moelle osseuse, les animaux peuvent ressentir une gêne temporaire au niveau de la mobilité. Très rarement, il peut y avoir également apparition d’amas de cellules cancéreuses forment une masse, dans diverses localisations (organes, tête).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour prélever la moelle osseuse et la rate, deux organes où se localisent les cellules leucémiques. Cela permettra d'étudier finement leurs caractéristiques.

Remplacement

Bien que certains modèles cellulaires in vitro permettent d’obtenir un premier niveau de caractérisation de réponse aux traitements, ils ne sont pas suffisants car ils ne permettent pas de résumer toutes les conditions de développement de la leucémie observée chez l’homme. Afin d’appliquer nos résultats au stade clinique chez l’homme, il est indispensable d’avoir des preuves d’efficacité dans des modèles de souris.

Réduction

Le nombre minimum de souris nécessaires par groupe a été établit grâce aux études antérieures du laboratoire et à l’utilisation de tests statistiques appropriés. Nous utiliserons un groupe contrôle pour différentes expériences.

Raffinement

En vue de réduire le stress subit par les animaux, le confort à l’intérieur des cages sera optimisé par des buchettes en bois que les souris aiment ronger, des tunnels en carton où elles trouvent refuge et des nids en papier. Les animaux seront observés tous les jours en faisant particulièrement attention aux symptômes et changements de comportement. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l'animal, en optimisant le mode et le volume d'injection et la durée de traitement. Les animaux seront anesthésiés et une analgésie sera effectuée lors des prélèvements de moelle osseuse car il y a un risque plus important de gêne ou de douleur liée à cette procédure. De plus, les études antérieures ont permis d’identifier les points limites qui, seuls ou cumulés, vont nécessiter une intervention de l’expérimentateur afin de soulager l’animal. Une décision rapide sera prise pour éviter toute souffrance animale excessive. En effet, si une douleur est constatée un antalgique sera administré à l’animal. Si un antalgique ne peut être administré et/ou n’est pas suffisant à calmer la souffrance de l’animal, une euthanasie de l’animal sera réalisée.

Choix des espèces

Le modèle murin utilisé dans ce projet est déjà validé pour l’étude des mécanismes impliqués dans la leucémie aigüe myéloïde. Ce modèle présente une forte transposabilité aux données humaines en raison de la conservation des voies moléculaires clés entre la souris et l’homme. Son utilisation se justifie également par la robustesse des résultats préliminaires obtenus in vitro, qui nécessitent désormais une validation fonctionnelle in vivo dans un système pertinent et contrôlé. Ces modèles préalablement décrits utilisent des souris adultes âgées de 6 à 8 semaines, âge pour lequel la prise de greffe des cellules cancéreuses est optimal.

Une partie des souris utilisées est dépourvue de système immunitaire, donc exposée aux infections, et une autre partie est castrée avant même sa maturité sexuelle. 3 720 souris au total vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des tumeurs de mélanome ou de cancer du sein, un implant sous la peau, des injections jusqu'à trois fois par semaine, une prise de sang hebdomadaire et deux séances d'irradiation, la croissance des tumeurs pouvant gêner leurs déplacements, se nécroser et gagner les poumons. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure, l'objet déclaré étant de comprendre pourquoi les femmes résistent mieux au cancer que les hommes.

Objectifs

En France, les cancers sont non seulement plus fréquents mais aussi plus mortels chez les hommes que chez les femmes. Les mécanismes responsables de ces différences liées au sexe dans les cancers sont peu documentés et probablement complexes. A côté du mode de vie (consommation d'alcool, de tabac ...) qui peut varier entre les hommes et les femmes, nous pensons que des facteurs biologiques qui sont différents en fonction du sexe tels que les hormones sexuelles (estrogènes, androgènes) ou encore des facteurs génétiques (gènes du chromosome X ou du chromosome Y) pourraient aussi contribuer à expliquer la meilleure résistance des femmes au cancer en augmentant leur réponse immune anti-tumorale. Les grands objectifs de notre projet sont doubles. D’une part, nous identifierons si des facteurs génétiques liés au sexe contribuent aux meilleures réponses anti-tumorales chez les femelles et influencent leur réponse aux immunothérapies. D’autre part, nous évaluerons si les hormones sexuelles féminines (estrogènes) participent aux meilleures réponses immunitaires chez les femelles.

Bénéfices attendus

Bien qu'observables pour la plupart des cancers, les mécanismes à l'origine des différences dans le cancer entre les hommes et les femmes sont encore très peu explorés et largement négligés dans le diagnostic et la prise en charge thérapeutique. Il est en effet admis que la plupart des cancers se déclarent non seulement plus tôt chez les hommes mais que leur incidence et leur taux de mortalité associée sont plus élevés chez les hommes en comparaison aux femmes, supposant de meilleures réponses immunes antitumorales chez les femmes. Notre projet permettra de contribuer à identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires à l'origine de ce dimorphisme sexuel dans l'immunité anti-tumorale. Ces mécanismes pourraient être exploités pour les thérapies de nouvelle génération et la gestion du cancer en fonction du sexe.

Procédures

Les animaux pourront subir : - Une castration, réalisée chez des animaux sous anesthésie générale (injection, 30 sec), opération qui dure moins de 10 min par souris mâle ou femelle - Implant sous la peau réalisée sous anesthésie générale ( 30 sec), dure moins de 5 min - - des injections sous-cutanées et intraveineuses (durée moins de 1 min) au maximum 3 fois par semaine - - des prélèvements veineux de sang - 1 min - au maximum 1 fois/semaine pendant la procédure - deux irradiations de moins de 4 minutes chacune

Impact sur les animaux

Les lignées génétiquement modifiées que nous utiliserons, et dont nous disposons d’ores et déjà au laboratoire dans ce projet n’ont pas de phénotype dommageable hormis les souris immunodéficientes. Ces souris dépourvues de système immunitaire sont plus sujettes aux infections. Une partie des animaux sera ovariectomisée ou castrée. Les animaux récupèrent parfaitement de ces opérations. Cependant, la chirurgie peut induire des douleurs abdominales modérées post-opératoires. Les injections réalisées aux animaux sont associées à des douleurs locales modérées et transitoires au point d’injection. La croissance des tumeurs primaires de mélanome et de cancer du sein peut induire des difficultés de déplacement. La croissance tumorale peut aussi être associée au développement de nécrose. Le lieu préférentiel de métastase du mélanome est le poumon et peut donc être accompagnée de troubles respiratoires. Globalement, la pousse tumorale et le développement de métastases peuvent être associés à une altération de l’état général (absence de nidification, absence de toilettage, asthénie, léthargie, tremblement, dos arqué) et à une perte de poids. De plus, un stress peut être généré chez l’animal par les manipulations répétées (contention lors des injections et de la mesure du volume tumoral). Une grille de scoring decrit avec précision les actions à mener.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Les réponses immunes anti-tumorales misent en place pour l’élimination efficace des cancers sont complexes. Elles nécessitent l’implication de plusieurs types de cellules immunitaires qui agissent de manière coordonnée dans le temps (avec des cinétiques précises) et dans l’espace (site tumoral, site de dissémination métastatique, ganglions lymphatiques drainant). Ces différentes étapes ne peuvent pas être mimées in vitro.

Réduction

Une étude approfondie de la littérature a été réalisée. Elle nous a permis de choisir les modèles les mieux adaptés pour répondre à nos questions scientifiques mais aussi d’adapter le nombre minimal d’animaux nécessaires. Nous avons aussi interrogé des chercheurs maitrisant ces modèles et leur robustesse. Nous en avons conclu que le nombre minimal d’animaux est de 10 par groupe. Le calcul d'effectif a été réalisé en utilisant un test non paramétrique de rang. Les expériences seront reproduites 2 fois. Un maximum d’étude sera réalisé sur le même animal : étude longitudinale de mesure de la pousse tumorale et étude cytométrique/transcriptomique/histologique sur les tissus post-mortem.

Raffinement

Toutes les procédures seront réalisées par du personnel formé à l'expérimentation animale et détenteur du diplôme de chirurgie expérimentale quand cela le nécessite (ovariectomie, castration). Lors de la réalisation des procédures, des précautions et mesures adaptées seront prises pour réduire au mieux le stress et la souffrance des animaux. Afin de limiter les risques d'infection des animaux, en particulier les animaux immunodéficients, les animaux seront placés dans des cages placées sur portoir ventilé et les expérimentateurs seront munis de protection personnelle (combinaison, masque, charlotte, surchaussures, gants). L’environnement de toutes les cages sera enrichi (igloos, sizzelnest pour la nidification, rouleaux en carton) et de la nourriture/eau gélifiée rajoutée dans la cage si nous notons que les souris perdent du poids sans que les points limites ne soient atteints. Du serum physiologique tiédi pourra être injecté en cas de déshydratation. Un collyre anésthésiant sera appliqué sur l'oeil avant les injections en retro-orbitaire. L’ovariectomie, la castration et l’implantation des cellules tumorales mammaires sera réalisée sous anesthésie générale. Un anesthésique local sera administrée au point d'incision pour limiter la douleur. Durant l’opération du gel oculaire sera appliqué afin d’éviter tout dessèchement de la cornée. Durant et après la chirurgie, les animaux sont placés sur un tapis chauffant afin de limiter l’hypothermie et ce jusqu’à leur réveil. En péri-opératoire (avant et après la chirurgie), les animaux seront analgésiés pendant 24 heures. Une surveillance accrue pendant les 3 jours post-chirurgie sera réalisée afin de détecter tout signe de douleur et de détresse. Des points limites spécifiques ont été établis et sont décrits pour chaque procédure. S’ils devaient être atteints, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Les acteurs de la réponse immunitaire anti-tumorale chez la souris sont très similaires à ceux de l'Homme. A ce jour, la souris représente le meilleur modèle animal pour étudier la réponse immunitaire anti-tumorale qui est une réponse intégrée dans le temps (précoce avec la réponse immunitaire innée, plus tardive avec la réponse immunitaire adaptative) et dans l'espace (sur le site tumoral ou dans les organes lymphoïdes). Une partie des souris devra être castrée avant maturité sexuelle (4-6 semaines), donc avant toute sécrétion d'hormones sexuelles. Toutes les autres procédures seront réalisées sur des animaux agés de 8-30 semaines. Cet âge correspond à l'âge adulte chez la souris, période durant laquelle nous souhaitons étudier l'impact des facteurs liés au sexe sur la réponse immune anti-tumorale.

10 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 8 640 reçoivent des cellules tumorales sous la peau du flanc et 2 160 se les font injecter dans le foie au cours d'une chirurgie abdominale, avant des séances de plasma froid appliqué directement sur la peau, jusqu'à sept fois dix minutes, qui peuvent l'assécher jusqu'à la nécrose. S'y ajoutent quatre à cinq imageries par animal et deux à trois prises de sang. Le porteur écrit qu'on peut "raisonnablement espérer" une régression des tumeurs, affirme qu'il est impossible de recréer in vitro la complexité d'un "organisme entier", et indique développer en parallèle des modèles en trois dimensions pour réduire le nombre de souris.

Objectifs

Les cholangiocarcinomes (CCA) sont un type de cancer rare qui atteint le foie et les voies biliaires. A ce jour, seule l’ablation chirurgicale apparaît comme une thérapie efficace mais elle n’est envisageable que dans 20 pourcents des cas, avec sur 5 ans un taux de survie estimé entre 15-40 pourcents. La majorité des patients ne pouvant bénéficier d’intervention chirurgicale reçoit alors une chimiothérapie. En cas de progression tumorale consécutive à cette première ligne de traitement, il n’existe à ce jour pas de thérapie complémentaire approuvée. Par conséquent, l’émergence de nouvelles approches thérapeutiques est plus qu’attendue. Les plasmas froids atmosphériques (PFA) sont des gaz faiblement ionisés, constitués d’électrons, d’espèces radicalaires et excitées et possédant des propriétés de champ électrique et de rayonnement. Les PFA constituent une stratégie physique innovante et prometteuse pour le traitement des carcinomes puisque leurs capacités à réduire la croissance tumorale a récemment été démontrée dans des études in vitro et in vivo. Cependant, le développement et l’efficacité d’une stratégie PFA sur les cholangiocarcinomes (CCA) n’ont pas encore été testés. La finalité du projet est donc d’évaluer l’efficacité de la thérapie PFA comme alternative à l’ablation chirurgicale ou comme approche complémentaire à des traitements conventionnels. L’utilisation PFA permet raisonnablement d’espérer une régression significative de la taille des tumeurs, voire même une régression importante en combinant cette approche innovante à l’approche conventionnelle de la chimiothérapie. Par ailleurs, on peut s’attendre à un « effet sélectif » du plasma, c’est-à-dire qu’appliqué sur une zone présentant des cellules tumorales et saines, le plasma pourrait favoriser la mort des cellules cancéreuses sans endommager les cellules saines. Les objectifs sont de tester l’efficacité antitumorale du PFA et de mieux comprendre les mécanismes d’action du PFA, en particulier sur le phénotype des cellules tumorales, les cellules du microenvironnement tumorale et sur les composants de la matrice extracellulaire (MEC), dans des modèles précliniques de CCA ectopique. La caractérisation des échantillons sera réalisée par des approches multiples de biologie moléculaire et cellulaire. Ce projet sera mené dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Les tumeurs des voies biliaires ou cholangiocarcinome (CCA) sont de très mauvais pronostiques et très agressives. Les traitements sont limités, seule la résection chirurgicale est efficace mais seuls 20 à 30 % des patients sont éligibles, les autres recevront une chimiothérapie palliative. La recherche sur traitements dit innovants dans un but de traiter localement la tumeur est nécessaire pour proposer de nouvelles options thérapeutiques pouvant être proposée seule ou en combinaisons avec des thérapies systémiques déjà en place. Dans son ensemble, ce projet est de tester dans des modèles expérimentaux murins, l’effet du plasma froid atmosphérique (PFA) sur le CCA. Les bénéfices attendus sont de démontrer un effet antitumoral du plasma froid atmosphérique dans des modèles bien décrits de CCA représentatifs de la maladie humaine. Si l’effet anti-antitumoral s’avérait efficace, ce projet pourrait permettre de développer un nouvel outil thérapeutique anti-cancéreux applicable en santé humaine dans le cadre des cancers des voies biliaires. Au-delà du cancer des voies biliaires, les PFA pourraient jouer un rôle important dans le développement de nouvelles applications médicales. Par exemple, les résultats pourraient orienter la création de nouvelles thérapies pour d’autres cancers ou d’autres applications comme la cicatrisation des plaies et l'ingénierie tissulaire.

Procédures

- Procédure 1 (EU1). 1. Injection sous cutanées des cellules (n=8640) sur souris vigiles, durée 10 secondes/animal - Procédure 2 (EU1). 1 chirurgie pour injecter dans le foie des cellules sur souris anesthésiées et sous analgésie (n=2160), durée 15-20 minutes/souris - Traitement au plasma froid atmosphérique (EU1/EU2) sur souris anesthésiées (n=1080 procédure 1 et n=540 procédure 2) 10 minutes/souris, répété 6 à 7 fois max. - Imagerie (EU2). Anesthésie + imagerie (4-5 fois sur même souris) (n=6480), durée 15 min/souris - Prélèvements sanguins (EU1/EU2) sur animal vigile (2-3 par souris) (n=6480), durée 10 min/souris - Prélèvement terminal (EU1/EU2). A l’issue des traitements, tous les animaux seront anesthésiés et analgésiés puis soumis à un prélèvement sanguin et tissulaire pour effectuer les analyses et ne durera pas plus de 10 minutes entre de début de l’anesthésie et l’euthanasie de l’animal.

Impact sur les animaux

-le développement des tumeurs : -le modèle ectopique implique une injection des cellules sous cutanée dans le flanc/dos de l’animal ce qui peut engendrer un stress à l’animal en raison de la contention et d’une douleur de courte durée lors de l’introduction de l’aiguille, et un inconfort au fur et à mesure du développement tumoral. -Le modèle orthotopique (injection dans le foie) implique une chirurgie abdominale pour injecter dans un lobe du foie les cellules tumorales, ce qui engendre donc des nuisances liées à l’anesthésie (stress thermique, risque d’arrêt cardio-respiratoire) et à la chirurgie elle-même (douleurs post-opératoires malgré la prise en charge réalisée, inflammation locale, risque de dessiccation de la plaie). - Le traitement par plasma froid. L’utilisation de ce gaz faiblement ionisé appliqué directement sur la peau de l’animal peut générer un assèchement de la peau pouvant aller jusqu’à la nécrose dans les cas les plus extrêmes (peu probable). - Pour les traitements administrés par injection au niveau de l’abdomen ou dans la veine de la queue ou par gavage, les nuisances pourraient être un éventuel durcissement abdominal ou de la queue, une inflammation de l’abdomen, queue ou gorges). Les contraintes liées au gavage sont la contention qui constitue un facteur de stress. - Les traitements seront effectués sous anesthésie (sauf pour le gavage) et impliqueront donc également les contraintes/risques liées à l’anesthésie elle-même.

Devenir

A l’issue des procédures, les animaux seront tous euthanasiés par des méthodes réglementaires afin de prélever le sang et les tissus pour réaliser différentes analyses biologiques. Ces analyses permettront d’évaluer l’impact « biologique » des différents traitements, en utilisant les différents marqueurs de progression de la pathologie.

Remplacement

Dans la mise en œuvre de ce projet, un organisme vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement et l’évaluation de thérapies innovantes anti-cancéreuses. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu dans le développement du cancer. Le modèle animal est donc indispensable dans le cadre de ce projet.

Réduction

Le projet impliquera un total de 10800 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique G*Power a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude qui est de 15 par groupe. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyses à effectuer (les différents types de tests donnant des résultats soit qualitatifs, soit quantitatifs). D’une façon générale, les modèles seront testés avec un seuil de validité de 5%. Lorsque ces conditions ne seront pas vérifiées, des tests non paramétriques seront effectués. En parallèle des animaux, nous développons des modèles in vitro en 3 dimensions afin de tester nos thérapies, ce qui permetra de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, enrichissement). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum, le milieu est enrichi. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie). Un analgésique, notamment la buprénorphine, sera utilisé en pré-opréatoire 20 minutes avant et post-opératoire pour limiter la douleur et garantir un bien-être optimal des animaux. Un protecteur oculaire en gel sera aussi utilisé lors de l'anesthésie pour éviter tout assèchement des yeux. Pour le transport des animaux, celui-ci est effectué dans le respect du bien-être animal (mise à disposition d'eau sous forme de gel et de nourriture) et est réalisé par un transporteur agréé.

Choix des espèces

Les cellules en culture ne permettent pas de tester des nouveaux traitements anti-cancéreux dans sa globalité. Aussi, la souris est utilisée pour mimer un cancer avec des caractéristiques de la maladie proche de celles observées chez l’homme. Plusieurs modèles animaux de cancers biliaires (ectopique ou orthotopique) existent chez la souris récapitulant les différentes formes observées chez l’homme. Les souris seront utilisées à l'âge adulte/jeune adulte : 5 à 8 semaines pour les animaux commerciaux dont 1 semaine d’acclimatation. Nous n'utilisons pas d'animaux trop vieux afin de nous affranchir des problèmes de prise de greffes dans le cas des xénogreffes ectopiques et modifications des fonctions hépatiques dues à l'âge dans le cas des greffes syngéniques orthotopiques qui pourraient interférer avec nos résultats.

4 840 souris vont être utilisées, toutes tuées pour analyse de leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau, jusqu'à trois gavages de matières fécales, un traitement antibiotique, jusqu'à quatre injections d'immunothérapie et sept injections bloquant des voies immunitaires, certaines subissant en plus une chirurgie. Les tumeurs peuvent limiter leur mobilité, les antibiotiques provoquer des diarrhées et le tout des pertes de poids. Le porteur affirme que seul un animal "vivant, entier" permet d'étudier ces interactions, les organoïdes ne reproduisant pas selon lui le dialogue entre immunité intestinale et tumeur.

Objectifs

De plus en plus de preuves indiquent que le microbiote intestinal influence fortement l'immunité antitumorale et les réponses cliniques aux immunothérapies dans le traitement du cancer. Notre laboratoire a montré que la dysbiose, une composition altérée du microbiote intestinal, peut réduire l'efficacité des immunothérapies et contribuer à la résistance au traitement contre le cancer. Alors que les interventions microbiennes telles que la transplantation de microbiote fécal (TMF) peuvent restaurer les communautés bactériennes intestinales bénéfiques et améliorer les réponses aux traitements, les mécanismes expliquant l'efficacité des TMF sont encore à étudier. Parmis ceux potentiels, la modulation du métabolisme et de l'immunité post-TMF seront étudiés dans ce projet. Dans ce projet, nous testerons un métabolite mis en évidence dans d'anciens projets, associé à une meilleure efficacité des traitements par immunothérapies post-TMF. Nous étudierons plus en détails les effets immunomodulateurs de ce métabolites, sur sa voie d'action (locale ou systémique) et ses effets sur le thymus.

Bénéfices attendus

En effet, nous avons mis en évidence un métabolite associé à la réponse aux immunothérapies chez les patients, et nous étudierons son effet dans ce projet, en association aux TMF et au traitement par immunothérapie. De plus les modulations immunitaires seront étudiées, et notamment le rôle du thymus. En évaluant la modulation de la réponse immunitaire et du métabolisme de manière microbiote-dépendante, ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes de résistance ou la réponse aux immunothérapies chez les patients atteints de cancer. Cette compréhension permettrait aussi de montrer que le métabolite étudié pourrait constituer un biomarqueur de la réponse aux TMF + immunothérapies. De plus, cela pourrait aider à comprendre la réussite ou l’échec de la transplantation de microbiote fécal à contourner la résistance aux ICI, et de pouvoir sélectionner des donneurs. Enfin, cela permettrait d’optimiser l’utilisation des immunothérapies, et d’éclairer les interactions entre l’immunité et le microbiote intestinal, pouvant au final influencer les décisions cliniques.

Procédures

Les interventions prévues seront l'implantation d'une tumeur par injection sous cutanée (une fois, d'une durée de moins d'1 minute), l'administration orale de matières fécales avec une sonde de gavage oral (1 à 3 fois, durée 1 minute), l'administration de traitements d'immunothérapie par injection intrapéritonéale (4 fois maximum, durée 1 minute), l'administration de traitements bloquant certaines voies immunitaires par injection intrapéritonéale (7 fois maximum, durée 1 minute). Dans les procédures 4 et 5, une chirurgie seral réalisée, sous anesthésie générale et les souris seront traités par un anti-douleur (une fois, durée 15-20 minutes). Enfin, des prélèvements de sang seront réalisés, une fois par semaine si 100uL sont prélevés (durée 2-3 minutes). Toutes les injections seront réalisées sous anesthésie locale, par lidocaïne.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir un stress léger et transitoire lié aux manipulations. Les gavages oraux pourront provoquer un inconfort léger et transitoire pour la souris. Il y a un risque de diarrhée car les souris recevront un traitement antibiotique de courte durée, induisant une déshydratation légère et de courte durée. Il y a aussi un risque de perte de poids modéré post-transplantation de microbiote, post traitement par antibiotique ou post injection de tumeur sous-cutanée. Les injectionspeuvent provoquer des douleurs légères et transitoires et seront faites sous anesthésie locale. Les tumeurs peuvent provoquer une limitation modérée de l'activité et de la mobilité des souris. Les chirurgies comportent un risque de douleur post-opératoire modérée.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées afin d’analyser les organes post-mortem.

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale, intestinale et périphérique et l’effet de la transplantation de microbiote fécal sur l'immunité et la réponse antitumorale, avec toutes les interactions nécessaires, impossibles à reproduire in vitro ou ex vivo. En effet, l'utilisation d'organoïdes n'est pas possible car les organoïdes reproduisent un tissu ou organe mais ne peuvent reproduire l’interaction du système immunitaire intestinal avec l’environnement tumoral après stimulation par le microbiote. Dans ce projet, nous voulons observer l'effet d'une transplantation de microbiote fécal sur différentes composantes de l'immunité. Seul un organisme entier permet d’étudier cela, avec un système immunitaire et une génétique proche de l'Homme comme la souris.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Le nombre d’animaux est rigoureusement contrôlé pour optimiser les ressources tout en garantissant des résultats fiables. D'après nos études antérieures et des analyses statistiques, nous avons besoin de 8 animaux par groupe pour obtenir des différences significatives.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être avec un régime alimentaire normal et de l’eau ad libitum, ainsi qu’un enrichissement adapté. Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début de l’expérimentation. La surveillance régulière permettra le suivi du comportement de la souris et l’éventuelle mise en place de mesure d'analgésie si les animaux présentent une souffrance, voire d'euthanasie si les animaux atteignent les points limites. Toutes les injections sous-cutanées, intraveineuses et intrapéritonéales (i.p.) seront faites sous anesthésie locale. Toutes les souris auront un examen clinique quotidien et des pesées régulières (au moins une fois/semaine). Les points limites seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques. La génétique est proche de celle de l’Homme et bien connue. La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques, la plus susceptible d’apporter les résultats satisfaisants pour nous au vu des objectifs du projet. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des antibiotiques ou bactéries associées à ces antibiotiques sur le microbiote et l’immunité intestinales. Les animaux seront utilisés au stade adulte, à partir de 6-7 semaines de développement, les cancers cibles touchant l’adulte. De plus, à cet âge-là, les animaux sont matures du point de vue immunologique.

1 430 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leurs tumeurs et de leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales, jusqu'à seize injections de traitement en deux mois et une irradiation localisée de douze minutes sous anesthésie générale. Le porteur annonce une diminution de l'appétit, une réduction de l'activité et des modifications du comportement social liées à la croissance des tumeurs et aux traitements. Il promet en retour un "nouveau paradigme" de radio-immunothérapie et une "transformation significative" des stratégies thérapeutiques, alors que le projet en est au stade de combiner trois traitements chez la souris.

Objectifs

Les agonistes des récepteurs étudiés sont des peptides intestinotropes connus pour leurs effets bénéfiques sur la barrière intestinale et leurs capacités immunomodulatrices. Comparés aux traitements immunologiques classiques, ils présentent un profil de tolérance favorable, tout en modulant efficacement l'inflammation locale et en préservant l'intégrité épithéliale intestinale. Parallèlement, l'irradiation intestinale à faible dose apparaît comme une approche innovante capable de remodeler le microbiote intestinal, d'activer les cellules dendritiques et d'induire un effet immunitaire antitumoral à distance (effet abscopal). Toutefois, malgré les succès notables des inhibiteurs de points de contrôle immunitaire, leur efficacité reste limitée dans les tumeurs dites "froides" ou peu immunogènes. Le projet actuel vise précisément à explorer la synergie thérapeutique potentielle entre ces différentes stratégies dans un modèle murin de cancer colorectal. Cette approche multidimensionnelle pourrait ouvrir la voie à une nouvelle génération de thérapies combinatoires, dépassant les limites actuelles des immunothérapies classiques, souvent entravées par un microenvironnement tumoral immunosuppressif et une toxicité intestinale significative. En établissant clairement le bénéfice thérapeutique de cette combinaison innovante, ce projet pourrait conduire à une transformation significative des stratégies thérapeutiques actuelles, notamment en réduisant les effets secondaires et en augmentant significativement les taux de réponse immunitaire antitumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à explorer une stratégie innovante combinant la radiothérapie intestinale à faible dose, un agoniste de récepteur et une immunothérapie, afin de surmonter les limites des thérapies conventionnelles et d'améliorer l’efficacité des traitements anticancéreux. Cette approche multimodale vise non seulement à optimiser la réponse immunitaire antitumorale, mais également à proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur la modulation du microenvironnement intestinal. À travers une conception expérimentale rigoureuse et des analyses multi-paramétriques approfondies, ce projet ambitionne de poser les bases d’un nouveau paradigme de radio-immunothérapie ciblant l’axe microbiote – barrière intestinale – immunité adaptative, tout en réduisant les effets secondaires associés aux traitements combinés. En décryptant les mécanismes synergiques entre ces trois stratégies :modulation du microbiote et activation locale, la réparation de la muqueuse intestinale et réduction de l'inflammation et l’activation de lymphocytes T cytotoxiques, cette étude fournira une base translationnelle solide pour le développement de futurs essais cliniques combinés, alliant efficacité thérapeutique et toxicité minimale.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections de cellules tumorales (n=1, 25 secondes) et à des injections de traitements (au maximum 16 injections sur deux mois, durée 25 secondes), sous anesthésie locale. Les animaux vont recevoir une anesthésie générale afin de les placer dans les dispositifs qui permettent la réalisation des irradiations localisées au niveau des tumeurs (n=1, durée 12 minutes en tout).

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent subir un stress léger en raison de leur manipulation par l'expérimentateur, lors des procédures expérimentales (telles que les injections, etc.). Les animaux peuvent également ressentir douleur et inconfort légers à modérés comme les injections sous-cutanées pour l'implantation des tumeurs, les traitements de radiothérapie ou les traitements pharmacologiques injectés en intra-péritonéale. En raison de la croissance des tumeurs ou des effets secondaires des traitements, les animaux peuvent présenter des changements de comportement modérés, tels qu'une diminution de l'appétit, une réduction de l'activité ou des modifications du comportement social.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour études sur les tumeurs et tissus post-mortem.

Remplacement

Ce projet vise à évaluer l’effet thérapeutique combiné de l’irradiation intestinale à faible dose (ILDR), d’un inhibiteur du point de contrôle immunitaire (anti-PD-L1) et d’un modulateur immuno-métabolique, un agoniste du récepteur GLP-2 (GLP-2RA), sur la réponse tumorale. Étant donné que l’ILDR, le blocage de PD-L1 et le GLP-2RA agissent sur un réseau complexe d’interactions entre l’hôte, la tumeur et le microbiote intestinal, l’étude de ces mécanismes nécessite un système immunitaire intact, un microenvironnement intestinal fonctionnel et un état métabolique stable. Cette complexité multifactorielle ne peut être reproduite de manière fiable ni par des cultures cellulaires (in vitro), ni par des modèles informatiques (in silico). Par conséquent, afin de caractériser avec précision les mécanismes d’action et l’efficacité thérapeutique de cette approche combinée, le recours à un modèle animal vivant, immunocompétent et métaboliquement intact, est indispensable.

Réduction

Afin de pouvoir observer des différences qui soient statistiquement interprétables entre les différents groupes de traitements, nous avons besoin d’utiliser des tests statistiques solides et adéquats. Ces tests exigent l’utilisation d’un nombre minimum d’animaux par groupe. Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux à utiliser nous permettant d’atteindre les objectifs du projet, nous avons réalisé une analyse statistique à priori, (avec G*Power) afin de calculer le nombre d’animaux nécessaires pour détecter des différences significatives pour chaque procédure expérimentale. De plus, notre expertise dans le domaine de la radiobiologie ainsi que les données de la littérature nous permettent de réduire les conditions expérimentales et donc réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Toutes les manipulations expérimentales seront menées en veillant à adhérer aux principes éthiques les plus stricts pour minimiser la douleur, l'angoisse et le stress chez les animaux. Une anesthésie (isoflurane/Lidocaïne) adéquate sera utilisée pendant les expériences pour soulager ou éliminer la douleur en particulier lors des injections intrapéritonéales. Les conditions d'hébergement des animaux seront optimisées, en fournissant l'environnement et la nourriture nécessaire. Leur environnement sera enrichi avec du coton ou des maisons en carton afin de diminuer leur angoisse. Le comportement et l'état de santé des animaux seront surveillés quotidiennement, pour identifier et traiter toute anomalie. Les souris seront élevées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. Une pesée sera effectuée régulièrement, au minimum de façon hebdomadaire.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie et des réponses immunitaires pendant le développement tumoral. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues et de nombreuses études ont déjà validé des découvertes faites chez la souris en les appliquant pendant des essais cliniques, ce qui facilite le transfert des résultats obtenus chez la souris en clinique. Les souris seront utilisées à un âge de 8 ou 9 semaines, âge auquel les souris sont adultes.

6 500 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous la peau une greffe de tumeur prélevée sur un patient, puis jusqu'à 160 injections de médicament par étude, certaines molécules étant administrées deux fois par jour pendant seize semaines, avec des prélèvements de sang hebdomadaires. Un même animal peut rester trente-six semaines dans le protocole. Ces modèles de tumeurs résistantes, le porteur les met à disposition de la communauté scientifique et les emploie dans des collaborations académiques et industrielles pour valider ou réfuter des hypothèses sur des composés, et il affirme qu'il est "indispensable" de créer de nouveaux modèles sur un "organisme complexe" comme la souris.

Objectifs

Depuis plusieurs années, le développement de nouvelles thérapies anticancéreuses a permis des avancées notables, notamment pour améliorer la survie des patients atteints de cancers difficiles à traiter. Cependant, la résistance aux traitements, phénomène appelé résistance acquise, demeure un défi majeur en oncologie, limitant l’efficacité à long terme des thérapies. Ce problème survient généralement après quelques mois de traitement, entraînant la progression de la maladie. Les échecs thérapeutiques résultent souvent d’un manque de compréhension des mécanismes d’action des médicaments et des voies biologiques impliquées dans l’échappement des cellules tumorales. Mutations génétiques, altérations de la signalisation cellulaire ou modifications du microenvironnement tumoral influencent la réponse aux traitements. Une meilleure connaissance de ces mécanismes permettrait d’identifier de nouvelles cibles et de développer des thérapies plus efficaces, personnalisées et durables. Dans cette optique, les modèles issus de greffes de tumeurs humaines chez la souris, jouent un rôle clé. Ces modèles conservent les caractéristiques génétiques et pharmacologiques des tumeurs humaines, offrant une reproduction réaliste des réponses cliniques et des mécanismes de résistance. Ils sont ainsi devenus des outils indispensables pour évaluer les effets de nouveaux traitements et combinaisons thérapeutiques. Notre projet vise à développer des modèles de greffes de tumeurs de patients à partir de biopsies de patients ayant développé des résistances à des thérapies innovantes en développement. Ces modèles permettront d’étudier les mécanismes de résistance et d’action des médicaments, ainsi que de tester de nouvelles stratégies, notamment des combinaisons thérapeutiques. À ce jour, notre équipe a généré de nombreux modèles de ce type, utilisés pour des recherches approfondies sur les mécanismes de résistance et le développement de nouveaux traitements. L’objectif de ce projet est de caractériser pharmacologiquement ces modèles, de tester des composés innovants et de mener des études pharmacocinétiques et pharmacodynamiques. Ces travaux contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes de résistance et à l’optimisation des thérapies contre le cancer.

Bénéfices attendus

L’utilisation des modèles de greffes de tumeurs de patients sur aimaux permet de mieux comprendre les mécanismes de résistance aux thérapies, contribuant ainsi à l’avancée des connaissances scientifiques. Au sein de notre équipe, nous avons développé une activité de recherche dédiée à l’identification des mécanismes de résistance et des modes d’action de thérapies innovantes. Au cours des dernières années, nous avons lancé plusieurs projets de recherche, notamment sur la résistance précoce aux thérapies. Ces travaux ont permis de générer de nouvelles connaissances sur les mécanismes de résistance et d’action des médicaments, avec des implications directes pour améliorer la prise en charge des patients atteints de cancer. Nos modèles sont également mis à la disposition de la communauté scientifique et peuvent être intégrés dans des projets de recherche fondamentale, préclinique et translationnelle. Par exemple, les tests pharmacologiques réalisés dans le cadre de collaborations académiques et industrielles ont permis de valider ou de réfuter les hypothèses sur des modèles plus sophistiqués que les lignées cellulaires, et plus représentatifs des caractéristiques humaines. Un autre avantage majeur de ces modèles réside dans leur capacité à conserver les caractéristiques pharmacologiques, génétiques et histologiques des tumeurs des patients. Cela offre la possibilité de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques ou de nouveaux composés sur des tumeurs issues de patients en progression sous thérapies innovantes. À terme, ces recherches ouvrent la voie à des essais cliniques pour de nouveaux médicaments. À ce jour, notre équipe a validé, grâce à ces modèles, des combinaisons thérapeutiques capables de surmonter la résistance ainsi que de nouveaux inhibiteurs, dont certains sont déjà en cours d’évaluation clinique.

Procédures

Chaque souris incluse dans l’étude fera l’objet d’une greffe tumorale sous-cutanée sous anesthésie générale, représentant une intervention unique d’environ 10 à 15 minutes. Un sous-groupe recevra également, au moment de la greffe, un implant hormonal, inséré sans intervention supplémentaire, en sous-cutané, durant la même anesthésie générale. À l’issue de la phase de croissance tumorale, une partie des souris sera traitée selon différents protocoles expérimentaux. Les traitements seront administrés pendant une période pouvant aller jusqu’à 16 semaines, à une fréquence variant de 1 à 5 jours par semaine, selon les groupes. Certains médicaments nécessiteront une administration biquotidienne, portant le nombre maximal d’injections médicamenteuses à 160 par animal et par étude. La durée moyenne de chaque procédure (de l’implantation tumorale jusqu’à la fin du traitement) est estimée à 20 semaines, tandis que la durée maximale est fixée à 36 semaines par animal. Des prélèvements sanguins ponctuels ou séquentiels pourront être réalisés au cours de l’étude. Chaque prélèvement durera environ 5 minutes. Lors de cinétiques courtes (sur une semaine), jusqu’à 3 prélèvements maximum seront effectués. Pour des cinétiques longues, un prélèvement par semaine pendant une durée maximale de 6 semaines sera réalisé.

Impact sur les animaux

Les nuisances découleront des interventions et greffes de cellules tumorales sous anesthésie générale, des injections de traitements, des suivis de croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse. Ces différentes manipulations peuvent entraîner du stress chez l’animal et les croissances tumorales en sous-cutanée peuvent entraîner des douleurs locales et modérées. Une perte d’appétit modérée et donc une perte de poids modérée peuvent apparaître chez la souris suite aux traitements médicamenteux. Les prises de sang peuvent entraîner une douleur locale modérée transitoire.

Devenir

L’ensemble des animaux sera euthanasié à l’issue de chaque procédure afin de permettre la récupération des échantillons tumoraux et/ou tissulaires pour les analyses post-traitement (pharmacologiques, histologiques, ou génétiques).

Remplacement

Il s'agit ici d'un projet de recherche dont l'objectif est d'étudier les mécanismes de résistance aux thérapies, de mieux comprendre les mécanismes d'action des médicaments innovants et de développer de nouvelles thérapies pour les patients. Les tumeurs greffées dérivées de patients que nous avons générés, et que nous continuons à développer à partir de biopsies de patients résistants à des thérapies innovantes (saisine valider), constituent des modèles précieux et uniques. Ils offrent une opportunité essentielle pour approfondir notre compréhension des résistances et des mécanismes sous-jacents. Ces modèles, plus proches à la fois génétiquement, pharmacologiquement et histologiquement des tumeurs humaines, permettront d’augmenter le succès du développement de traitements efficaces en clinique. Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments pour des populations bien définies (médecine personnalisée), il est indispensable de créer de nouveaux modèles sur un organisme complexe tel que la souris, avec une activité métabolique pouvant modifier la distribution et l’efficacité thérapeutique. La complexité biologique des organismes vivants est extrêmement élevée, et certaines interactions entre différents systèmes biologiques sont impossibles à reproduire en dehors d'un organisme vivant. Les modèles animaux peuvent fournir des informations cruciales sur la physiologie, la pathologie et les mécanismes de la maladie qui ne peuvent pas être obtenues par d'autres moyens. De plus, ils représentent beaucoup mieux les processus biologiques humains que les modèles cellulaires ou informatiques. De plus, les interactions entre différents organes et systèmes de l'organisme ne peuvent être étudiées que chez les animaux vivants.

Réduction

En parallèle du développement de tumeurs greffées dérivées de patients, et afin de réduire le nombre d'animaux utilisés en expérimentation (respect des 3R), nous développons des organoïdes et des lignées cellulaires. Ces modèles in vitro permettront des études mécanistiques et un large criblage de médicaments, limitant ainsi l'utilisation d'animaux en validant les résultats in vitro avec des modèles de greffes de tumeurs de patients sur souris plus proches de la biologie humaine. Les effectifs d'animaux ont été calculés au plus juste en utilisant des calculs de psuissance. Les résultats seront exploités grâce à des tests statistiques (modèles linéaires non non-linéaires).

Raffinement

Lors des interventions, telles que les greffes sous-cutanées ou l'ajout de pastille hormonale, les souris sont anesthésiées (anesthésie générale) et reçoivent un médicament contre la douleur. Elles sont surveillées quotidiennement pour évaluer leur état de santé. La taille des tumeurs est mesurée régulièrement à l'aide d'un pied à coulisse, pour surveiller la taille des tumeurs. L'alimentation des souris sera adaptée à leur prise alimentaire et remplacée par une alimentation appétente et plus facilement préhensile en cas de perte d'appétit. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

L'utilisation de souris est justifiée: par la facilité d’utilisation des modèles murins pour le développement préclinique. Par la nécessité d’utilisation de modèles immunodéprimés afin de faciliter la croissance tumorale. Des souris âgées de 5 à 9 semaines seront utilisées pour standardiser la procédure et ainsi réduire la variabilité intra-expérience. Par ailleurs, l’utilisation de souris âgées de 5 à 9 semaines permet d’améliorer le taux de prise des greffes.

Livrées par un transporteur spécialisé après un trajet limité à trente minutes, les souris arrivent à cinq semaines et entrent en expérience une semaine plus tard, une partie d'entre elles quasiment dépourvue de système immunitaire. 6 539 souris vont être utilisées sur les deux sites du projet, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une tumeur du pancréas ou du foie implantée sous la peau ou dans l'organe, une radiothérapie externe ou un produit radioactif injecté, puis jusqu'à une heure trente d'IRM sous anesthésie. Les essais en éprouvette ont déjà confirmé l'efficacité des produits testés, ce dont le porteur déduit qu'il est "indispensable" de passer à l'animal, faute de reproduire in vitro la complexité du milieu tumoral.

Objectifs

Les avancées récentes en cancérologie ont considérablement amélioré les options de traitement, notamment en radiothérapie. Parmi les techniques utilisées, il y a la radiothérapie externe, qui cible les tumeurs à l'aide de rayons et la radiothérapie interne, qui consiste à injecter des substances radioactives se fixant directement sur les cellules tumorales. L'objectif principal de ce projet, qui se déroulera sur 2 sites de recherche différents (EU1 et EU2), est d'identifier des biomarqueurs prédictifs de la réponse aux radiothérapies dans des modèles animaux de cancers pancréatique et hépatique. Actuellement, l'absence de biomarqueurs fiables pour évaluer l'efficacité et la toxicité de ces traitements empêche de personnaliser les soins oncologiques. Ce projet vise à relier des marqueurs biologiques à la réponse tumorale et aux effets secondaires des traitements, afin d'adapter ces approches thérapeutiques en clinique. L'utilisation de modèles animaux est essentielle pour se rapprocher des conditions humaines. De plus, nos techniques d'imagerie permettront de suivre l'évolution des biomarqueurs d'intérêt sur le long terme, sans avoir à euthanasier les animaux à chaque étape. Ces outils aideront à identifier des biomarqueurs prédictifs la réponse aux traitements en milieu clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider de nouveaux biomarqueurs d’imagerie prédictifs pour mieux identifier les patients susceptibles de bénéficier de la Radiothérapie externe ou de nouvelles approches en Radiothérapie Interne Vectorisée, tout en permettant une évaluation rapide de l’efficacité des traitements.

Procédures

Dans ce projet, des tumeurs pancréatiques et hépatiques seront implantées chez des souris, soit sous la peau (1 minute), soit directement dans l'organe (4 minutes), après anesthésie gazeuse (5 minutes). Certaines souris recevront un médicament radioactif par injection (20 secondes), tandis que d'autres auront un traitement de radiothérapie externe (4 minutes), également sous anesthésie chimique par voie intrapéritonéale (15 secondes). Des prises de sang (15 secondes) seront effectuées pour vérifier l'impact des traitements sur le sang, le foie et les reins. Une partie des souris sera utilisée pour tester l'efficacité des différents traitements, et une autre pour étudier par imagerie des marqueurs biologiques. L’imagerie PET-CT sera réalisée au sein de l’EU1 (1 heure maximum), l’imagerie IRM sera réalisée au sein de l’EU2 (1h30 maximum). En outre, certaines souris permettront de mesurer la répartition du médicament dans différents organe après euthanasie. La croissance des tumeurs sera suivie minutieusement et évaluée deux fois par semaine par des techniques n'induisant pas de nuisances.

Impact sur les animaux

On peut s'attendre à un léger stress dû à la manipulation des animaux. La douleur associée aux injections intrapéritonéales, intratumorales et intraveineuses est équivalente à celle d'une piqüre avec une aiguille. De plus, la douleur générée par les prélèvements sanguins, l'implantation des cellules tumorales sera soigneusement contrôlée. Le suivi du développement tumoral, avec des mesures et observations régulières, garantira que leur augmentation de volume n’entraine pas de souffrance ou de difficulté pour la locomotion. Si nécessaire, des médicaments anti douleurs seront administrés.

Devenir

Les souris seront toutes euthanasiées en fin de procédure expérimentales ou plus précocement sur la base de critères éthiques

Remplacement

Des tests in vitro ont été réalisés en laboratoire pour évaluer la cytotoxicité des traitements ainsi que leur impact sur la survie et la prolifération des cellules tumorales. Ces essais ont confirmé l’efficacité des radiopharmaceutiques et des modalités de traitement dans un environnement contrôlé. Ils ont également fourni des informations clés sur les mécanismes d’action des traitements et leurs effets sur les cellules tumorales ainsi que sur les fibroblastes associés au cancer. Cependant, malgré la richesse de ces résultats, il est indispensable de passer à des modèles in vivo, car les tests in vitro ne peuvent pas reproduire la complexité du milieu tumoral ni permettre l'évaluation de l’efficacité thérapeutique par imagerie ou la recherche de biomarqueurs prédictifs dans un contexte vivant. Ainsi, les protocoles qui seront utilisés in vivo reposent directement sur les résultats obtenus lors des tests in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés sera limité au strict nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Grâce à des techniques d'imagerie non invasive, nous pourrons suivre l'évolution des traitements sans avoir à euthanasier les animaux à chaque étape. Les effets des traitements seront suivis de près pour observer l'évolution des tumeurs et comprendre les effets de chacun des traitements. Tout au long du projet, le bien-être des animaux sera une priorité.

Raffinement

Afin de limiter la douleur et le stress des animaux, nous avons établi des point limites gradés, précis et adaptés pour toutes les procédures mises en oeuvre au cours de ce projet. Si les animaux atteignent ces points limites, cela constitue un critère d’arrêt de l’expérimentation et les animaux seront euthanasiés. Une surveillance minutieuse des animaux sera réalisée (suivi journalier du poids, du volume tumoral et du comportement) afin réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux. En cas de douleur, un traitement antidouleur adapté sera donné. Concernant l’enrichissement du milieu, les souris disposent de carrés en cellulose pour la formation d’un nid commun confortable, de baguettes en bois qu’elles peuvent ronger. En cas d’isolement forcé d’une souris dans une cage, un abri supplémentaire sera également fourni. Certains animaux utilisés dans ce projet n’ont quasiment pas de système immunitaire, ils seront donc hébergés dans des conditions sanitaires strictes. Les animaux seront transportés par un transporteur spécialisé, dans des boîtes de transport ventilées, avec de la litière, de l’hydrogel et de la nourriture. Le trajet sera court et ne dépassera pas 30 minutes pour limiter leur stress.

Choix des espèces

La souris est un mammifère suffisamment proche de l’espèce humaine d’un point de vue physiologique et la souris immunodéprimée est un bon modèle pour l’étude de la cancérologie humaine. Les animaux, âgés de 5 semaines, seront utilisés après une période d’acclimatation d’une semaine après la réception. Ils seront alors âgés de 6 semaines, âge où l’on observe une forte incidence de prise de greffe et une bonne homogénéité de réponse.