Cancers

Les souris utilisées sont immunodéficientes, donc exposées à une dégradation de leur état général au moindre contact avec un agent infectieux. 340 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales pouvant durer quinze minutes sous anesthésie gazeuse, puis une injection de la molécule à tester, des mesures de tumeur trois fois par semaine, quatre observations à travers la peau, et pour quarante d'entre elles sept prélèvements de sang. Toutes sont tuées pour prélever leurs organes, le porteur indiquant qu'aucune méthode d'imagerie ne permet de suivre sur des temps aussi longs la distribution des molécules dans un "organisme entier".

Objectifs

L’objectif du projet est de quantifier et d’analyser, au sein de l’organisme entier et plus spécifiquement au sein de la tumeur, la distribution de huit nouvelles molécules innovantes issues de travaux menés au laboratoire pour le diagnostic et/ou le traitement de cancers pulmonaires, de cancers du feuillet enveloppant la cage thoracique et de cancers du sein. La caractérisation de ces nouvelles molécules ou de leur distribution au sein des tissus ou d’un organisme entier est nécessaire afin de s’assurer que ces molécules, après leur administration, soient bien adressées vers les cellules cancéreuses qu’elles ciblent privilégiement.

Bénéfices attendus

Les études de distribution dans les tissus, et plus spécifiquement dans la tumeur, réalisées dans ce projet vont permettre de définir la spécificité des molécules testées pour leur cible biologique après que ces molécules auront été administrées au sein d’un organisme entier. La validation de la distribution tumorale de ces nouvelles molécules fera de ces molécules une solution prometteuse pour le diagnostic et/ou le traitement des cancers qu’elles ciblent.

Procédures

Une seule brève (30 secondes) injection ou une plus longue (15 minutes) injection de cellules tumorales sur animal sous anesthésie gazeuse. Une seule brève (30 secondes) injection de molécule d’intérêt sur animal sous anesthésie gazeuse. Des mesures de la taille des tumeurs réalisées 3 fois par semaine (2 minutes) sur animal sous anesthésie gazeuse. Quatre observations à travers la peau pendant 5 minutes sur animal anesthésié par voie gazeuse. Un seul prélèvement de sang (1 minute) sous une anesthésie gazeuse, sauf pour 40 animaux du projet où 7 prélèvements d’un tout petit volume de sang (1 minute) seront réalisés sur animal sous anesthésie gazeuse.

Impact sur les animaux

Les procédures seront réalisées chez des souris immunodéficientes qui constituent des lignées à phénotype dommageable, c’est-à-dire des lignées dans lesquelles l'état général des animaux est altéré s’ils sont exposés à des agents infectieux. Les effets indésirables attendus lors de l’étude sont une douleur et/ou une infection au niveau des points d’injections qui ne devraient pas s’étendre à plus de quelques heures après l’injection, une souffrance et/ou une nécrose occasionnée par le développement tumoral qui ne devraient pas s’étendre au-delà de 24 heures, une perte de sang lors de prélèvements et un stress dû aux manipulations des animaux pendant les procédures expérimentales qui ne dureront que quelques brèves minutes.

Devenir

L’étude de la biodistribution des molécules d’intérêt au sein des tissus tumoraux nécessite de prélever les organes des animaux qui doivent donc être euthanasiés. Il n’existe pas d’autre méthode d’imagerie qui permette d’étudier cette biodistribution sur des temps longs.

Remplacement

L’étude de la biodistribution des molécules au sein des tissus tumoraux nécessite de prélever les organes et il n’existe pas d’autre méthode d’imagerie qui le permette sur des temps aussi longs. La caractérisation de ces molécules au sein d’un organisme entier est donc nécessaire. De plus, nous avons opéré une pré-sélection chimique et pharmacologique in vitro de chacune des molécules innovantes analysées in vivo dans ce projet qui sont destinées au diagnostic et/ou au traitement de cancers chez l’Homme.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux : - Chaque procédure sera réalisée sur le plus petit nombre d’animaux par groupe déterminé via l’utilisation d’une application calculant les tailles d'échantillons nécessaires. - Les procédures ont pour but d’observer la distribution des molécules au sein de la tumeur. Les résultats seront considérés comme statistiquement significatifs à partir de 5 rongeurs par sexe et par groupe. - Une seule dose des molécules testées a été sélectionnée grâce à des analyses bibliographiques et des expériences in vitro. - Nous utilisons des modèles tumoraux qui ont déjà été décrits et mis au point par nos collègues chez la souris immunodéprimée ce qui permet de ne pas réaliser de tests de développement de tumeur chez des animaux supplémentaires.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe dans un milieu enrichi comprenant des maisons et des tunnels en carton, de la paille ou du mouchoirs en papier pour leur nid, et des bâtonnets en bois à ronger. Les animaux seront hébergés au minimum 7 jours à l’animalerie avant d’entrer en procédure. Une surveillance quotidienne des animaux est assurée par des personnes habilitées et formées. Pour réduire ou supprimer la douleur et le stress relatifs à l’injection unique de cellules tumorales et à l’injection unique de la molécule testée, ces deux injections seront réalisées pour chaque animal dans une pièce au calme sans passage et sous une anesthésie gazeuse. Un suivi attentif de l’évolution de la taille de la tumeur sera mené trois fois par semaine. Un suivi attentif de l’apparence de la tumeur sera aussi mené trois fois par semaine afin de déceler toute apparition d’une éventuelle nécrose. Les animaux seront observés attentivement trois fois par semaine. Des paramètres ont été définis permettant de prendre les décisions adéquates en cas de suspicion de douleur ou souffrance. Chaque animal sera sous une surveillance accrue durant les 24 heures après l’administration de la molécule afin de déceler tout comportement anormal ou tous signes éventuels de douleur ou souffrance. Tout animal présentant des signes de douleur ou souffrance sera euthanasié.

Choix des espèces

La souris est une espèce pertinente dans les études de biodistribution des molécules. Nous utiliserons des souris immunodéprimées, ce qui facilite l’implantation de cellules tumorales et le suivi dans la tumeur des molécules. Nous sélectionnerons des animaux adultes car les molécules testées dans ce projet sont destinées à des études cliniques chez des patients adultes.

3 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une administration unique du composé, puis jusqu'à six prélèvements sanguins en une semaine, sous anesthésie gazeuse. L'objectif est de mesurer comment un candidat médicament se répartit dans l'organisme, pour choisir la molécule et la dose qui passeront ensuite en clinique. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative" pour ce type d'étude et que les modélisations in silico ne sont "pas encore abouties".

Objectifs

Le projet a pour but d’évaluer la biodisponibilité de composés afin de sélectionner le meilleur candidat médicament, de définir les doses à administrer chez l’homme et la pharmaceutique optimale. Il fait suite à une première sélection de candidats médicament qui ont montrés leur efficacité sur des modèles vitro ou vivo

Bénéfices attendus

Ce projet permet d’étudier la biodisponibilité des candidats médicaments dans l’organisme vivant. Les données ainsi recueillies dans un contexte pré-clinique permettent de sélectionner les molécules candidates les plus prometteuses (selon leur profil pharmacocinétique et leur biodisponibilité) et d’identifier la forme pharmaceitique optimale avant de poursuivre vers les études cliniques. Les molécules étudiées sont à visée thérapeutique humaine ou vétérinaire (maladie d’Alzheimer, maladies cardiaques, diabète, ...).

Procédures

Les administrations sront réalisées sur animaux vigiles ou anesthésiés selon la voie utilisée. Les administrations sont réalisées en bolus (administration en une seule fois et inférieure à 30 secondes). Les animaux sont également soumis à des prélèvements sanguins répétés après application d’un analgésique si besoin et sous anesthésie. 6 prélèvements maximum sont réalisés par animal sur une semaine (la durée totale de l’intervention pour chaque prélèvement est d’environ 5 min : anesthésie + prélèvement) et sur un période allant de15 min à généralement 24h mais pouvant s’étendre jusqu’à 1 mois maximum

Impact sur les animaux

Les effets indésirables généralement observés sont principalement dus aux gestes expérimentaux, c’est à dire à l’administration du composé ou aux prélèvements sanguins. Pour les administrations on peut observer de l’inconfort ou une douleur locale au point d’injection. Pour les prélèvements répétés on peut observer un stress lié à la manipulation répétée des animaux, un inconfort, une douleur locale ou un hématome au point de prélèvement. Dans tous les cas l'inconfort ou le stress, si observé, sera de très courte durée, inférieur à 1 min. Les nuisances en lien avec les effets possibles des molécules testées sont rares. Néanmoins on pourrait observer les effets indésirables suivants : Signes de douleur sur la face, constrictions abdominales, posture modifiée, présence de sang dans les urines, modification de la consistance des selles, perte de poids, hypothermie, modification de la respiration. Si ces signes devaient néanmoins survenir ils seront de courte durée, inférieur à 1h.

Devenir

Les animaux utilisés étant des jeunes adultes entre 6 et 12 semaines, l’application d’une seconde procédure expérimentale ne peut pas être envisagée. A la suite du dernier prélèvement, l’animal est donc mis à mort.

Remplacement

L’étude de la biodisponibilité d’un candidat médicament est une étape importante et nécessaire dans le développement d’un médicament et il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour ce type d’étude. Des méthodologies de modélisation in silico sont en cours de recherche mais ne sont pas encore abouties et fiables pour apporter le même niveau d’information.

Réduction

Afin de calculer un minimum de statistiques descriptives (moyenne, écart-type et coefficient de variation) sur les données obtenues, un minimum de 3 animaux par conditions (molécule, voie d’administration, dose, formulation, temps de prélèvement) est nécessaire. L’expérimentation est définie pour prélever sur un même animal le volume minimum de sang nécessaire aux analyses tout en respectant les volumes de sang définis dans les textes règlementaires . Le nombre de prélèvement par animal est ainsi optimisé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux

Raffinement

Tout au long des expériences une observation de l’état clinique des souris est assurée. Les mesures de raffinement suivantes sont prises. Les animaux sont maintenus en groupe stable durant toute la période d’acclimatation et si possible pendant la procédure expérimentale. Afin de réduire le stress et la souffrance animale les administrations sont réalisées sous anesthésie gazeuse lorsque le geste technique ou le type d’administration le nécessite et les prélèvements sont réalisés sous analgésie et anesthésie gazeuse. Les souris à euthanasier sont placés dans une salle isolée du reste des animaux. Pour ce projet les études sont réalisées sur animaux sains. Aucune toxicité particulière n'est attendue sur les molécules testées. Des points limites adaptés sont définis et un arbre décisionnel basé sur ces points limites est établi. Des critères de diminution ou d’arrêt des souffrances sont mis en place.

Choix des espèces

Le modèle (rongeur) dans les études pré-cliniques précoces est le même modèle qui sera ensuite utilisé et requis dans le cadre d’études réglementaires de toxicocinétique. Le choix de la souris dépendra des données déjà disponibles dans la littérature et du modèle qui a été utilisé dans les précédentes études pré-cliniques et/ou qui sera requis selon les études réglementaires visées. Les animaux utilisés sont des jeunes adultes d’environ 6-12 semaines basé sur les recommandations des textes règlementaires et leur robustesse par rapport à des animaux plus âgés ou juvéniles. De plus l'utilisation d'animaux spécifiques de cette tranche d'âge permet la comparaison d'études différentes mais avec des molécules chimiquement proches en limitant le biais expérimental lié à l’âge.

164 lapins reçoivent une greffe de tumeur, implantée par chirurgie dans le foie ou injectée sous la peau du dos, de l'oreille ou de la glande mammaire, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La tumeur peut provoquer un inconfort pendant 42 jours, et une détection tardive de métastases pulmonaires peut s'accompagner de douleurs. Le porteur déclare vouloir développer la culture cellulaire pour cesser de produire cette lignée tumorale sur l'animal, tout en programmant l'usage de ces lapins sur cinq ans. Tous sont tués pour prélever et exploiter les tumeurs.

Objectifs

En 2023, plus de 400000 nouveaux cas de cancer ont été diagnostiqués. Les thérapies combinant différentes traitements ainsi que le développement de nouvelles technologies et techniques associées à la chirurgie se sont largement développées aux cours des dernières années. Il y a donc une nécessité urgente à disposer de modèles précliniques adaptés afin de pouvoir valider ces nouveaux traitements avant de les proposer aux patients. Les modèles in vitro et in vivo (rongeurs) ont leurs limites et il est primordial de pouvoir disposer de modèles moyen / gros animaux, notamment pour les dispositifs médicaux humains ne pouvant être utilisés sur des petites espèces. Parmi les animaux de taille moyenne notamment compatible avec un geste chirurgical tel qu’effectué chez l’Homme, le lapin est le seul modèle animal pour lequel un modèle tumoral est disponible: le cancer de la peau. Globalement, ce modèle permet de réaliser des tests de traitements et sa caractérisation permettra d’améliorer les pratiques lors de son utilisation. L’objectif de ce projet est la caractérisation de ce cancer permettant une standardisation. Cela permettra d’une part, un raffinement du modèle ainsi qu’une réduction à terme du nombre d’animaux utilisé notamment grace à des techniques alternatives comme la culture cellulaire en 3D. D’autre part, une meilleure connaissance du modèle permettra d’étendre les applications de recherche à différents types de cancer/traitement.

Bénéfices attendus

Les connaissances qui découleront de ce projet permettront d’aider aux développements de traitements contre le cancer par la mise au point de modèles fiables.

Procédures

Pour l’anesthésie générale, les animaux subiront deux fois une injection. Un rasage sera appliqué sur les zones d’implantation des greffes une fois. Sous anesthésie générale et antidouleur, certains animaux subiront une chirurgie (incision d’environ 3 cm) qui durera environ 30 minutes. Cette opération permettra la mise en place d’un fragment tumoral ou une suspension cellulaire dans le foie. Chez d’autres animaux, le fragment ou la suspension cellulaire sera injectée dans le foie à travers la peau (5 minutes). Enfin, d’autres animaux recevront l’injection de fragment ou suspension de cellules au niveau du dos ou de l’oreille ou de la glande mammaire sous la peau. Les lapins seront sortis de leur cage pour être pesés 2 fois par semaine sur six semaines maximums soit 18 fois maximum. Des mesures échographiques ou au pied à coulisse sur l’animal vigile sous contention seront réalisées au minimum une fois par semaine pour suivre l’évolution des tumeurs soit maximum 8 fois sur 6 semaines.

Impact sur les animaux

Les nuisances/effets indésirables sur l’animal sont principalement marqués par : - Une douleur modérée possible durant 1 à 2 jours après la chirurgie au niveau de la zone chirurgicale et au niveau des oreilles (pose de cathéter). - Un inconfort après la chirurgie (42 jours maximum) peut être généré par la présence de la tumeur sous la peau. - Dans l’éventualité d’une détection tardive de métastase, une douleur possible de l’animal peut avoir lieu sur quelques jours lors du développement de métastase (notamment pulmonaire). - Un stress de quelques minutes peut avoir lieu lors de la manipulation pour les anesthésies/injections/mesures des tumeurs et pesées.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort dans le but de prélever, étudier et exploiter les tumeurs.

Remplacement

Le lapin est le seul modèle moyen / gros animal présentant un modèle tumoral : le VX2 (carcinome épidermoïde) pouvant être compatible avec un geste chirurgical tel qu’effectué chez l’Homme ainsi que l’utilisation de dispositifs médicaux humains. Un des objectifs de ce projet est de développer la culture de cellules pour de ne plus à avoir utiliser l’animal pour produire la tumeur.

Réduction

Pour ce projet, le nombre d’animaux a été réduit au minimum pour permettre le maintien, la production et la caractérisation de tumeur VX2 au cours des 5 ans. Le nombre de 4 animaux par groupe va permettre d’obtenir des données suffisantes à l’avancée du projet (pertinence des techniques et sites d’implantation, du type de greffons). Les tests in vitro réalisés en amont et l’optimisation au fur et à mesure vont permettre une réduction d’une nombre de groupe. Toutes les conditions ne seront pas testées en memes temps ce qui permettra d’arrêter le projet dès qu’on obtient un bon développement de tumeur. D’autre part, il s’agit d’une étude descriptive visant à valider de nouvelles techniques sans nécessité de tests statistiques.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupes sociaux de 2 ou 4 lapins en concertation avec l’éleveur. Ils seront isolés sur la période post-chirurgie et seront remis ensemble lorsqu’il n’y aura aucun risque pour eux de s’abîmer la cicatrice. Les animaux sont habitués aux techniciens par des temps d’échanges et distribution de friandises. L’état des animaux est évalué par un scoring biquotidien en semaine et quotidien le week-end basé sur l’aspect de l’animal, le suivi de l’alimentation et de l’abreuvement.

Choix des espèces

Le lapin est le seul modèle animal non rongeur disposant d’un modèle tumoral fiable et reproductible. Des animaux au stade adulte (environ 12 semaines) seront utilisés. Ce stade permet d’avoir des animaux avec un système immunitaire peu mature (3-3,3kg) favorisant le développement d’une tumeur.

5 212 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Greffées de cellules leucémiques après un pré-conditionnement, elles reçoivent trois injections de chimiothérapie puis des composés pharmacologiques, et subissent des prélèvements de sang et de moelle osseuse sous anesthésie générale. Le porteur indique que l'injection de lignées cellulaires provoque un développement rapide de la maladie conduisant à la mort de l'animal, avec amaigrissement, paralysie et prostration, alors que la gravité déclarée pour l'ensemble du projet reste modérée. Il conclut que les modèles in vivo sont "indispensables" pour étudier la résistance aux chimiothérapies, tout en annonçant des modèles de moelle osseuse in vitro censés réduire "à terme" le recours aux souris.

Objectifs

Les leucémies sont les cancers du sang et de la moelle osseuse les plus courants chez l’adulte, mais leur pronostic reste défavorable malgré des taux initiaux élevés de rémission. Cela s’explique par la rechute fréquente due à la survie de cellules résistantes au traitement. Ce projet vise à élucider et exploiter les mécanismes sous-jacents à la résistance des cellules leucémiques pour surmonter les limitations des traitements actuels. Les expériences sont menées sur des modèles murins greffés avec des cellules leucémiques et soumis à des protocoles de chimiothérapie. Notre objectif est d’identifier les mécanismes de résistance des cellules leucémiques et de proposer à terme de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter plus efficacement ces pathologies.

Bénéfices attendus

Le projet pourrait offrir des bénéfices significatifs en termes de compréhension et de traitement des leucémies. Sur le plan scientifique, il permettra de décrypter les mécanismes moléculaires régissant la résistance aux traitements. D’un point de vue clinique, ces découvertes pourraient conduire au développement de stratégies thérapeutiques visant à améliorer les réponses aux chimiothérapies intensives, réduisant ainsi les risques de rechute. Enfin, sur le plan sociétal, ces avancées pourraient améliorer à terme les taux de survie et la qualité de vie des patients atteints de leucémie.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Injections : - Pré-conditionnement des animaux : une injection par animal, 24h avant injection des cellules. Durée : quelques secondes. Sur animaux vigiles. - Traitements par chimiothérapie : 3 injections Jours 1/3/5, durée : environ 1 minute. Sur animaux vigiles. - Composés pharmacologiques testés : leur fréquence d’administration sera déterminée selon la littérature , en respectant scrupuleusement les recommandations des volumes limites. Ce sont des procédures qui durent de quelques secondes à 1 minute. - Injection des cellules leucémiques : injection des cellules. Cette manipulation dure de quelques secondes à une minute. Sur animaux vigiles. Prélèvements : - Prélèvements sanguins. Cette procédure est réalisée alors que les souris sont anesthésiées. Durée : environ 1 minute. Le premier prélèvement sera effectué 8 semaines après injection des cellules, et ensuite toutes les 4 semaines si besoin. - Prélèvements de moelle osseuse (les prélèvements sont réalisés après anesthésie générale de la souris).

Impact sur les animaux

Les expériences utilisant des cellules de patients (ou dérivés) n’engendrent pas d’effets secondaires visibles sur les animaux. Les traitements par chimiothérapie ont été optimisés dans notre laboratoire, de manière à ne pas avoir d’effets toxiques visibles sur les animaux (pas de perte de poids, ni de modification du comportement, ni de mortalité). Par contre, l’utilisation de lignées cellulaires de leucémie injectées à des souris entraîne un développement rapide de la maladie qui conduit à la mort de l’animal. Les effets indésirables prévus sur les animaux incluent une détérioration rapide de l'état général des souris, en particulier lors de l'injection de lignées cellulaires, qui peuvent entraîner des effets notables sur le comportement et la santé des animaux. Aussi, dans le cadre des expériences utilisant ces cellules, les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel de la zootechnie et les expérimentateurs. Ces observations quotidiennes porteront sur des indicateurs précis : amaigrissement, paralysie, perte d’activité, prostration, deshydratation). Si un animal atteint un certain score de détérioration, l’expérience sera stoppée pour cet animal.

Devenir

Tous les animaux des procédures sont euthanasiés à la fin des expériences.

Remplacement

Pour respecter la règle des 3R, il est important de chercher à remplacer l’expérimentation animale. Cependant, afin d’étudier la résistance aux traitements dans les leucémies, des études sur des modèles animaux sont indispensables. Les modèles in vitro, bien qu’utiles pour une première compréhension des mécanismes, ne reproduisent pas fidèlement les interactions complexes entre la tumeur et son microenvironnement ni son évolution dans un organisme vivant. Par exemple, nous avons observé une absence de corrélation entre les réponses in vitro et in vivo à la chimiothérapie utilisée dans les leucémies, ce qui souligne l’importance des études in vivo. Ces dernières sont essentielles pour valider nos résultats et envisager leur application clinique chez l’homme. Néanmoins, afin de réduire l’utilisation d’anmiaux dans le futur, notre laboratoire est engagé dans le développement de modèles de moelle osseuse in vitro. Nous espérons que ceci nous permettra à terme de réduire à terme notre utilisation d’animaux en vue de les remplacer au moins partiellement par ces modèles in vitro.

Réduction

Les effectifs des cohortes seront définis à l'aide d'un logiciel de simulation, en s'appuyant sur des études précédentes et en utilisant des tests statistiques visant à optimiser et réduire le nombre d'animaux et d'échantillons nécessaires.

Raffinement

L'expérimentation inclut un suivi adapté du bien-être des animaux, tenant compte du modèle et des éventuels effets indésirables. Les animaux seront observés quotidiennement, et leur environnement enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer leur confort. Les protocoles viseront à minimiser le stress et la douleur en optimisant les injections et la durée des traitements. Les études précédentes ont aidé à mieux définir les points limites, et la majorité des procédures ont déjà été approuvées par un comité d'éthique pour l'expérimentation animale. Les souris utilisées dans ce projet (NSG) étant des animaux hautement immunodéprimés, ils sont maintenus dans un hébergement au statut sanitaire strict. Les cages sont disposées sur des portoirs ventilés et toute personne pénétrant dans les hégerment doit porter des équipements de protection individuelle (masque chirurgical, charlotte, surchaussures, combinaison, gants).

Choix des espèces

Le modèle souris est essentiel pour comprendre la biologie des cancers. Dans cette étude, nous utilisons des souris immunodéficientes, qui sont les modèles murins les plus utilisés à ce jour pour réaliser des greffes de cellules humaines leucémiques. Le développement de la maladie est relativement fidèle à celui retrouvé chez les patients atteints de leucémie. Les animaux utilisés sont des animaux adultes, les leucémies aiguës myéloïdes étant des cancers affectant préférentiellement les sujets adultes.

Une greffe de tumeur sous la peau puis huit injections dans l'abdomen : 40 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour les analyses histologiques et la mesure de la progression tumorale. Le développement de la tumeur peut entraîner une perte de poids. Il s'agit de tester un anticorps dirigé contre une protéine appelée LVRF sur des tumeurs de médulloblastome, cancer cérébral de l'enfant, l'effectif de chaque groupe étant calé pour obtenir 80 % de chances d'un résultat statistiquement significatif. Les souris appartiennent à des lignées immunodéficientes, retenues parce qu'elles laissent se développer des cellules humaines greffées, et le porteur affirme qu'aucun système ne reproduit aujourd'hui la complexité du médulloblastome hors de l'animal vivant.

Objectifs

L’objectif est de tester in vivo l'efficacité d’un anticorps (anti-LVRF) sur la progression de tumeurs de médulloblastome. La validation in vivo de l'efficacité de ce composé sur le développement de la tumeur pourrait permettre la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques contre les médulloblastomes.

Bénéfices attendus

Les médulloblastomes sont les tumeurs cérébrales malignes les plus fréquentes chez les enfants. Ils représentent 20% des tumeurs du système nerveux central chez l'enfant. Malgré les traitements standards (chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie), la plupart des patients récidivent. Le taux de survie à 5 ans varie de 80% à 50%. Il est donc important de proposer aux patients de nouveaux traitements médicamenteux pour améliorer le résultat clinique. La validation in vivo de l'efficacité d'un traitement ciblant la protéine LVRF permettrait la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques contre les médulloblastomes.

Procédures

Les 40 animaux recevront une greffe sous-cutanée de cellules tumorales de médulloblastome (une seule intervention de 1 minute environ). Chaque animal recevra également un total de 8 administrations par voie intra-péritonéale (30 secondes/administration).

Impact sur les animaux

La manipulation, contention des animaux, les injections de cellules, d'anesthésiques ou d'analgésiques sont générateurs de stress pour les animaux. Les injections entrainent également une douleur légère de courte durée. Le développement tumoral est susceptible d'entraîner une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés dans le cadre des études de survie, pour les analyses histologiques ou de progression tumorale.

Remplacement

L'efficacité thérapeutique de nouveaux médicaments sur la croissance tumorale des médulloblastomes nécessitent une approche expérimentale in vivo. En effet, il n’existe pas à ce jour de système suffisamment robuste pour mimer toute la complexité biologique et physiologique des médulloblastomes. Ce travail sur l'animal vivant s'inscrit dans la continuité d'expériences et de résultats que nous avons obtenu in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux prévu dans chaque groupe est basé sur un calcul d'effectif permettant de prédire que nous avons 80% de chance d’obtenir un résultat statistiquement significatif.

Raffinement

La détection de toute souffrance de l’animal sera assurée et le niveau de souffrance évalué en fonction d'une grille de score. En fonction des scores obtenus, il sera envisagé une analgésie ou l'euthanasie de l'animal. Pour le bien- être de l'animal, les souris seront logées selon les normes requises avec un enrichissement (copeaux de bois, dômes) et en groupes de 5 individus par cage afin d’éviter le stress de l’isolement. Les cages pourvues de couvercles filtrants seront disposées dans une armoire ventilée.

Choix des espèces

Le modèle murin est le plus adapté pour aborder les questions relatives aux tumeurs cérébrales. L'utilisation de lignées murines immunodéficientes permet la transplantation de cellules d'une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d'une espèce différente (souris). Les tumeurs de médulloblastome générées dans ce modèle animal sont particulièrement similaires aux tumeurs humaines. Les souris seront réceptionnées à l’animalerie à l’âge de 5 semaines et utilisées à l’âge de 6 semaines, en accord avec les protocoles décrits pour ces modèles physiopathologiques.

Une greffe de cellules tumorales directement dans le pancréas ou dans la rate, opération de dix minutes, ouvre le protocole pour chacune des 880 souris utilisées, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements terminaux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Suivent quatre semaines de traitement, à raison de deux injections intrapéritonéales par semaine, pour mesurer l'effet d'une chimiothérapie associée à un inhibiteur de la réparation de l'ADN sur des métastases hépatiques. L'efficacité de cette association a déjà été montrée in vitro et sur deux modèles murins de tumeurs sous-cutanées, ce qui n'empêche pas de recommencer en greffe orthotopique. Le porteur justifie l'effectif par une variabilité de prise de greffe qui impose des groupes de dix animaux, sans expliquer comment on passe de dix à 880.

Objectifs

Le cancer du pancréas est un cancer digestif diagnostiqué à un stade avancé avec un des plus mauvais pronostics, moins de 8% des patients survivent au-delà de 5 ans. Au moment du diagnostic, 80% des patients ont déjà des métastases, rendant la chirurgie impossible. Actuellement, très peu de thérapies sont proposées. De plus, ce cancer résiste à la chimiothérapie. Ces échecs peuvent être expliqués par les caractéristiques de la maladie ainsi que par le manque de biomarqueur permettant la sélection des patients traités. Pour augmenter les chances de survie des patients, de nouvelles thérapies plus ciblées sont en développement. C’est dans ce contexte que nous avons montré un très fort effet anti-cancéreux de l’association de médicaments existants avec ces nouvelles molécules ciblées. Il s’agit maintenant d’évaluer la thérapie in vivo.

Bénéfices attendus

Il a déjà été démontré in vitro l’efficacité de l’association d'un chimiothérapeutique avec un inhibiteur spécifique de la réparation des lésions de l'ADN, dans différents modèles de cancer du pancréas et ceci à de faible dose de drogue. Cette synergie a aussi été démontré dans 1 modèle de souris immuno-déprimé et 1 modèle de souris compétentes sur des tumeurs sous-cutanées. Il s'agit maintenant d'étudier à la fois l'efficacité du traitement sur le même modèle immunocompétent mais en greffe orthotopique, ainsi que sur les métastases hépatiques obtenus lors de greffe intrasplénique, et de mettre en évidence les mécanismes immunitaires impliqués dans la réponse.

Procédures

Tous les animaux subiront une procédure chirurgicale d'environ 10 minutes par animal. Les traitements se déroulent sur 4 semaines à raison de deux injections intrapéritonéales par semaine (d'une durée d'une trentaine de secondes environ).

Impact sur les animaux

Effets indésirables directs : - douleur associée à une injection intra péritonéale lors des traitements ou lors de l'implantation de cellules en intra-pancréatique. Effets indésirables indirects, conséquence des produits injectés : - croissance tumorale - perte de poids. Les nuisances qui pourront être engendrées par la croissance tumorale chez ces animaux seront parfaitement surveillées et maîtrisées afin de limiter toute souffrance animale. Concernant les traitements, de nombreuses études ayant déjà été élaborées, les doses administrées aux animaux sont maîtrisées et de ce fait aucun effet indésirable dû au traitement est attendu.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements terminaux.

Remplacement

Il n’existe pas encore de vrai modèle in vitro reproduisant la complexité de la tumeur et permettant de déterminer l'efficacité thérapeutique d'un traitement. En revanche on assiste à une transition des modèles cellulaires en 2 dimensions vers des modèles cellulaires en 3 dimensions, les organoïdes, qui reproduisent un peu plus fidèlement l’environnement humain in vivo. L’utilisation d’organoïdes est encore très complexe et ne permet pas encore de se passer d'expérimentation in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en conservant une puissance statistique suffisante pour le traitement du résultat. L’analyse statistique sera réalisée en collaboration avec une unité de biométrie. Les différentes analyses statistiques seront réalisées à l’aide d’un logiciel. D’après nos expériences précédentes et la littérature, la variabilité de prise de greffe nécessite des groupes de 10 animaux

Raffinement

La première mesure prise afin de limiter le stress chez nos animaux est une semaine de stabulation à leur arrivée sur la plateforme, ceci afin de les habituer à leurs nouvelles conditions d'hébergement. Le milieu est enrichi à l’aide de litière mélangée à des copeaux, ainsi que de briques de peuplier et dôme en plastique opaque. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Une grille de scoring ayant été établie, tous les soins nécessaires pour apaiser le stress ou la douleur seront mis en place, jusqu’à l’euthanasie si besoin.

Choix des espèces

L’étude de l’effet des thérapies des modèles possédant un système immunitaire demande l’utilisation de souris immunocompétentes greffées avec une tumeur murine. Age 6-7 semaines, âge ou l’on observe une forte incidence de prise de greffe et une forte homogénéité.

Tuées à la fin de chaque procédure, y compris celles dont la tumeur est jugée trop grosse, trop petite ou mal formée au moment de constituer les groupes, 7 920 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit que la présence d'une tumeur, même petite, exclut toute réutilisation, tout replacement et toute adoption. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau, trois injections de traitement et une de produit de contraste sur animal éveillé, jusqu'à six prises de sang réparties sur trois mois, des séances d'imagerie sous anesthésie et des mesures de tumeur deux à trois fois par semaine. Il s'agit d'occuper temporairement le foie avec une nanoparticule lipidique pour que les médicaments anticancéreux restent plus longtemps dans le sang, sans que la répartition de ces près de huit mille animaux soit détaillée.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’améliorer l’efficacité des traitements administrés par voie intraveineuse (IV) et de réduire leur toxicité périphérique en modifiant la biodistribution des agents thérapeutiques grâce à leur association à une nanoparticule lipidique. La biodisponibilité systémique des médicaments est essentielle à l’efficacité thérapeutique. Pour atteindre sa concentration maximale dans le tissu cible, comme la tumeur en oncologie, les médicaments doivent surmonter un obstacle biologique de taille : la clairance hépatique. Le rôle du foie est de filtrer le sang afin d’éliminer les composés toxiques, dont un grand nombre de médicaments. Ainsi, de nombreux candidats thérapeutiques prometteurs administrés par voie IV présentent une biodisponibilité faible ou suboptimale, qui se traduit par une accumulation faible ou nulle dans le tissu cible et par une toxicité hors cible potentiellement élevée. Par conséquent, si beaucoup de médicaments présentent un potentiel à l’échelle du laboratoire, la plupart n’ont pas d’avenir clinique. Afin de surmonter cet obstacle, une nanoparticule lipidique a été conçue pour augmenter de façon temporaire la biodisponibilité des thérapies administrées par voie IV et pour minimiser le risque d’effets en dehors de la cible. La nanoparticule lipidique utilisée dans ce projet, est destinée à occuper temporairement les voies hépatiques responsables de la clairance thérapeutique, afin de permettre à un médicament donné de plus fortement s’accumuler dans les tissus cibles pour augmenter son efficacité, tout en minimisant le risque de toxicité hépatique chez le patient. Dans ce projet, la pharmacodynamie, la biodisponibilité, l’innocuité, la biodistribution tumorale et l’efficacité anti-tumorale des compositions thérapeutiques (nanoparticule lipidique + agent thérapeutique) seront comparées à celles de l’agent thérapeutique seul. Le but est d’améliorer le ratio bénéfice – risque des médicaments.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront d’évaluer l’impact de la nanoparticule lipidique sur la biodistribution, l’efficacité et l’innocuité de plusieurs thérapies anti-cancéreuses. A court terme ce projet permettra de faire progresser les connaissances sur le design des nanomédecines. Il permettra d’optimiser les propriétés physico-chimiques des agents thérapeutiques et de cette nanoparticule lipidique pour obtenir un meilleur ratio bénéfice - risque des traitements associés. A plus long terme, cette nanoparticule pourrait permettre d'éliminer l'une des barrières biologiques majeures limitant l'accès à la clinique de certaines agents thérapeutiques prometteurs. De plus, en réglant le problème de la clairance dans le foie, il serait permis d’avoir une action plus efficace des médicaments déjà autorisés, et donc assurer de meilleurs résultats thérapeutiques pour les patients. Le cancer reste l'une des principales causes de morbidité et de mortalité à l'échelle mondiale. Selon les données les plus récentes, le cancer représente environ 1 décès sur 6 dans le monde. En 2020, environ 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués dans le monde, et 10 millions de personnes sont décédées des suites du cancer. Ce nombre est en constante augmentation et devrait continuer à croître dans les prochaines décennies, principalement en raison du vieillissement de la population mondiale et de l'adoption croissante de modes de vie associés à des facteurs de risque. Ainsi, développer une stratégie qui permet d’augmenter l’efficacité des thérapies administrées par voie IV offrirait de nouvelles perspectives aux patients.

Procédures

Trois injections d’agents thérapeutiques et une injection de réhausseur de contraste sont effectuées sur animaux éveillés (durée 1-4 min). Les souris sont également soumises à un exmaen d'imagerie médicale non invaif sous anesthésie générale (20-30 min). Au maximum 6 prélèvements de sang étalés sur 3 mois seront réalisés sur animaux vigiles (1-2 minutes par prélèvement). Une administration unique de cellules de cellules tumorales par voie sous-cutanée sera réalisée sur animaux éveillés (1-2 minutes). Une mesure de la taille de la tumeur sera réalisée sur animaux éveillés (1-2 minutes) 2 à 3 fois par semaine pendant maximum 3 mois.

Impact sur les animaux

Les injections ou prélèvements sanguins peuvent entrainer un léger inconfort transitoire et un bref stress. Dans certains cas, un hématome transitoire peut apparaitre à l’endroit de la ponction. Lors de la croissance des tumeurs, des blessures ou nécrose peuvent apparaître au niveau de la tumeur. L’anesthésie peut induire dans de très rares cas une dépression cardiorespiratoire de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes. Les animaux dont le volume tumoral ne correspondra pas aux prérequis seront mis à mort à la constitution des groupes d’animaux sélectionnés pour le traitement. Ils ne pourront pas être réutilisés car ils porteront une tumeur soit ne correspondant pas aux critères d’acceptabilité (nécrose/ulcération/bilobée/envahissant les tissus autour), soit déjà trop grosse pour l’étude avec un risque d’échappement thérapeutique, soit trop petite mais en cours de croissance. La présence d’une tumeur, même petite, exclut l’inclusion des animaux dans une autre étude, leur replacement ou leur adoption.

Remplacement

À ce jour, aucun modèle cellulaire existant ne permet de reproduire de manière exhaustive les caractéristiques complexes liées à la progression tumorale et aux interactions avec le système immunitaire. Parmi les modèles disponibles, les modèles de greffes de cellules tumorales se distinguent par leur pertinence scientifique et leur capacité à fournir des informations détaillées, ce qui explique leur utilisation extensive et leur documentation dans la littérature. Dans le cadre de ce projet, où l’un des principaux objectifs est d’évaluer l’efficacité de traitements innovants sur la croissance tumorale, le choix du modèle de souris greffées s’avère essentiel et incontournable. Ce modèle offre un environnement expérimental qui permet d'étudier à la fois les mécanismes d'action des nanoparticules lipidiques ainsi que leurs effets sur la dynamique tumorale. L’utilisation de souris est également essentielle pour explorer les mécanismes de biodisponibilité, de métabolisation, de pharmacodynamie, de tolérance des agents thérapeutiques testés, ainsi que leur distribution tumorale fournissant des données cruciales sur leur comportement in vivo et leur potentiel thérapeutique. Seuls les agents thérapeutiques ayant montré une innocuité et une bonne biodistribution seront testées dans les modèles d’efficacité.

Réduction

Pour minimiser le recours aux animaux dans les procédures expérimentales, les agents thérapeutiques candidats sont d'abord testées in vitro afin de ne retenir que ceux ne présentant aucune toxicité cellulaire. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé pour garantir une analyse statistique pertinente des résultats. Par ailleurs, certaines nanoparticules lipidiques peuvent être couplées à des molécules fluorescentes ou bioluminescentes, permettant un suivi longitudinal de leur biodistribution par imagerie in vivo. Un animal peut ainsi être étudié au cours du temps. Cette approche réduit la nécessité de mettre à mort des animaux à différentes étapes intermédiaires de l’étude.

Raffinement

Pour réduire le stress des animaux, une période d’acclimatation d’au moins 5 jours sera respectée. Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées, avec un environnement contrôlé (hygrométrie, température, renouvellement d’air, cycle jour/nuit) et relié à un système d’alarme. Les animaux sont cinq par cage, et les groupes constitués pendant l’acclimatation seront autant que possible maintenus tout au long de l’étude. Un enrichissement adapté à l’espèce sera fourni dans toutes les cages, depuis l’arrivée des animaux jusqu’à la fin de l’étude (ex. : maisons en carton, coton). Les animaux et leurs conditions d’hébergement seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié. Un vétérinaire sera présent à l’animalerie plusieurs jours par semaine, et des soins vétérinaires d’urgence seront disponibles en dehors des horaires classiques, y compris les week-ends et jours fériés. Des points limites ont été définis et seront appliqués.

Choix des espèces

Les souris greffées avec des cellules cancéreuses murines ou humaines sont les modèles de référence pour l’étude des traitements dans la recherche en oncologie. La souris est l’espèce la plus documentée dans la littérature pour des modèles de greffes tumorales. C’est une espèce qui permet d’obtenir des résultats satisfaisants et reproductibles, d’où son intérêt pour ce projet. Les souris utilisées dans ce projet seront à un stade adulte afin d’évaluer l’efficacité des agents thérapeutiques sur des animaux ayant un système immunitaire et des organes matures et développés.

La douleur est évaluée une fois par semaine, des points limites devant entraîner la mise à mort des souris qui se dégradent. 1 231 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse de leurs organes. Une chirurgie sous anesthésie générale implante des cellules tumorales dans le pancréas, puis viennent des échographies hebdomadaires sous anesthésie, une à deux séances de champs électriques pulsés par semaine et des injections dans la tumeur ou dans l'abdomen, chaque animal portant une électrode et son connecteur. L'objectif déclaré est de rendre l'environnement dense de la tumeur perméable à la chimiothérapie, les essais chez des personnes atteintes d'un cancer du pancréas étant renvoyés à plus tard.

Objectifs

Le cancer du pancréas est une maladie grave avec près de 100% de décès dans les 5 années suivant le diagnostic à cause d’un environnement tumoral dense empêchant la chimiothérapie d’atteindre sa cible, et d’une résistance à l’action du système immunitaire. Ainsi modifier cet environnement tumoral pour le rendre moins dense permettrait à la chimiothérapie et aux autres traitements d’être plus efficace. L’objectif de l’étude est d’observer si l’utilisation d’une thérapie par champ électrique pulsé permet de modifier l'environnement tumoral dans des zones précises, sans impacter les tissus sains, en rendant les cellules tumorales plus perméables à la chimiothérapie et plus sensible à l’action du système immunitaire et ainsi améliorer l’efficacité des traitements existants. Ce projet est multi-site, l'implantation de tumeurs dans le pancréas se faisant dans l'animalerie 1, les examens et la suite du projet sont réalisés dans l'animalerie 2.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de valider le traitement par champ électrique pulsé et réversible ainsi que les conditions de son utilisation pour envisager des essais thérapeutiques ultérieurs chez des patients atteints de cancer du pancréas.

Procédures

Intervention chirurgicale sous anesthésie générale (15 min maximum/souris) pour l’implantation des cellules tumorales. Alternativement, injection sous-cutanée de cellules tumorales (15 sec/souris). Suivi hebdomadaire de croissance tumorale par échographie sous anesthésie (8 min/souris). 1 à 2 traitements par champs électrique pulsé et réversible une fois par semaine (3 min/souris). Pour certains animaux, injection intrapéritonéale de traitement (10 sec/souris, 1 à 2 fois par semaine) ou injection intratumorale de traitement (10 sec/souris, 1 à 2 fois par semaine). Mesures de certains paramètres par injection intra-abdominale ou injection intraveineuse (20 min/souris, sous anesthésie générale), suite à une injection sous-cutanée d’antalgique 30 min avant (10 sec/souris).

Impact sur les animaux

La croissance des tumeurs dans le pancréas peut entrainer une perte de poids et des signes de souffrance. La chirurgie du pancréas induit une douleur liée au geste chirurgical. L’injection sous-cutanée de cellules tumorales cause une douleur modérée et un stress. Le suivi de la croissance tumorale hebdomadaire sous anesthésie peut causer du stress chez la souris. Les traitements par champs électrique peuvent causer un stress chez les animaux et des douleurs modérées. Les injections sous-cutanées pour soulager la douleur ou intrapéritonéales et intratumorales pour le traitement peuvent causer une douleur légère chez la souris. Les injections intrapéritonéales pour la réalisation de mesures invasives peuvent causer des douleurs et un stress pour les animaux. Le transport entre les animaleries 1 et 2 peut provoquer un stress léger. La présence de l'électrode et connecteur peuvent causer un inconfort léger chez la spuris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, pour analyses ex vivo des organes.

Remplacement

Des études in vitro ont été réalisées pour déterminer les réglages à utiliser pour les champs électriques pulsés et réversibles et documenter leur impact couplé à la chimiothérapie dans des modèles de culture cellulaire. Toutefois ces techniques ne peuvent représenter correctement la physiologie du développement tumoral permise par un modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit à ce qui est nécessaire pour être significatif à l'aide de test statistiques adaptés. Des outils d’imagerie non invasive seront utilisés pour suivre le développement tumoral, évitant des mises à mort séquentielles et limitant le degré de souffrance des souris, les tumeurs étant détectées très tôt.

Raffinement

Le suivi de la douleur sera réalisé une fois par semaine et des points limites clairs ont été définis, entrainant la mise à mort de l’animal si nécessaire. Un suivi est prévu toutes les semaines en post opératoire et après injection des traitements. L’échographie sera réalisée sous anesthésie générale, à celle-ci on ajoutera une analgésie adaptée lors de la chirurgie et des traitements et mesures. Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des cages disposant d’enrichissement. Le transfert des souris de deux établissements est réalisé dans des boites de transport simples car ces deux animaleries étant localisées dans le même bâtiment au même étage. Les animaux ne restent pas plus de 30 minutes en boites de transport et ne sortent pas à l’extérieur.

Choix des espèces

La souris est un bon modèle permettant de mimer les tumeurs du pancréas humaines. Les souris seront utilisées à partir de l’âge adulte (8 à 10 semaines) afin de documenter l’impact des traitements sur un organisme mature.