Cancers

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une injection de cellules cancéreuses sous la peau leur fait développer une tumeur des voies biliaires, puis elles reçoivent un anticorps par injection chaque semaine et un composé par gavage chaque jour pendant six semaines. Le porteur indique que la tumeur peut s'ulcérer, ce qui entraîne une douleur moyenne au long terme, et que le gavage irrite l'œsophage au point de gêner la prise de nourriture. Il écrit que l'approche a déjà été validée in vitro et sur des tissus de patients, et qu'elle exige maintenant une validation sur "animal entier", au nom d'un "besoin urgent" de traitements contre ce cancer.

Objectifs

Ce projet vise trois objectifs principaux. Le premier est de comprendre le rôle d'une protéine particulière dans un cancer du foie appelé cholangiocarcinome (CCA), un cancer agressif qui se développe à partir des cellules des voies biliaires. Le deuxième objectif est d'étudier comment un anticorps, spécialement conçu pour cibler cette protéine, agit contre ce cancer. Enfin, le troisième objectif est de voir si cet anticorps, utilisé en combinaison avec d'autres traitements, peut améliorer les résultats chez les patients atteints de ce cancer. Le cholangiocarcinome est un cancer très agressif avec peu d'options de traitement efficaces, ce qui rend la recherche de nouvelles thérapies cruciale. Notre protéine d'intérêt, située à la surface des cellules, est impliquée dans plusieurs types de cancers, dont celui du foie. Des études chez la souris ont montré que lorsque cette protéine est surexprimée, elle favorise la croissance des tumeurs et réduit la survie, ce qui indique qu'elle joue un rôle important dans le développement du CCA. Nous avons également mis au point un anticorps capable de reconnaître spécifiquement cette protéine et de ralentir la croissance des cellules cancéreuses humaines transplantées chez des souris. Le but du projet est de confirmer l'importance de cette protéine en observant si sa présence ou absence dans des lignées cellulaires affecte la croissance des tumeurs. Nous allons aussi étudier comment cet anticorps fonctionne en suivant l'effet du traitement sur la croissance tumorale à différents stades. De plus, nous testerons si la combinaison de cet anticorps avec d'autres traitements, ciblant des voies de signalisation spécifiques, offre de meilleurs résultats que l'anticorps seul. Ces études seront menées sur des souris pour créer des modèles de cancer réalistes et évaluer les différentes approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Notre étude vise à valider le rôle pro-tumorigène d’une protéine dans le contexte du cholangiocarcinome. Elle vise aussi à étudier le mécanisme d’action d’anticorps ciblant cette protéine, ainsi que l’efficacité d’une combinaison de cet anticorps avec des inhibiteurs ciblant des voies de signalisation fortement activées dans le contexte du CCA. Certains anticorps ciblant la protéine d’intérêt sont déjà admis par le Food and Drug Administration (FDA) pour un essai clinique de phase I en cours de réalisation dans le cadre du traitement des cancer de la tête et du cou. Nous sommes convaincus que le ciblage de cette protéine par cet anticorps peut avoir un intérêt thérapeutique pour le traitement du cholangiocarcinome. A noter qu’il existe un besoin urgent de nouveaux traitements novateurs contre le CCA vu que le taux de survie est bas et les options de traitement offertes sont très limitées. De plus, dans la plupart des cas, le cancer des voies biliaires est généralement diagnostiqué au stade 4, lorsqu’une intervention chirurgicale n’est plus une option et qu’une chimiothérapie peut prolonger la durée de la vie, mais en réduisant beaucoup la qualité de celle-ci. Cette étude doit permettre de faire un nouveau pas vers le développement clinique de nouvelles thérapies et ainsi contribuer à améliorer la prise en charge des patients à l’avenir.

Procédures

Les animaux de ce projet seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Les animaux recevront des traitements 1 fois par semaine pendant 6 semaines maximum par injection réalisée sur animaux anesthésies (par suite de la mesure des tumeurs) et prend moins d’une minute à être réalisée. Les animaux recevront également un traitement oral par un composé quotidiennement pendant 6 semaines (gavage). Les traitements sont réalisés sur animaux vigiles et prend moins d’une minute à être réalisé. Les animaux de ce projet seront soumis à des mesures de tumeurs à l’aide d’un pied de coulisse qui seraient réalisées en environ 1 minute. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Pour les procédures 2-6, la manipulation et la contention peut engendrer un stress physique de courte durée lors de la manipulation. Pour les procédures 2-6, la croissance de la tumeur peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée, ce qui peut engendrer une douleur moyenne au long terme. Pour les procédures 5 et 6, le gavage peut entrainer principalement une irritation/inflammation de l’œsophage avec pour conséquence un inconfort de la souris pour se nourrir au moyen terme et donc une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs, foies) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. L’anesthésie va être utilisée pour les gestes invasifs.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines minimum. Il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement.

Greffées d'une tumeur sous la peau en état vigile, mesurées trois fois par semaine, traitées par injection dans la veine de la queue puis mises à mort quand la tumeur atteint 1 500 mm3 ou se nécrose, 4 644 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie est immunodéprimée pour éviter le rejet des cellules tumorales humaines. Le porteur affirme que les preuves d'efficacité hors organisme vivant ont déjà été obtenues et qu'aucune alternative ne peut se substituer à la souris, les candidats médicaments visant une cible commune à la souris et à l'être humain. 928 souris sont réutilisées dans une autre procédure, et celles qui n'entrent pas en protocole sont réformées pour l'entraînement aux gestes techniques avant d'être tuées.

Objectifs

Ce projet dans son ensemble consite à développer et analyser l'efficacité de nouvelles thérapies "ciblées" à visée thérapeutique humaine de type conjugué-drogue-anticorps (ADC). Ces thérapies de rupture permettent de cibler spécifiquement les cancers habituellement de très mauvais pronostiques, tout en diminuant drastiquement les effets secondaires. Elle représentent ainsi l’un des meilleurs espoirs depuis l’avènement des immunothérapies anticancéreuses. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats d’efficacité permettront de désigner le meilleur candidat ainsi que sa dose minimale efficace et les meilleures fréquences d’administration. Ce projet est articulé en trois procédures consécutives et dépendantes les unes des autres : # La Procédure-1 permettra mettre au point différents modèles tumoraux d’intérêt (tumeur/ souris) et d’effectuer un premier tri parmi ceux-ci. # La procédure-2 consiste en une étude Pilote d’efficacité antitumorale en utilisant un/des médicament/s contrôle de référence sur les meilleurs modèles de procédure-1. # La Procédure-3 permettra de déterminer quels sont les meilleurs candidats médicaments, ainsi que leur dose et fréquences d’injections optimales en utilisant le/les meilleurs modèles sélectionnés dans les Procédures 1 et 2.

Bénéfices attendus

Ce projet dans son ensemble consite à développer et analyser l'efficacité de nouvelles thérapies "ciblées" à visée thérapeutique humaine de type conjugué-drogue-anticorps (ADC). Ces thérapies de rupture permettent de cibler spécifiquement les cancers habituellement de très mauvais pronostiques, tout en diminuant drastiquement les effets secondaires. Elle représentent ainsi l’un des meilleurs espoirs depuis l’avènement des immunothérapies anticancéreuses. Les données d’efficacité (combinées avec les données de tolérance), permettent de choisir les candidat médicaments ayant la meilleur fenêtre thérapeutique chez les patients (c'est à dire la meilleur efficacité pour le moins d'effets indésirables). Ainsi, ces études permettront de définir quels seront les meilleurs candidats médicaments contre les cancers ciblés et de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser lors des premières études cliniques chez l’Homme. La première et la seconde procédure permettront de sélectionner et caractériser le/les meilleurs modèles tumoraux. La troisième procédure permettra de déterminer quels sont les meilleurs candidats médicaments, ainsi que leur dose et fréquences d’injections optimales (en vue d’une phase clinique chez l’Homme), en utilisant le/les modèles sélectionnés dans les procédures précédentes.

Procédures

# Greffe tumorale sur souris vigile en sous-cutané (2-3 minutes). # Les prises de mesure seront effectuées trois fois par semaine et quotidiennement en cas d'approche des points limites. # Traitement des animaux par les différents médicaments par voie intraveineuse sur souris vigiles (2-3 minutes). # Les animaux atteignant les points limites ou en fin d’expérience seront mis à mort.

Impact sur les animaux

# Les animaux subiront un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : change, pesée, contention et anesthésie. # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors : (1) de la greffe tumorale sur animal vigile par injection souscutanée ainsi que lors (2) de l’injection par intraveineuse dans la veine de la queue sur souris vigiles des candidats médicaments. # Pour les groupes traités, une diminution de la croissance tumorale est attendue.

Devenir

Pour chacune des trois procédures: Tous les animaux ayant atteint les points limites ou en fin d’étude seront euthanasiés. De même, les souris non entrées en protocole seront réformés pour l’entrainement aux gestes techniques avant d’être mises à mort. La Structure Bien Etre Animal (SBEA), assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.

Remplacement

Les preuves de concept d’efficacité de ces candidats médicaments anticancéreux hors organisme vivant (dits in- vitro et ex-vivo), ont déjà été effectuées avec succès. A présent, seul un modèle physiologique complexe (organisme vivant) est nécessaire pour permettre de poser les bases d’une étude clinique afin d’obtenir des résultats représentatifs en terme de doses et de fréquences. De plus, les candidats médicaments étudiés dans ce projet étant cross-réactif (cible anticancéreuse comparables entre l’Homme et la Souris), aucune alternative ne peux se substituer à un modèle Souris.

Réduction

La procédure-1 et 2 permettent de mettre au point les modèles, de les caractériser au mieux et de diminuer les nombres d'animaux utilisés en procédure-3. Elles sont toutes deux effectuées sur un nombre limité d’animaux (sans toutefois mettre en péril l’interprétation des résultats). En effet, seul(s) le(s) modèle(s) ayant donné satisfaction lors des procédures 1 et 2 seront utilisés pour la procédure-3 avec un nombre d'animaux optimisé par rapport à chaque modèle. Par ailleurs dans les procédures 2 et 3, le fait de tester une dose en injection unique ou répétée une à deux fois en fonction des résultats obtenus au fil de l’eau, permet de diminuer drastiquement le nombre de groupes utilisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (coton pour nidification, tunnels, bâtons à ronger).Il est à noter que les enrichissements de type nid ou rouleaux en cartons seront proscris à partir de la greffe tumorale afin d'éviter toute plaie sur les tumeurs et seront compensés par une augmentation des quantités de balles de coton et de bâtons à ronger. Avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées (période de stabulation) pendant une période d’une semaine afin de limiter leur stress. Une surveillance comportementale et physiologique poussée des animaux ainsi que la définition d’une grille de score adaptée et suffisamment prédictive permettra d’anticiper et éviter au mieux toute souffrance animale. La surveillance des animaux sera quotidienne et les prises de mesure effectuées trois fois par semaine avec une analyse scorée des critères physiques et comportementaux, du poids corporel et du volume tumoral et de la qualité de la tumeur (homogénéité, permettant la mobilité de l’animal…). Le point limite du volume tumoral sera de 1500mm3. La nécrose ou la gêne à la mobilité due à la tumeur constitueront également des points limites. Un système de surveillance est mis en place au sein de l'Etablissement Utilisateur pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue le weekend et les jours fériés. Les animaux inclus dans la grille de score mais n’atteignant pas les critères éthiques de mise à mort recevront des soins conservateurs adaptés (alimentation et abreuvement facilités, réchauffement, isolement...). Les souris atteignant les points limites ou en fin d’expérience seront mises à mort. Les souris non entrées en protocole seront réformées pour entraiment des gestes techniques avant d’être mises à mort. La Structure Bien-Etre Animal (SBEA) assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.

Choix des espèces

# S’agissant d’analyses d’efficacité in-vivo par voie intraveineuse, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. Pour les modèles modèles de tumeurs humaines, des animaux immunodéprimés sont nécessaires afin d’éviter tout rejet des cellules humaines par le système immunitaire. Dans le cas des tumeurs de souris, l’utilisation de la souches consanguine dont sont issues les cellules cancéreuses est indispensable. # La souris est une espèce animale à la fois petite et parfaitement caractérisée pour ces études (avec des données permettant de transposer les résultats chez l’Homme). En plus, les données de tolérances et de pharmacologie seront générées sur cette même espèce animale afin de déterminer au mieux la fenêtre thérapeutique de ces candidats médicaments. # Les animaux seront livrés entre 7 et 8 semaines de développement et inclus en expérience entre 8 et 9 semaines (après 7 jours d’acclimatation dans l’établissement utilisateur). A cet âge-là, les animaux sont adultes avec des organes matures permettant leur comparaison avec les patients humains. Pour les animaux non-immunodéprimés, leur système immunitaire sera complètement mature et adulte. # Il est à noter que le phénotype « immunodéprimé » ne sera pas un phénotype dommageable dans nos condition d’hébergement et d’expérimentation (statut sanitaire sans pathogènes ni opportunistes et expérimentation en condition stérile).

Gavées ou injectées deux fois par jour, cinq jours par semaine pendant un mois, puis rasées et épilées à la cire sous anesthésie, 148 souris porteuses de neurofibromes cutanés vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont isolées pendant toute la durée du traitement, ce que le porteur reconnaît comme une source de stress à gérer. Il écrit par ailleurs qu'aucune des procédures n'est douloureuse et que les tumeurs de son modèle sont plates, petites et indolores, tout en décrivant des irritations cutanées après l'épilation et des douleurs ponctuelles aux sites d'injection. Quatre des cinq composés testés l'ont déjà été sur le même modèle lors d'une étude précédente, et la peau du dos de chaque souris est prélevée après la mise à mort.

Objectifs

La neurofibromatose de type I est une maladie génétique qui touche environ 1 million des personnes dans le monde. Elle se caractérise par l'apparition de tumeurs bénignes appelées neurofibromes cutanés et dont le nombre peux atteindre des milliers. Ces tumeurs, en plus d’être esthétiquement dommageables, peuvent causer des démangeaisons et des douleurs impactant sévèrement sur la qualité de vie du patient. Nous avons conçu le modèle murin de NF1 (Nf1-KO) qui recapitule le développement des NFc. Ce modèle est utilisé pour décoder les mécanismes qui gouvernent le développement des NFc et pour l’élaboration des pharmacothérapies pour leur traitement. L'objectif de ce projet est de tester l'efficacité de 5 composés à prévenir ou faire régresser les NFc dans ce modèle. 4 d’entre elles ont déjà été testé lors de l’étude précédente au moyen du même modèle. Les nouveaux essais avec des molécules utilisées précédemment visent à renforcer les résultats précédents, décoder leurs mécanismes d’action sur les cellules tumorales et le microenvironnement tumoral et d’évaluer leur efficacité pour prévenir le développement des NFc. L’efficacité du nouveau composé sera testée en utilisant le protocole curatif pour faire régresser les NFc déjà présents et matures. Les 4 procédures respectent des règles éthiques strictes pour garantir le bien-être des animaux, et l'étude a été validée par des comités scientifique de pilotage de ces projets.

Bénéfices attendus

Aujourd'hui, il n'existe aucun traitement efficace pour prévenir ou faire régresser ces tumeurs chez les patients NF1. La seule option consiste en leur exérèse chirurgicale, procédure utilisée quand le nombre des NFc est réduit. Ce projet vise à (i) évaluer l’efficacité de nouveaux composés, puis de comparer les résultats avec ceux obtenus avec d’autres molécules, (ii) décoder leur mécanismes d’action sur des cellules tumorales et leur environnement, (iii) identifier des éventuels effets indésirables et (iv) explorer les synergies entre les composées dans des cas d’utilisation des combinaisons des composés.

Procédures

Nous allons administrer des molécules en intrapéritonéales ou par gavage deux fois par jour sur 5 jours, pendant un mois. Cette procédure ne nécessite pas l'anesthésie des animaux. Il faut environ 1 min de contention par animal pour réaliser les administrations. Le rasage, épilation et la prise de photo de la peau du dos des souris se feront sous anesthésie générale pour une durée inférieur à 5 min par souris. Cette étape sera réalisée deux fois (avant et après le traitement), afin de pouvoir évaluer l’efficacité des molécules.

Impact sur les animaux

Les NFc présents dans notre modèle murin sont indolores, plates et de petite taille. Les travaux récents révèlent que chez les patients NF1, les NFc sont moins sensibles aux stimuli thermiques et mécaniques que la région adjacente dépourvu des tumeurs. Nous n’avons observé aucun phénotype dommageable chez des souris mutantes avant l’âge de 1 an. Malgré, l’aspect asymptomatique nous sommes à l’écoute du bien-être animal. Toutefois, des nuisances liées au stress des manipulations, aux contentions répétées des souris, à l’anesthésie générale sont également à prendre en compte. De plus certains des animaux seront traités par injection pendant 28 jours qui peut induire une douleur légère ponctuelle et locale au site d'injection. L’épilation à la cire avant et après le traitement (28 jours d'intervalles) peut également induire une légère irritation de la peau pendant quelques minutes et enfin, lorsque les souris seront gardées isolées durant la durée du traitement la gestion du stress est à prévoir.

Devenir

Pour l’ensemble des procédures décrites dans le projet, tous les animaux seront mis à mort à la fin des traitements, afin d’évaluer l’efficacité des molécules à faire régresser la croissance des tumeurs cutanées. Pour cela la peau du dos de chaque souris sera prélevée en vue de faire une analyse cellulaire et moléculaire et seront comparées au groupe contrôle qui n’a pas reçu les molécules.

Remplacement

A notre connaissance, il n’existe aucun autre modèle animal, ni système in vitro, récapitulant le développement des NFc. Tous les précédents essais pharmacologiques ont été réalisé avec le même modèle animal et en utilisant la même procédure expérimentale nous permettant de comparer l’efficacité des composés entre eux.

Réduction

L’expertise acquise lors de précédents études nous ont permis d’optimiser et standardiser la procédure de traitement, de suivi et d’analyse post mortem des animaux réduisant ainsi considérablement le nombre d'animaux.

Raffinement

Aucune des procédures utilisées pour l’administration des molécules et suivi des animaux n’est douloureuse et ne nécessite l’utilisation des traitements anti-douleurs. Lors des épilations à la cire, les souris seront anesthésiées, rasées, épilées à l'aide de petites bandes de cire froide, puis de la vaseline sera appliquée sur la zone épilée pour réduire les irritations et rougeurs. Contrairement aux patients NF1, les souris Nf1- KO développent des NFc dont l’aspect est plat et la taille est réduite sans phénotype dommageable. Lors de l’anesthésie générale, pour éviter l’hypothermie, les souris seront maintenues sur un tapis chauffant. Leurs yeux seront également enduits d’une crème ophtalmique afin de prévenir un dessèchement de la cornée. Le personnel de l’animalerie a mis en place des conditions d'hébergement optimales et des stratégies de raffinement rigoureuses pour améliorer le bien-être des souris. Nous fournissons également des enrichissements environnementaux, pour favoriser les comportements naturels et réduire le stress. Lors des précédentes études nous n’avons observé aucun effet indésirable sur la perte du poids et le comportement des animaux. Néanmoins, les souris sont surveillées en se basant sur une grille d’évaluation du bien-être animal, avec l’utilisation de point limite, nous permettant en cas de signe persistant de plus de 24h de décider de l’arrêt du traitement avec la mise à mort des animaux. Enfin le personnel de l’animalerie nous informe quotidiennement et lors de leur visite les weekends de l’état de santé des souris.

Choix des espèces

Nous avons conçu un modèle murin de la Neurofibromatose de type 1 qui recapitule le développement des NFc. A notre connaissance, il n’existe aucun autre modèle animal, ni système in vitro, permettant d’étudier ces tumeurs et de réaliser des tests pharmacologiques. Pour ce projet nous utiliserons deux stades de développement des NFc en utilisant d'une part des males âgés d’un mois et demi (P45) pour les traitements préventifs correspondant à la phase de croissance et d'autre part en utilisant des mâles âgés 6 mois pour les traitements curatifs correspondant à la phase de stabilisation des NFc.

Toutes tuées à la fin des procédures pour éviter la dissémination d'organismes génétiquement modifiés, 2 770 souris transgéniques sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut recevoir une greffe de cellules leucémiques, des injections antitumorales deux fois par semaine pendant quatre semaines, un gavage quotidien sur la même durée, jusqu'à douze prélèvements sanguins et trois prélèvements de moelle osseuse. Une partie est irradiée avant greffe, ce que le porteur qualifie d'affaiblissement modéré et transitoire, les animaux à pathologie avancée perdant du poids et s'affaiblissant jusqu'à l'arrêt de la procédure. Sur le remplacement, il conclut que le modèle murin est "incontournable", notamment parce que les lignées cellulaires cultivées divergent des échantillons de patients.

Objectifs

Les leucémies aiguës myéloblastiques sont des cancers des cellules sanguines, dont le pronostic s’est peu amélioré au cours des 25 dernières années. Les taux de rechute et de survie sont respectivement d’environ 45% et 65%. Les mutations sur lesquelles nous travaillons restent de très mauvais pronostic. Dans l'ensemble, l'objectif de ce projet est d'améliorer la compréhension du développement, de l’évolution et de la rechute des leucémie aigues myéloïdes et d'identifier les mécanismes impliqués dans la leucémogenèse et la résistance aux traitements permettant d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de leucémies agressives. Nos résultats précédents indiquent que le stade développemental (ex: fœtal, nouveau-né ou adulte) dans lequel ces altérations surviennent est important. Nos analyses moléculaires suggèrent que des mécanismes induits par ces fusions et des mécanismes de coopération entre différentes mutations sont importants pour les cellules leucémiques. Il est donc indispensable de développer des modèles physiologiques prenant en compte le stade du développement pour comprendre les mécanismes de la transformation leucémique et tester leurs rôles dans l'initiation ou le maintien des tumeurs. A ce jour, l'étude de l'inactivation de certains gènes in vivo, ainsi que le rôle chez l'animal entier ne peuvent pas encore être complètement remplacés par les modèles sophistiqués de remplacement. L’objectif de nos études est de caractériser les mécanismes mis en jeu dans les leucémies à mauvais pronostic et de tester l'efficacité de nouvelles approches thérapeutiques, dans le contexte d’un organisme entier.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est d'améliorer la compréhension du développement, de l’évolution et de la rechute des leucémie aigues myéloïdes et d'identifier les mécanismes impliqués dans la leucémogenèse et la résistance aux traitements permettant d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de leucémies agressives. Spécifiquement, nous attendons du projet qu'il permette à court terme: -De caractériser les mécanismes impliqués dans le développement leucémique, le maintien leucémique, la rechute et la résistance aux traitements. -D'identifier la trajectoire de transformation entre une cellule normale et une cellule leucémique afin de caractériser les spécificités des cellules leucémiques exprimant différents oncogènes. -D’évaluer l’effet de l’inflammation dans le développement et la propagation leucémique. -A plus long terme, nous visons l'identification de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de ces leucémies.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: -Injection de cellules: les injections sont ponctuelles (une fois par animal). Chaque injection prend entre quelques secondes et 3 à 5 minutes en fonction de la voie d'injection. -Injection de molécules: injections dans le cadre de tests de traitements anti-tumoraux et pourront être biheddomadaires sur une durée de 4 semaines. Chaque injection prend quelques secondes. -Gavage oral: dans le cadre de tests de traitements anti-tumoraux et sont journaliers sur une durée de 4 semaines. Chaque gavage prend 10-20 secondes. -Prélèvement de sang: jusqu'à 12 prélèvements par souris avec une fréquence ne dépassant pas 1 fois/semaine. Chaque prélèvement prend ~1 minute. -Prélèvement de moelle: jusqu'à 3 prélèvements par souris avec un intervalle d'au moins 15 jours entre deux prélèvements. Chaque prélèvement prend 2 à 3 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances sur les animaux sont dues au développement d'hémopathies malignes. Chez les animaux qui présentent une pathologie avancée, cela se traduit par une perte de poids et un affaiblissement général qui récapitule la maladie humaine nécessitant une surveillance renforcée, des soins puis un arrêt de la procédure. Les gavages pourront entraîner un stress léger et un inconfort temporaire. L’irradiation peut également entrainer à court terme un affaiblissement modéré transitoire des souris .

Devenir

Tous les animaux sont transgéniques et doivent être euthanasiés à la fin de la procédure pour éviter la dissémination des OGM. Des analyses post-mortem sur les organes des animaux permettent aussi de caractériser la pathologie par des analyses histologiques.

Remplacement

L'utilisation de modèles murins dans ce projet est incontournable pour les raisons suivantes : 1-La génération de toutes les cellules du sang n’est actuellement pas possible par des techniques de culture exclusivement in vitro; 2-Des lignées cellulaires immortalisées et poussant in vitro ne sont pas disponibles pour la plupart des oncogènes que nous étudions. D’autre part, plusieurs études montrent que ces lignées cellulaires cultivées in vitro divergent significativement des échantillons leucémiques de patients; 3-Les approches précliniques in vivo sont indispensables pour prendre en compte la pharmacologie des composés utilisés incluant la formulation, la biodisponibilité et la détection d’éventuels effets secondaires délétères; 4-Pour mettre en place des modèles de remplacement (ex: modèles de leucémie à partir de cellules souches), il est indispensable avant tout, de démontrer que les cellules obtenues par cette approche sont capables de reproduire in vivo des leucémies proches de celles observées chez les patients.

Réduction

Pour déterminer l’efficacité des modèles, nous évaluons le développement tumoral entre les groupes contrôles et les groupes expérimentaux à l'aide de différents paramètres (nombre de globules blanc, globules rouges, plaquettes dans le sang; pourcentage de cellules anormales par les analyses de cytométrie en flux; poids des rates et des foies) grâce à un test statistique. La robustesse des modèles est évaluée en confrontant ces résultats au cours du temps. Les nombres calculés dans ce projet sont des nombres maximaux calculés par des méthodes de calcul de puissance ou limités par le matériel cellulaire disponible (ex: dans le cas de populations purifiées de progéniteurs hématopoïétiques). Pour ce projet, nous avons favorisé l'utilisation de modèles transgéniques développés sur la base d'une expression des oncogènes proche de la physiologie et qui développent des hémopathies de manière pénétrante. Ainsi, le développement tumoral est contrôlé et le nombre de souris utilisé correspond précisément au nombre de souris permettant d'obtenir une valeur statistique des résultats.

Raffinement

Les procédures douloureuses sont accompagnées d’anesthésie et d’analgésie appropriées. Les animaux sont observés avec une fréquence adaptée à la procédure. L'utilisation d'une grille de score nous permet de suivre les animaux et d'intervenir pour les soulager en cas d’observation d'une souffrance. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Comme explicité plus haut, l’irradiation peut entrainer à court terme un affaiblissement des souris. Pour prévenir les conséquences après une irradiation léthale suivie de greffe et assurer le confort des animaux durant le premier mois post-irradiation, une nourriture enrichie est mise à disposition.

Choix des espèces

L'espèce souris a été choisie pour les raisons suivantes : -Les souris possèdent un système hématopoïétique proche de celui de l'homme et de nombreux modèles de souris existent déjà permettant des croisements avec nos modèles. -Les approches précliniques in vivo sur souris sont indispensables pour prendre en compte la pharmacologie des composés utilisés incluant la formulation, la biodisponibilité et la détection d’éventuels effets secondaires délétères. Les nombreux modèles murins déjà disponibles reposent sur la proximité entre le développement des cellules du sang chez l'homme et la souris et ils permettent de comparer les résultats avec ceux d'autres études. Nous utiliserons des souris adultes et/ou des nouveau-nés et des embryons. Les souris adultes auront entre 6 et 10 semaines pour avoir des tests efficaces et reproductibles. Pour l'étude des pathologies de l’enfant, un article récent montre l’importance d'utiliser des receveurs à différents stade de développement. Ainsi, nous utiliserons à la fois des cellules fœtales (foie fœtal), des cellules de nouveau-nés et des cellules adultes qui seront greffées dans des receveurs soit nouveau-nés soit adultes, âges qui correspondent à la population de patients..

Une tumeur de type glioblastome est induite dans le cerveau, un implant souple est posé dans la zone péritumorale au cours d'une chirurgie sous anesthésie pouvant durer six heures, puis les signaux cérébraux sont enregistrés sur animal vigile jusqu'à trois heures par jour et le sang prélevé chaque semaine. 30 miniporcs sont utilisés dans ces procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur attend une hémorragie puis un possible œdème cérébral pendant la chirurgie, un traumatisme local lié à la pose des électrodes et à l'extraction des tumeurs, une douleur modérée après l'opération et des infections aux points de suture. 26 animaux sont tués pour analyses histologiques, les 4 miniporcs restants, non implantés, pouvant être réutilisés dans d'autres projets.

Objectifs

L’objectif du projet de recherche est la vérification et la validation des performances de l’implant intracérébral innovant et de son intérêt théranostique (approche médicale visant à privilégier le développement simultané des aspects diagnostic et thérapeutique). Un verrou technologique actuel concernant les implants neuronaux et leur intérêt thérapeutique est leur capacité à pouvoir enregistrer les neurones sur le long terme. C’est en partie dû au fait que les implants actuels sont rigides, ce qui entraine une réponse inflammatoire de l’organisme forte. L’avantage du développement de notre implant souple est qu’il permet, en étant souple, d’augmenter sa biocompatibilité et de limiter la réaction inflammatoire. Nous avons eu des résultats prometteurs chez les rongeurs. Nous voulons tester la capacité de l’implant cérébral à assurer un interfaçage stable sur le moyen et long terme à l’échelle cellulaire et multi-cellulaire dans le système nerveux central au niveau cortical, chez le grande modèle. Nous voulons tester la biocompatibilité de l’implant et évaluer leur acceptation et leur intégration sur le long terme par le tissu cérébral chez le mini-porc. Cette étude comporte trois axes : - enregistrement de signaux électrophysiologiques corticaux - enregistrement de signaux électrophysiologiques péri-tumoraux - stimulation péri-tumorale : étude des effets sur les signaux électrophysiologiques péri-tumoraux La qualité des implants sera déterminée par leur capacité à assurer une bonne stabilité des enregistrements. En particulier, nous déterminerons la stabilité des formes des potentiels d’action sur des périodes de plusieurs jours.

Bénéfices attendus

Cela permettra de valider un nouveau dispositif qui peut aider les neurochirurgiens à mieux délimiter les marges tumorales, évaluer le pronostic et permettre un ajustement plus précoce du traitement dans une maladie incurable comme le GBM. Il constituera un gain significatif pour les cliniciens, les patients et les systèmes de santé. De plus, ce projet permettra comprendre mieux le fonctionnement de la zone péritumorale.

Procédures

Les animaux sont soumis à : -Procédures chirurgicales et analyse d’imagerie : sous anesthésie, donc la durée sera plafonnée à 6h, et limitée autant que possible à 2h30, afin d'assurer une récupération optimale aux animaux. Cette longue procédure permet d'évaluer un maximum de paramètres sur un seul animal et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés ; - Les enregistrements signaux cérébraux : sur les animaux vigiles, maximum 3 heures par jour; - Les prises de sang seront effectuées 1 fois par semaine sous anesthésie avec une durée environ 2 minutes.

Impact sur les animaux

La principale nuisance attendue chez les animaux est relative à la chirurgie et à la période postopératoire. Il s’agit plus précisément de : - stress de l’anesthésie, hypothermie ; - hémorragique puis possible œdème cérébral au niveau du cerveau pendant la chirurgie ; - le traumatisme local provoqué dans le cerveau (par la pose des électrodes et l’extraction des tumeurs) ainsi que la douleur modérée en postopératoire ; - infection au niveau des points de sutures. La principale nuisance attendue sur la partie des enregistrements : l'inconfort lié à la présence des électrodes. Pour les prélèvements (sang) : stress de l’anesthésie, légère douleur possible. Une surveillance des paramètres comportementaux (anxiété, motricité, etc..) permettra de détecter les complications inattendues.

Devenir

A la fin du projet, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses histologiques. Les animaux supplémentaires, non utilisés lors de l'implantation, pourront être réutilisés dans d'autres projets.

Remplacement

Nous avons précédemment travaillé avec des cultures cellulaires et des organoïdes, mais à ce stade de l’étude, il est nécessaire de passer à un modèle in vivo. Nous avons besoin d’étudier l’impact des mouvements in vivo sur la stabilité et la robustesse de l’implant à long terme.

Réduction

Conformément au principe des 3R, les matériaux ont été préalablement testés sur des cultures cellulaires afin de minimiser le nombre d'animaux nécessaires pour les essais in vivo. La première étude (preuve de concept) sera réalisée sur un minimum de 10 animaux, incluant 2 supplémentaires. Le nombre d’animaux a été réduit au strict minimum requis pour obtenir des données fiables concernant l’évaluation de la fonctionnalité du dispositif. Cependant, le Règlement Européen 2017/745 exige un nombre suffisant de preuves d'efficacité à travers plusieurs traitements. Le produit est considéré efficace s'il fonctionne sur 10 tumeurs. Par conséquent, une autre étude avec 20 animaux (2 supplémentaires) est envisagée afin de répondre aux exigences réglementaires.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leurs besoins éthologiques avec des enrichissements propres à l’espèce. La température de la salle d’hébergement sera augmentée après la chirurgie. Le suivi quotidien des animaux et les pesées hebdomadaires sont assurés par le personnel technique et animalier habilité et habitué à travailler avec des porcs. Les animaux suivront également un programme de socialisation afin de réduire le stress engendré par les actes quotidiens. En cas de troubles liés au dispositif, des traitements pourront être mis en place, similaires à ceux pratiqués en médecine humaine. Tout acte douloureux ou fortement stressant sera réalisé sous sédation ou sous anesthésie (locale ou générale selon les besoins). Au cours des études, les animaux feront l'objet d'un suivi clinique, afin de détecter tout signe de mal-être ou toute anomalie physique. La surveillance est renforcée durant la période post-opératoire et en cas d’apparition de troubles. L’ensemble de ces informations sont reportées sur des fiches de suivi adaptées. Cette surveillance permet une intervention rapide auprès du vétérinaire et du responsable de projet pour adapter les soins analgésiques si nécessaire. Si une étape du protocole chronique affecte l’état de santé au point d’atteindre l’un des points limites sans qu’aucune action ne puisse permettre un retour à l’état basal, alors le protocole sera interrompu et l’animal mis à mort selon les modalités éthiques. Quant au traitement à la ciclosporine, les animaux seront plus vulnérables aux infections. Par conséquent, un équipement de protection individuelle propre (gants, etc.) sera utilisé pour prévenir l’infection. De plus, un masquant de goût sera utilisé pour rendre le traitement plus appètent. Pendant la procédure chirurgicale, les animaux sont maintenus sous anesthésie générale avec une surveillance constante de leurs paramètres vitaux (fréquence cardiaque, pression sanguine, température...). Ceux-ci nous permettent d’apporter la nécessaire hydratation ou de fournir des antiarythmiques en cas de risque de fibrillation ventriculaire. Une fois implantés, les animaux devront être isolés dans leur enclos pour éviter la détérioration des connecteurs, ce qui rendrait les implants inutilisables et risqués. Cependant, ils pourront interagir visuellement et auditivement avec d'autres animaux dans des enclos voisins, et des jeux (ballons...) enrichiront leur environnement.

Choix des espèces

Le porc (une tumeur induite), à cause de similarités anatomique du cerveau de porc et de l’homme. Le transfert technologique de nouveaux implants chez l’homme impose des tests précliniques dans un modèle animal pertinent. Il sera nécessaire d'évaluer la biocompatibilité des implants et leur capacité à enregistrer l’activité neuronale et la stimuler électriquement de manière stable sur le long terme chez le mini-porc. En effet, ce modèle est plus pertinent que le modèle rat, car son cerveau produit des mouvements importants qui sont une des sources principales de l’instabilité des signaux chez l’homme. De plus, notre laboratoire a un modèle tumeur glioblastome développé et validé chez le minipig. Les porcs utilisés en étude sont de jeunes animaux, car la craniectomie doit être réalisée chez les miniporcs de moins de 5 mois, période pendant laquelle les sinus ne sont pas encore bien développés. Les porcs utilisés en étude sont de jeunes animaux, car la craniectomie doit être réalisée chez les miniporcs de moins de 5 mois, période pendant laquelle les sinus ne sont pas encore bien développés.

Perte de poids, dégradation de l'état général et perte de mobilité déclenchent la mise à mort avant le terme prévu. 3 255 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des analyses post mortem. Chacune reçoit une greffe de cellules leucémiques humaines directement dans le tibia sous anesthésie, puis des traitements oraux, intrapéritonéaux ou intraveineux quotidiens ou bi-quotidiens, et des prélèvements de sang à la patte sur animal vigile atteignant 15 % de son volume sanguin sur 28 jours, pendant 60 à 120 jours d'étude. L'établissement présente ce modèle comme un outil à intégrer dans son processus de sélection de candidats médicaments, plus fidèle que la greffe sous la peau qu'il reconnaît pourtant moins invasive.

Objectifs

La leucémie aiguë myéloïde (LAM ou AML en anglais) est un cancer hématologique relativement rare dont le besoin thérapeutique reste important. Elle représente environ 1,2 % de l'ensemble des cancers diagnostiqués chaque année dans le monde. L’AML est une pathologie agressive qui se développe rapidement et nécessite une prise en charge rapide. Le pronostic des patients atteints d’AML reste sombre malgré les progrès réalisés ces dernières années. Le taux de survie globale à 5 ans pour l’AML est d'environ 25 % chez les adultes, mais il chute considérablement avec l'âge, atteignant moins de 10 % chez les patients de plus de 65 ans. L’AML peut également toucher les enfants, elle représente 15 à 20% des leucémies pédiatriques. L'arsenal thérapeutique contre l’AML se compose principalement de la chimiothérapie intensive, des thérapies ciblées pour certaines mutations, et de la transplantation de cellules souches hématopoïétiques. Cependant, ces traitements présentent des limites importantes : une toxicité élevée, une résistance des tumeurs aux thérapies ciblées et surtout des options limitées pour les rechutes. Les AML se développent au sein de la moelle osseuse, puis se disséminent dans le système sanguin ou lymphatique. C'est dans cet environnement propice à la croissance et à la différenciation des cellules sanguines que les cancers des cellules hématopoïétiques prennent leur origine et se développent en premier. L’objectif de ce projet consiste à mettre en place et à intégrer dans nos études sur la souris immunodéprimée (sans système immunitaire, permettant la greffe de tumeur humaine), la greffe orthotopique (qui est située à son emplacement anatomique habituel) des leucémies, via une injection de cellules tumorales dans l’espace intra-tibial, l’un des sièges de la moelle osseuse qui présente l’intérêt d’être facile d’accès. Ce modèle présente un intérêt particulier pour l’étude de la pathologie humaine. En effet, il y a une diffusion des cellules tumorales dans le système sanguin avec pour résultante le développement de signes cliniques similaires à ceux rencontrés chez le patient. Cette approche vise à mieux reproduire les conditions de développement pathologique chez le patient, rendant ainsi les observations et les conclusions obtenues chez la souris plus pertinentes pour les futures applications cliniques.

Bénéfices attendus

Actuellement, parmi les modèles de recherche préclinique utilisés pour étudier les cancers, l’évaluation de l’efficacité et de la pharmacodynamie (vérification de l’atteinte de la cible thérapeutique) des thérapies candidates s’effectue sur des cellules tumorales greffées sous la peau de la souris avec mesure au pied à coulisse de la taille des tumeurs. Cependant cette approche ne récapitule pas l’ensemble des conditions environnementales et pathologiques des maladies du sang chez l’Homme (telles que la leucémie). Les greffes en intra-veineuse (IV) quant à elles miment la propagation de la maladie chez l’Homme dans le sang ou la lymphe, mais le micro-environnement initial n’est pas le même. Le modèle de greffe intra-tibiale, est quant à lui plus représentatif de la physiopathologie chez le patient. Il permet de sélectionner les futurs candidats médicaments dans un contexte de propagation tumorale qui reproduit plus fidèlement le contexte environnemental et pathologique du patient lors du développement de leucémies. Ce modèle vise à être intégré dans notre processus de sélection et de caractérisation de candidats thérapeutiques dans les pathologies de leucémies en complément de la greffe IV qui reste cependant moins invasive que la greffe intra-tibiale. Le choix de l’un ou l’autre de ces modèles dépendra de nombreux paramètres, tel que l’indication finale d’application du candidat médicament, la question posée ou l’objectif de l’expérience par exemple. En outre, certaines formes de cancer hématologique ne peuvent pas être reproduites chez la souris par greffe sous-cutanée ou intraveineuse, car le microenvironnement n'est pas adapté à leur développement. La greffe intra-tibiale favorise la croissance de ces tumeurs, car elle reproduit le microenvironnement propice à leur développement. Contrairement à la greffe en sous-cutanée qui permet un taux de prise de la greffe oscillant entre 70% et 90%, la greffe intra-tibiale permet un taux de prise proche de 100% ainsi que des tumeurs plus homogènes (selon sources bibliographiques). Ce modèle nous permettra donc d’évaluer l’efficacité de nos candidats médicaments pour le traitement de l’AML.

Procédures

- Analgésie préalable à la greffe : injection sous cutanée 20 à 30 minutes avant la greffe (10 secondes/souris) - Greffe intra-tibiale pour l’implantation des cellules tumorales : cette procédure prendra moins de 5 minutes et sera réalisée une seule fois sur l’animal sous anesthésie générale gazeuse de quelques minutes. - Prélèvements de sang au niveau des membres inférieurs sur animal vigile, à raison de 15% du volume total de sang sur 28 jours (pour le suivi de l’envahissement tumoral ou le suivi pharmacocinétique) (environ 20 secondes par prélèvement par souris). Réitération toutes les 3 semaines. - Traitements sur animal vigile : administrations aigues orales, intra-péritonéales ou intra-veineuses de candidats médicaments (10 à 15 secondes par souris). Traitements sur plusieurs semaines, en quotidien ou bi-quotidien. Dans le respect des limites éthiques.

Impact sur les animaux

Dans de rares cas, gonflement ou hématome au niveau du genou, provoquant une douleur modérée. Des prélèvements sanguins au niveau de la veine de la patte doivent être effectués une fois par semaine et ce toutes les 3 semaines jusqu’à la fin de l’expérimentation (60 jours s’il n’y a pas d’envahissement tumoral ou 120 jours lors des études d’efficacité avec des candidats médicaments qui provoquent la disparition des cellules tumorales) : - Piqûre au niveau de la veine saphène et prélèvement du sang qui provoque une douleur légère. Ce geste dure au maximum 1 minute par animal. L’envahissement tumoral des leucémies dans la moelle osseuse et dans le sang peut provoquer une perte de poids ainsi que l’apparition de divers signes cliniques : détériorations de l’état général et altération de la mobilité.

Devenir

Chaque animal sera euthanasié en fin d'étude (ou cours d'étude en cas d’apparition de signes cliniques limites) pour réalisation d'études post-mortem.

Remplacement

L’identification de candidats médicaments est réalisée selon différentes étapes. Les premières études réalisées in vitro permettent de caractériser les composés candidats et de ne sélectionner que les molécules les plus efficaces en amont des études in vivo. Mais à l’heure actuelle, il est impossible de reconstituer in vitro la complexité d’une tumeur et ses interactions avec le microenvironnement, et c’est encore plus complexe pour des maladies du sang. Aussi les études in vivo demeurent indispensables pour étudier les effets pharmacologiques d’un candidat médicament, ses potentiels effets secondaires et prédire ses effets potentiels chez l’homme. La greffe intra-tibiale représente un modèle d’intérêt pour la recherche de produits anti-cancéreux dans le cadre du traitement des AMLs puisque ce modèle se développe dans le tissu d’origine, qu’il récapitule de nombreuses caractéristiques de la pathologie humaine et qu’il reconstitue les interactions entre les cellules tumorales et leur micro-environnement. Ainsi à ce jour, il n’y a pas de méthode substitutive. De plus, le modèle sera utilisé dans des phases avancées de développement des candidats médicaments, lorsque l’on se rapproche des phases cliniques chez le patient. Il visera à évaluer un nombre restreint de candidats médicaments dans ce modèle complexe et translationnel.

Réduction

Un des intérêts majeurs dans la mise en place de cette approche expérimentale, en plus du fait qu’elle reproduise très finement la complexité environnementale du contexte pathologique qui existe chez le patient, est qu’elle permet un taux de réussite de greffe chez la souris proche de 100%, soit la quasi-totalité des souris greffées qui pourront être incluses dans les études. Les candidats médicaments testés dans ce projet sont issus d’une présélection drastique in silico et in vitro incluant de nombreux modèles substitutifs à l’utilisation de l’animal. Les candidats médicaments sont également évalués en amont pour les aspects de sécurité non clinique et pour définir des doses non toxiques à administrer aux souris. Selon les besoins, une évaluation pharmacocinétique (permettant d’apprécier la distribution des candidats médicaments dans le système sanguin) sera intégrée au sein des études d’efficacité thérapeutique, permettant ainsi de ne pas réaliser deux études indépendantes et ainsi réduire le nombre d’animaux. Pour les prélèvements de sang de cette partie pharmacocinétique, la technique de prélèvement à la veine du membre inférieur, sera privilégiée, donnant la possibilité de réaliser des prélèvements répétés sur le même animal, dans le respect des limites physiologiques et des préconisations applicables au bien-être animal. Le nombre d’animaux par groupe pour la première phase dédiée à la détermination des conditions de greffe et de croissance tumorale est déterminé sur la base bibliographique de chaque lignée tumorale à étudier, et en respect des volumes de sang prélevables recommandés par la SBEA. Des études statistiques pour cette première étape seront focalisées sur la différence entre mâles et femelles. Nous réaliserons ensuite des études statistiques et nous prendrons en compte l’avancement du développement des candidats médicaments afin de réduire le nombre de groupe par étude si possible : une approche statistique basée sur les données de détermination des conditions de greffe et de croissance tumorale permettra potentiellement d’affiner le nombre d’animaux par groupe ou le nombre de groupe/étude pour l’étude de l’efficacité des composés.

Raffinement

• Les souris sont maintenues en groupes sociaux tout au long de l’étude. L’habitat des souris est enrichi de matériel adapté pour leur permettre d’exprimer leurs instincts naturels comme ronger ou nidifier (tube ou dôme, cocoon, sizzle dry) et de l’aliment est distribué dans la cage pour favoriser le comportement de fouissage. • Un scoring individuel (axé sur l’activité et le comportement en complément des points limites standards et spécifiques au modèle sont mis en place afin de pouvoir suivre le bien-être animal et limiter toute souffrance). • Pour des prélèvements de sang, la technique de prélèvement de sang à la veine latérale du membre inférieur, sera privilégiée. Le volume total de prélèvement est conforme aux recommandations de la structure de bien-être animal afin de respecter la volémie physiologique et le bien-être animal. Cette technique est peu invasive. • Pour la greffe en elle-même, les animaux seront anesthésiés et sous analgésie, protégés de l’hypothermie par l’utilisation de tapis chauffant. Un gel oculaire sera appliqué pour prévenir la sécheresse oculaire et une administration sous cutanée de sérum physiologique sera réalisée pour prévenir la déshydratation. • À la suite de la greffe, il sera nécessaire de comprimer la zone d’injection par des gestes sûrs et acquis auprès d’un expert formateur afin d’éviter les risques de complications post injection. Les candidats médicaments sont également préalablement évalués pour les aspects de sécurité non clinique et les doses administrées dans ce modèle sont déterminées comme non toxiques pour le rongeur.

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de souris est largement décrite dans les publications en recherche pré-clinique : ces modèles sont davantage déployés chez la souris que chez le rat. Les souris sont utilisées à partir de 6 semaines. C’est l’âge classiquement utilisé dans tous les protocoles qui seront réalisés dans la sélection des candidats médicaments. Afin de ne pas avoir d’interférence avec les signes de vieillissement nous essayerons dans la mesure du possible de ne pas excéder 6 mois d’âge à la fin des études.

Greffées d'une tumeur sous la peau ou directement dans le poumon, le pancréas, le foie ou le cerveau, 2 000 souris immunodéprimées sont soumises à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever la tumeur et les organes. Chaque animal reçoit une injection de nanoparticules puis une séance de radiothérapie, avec une imagerie sous anesthésie par semaine pendant huit semaines au maximum. L'objectif immédiat consiste à choisir un schéma de traitement en vue d'un essai clinique, essai renvoyé au futur. Le porteur écrit que la radiothérapie "ne devrait pas engendrer d'effets indésirables" et que l'imagerie est indolore, tout en reconnaissant que le modèle de souris aux défenses immunitaires réduites constitue "une nuisance en soi".

Objectifs

Selon les données récentes de l'Organisation mondiale de la santé (OMS), environ 19,3 millions de nouveaux cas de cancer ont été diagnostiqués en 2020, et les projections estiment que ce nombre atteindra près de 30 millions d'ici 2040. La radiothérapie est un traitement clé dans la prise en charge du cancer, utilisée chez environ 50 à 60 % des patients à un moment de leur parcours thérapeutique. Elle consiste à utiliser des rayons pour détruire les cellules cancéreuses tout en préservant au maximum les tissus sains. La radiothérapie est particulièrement efficace dans le traitement des cancers du sein, de la prostate, du poumon et des cancers de la tête et du cou. Elle reste donc un pilier essentiel des stratégies thérapeutiques, notamment pour les cancers localisés ou en complément d'autres traitements comme la chirurgie et la chimiothérapie. Un développement prometteur pour renforcer l'efficacité de la radiothérapie est l'utilisation de de deux types de particules de très petite taille appelées nanoparticules : 1) des nanoparticules en métal qui permettrait d'augmenter localement la dose de radiation absorbée par les cellules cancéreuses et d’amplifier les dommages infligés aux cellules tumorales lors de l'exposition aux rayonnement, ou 2) des nanoparticules remplies avec une drogue anticancéreuse qui peuvent s'ouvrir avec la radiothérapie permettant de libérer la drogue anticancéreuse localement dans la tumeur. L'intégration des nanoparticules dans les traitements de radiothérapie pourrait ainsi représenter une avancée majeure dans l'optimisation des thérapies contre le cancer, permettant d’améliorer la précision des traitements, et de réduire les effets secondaires. L’objectif de ce projet est de tester l’utilisation de nanoparticules, soit métalliques soit chargées en drogue anticancéreuse, améliorant la radiothérapie dans différents types de cancer. Ce projet se déroulera sur deux sites. Sur le premier (EU1), auront lieu : l’implantation des cellules cancéreuses et le suivi de croissance tumorale. Sur le deuxième (EU2), auront lieu les radiothérapies.

Bénéfices attendus

L'objectif du projet est de développer de nouvelles particules pour pouvoir proposer un schéma de traitement optimal avec une bonne efficacité thérapeutique pour un transfert vers un essai clinique chez l’homme.

Procédures

Interventions sur les animaux : anesthésie générale (EU1, entre 5 et 25 minutes), implantation sous cutanée et croissance de tumeur sous-cutanée (EU1, durée environ 10 minutes, 1 fois, suivi sur 8 semaine maximum), chirurgie d'implantation de cellules cancéreuses (EU1, durée environ 20 minutes, 1 fois), croissance de tumeur dans leurs sites d'origine (poumons, pancréas, foie, cerveau , 8 semaines maximum), anesthésie pour imagerie médicale (EU1, durée environ 15 minutes, 1 fois/semaine, 8 semaines maximum), injection de produit de contraste et/ou de particules (EU2, 1 fois), radiothérapie (EU2, durée environ 20 mimnutes,1 fois). Le modèle de souris avec des défenses immunitaires réduites est une nuisance en soi.

Impact sur les animaux

L’inoculation de tumeur peut induire des douleurs que ce soit en sous-cutanée ou en sur le site de la tumeur originelle. La radiothérapie ne devrait pas engendrer d’effets indésirables. Les procédures d'imagerie sont indolores. Si les traitements ne sont pas suffisamment efficaces, la tumeur continuera de grandir et pourra causer des douleurs, l‘étude sera alors interrompue.

Devenir

Les animaux issus des procédures seront mis à mort afin de prélever la tumeur et des organes pour des analyses anatomopathologiques.

Remplacement

Nous aurons, par une série de tests sur cellules en culture in vitro, sélectionné les particules d’intérêt. Grace à des tests complémentaires sur des tumeurs en culture 3D, nous nous focaliserons sur environ 20 particules différentes, constituant les candidates les plus prometteuses. Les paramètres d'efficacité thérapeutique sont obtenus uniquement par l’emploi d’animaux. Ces études précliniques sont nécessaires avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n’existe pas de modèle non biologique ou in vitro permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques.

Réduction

Les tests in vitro permettront de réduire le nombre de particules à tester ainsi que le nombre de lignées de cellules. Cela nous permettra d’éviter de tester toutes les particules candidates sur animal. Concernant les tests sur animaux, nous nous efforcerons de faire en sorte que l’effectif utilisé soit minimal. Cela permettra ainsi de réduire le nombre d’animaux employé autant que possible tout en obtenant des informations scientifiques avec une validité statistique suffisante. Les particules qui seront validées après cette première étape seront injectées chez des souris porteuses de tumeurs afin de tester leur efficacité thérapeutique. Dans chaque procédure le nombre d’animaux pourra être réduit jusqu’à 50% si l’effet attendu est suffisamment important pour obtenir des résultats statistiquement fiables avec la première moitié d’animaux ou si les données se révèlent non pertinentes (arrêt alors des expérimentations). Le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe afin de ne pas compromettre la validité des expériences. Ce nombre a été estimé à l'aide d'une approche statistique.

Raffinement

Les souris utilisées dans ce projet ont des caractéristiques nuisibles pour leur santé, des mesures compensatoires de raffinement ont donc été prises pour leur hébergement : mesures d’hygiène supplémentaires, les cages sont stériles et jetables, la litière, les croquettes et l'enrichissent sont également stérilisés. L’étude se déroulera sur une période qui, dans la vie des animaux avec des défenses immunitaires réduites, se situe bien en amont des complications liées à l’âge chez ces animaux. Les chirurgies se feront sous anesthésie générale et la douleur sera gérée par une analgésie adaptée. Le transport entre les EU s’effectuera dans des boites de transport avec enrichissement, boisson et nourriture. L’application de critères d’arrêt et le suivi quotidien des animaux garantiront leur bienêtre, et nous permettront d’intervenir immédiatement de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Toute forme de nuisance ou effets indésirables des procédures expérimentales seront attentivement surveillées lors de l'observation des animaux. Ces effets indésirables sont listés parmi les points limites de chaque procédure. L’utilisation de souris avec des défenses immunitaires réduites permet l'étude de lignées cancéreuses humaines sans phénomène de rejet. La croissance des tumeurs sera suivie régulièrement au pied à coulisse et par imagerie médicale.

Choix des espèces

Les souris immunodéprimées de 5 semaines permettent le développement de modèles tumoraux humains sans phénomène de rejet. À ce stade de développement, on obtient des souris adultes avec des tumeurs bien installées, juste avant que leur système immunitaire, en particulier les cellules qui combattent les infections et les tumeurs, n'atteigne son niveau maximal de production à 8 semaines. Les méthodes utilisées pour induire une tumeur sont rapides et reproductibles et la bonne connaissance de ces modèles de pathologie chez la souris fait que les limites éthiques de ce type d’expérimentation sont bien connues.

8 macaques crabiers vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit deux perfusions d'un anticorps couplé à un agent cytotoxique, sanglé quarante minutes sur une chaise de contention, et subit quinze prélèvements sanguins avant un prélèvement de moelle osseuse dont il ne se réveillera pas. Le porteur attend des diarrhées, des hématomes et des poussées de fièvre, et prévoit de projeter aux animaux un documentaire ou un dessin animé sur tablette pendant les contentions. Le projet sert à choisir laquelle de deux formulations passera l'étude réglementaire suivante, étape qualifiée d'"indispensable" dans le développement du candidat médicament.

Objectifs

Ce projet consiste à étudier les effets et le devenir de deux formulations composés d’anticorps conjugués à des agents toxiques administrées à deux doses différentes de manière répétée (x2) en intra-veineux chez le singe cynomolgus (Macaca fascicularis) dans le cadre du développement d’un traitement anti-cancéreux chez l’homme. L’étude permettra de sélectionner la formulation et la dose maximale tolérée pour une future étude de toxicité réglementaire. Ce projet constitue donc une étape importante et indispensable dans le processus de développement et de selection du candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont, à terme, la validation et la mise sur le marché d’un anticorps capable de cibler les tumeurs de manière très spécifique, couplé à un agent cytotoxique capable d’éliminer les cellules tumorales. Cette étude génèrera des données scientifiques qui permettront d’affiner les protocoles des études règlementaires sur le primate. Ainsi les connaissances acquises permettront de réduire le nombre d’animaux mais aussi d’adapter les méthodes de suivi et de raffinement spécifiques aux primates.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux vigiles recevront à deux reprises un candidat médicament par voie intra-veineuse. L’injection durera 30 minutes et la contention sur chaise durera environ 40 minutes. Les animaux bénéficieront d’une période de repos de deux semaines entre les 2 administrations. Quinze prélèvements sanguins de 1 à 5ml par animal seront réalisés sur toute la durée du projet (temps de contention : environ 5minutes). Une sédation sera envisagée en cas de besoin. Un prélèvement de moelle osseuse par animal sera réalisé (sous anesthésie générale et analgésie). Le prélèvement durera environ 30 minutes (anesthésie comprise) Les animaux ne seront pas réveillés après le prélèvement. Le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Pour le confort des animaux, certains prélèvements et suivis pourront être réalisés simultanément (ce qui diminuera le nombre de manipulations et de contentions).

Impact sur les animaux

Sur la base du mode d’action des anticorps et de leur possible cible gastro-intestinale, des selles molles et/ou des diarrhée pourront être observées. Aussi, des réactions locales du type hématomes léger au niveau des sites d'administration et une réaction de type fièvre peuvent éventuellement apparaître les jours suivant les administrations. La réalisation de prélèvements sanguins et les administrations par voie intraveineuse pourront également provoquer un stress, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou oedème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction ou d'injection. Durant les administrations, les animaux seront placés sur des chaises à contention ce qui a pour conséquence de réduire leurs mouvements. Les animaux auront accès à de l’eau et des friandises durant la manipulation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet dans le but de récolter les organes et d’évaluer la toxicité des candidats médicaments.

Remplacement

Les études de pharmacocinétique et de sécurité chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. En effet, celles-ci permettent de : - déterminer la biodisponibilité de candidats médicaments; - étudier les relations dose-concentration et/ou dose-effet ; - prédire la voie et la dose d’administration chez l'Homme; - déterminer la forme galénique à utiliser. Actuellement, aucune méthode alternative à l'utilisation des animaux (ex : in-vitro, in silico...) n'est susceptible d'apporter le même niveau d'information qu'un organisme vivant entier et complexe dans ce projet.

Réduction

Le nombre estimé d'animaux utilisés dans ce projet a été défini à 8 primates répartis en 4 lots de 2. Il a été réduit au minimum afin de tout de même obtenir des résultats fiables interprétables.

Raffinement

Un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie comprenant: - Des enrichissements structuraux permettant aux PNH d'évoluer dans un environnement tridimensionnel ; - De la litière pour leur permettre de fourrager ; - Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent ; - Des friandises et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; - De la musique d'ambiance est diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation de 27 jours sera mise en place avant le début de l’étude. Un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (prise de sang, de température rectale, chaise à contention). Durant les administrations, les animaux seront assis sur des chaises à contention. Pour limiter leur stress et l’ennui, un personnel formé veillera à interagir avec les animaux, leur distribuer des friandises ou encore leur projeter un documentaire/dessin animé sur une tablette électronique par exemple. Des points limites seront mis en place afin de detecter précocément tout signe de stress ou de douleur.

Choix des espèces

La molécule d’intérêt étudiée dans ce projet étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent et prédictif. En raison de sa proximité phylogénétique et physiologique avec l'Homme, le primate non humain (PNH) a été retenu dans le cadre de ce projet. En effet, les primates partagent de nombreuses similitudes avec l'Homme, notamment en termes de patrimoine génétique, de processus épigénétiques, d’organisation fonctionnelle du système immunitaire, et de leurs principales caractéristiques physiologiques, cognitives et comportementales. Par conséquent, les données obtenues avec ce modèle sont communément les plus prédictives des réponses observées chez l'Homme vis à vis de cette molécule d’intérêt. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses histologiques. Sachant que des prélèvements d’organes seront réalisés post-mortem dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.

Pour faire franchir à un anticorps anticancéreux la barrière qui protège le cerveau, 60 rats reçoivent un cathéter implanté dans le crâne. Le niveau de souffrance déclaré est modéré et tous sont tués au bout de quatre semaines, pour l'analyse des tissus cérébraux. Chaque animal subit seize ponctions sous anesthésie générale, huit prélèvements de sang et huit de liquide céphalo-rachidien, étalées sur ces quatre semaines. Le porteur reconnaît que l'acte chirurgical peut léser le cerveau ou la moelle épinière au point d'empêcher l'animal de se nourrir et de boire, et renvoie à des points limites "préalablement définis" sans dire lesquels.

Objectifs

Le cancer du sein métastatique est une cause majeure de mortalité chez les femmes, en particulier un sous type apellé "HER2", est un gros pourvoyeur de métastases cérébrales incurables. Il existe pour ce sous type une thérapie ciblée par anticorps, le trastuzumab. Malheureusement ce traitement, administré ne pénètre pas dans le cerveau en raison d'une barrière protectrice appelée la barrière hémato- encéphalique. Pour la contourner, des injections peuvent être faites directement dans le système nerveux central (SNC) c'est à dire dans le liquide céphalo-rachidien (LCR). Le problème est qu'une fois dans le LCR, les anticorps fuient vers l'extérieur du SNC. Nous avons développé un nouvel anticorps, dont le design permettait d'éviter la fuite du SNC. L’objectif de cette expérience est l’étude pharmacologique de ce composé thérapeutique chez des rats cathéterisés au niveau cérébral, dans l'objectif final de traiter des patientes atteintes de métatastases cérébrales de cancers du sein.

Bénéfices attendus

Notre projet se positionne dans une démarche translationnelle (objectif d'application clinique). Le cancer du sein métastatique est la cause majeure de mortalité chez les femmes. Les métastases cérébrales sont les localisations les plus graves, survenant dans 15 à 40 pourcent des cancers du sein métastatique, avec une survie très faible. Ces expérimentations vont nous permettre de faire une étude de l’efficacité d’une nouvelle molécule thérapeutique avec différents vehicules (des billes d’alginate de différentes taille) afin d’améliorer la formulation de ce traitement. Cette molécule sera par la suite testée lors d’un essai clinique

Procédures

Pour chaque animal, un premier acte de pose de cathéter au niveau cérébral, suivi d’une injection d’un agent thérapeutique se fait sous anesthésie générale (durée de l’opération : 20 minutes). Une analgésie 30 minutes avant opération est effectué ainsi que post-opératoire pendant 24 heures (jusqu’à 72h si nécéssaire). Les prélèvements sanguins et de liquide céphalo-rachidien (durée : 5 minutes) qui vont suivre cette opération se feront en même temps et sous anésthésie générale, à différents temps après l’injection de l’agent thérapeutique pour un total de 8 prélèvements sanguins et 8 prélèvements de liquide céphalo-rachidien espacés sur 4 semaines. Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire.

Impact sur les animaux

Durant la pose du cathéter, un stress thermique peut être observé pendant l’anesthésie de l’animal. L’acte chirugical peut entrainer des douleurs ou lésions au niveau cérébral et/ou de la moelle épinière. Ces lésions peuvent notament entrainer un problème pour l’animal à se nourrir et à s’hydrater. A cela s'ajoute des nuisances possibles durant les prélèvements (sanguin et de liquide céphalo-rachidien) à type de stress ou douleur lors du prélèvement sanguin.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés au terme des 4 semaines de traitement pour analyses tissulaires du cerveau ou en amont en cas d’atteinte d’un point limite préalablement défini

Remplacement

L'objectif de notre projet est d'étudier la pharmacologie d’un anticorps encapsulé dans des billes d’alginate après leur injection intra-cérébrale sur des modèles de rats. Des modèles in-vitro existent pour modéliser la barrière hémato-encéphalique. Il est également possible d'évaluer la dégradation des billes d’alginate contenant l'anticorps dans des modèles in vitro. Ces méthodologies permettent de répondre à des problématiques précises mais donnent des informations limitées et peu transférables à l'homme. Ces expériences permettent de réduire le nombre d’animaux nécessaires (et nous avons par ailleurs fait des expériences in-vitro pour ce sujet), mais ne permettent pas de s’affranchir totalement de l’expérimentation animale, en vue d'un essai clinique chez l'homme.

Réduction

Nous avons calculé le nombre d'animaux nécessaires pour ce travail selon plusieurs critères: 1) Un calcul statistique de puissance pour une interprétation fiable des résultats. 2) La prise en compte d'un taux de décès per opératoire (tenant compte de notre expérience passée, ce taux d'échec est grandement limité mais dois toutefois être pris en considération) Nous avons donc fixé à 10 le nombre de rats par bras de traitement. Ce projet prévoit 60 rats.

Raffinement

Une période d'acclimatation de 7 jours sera observée à réception des animaux. Un enrichissement des cages sera systématiquement proposé (un abri en plastique rouge translucide). Cette procédure expérimentale sera réalisée par une équipe maitrisant parfaitement le geste chirurgical et les mesures d'asepsie règlementaires. Le geste sera réalisé en conditions stériles, dans une pièce opératoire dédiée. Les mesures d'anesthésie/analgésies seront assurées tout au long de la procédure. Avant la réalisation de la chirurgie (pose de cathéter intrathécal) les animaux recevront une injection d'anesthésique et d'analgésique. L'analgésie sera prolongée systématiquement pendant 24h après le geste, et ultérieurement selon le besoin de l'animal. Les animaux sont suivis quotidiennement par les animaliers et les expérimentateurs. Si les points limites sont atteints avant la fin de l’expérimentation l’animal sera euthanasié. Les injections et ponctions de liquide céphalo-rachidien et de sang seront réalisées sur animal anesthésié afin de limiter le stress lié à l’acte.

Choix des espèces

Choix des espèces: Notre choix des rats est basé sur la faisabilité technique. En effet, compte tenu de la complexité technique à réaliser la cathéterisation intratécale, il n’est pas possible de réaliser ce projet chez la souris (modèle trop petit). Par ailleurs, pour l'analyse des prélèvements, nous avons besoin d’un volume minimum de liquide céphalo-rachidien (LCR) qui est incompatible avec le volume de LCR chez la souris. Stade de développement: Pour le stade de développement de l'animal, deux critères sont pris en compte: 1) D'une part le taux de réussite de l'anesthésie générale. Cette dernière doit être complète tout au long de la procédure chirugicale. L'efficacité des produits anesthésiques, injectés par voie intra péritonéale, est maximale sur de jeunes animaux avec de faibles réserves en graisses (les anesthésiques s'accumulant dans la graisse avec relarguage continu, nous avons identifié que sur des animaux plus vieux, ayant accumulé d'avantage de graisse, l'anesthésie est moins efficace et le reveil plus long à obtenir en fin de procédure) 2) D'autre part une réserve suffisante de liquide céphalo-rachidien pour les prélèvements répétés. Cette réserve étant directement liée au poids et au stade de développement de l'animal En ce sens, nous avons retenus un stade de développement de 6 semaines, meilleur compromis entre les deux critères.