Cancers

Pesées puis numérotées par poinçonnement de l'oreille sur animal vigile, 600 souris reçoivent une injection dans la veine de la queue, suivie de prélèvements sanguins à dix minutes, six heures, un jour, trois jours et sept jours, puis deux fois par semaine pendant quatre semaines. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré. Une partie subit en fin d'étude un prélèvement de grand volume par piqûre dans le cœur, sous anesthésie sans réveil, qui peut provoquer un arrêt cardiaque, suivi d'une dislocation cervicale. L'objet est de mesurer le passage dans le sang de candidats médicaments anticancéreux, en vue de fixer les doses des premiers essais chez l'être humain. Les souris qui n'entrent pas en protocole, et celles qui n'ont pas atteint les points limites, sont "reformées" pour l'entraînement du personnel aux gestes techniques.

Objectifs

Ce projet vise à déterminer les données de pharmacocinétiques, c’est à dire le devenir du médicament dans le sang, au cours du temps. Ces données pharmacocinétiques sont nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine. Ces études permettront d’évaluer au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité antitumorale et de tolérance qui seront également effectuées sur des modèles souris. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats de pharmacocinétique (projet actuel), d’efficacité et de tolérance seront objectivables entre l’humain et le modèle souris et serviront, à terme, de définir les modalités d'administration du médicament (dose et fréquences), lors des premiers essais cliniques. Une méthode de micro-échantillonage (prélèvement d’un échantillon de volume faible par le biais d’un dispositif adapté) sera utilisée afin d’améliorer la significativité de ces études, tout en réduisant le nombre d’animaux nécessaires en prélevant beaucoup moins de volume sanguin et à des fréquences adéquates.

Bénéfices attendus

La pharmacocinétique de composés thérapeutiques est un élément essentiel pour analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine. Ces études permettront de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité et de tolérance et permettront, à terme de déterminer les doses et fréquences des premières études cliniques chez l’Homme.

Procédures

1/ Après une semaine de stabulation, les souris seront pesées (maximum 1 min) et numérotées vigiles par poinçonnement auriculaire (maximum 3 min). 2/ Une contention suivie d'une injection/prélèvement sur animal vigile sont prévues sur chaque animal (1 à 3min) : - lors de l’injection par intraveineuse dans le veine caudale des candidats médicaments (t-0). - Lors de chacun des prélèvements dans la veine caudale et échantillonnage par microcapillaire. 3/ En fonction des expériences, un prélèvement sanguin terminal de grand volume (3 min), pouvant induire un arrêt cardiaque, sera pratiquée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil (maximum 3 min), suivi d'une mise à mort par dislocation cervicale (maximum 1 minute).

Impact sur les animaux

1/ La contention et les injections/prélèvements induisent un stress de l’animal durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte - de 1 à 5 minutes). 2/ les injections/prélèvements induisent un stress et une douleur de type modérée durant plusieurs secondes (pendant l’acte - de 1 à 5 minutes). Note : Les composés de cette classe thérapeutique, injectés à cette dose sont parfaitement tolérés dans la littérature et n'induisent pas d’évènements indésirables à la dose utilisée. Ces derniers seront néanmoins surveillés lors de chaque manipulation. 3/ En fonction des expériences, un prélèvement sanguin final de grand volume, pouvant induire un arrêt cardiaque, sera pratiquée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil, suivi d'une mise à mort par dislocation cervicale.

Devenir

Les animaux ayant atteint un point limite par rapport à la grille de score, seront euthanasiés. En fonction des besoins de l'expériences et de l'avis vétérinaire, les animaux inclus en expérience n'ayant pas atteint les points limites seront soit euthanasiés en fin de procédure pour un prélèvement terminal sans réveil suivi d'une nécropsie, soit reformées pour entrainement aux geste techniques sur avis vétérinaire. Les souris non entrées en protocole seront reformées pour entrainement aux geste techniques.

Remplacement

S’agissant d’analyses pharmacocinétiques, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs et robustes. De plus, les candidats médicaments étudiés dans ce projet se comportant de façon identique dans la souris comme chez l’humain (cible exprimée de la même façon et sans mutation entre les deux espèces), aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris.

Réduction

Le procédé de micro-échantillonnage lors des prélèvements sanguins permet d’obtenir l’ensemble des valeurs pour un même animal en ne lui prenant que de très faibles quantités de sang. Le nombre d’animaux utilisés est ainsi considérablement réduit par rapport à un prélèvement sanguin classique et les variations inter-individus sont également mieux maitrisées. Ainsi, seuls 4 à 5 animaux par groupe seront nécessaires pour ces expériences. Une majoration de 20% sur ce nombre d’animaux est appliquée en cas de problèmes à l’injection ou en cas de manque d’homogénéité entre les différents animaux au moment de l’entrée en expérimentation (pouvant mettre en péril les résultats de cette expérience).

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté ainsi qu'un enrichissement de l’environnement (coton pour nidification, tunnels, bâtons à ronger, ou équivalents). Avant la mise en place du protocole, les souris seront acclimatées pendant une période d’une semaine afin de limiter leur stress. Afin de de mettre en évidence tout signe de souffrance ou d’évènements indésirables pouvant provenir du traitement, les animaux seront suivis quotidiennement et avant chacun des prélèvements (10 min, 6h, 1 jour, 3 jours, 7 jours) puis deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Les animaux seront également pesés avant le traitement, puis 1 jour, 3 jours, 7 jours post-traitement, puis deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Les animaux seront euthanasiés à la fin du dernier prélèvement (à 28 jours post-traitement). Une grille de score suffisamment prédictive et adaptée à l’étude, permettra d'éviter la souffrance des animaux avec une surveillance physiologique et comportementale. Un système de surveillance sera mis en place avec l’Etablissement Utilisateur (EU) pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue les autres jours, y compris le WE. Un prélèvement sanguin final de grand volume (par piqure dans le coeur) pourra être effectué sous anesthésie/antalgie générale sans réveil suivi d’une mise à mort par dislocation cervicales. Les prélèvements d’organes seront réalisés après la mort de l'animal.

Choix des espèces

Les études pharmacocinétiques nécessitent d’être effectuées dans un organisme vivant. La souris est une espèce animale à la fois petite et bien caractérisée pour ces études (permettant de transposer ces données chez l’Homme). En plus, les données d’efficacité anticancéreuses et de tolérances seront également générées sur cette espèce animale afin de déterminer au mieux les doses cliniques à injecter de ces candidats médicaments. Des souris de souche CD-1 seront utilisées car plus massive et bien adaptée à ces expériences nécessitant des prélèvements répétés. Ces animaux seront inclus en expérience à des âges de 8-9 semaines. A cet âge-là, les animaux sont adultes avec un système immunitaire et des organes matures permettant une pharmacocinétique pertinente par rapport au type de thérapies utilisées dans ce projet.

Anesthésiées, greffées avec des cellules cancéreuses humaines sous la peau ou directement dans le poumon, le pancréas, le foie ou le cerveau, 2 000 souris aux défenses immunitaires réduites voient leur tumeur croître pendant huit semaines au maximum. S'ajoutent une séance d'imagerie sous anesthésie par semaine, une injection de nanoparticules, puis une séance de radiothérapie de vingt minutes. Le niveau de souffrance déclaré est modéré, et le porteur note que le modèle de souris immunodéprimée "est une nuisance en soi", tout en écrivant que la radiothérapie ne devrait pas provoquer d'effets indésirables. Elles sont tuées à la fin pour que la tumeur et les organes soient prélevés et analysés.

Objectifs

Selon les données récentes de l'Organisation mondiale de la santé (OMS), environ 19,3 millions de nouveaux cas de cancer ont été diagnostiqués en 2020, et les projections estiment que ce nombre atteindra près de 30 millions d'ici 2040. La radiothérapie est un traitement clé dans la prise en charge du cancer, utilisée chez environ 50 à 60 % des patients à un moment de leur parcours thérapeutique. Elle consiste à utiliser des rayons pour détruire les cellules cancéreuses tout en préservant au maximum les tissus sains. La radiothérapie est particulièrement efficace dans le traitement des cancers du sein, de la prostate, du poumon et des cancers de la tête et du cou. Elle reste donc un pilier essentiel des stratégies thérapeutiques, notamment pour les cancers localisés ou en complément d'autres traitements comme la chirurgie et la chimiothérapie. Un développement prometteur pour renforcer l'efficacité de la radiothérapie est l'utilisation de de deux types de particules de très petite taille appelées nanoparticules : 1) des nanoparticules en métal qui permettrait d'augmenter localement la dose de radiation absorbée par les cellules cancéreuses et d’amplifier les dommages infligés aux cellules tumorales lors de l'exposition aux rayonnement, ou 2) des nanoparticules remplies avec une drogue anticancéreuse qui peuvent s'ouvrir avec la radiothérapie permettant de libérer la drogue anticancéreuse localement dans la tumeur. L'intégration des nanoparticules dans les traitements de radiothérapie pourrait ainsi représenter une avancée majeure dans l'optimisation des thérapies contre le cancer, permettant d’améliorer la précision des traitements, et de réduire les effets secondaires. L’objectif de ce projet est de tester l’utilisation de nanoparticules, soit métalliques soit chargées en drogue anticancéreuse, améliorant la radiothérapie dans différents types de cancer. Ce projet se déroulera sur deux sites. Sur le premier (EU1), auront lieu : l’implantation des cellules cancéreuses et le suivi de croissance tumorale. Sur le deuxième (EU2), auront lieu les radiothérapies.

Bénéfices attendus

L'objectif du projet est de développer de nouvelles particules pour pouvoir proposer un schéma de traitement optimal avec une bonne efficacité thérapeutique pour un transfert vers un essai clinique chez l’homme.

Procédures

Interventions sur les animaux : anesthésie générale (EU1, entre 5 et 25 minutes), implantation sous cutanée et croissance de tumeur sous-cutanée (EU1, durée environ 10 minutes, 1 fois, suivi sur 8 semaine maximum), chirurgie d'implantation de cellules cancéreuses (EU1, durée environ 20 minutes, 1 fois), croissance de tumeur dans leurs sites d'origine (poumons, pancréas, foie, cerveau , 8 semaines maximum), anesthésie pour imagerie médicale (EU1, durée environ 15 minutes, 1 fois/semaine, 8 semaines maximum), injection de produit de contraste et/ou de particules (EU2, 1 fois), radiothérapie (EU2, durée environ 20 mimnutes,1 fois). Le modèle de souris avec des défenses immunitaires réduites est une nuisance en soi.

Impact sur les animaux

L’inoculation de tumeur peut induire des douleurs que ce soit en sous-cutanée ou en sur le site de la tumeur originelle. La radiothérapie ne devrait pas engendrer d’effets indésirables. Les procédures d'imagerie sont indolores. Si les traitements ne sont pas suffisamment efficaces, la tumeur continuera de grandir et pourra causer des douleurs, l‘étude sera alors interrompue.

Devenir

Les animaux issus des procédures seront mis à mort afin de prélever la tumeur et des organes pour des analyses anatomopathologiques.

Remplacement

Nous aurons, par une série de tests sur cellules en culture in vitro, sélectionné les particules d’intérêt. Grace à des tests complémentaires sur des tumeurs en culture 3D, nous nous focaliserons sur environ 20 particules différentes, constituant les candidates les plus prometteuses. Les paramètres d'efficacité thérapeutique sont obtenus uniquement par l’emploi d’animaux. Ces études précliniques sont nécessaires avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n’existe pas de modèle non biologique ou in vitro permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques.

Réduction

Les tests in vitro permettront de réduire le nombre de particules à tester ainsi que le nombre de lignées de cellules. Cela nous permettra d’éviter de tester toutes les particules candidates sur animal. Concernant les tests sur animaux, nous nous efforcerons de faire en sorte que l’effectif utilisé soit minimal. Cela permettra ainsi de réduire le nombre d’animaux employé autant que possible tout en obtenant des informations scientifiques avec une validité statistique suffisante. Les particules qui seront validées après cette première étape seront injectées chez des souris porteuses de tumeurs afin de tester leur efficacité thérapeutique. Dans chaque procédure le nombre d’animaux pourra être réduit jusqu’à 50% si l’effet attendu est suffisamment important pour obtenir des résultats statistiquement fiables avec la première moitié d’animaux ou si les données se révèlent non pertinentes (arrêt alors des expérimentations). Le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe afin de ne pas compromettre la validité des expériences. Ce nombre a été estimé à l'aide d'une approche statistique.

Raffinement

Les souris utilisées dans ce projet ont des caractéristiques nuisibles pour leur santé, des mesures compensatoires de raffinement ont donc été prises pour leur hébergement : mesures d’hygiène supplémentaires, les cages sont stériles et jetables, la litière, les croquettes et l'enrichissent sont également stérilisés. L’étude se déroulera sur une période qui, dans la vie des animaux avec des défenses immunitaires réduites, se situe bien en amont des complications liées à l’âge chez ces animaux. Les chirurgies se feront sous anesthésie générale et la douleur sera gérée par une analgésie adaptée. Le transport entre les EU s’effectuera dans des boites de transport avec enrichissement, boisson et nourriture. L’application de critères d’arrêt et le suivi quotidien des animaux garantiront leur bienêtre, et nous permettront d’intervenir immédiatement de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Toute forme de nuisance ou effets indésirables des procédures expérimentales seront attentivement surveillées lors de l'observation des animaux. Ces effets indésirables sont listés parmi les points limites de chaque procédure. L’utilisation de souris avec des défenses immunitaires réduites permet l'étude de lignées cancéreuses humaines sans phénomène de rejet. La croissance des tumeurs sera suivie régulièrement au pied à coulisse et par imagerie médicale.

Choix des espèces

Les souris immunodéprimées de 5 semaines permettent le développement de modèles tumoraux humains sans phénomène de rejet. À ce stade de développement, on obtient des souris adultes avec des tumeurs bien installées, juste avant que leur système immunitaire, en particulier les cellules qui combattent les infections et les tumeurs, n'atteigne son niveau maximal de production à 8 semaines. Les méthodes utilisées pour induire une tumeur sont rapides et reproductibles et la bonne connaissance de ces modèles de pathologie chez la souris fait que les limites éthiques de ce type d’expérimentation sont bien connues.

6 176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales, jusqu'à deux injections dans le sinus rétro-orbitaire, quatre injections intrapéritonéales, trois gavages hormonaux, deux prélèvements sanguins et une irradiation de six minutes et cinquante-quatre secondes. Le porteur décrit des tumeurs pouvant entraîner des difficultés respiratoires, des ulcérations, des nécroses, des automutilations et l'isolement des animaux, celles dont le système immunitaire est absent y étant plus exposées. Les retombées annoncées, mieux choisir les traitements et repérer les patients qui répondent aux immunothérapies, sont renvoyées au long terme, tandis que le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'évolution d'un "organisme entier" au cours du développement des cancers.

Objectifs

Les points de contrôle immunitaires sont des protéines qui interagissent avec les cellules du système immunitaire, appelées lymphocytes T, pour réguler leur activité une fois qu'une infection est éliminée. Cependant, dans le cas d’un cancer, les cellules tumorales utilisent ces protéines pour bloquer l’action des lymphocytes T, ce qui leur permet d’échapper au système immunitaire. Pour contrer cela, des médicaments appelés « inhibiteurs de points de contrôle immunitaires » ont été développés. Ils réactivent les lymphocytes T pour qu'ils attaquent les cellules cancéreuses. Ces traitements ont révolutionné le traitement de certains cancers, comme le mélanome avancé. Cependant, beaucoup de patients ne répondent pas à ces traitements ou rechutent dans les cinq ans. Il est donc crucial de mieux comprendre comment les voies cellulaires et moléculaires sont mises en place lors de traitements et de trouver des moyens de prédire qui va y répondre. La protéine Eomes, présente dans les lymphocytes T, joue un rôle important dans la lutte contre les tumeurs, mais on ne sait pas encore clairement comment elle influence la réponse à ces traitements. Les premières recherches montrent que plus il y a d'Eomes, meilleure est la réponse contre le cancer. Ce projet vise à comprendre comment Eomes agit sur l'efficacité des traitements contre le cancer, en utilisant des modèles de cancer chez la souris. Cela permettra de savoir si les lymphocytes T possédant Eomes sont les cibles principales des inhibiteurs des points de contrôle immunitaires.

Bénéfices attendus

La compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires mis en place lors du traitement par les inhibiteurs des points de contrôle immunitaires permettra d’améliorer la compréhension des réponses immunitaires impliquées dans la réponse antitumorale et ainsi de comprendre pourquoi certains patients sont réfractaires aux thérapies actuellement utilisées. À terme, cette étude aura donc pour but de mieux sélectionner les traitements, d’augmenter l’efficacité des traitements déjà existants, et potentiellement d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Tous les gestes invasifs seront réalisés sous inhalation d'isoflurane (2% + mélange air/oxygène). Une attention particulière sera portée au suivi par des personnes formées et compétentes. Les injections en sous cutanée ont une durée de 1 minute par souris et sont réalisées une seule fois. Les injections en intraveineuse au niveau de la veine caudale durent 5 minutes et sont réalisées une seule fois. Les injections en intraveineuse au niveau du sinus retro-orbital durent 1 minute et sont réalisées 2 fois avec un jour d’intervalle entre les deux injections. Les prélèvements de sang en sous-mandibulaire durent 1 minute par souris et sont réalisées 2 fois avec 3 semaines d’intervalle entre les deux prélèvements. Les injections intrapéritonéales ont une durée de 1 minute par souris et sont réalisées 4 fois avec 2 jours d’intervalle entre chaque injection. L’administration par gavage d’un traitement hormonal a une durée de 2 minutes par souris et sera réalisée 3 fois par souris. L’irradiation a une durée de 6 minutes et 54 secondes et est réalisé une seule fois.

Impact sur les animaux

Les modèles tumoraux murins induits dans ce projet vont engendrer le développement de tumeurs pouvant entraîner des difficultés de déplacements. Un défaut d’alimentation et/ou de boisson et une perte de poids de l’animal peuvent apparaître. De plus, les tumeurs pourraient éventuellement induire des troubles fonctionnels chez l'animal comme des difficultés respiratoires ou une augmentation du rythme respiratoire ainsi qu’une altération de la température corporelle. Des troubles comportementaux pourraient survenir tels que des auto-mutilations,des défauts de toilettage et de nidification ainsi que l’isolement. L’état général des souris pourrait être altéré. Les tumeurs peuvent également présenter des ulcérations ou des infections. Lors de la régression tumorale favorisée par l’action des combinaisons d’immunothérapies, des nécroses peuvent être visibles sans saignements ni rougeurs. L’absence de système immunitaire chez certaines souris du projet les rendent plus sensibles au développement et à la progression tumorale ainsi qu’aux ulcérations, infections et invaginations de la tumeur.

Devenir

Les animaux qui ont développé des tumeurs seront mis à mort afin de réaliser des analyses sur les cellules purifiées à partir des organes prélevés (moelle osseuse ou tumeurs, ganglions drainants la tumeur et rate). Ceci nous permettra d’évaluer l’efficacité des immunothérapies sur la réponse immunitaire anti-tumorale.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale dans le cadre de cette étude se fait après de nombreuses études in vitro dans des modèles cellulaires. Le principe de remplacement n'est pas applicable à ce projet car les études in vitro ne sont pas capables de prendre en compte la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du développement de cancers. Ces études in vitro ne reproduisent pas l'ensemble des voies impliquées dans des modèles physiologiques intégrés et par conséquent ne permettent pas l'obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine. Cependant, il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro capable de prendre en compte toute la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du développement de cancers.

Réduction

L’ensemble des expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux grâce à des études préliminaires qui nous ont permis de maîtriser ces modèles murins. Les résultats actuels ont permis de valider que des lots de 10 souris par génotype selon les paramètres à évaluer permettent d'acquérir des données fiables. La stratégie d’expérimentation sera une étude longitudinale. Cette approche expérimentale permet d’appliquer un modèle statistique pour un plan en mesures répétées et permet d’avoir une puissance de test importante car chaque animal est observé à différents temps et devient son propre contrôle. Un test statistique sera utilisé pour les expériences du projet. Dans ce projet, nous utilisons un modèle de mélanome murin dans lequel les cellules cancéreuses émettent de la lumière. Par imagerie, nous sommes capables de visualiser la progression tumorale et les métastases au cours du temps et ce de manière non invasive en ré-utilisant les mêmes animaux. Par ailleurs, dans ce projet, nous injecterons simultanément des cellules immunitaires (Lymphocytes T) compétentes et déficientes pour une protéine d’intérêt dans une seule et même souris dont le système immunitaire est non fonctionnel, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisé.

Raffinement

Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale que nous prenons en considération grâce au suivi quotidien des animaux dès l’initiation des modèles de cancers. Ainsi, l’expérimentateur impliqué dans le projet observera le comportement et mesurera le poids des animaux tous les deux jours à compter de l'initiation des modèles de cancers jusqu'à la fin de l'expérimentation. Toutes modifications de la prise de nourriture/boisson, de la posture, des déplacements, de la sociabilité et de la nidification seront observées. En cas de déshydratation et de perte de poids inférieur au seuil défini dans les points limites, de la nourriture et de l’eau sous forme de gel seront ajoutés. Les comportements d’agressivité seront également surveillés et du coton sera ajouté. Suite à l’induction des modèles tumoraux, des nécroses inflammatoires avec apparition d'une invagination au centre de la tumeur, de petits saignements et de rougeurs sur le pourtour de la tumeur peuvent se développer et seront nettoyées avec de la Vétédine. Pour diminuer la souffrance et la douleur liée aux procédures expérimentales et au développement de cancers, un traitement analgésique en locale (lidocaïne) sera administré aux souris au niveau de ces nécroses inflammatoires. Par ailleurs, des grilles d’expressions faciales des souris mises à disposition dans l’animalerie sont consultées pour détecter la douleur, la détresse ou la souffrance des animaux. De manière concomitante, des points limites ont été définis en concertation avec les zootechniciens pour détecter une dégradation trop importante de la santé et du bien-être des animaux et arrêter l’expérimentation. Pour éviter la mort à cause d’une éventuelle infection des souris dont le système immunitaire est non fonctionnel, ces souris seront hébergées en portoir ventilé, manipulées sous hotte avec port de gants, masque, combinaison, surchaussures et charlotte. Certains actes seront réalisés sous anesthésie générale et/ou sous anesthésie locale suivies d’un réveil des animaux sur tapis chauffant. Par ailleurs, les animaux sont hébergés en groupes sociaux harmonieux dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification, bâtonnets à ronger). Enfin, l'eau et la nourriture sont mises à disposition "ad libitum" et de la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et atténuer les bruits environnementaux.

Choix des espèces

Les modèles de l’espèce animale Mus musculus sont à la base de la compréhension des mécanismes de reconnaissance par le système immunitaire et ont permis ces dernières années d’importantes avancées thérapeutiques dans ce domaine. En effet, ces modèles sont très utilisés dans le criblage de nouvelles molécules, car, du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et chez la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à la compréhension de la résistance des cellules tumorales aux traitements. Par exemple, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour les molécules d’intérêt Eomes (délétion dans les lymphocytes T). Aucune autre espèce animale avec ces caractéristiques génotypiques pour ces protéines n’est disponible. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc...) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. L’ensemble des expériences du projet sera réalisé sur des jeunes adultes soit des animaux âgés d’environ 6 à 8 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise tumorale.

460 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des tumeurs se développent chez elles après induction d'un transgène, avec douleurs et lésions attendues, 60 souris subissant quatre prélèvements sanguins par ponction rétro-mandibulaire sur deux mois et 30 une administration intraveineuse. Le porteur annonce comme retombée d'ouvrir "une nouvelle voie d'exploration pour d'éventuelles thérapies", quand l'objectif immédiat est de montrer qu'une enzyme mutagène favorise l'apparition de tumeurs chez l'animal vivant. Il justifie le recours à la souris par le "besoin" d'observer la tumorigénicité dans le cadre d'un "organisme entier", malgré les modèles in vitro dont il dispose.

Objectifs

Une source importante de mutations observées dans les génomes de nombreux types de tumeurs est liée à certaines enzymes. L’objectif de ce projet est dans un premier temps de montrer que certaines enzymes (A3A) peuvent-être impliquées dans la survenue de cancers in vivo. Nous disposons de données obtenues en culture montrant que l’enzyme A3A peut muter des gènes impliqués dans la carcinogenèse. Ce projet nous permettra de montrer directement au sein de l’animal l’implication de A3A et d’autres molécules dans la survenue des cancers ou dans un début de pathologie tissulaire.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence l’activité mutagène de A3A in vivo. Nous espérons montrer également que d’autres molécules pourront contrecarrer l’effet mutagène de A3A chez l’animal. Le but du projet est d’améliorer la connaissance des mécanismes de tumorigénèse et l’implication de A3A dans ce processus. Ceci ouvrirait une nouvelle voie d’exploration pour d’éventuelles thérapies.

Procédures

Prélèvements sanguins de sang veineux par ponction dans la veine rétro-mandibulaire (sur 60 souris), quelques secondes par prélèvements ; et 4 prélèvements quinzomadaires/souris (pendant 2 mois) ; un antibiotique sera ajouté dans l’eau de boisson des souris. Administration intraveineuse,1 unique administration par souris (sur 30 souris) ; durée de l’acte : quelques secondes

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sur les animaux seront principalement la douleur et les lésions dues à la genèse des tumeurs. L’apparition des tumeurs suite à l’expression du transgène par l’administration de l’inducteur est liée à une douleur en principe de sévérité modérée, qui peut comporter une diminution d’activité seulement de quelques jours et une diminution de poids ne pas dépassant 20% si pas d’atteinte de points limites. Etant donné les caractéristiques de l’étude, nous évaluerons mieux la condition des animaux par la grille de Body Condition Score (BCS) (plus fiable et a adaptée pour ce type d’étude que le Body Weight (BW) due à l’ éventuelle apparition de tumeurs qui peut fausser ce dernier paramètre) A son tour, les prélèvements sanguins rétromandibulaires ou l’administration de substances via la veine de la queue peut induire une douleur et un inconfort léger de courte durée liés à l’introduction de l’aiguille.

Devenir

Les souris utilisées dans le cadre de ce projet seront mises à mort pour analyse tout au long de chaque procédure à des points définis ou en fonction de l’état des souris (signes cliniques de détresse/souffrance suite à survenue de tumeurs). En tout cas à la fin des procédures toutes les souris restantes seront mises à mort et les organes cibles prélevés pour analyse.

Remplacement

Malgré disposer de quelque modèle in vitro, le recours à la souris pour ce projet se justifie par le besoin d’avoir accès aux effets de tumorigénicité en présence des transgènes d’intérêt dans le cadre de l’organisme entier (affectation différents organes, circulation des exosomes par voie sanguine)

Réduction

Le nombre d’animaux que nous estimons nécessaire est basé sur notre expérience préalable et corroboré par l’avis des biostatisticiens pour être surs d’utiliser le nombre minimum d’animaux nécessaire, avec le maximum d’information par animal, afin d’attendre l’objectif fixé avec des résultats fiables. Quand cela sera possible, les animaux seront leur propres témoins (i.e. point a 21 jours). Pour la production d’exosomes à utiliser dans la deuxième procédure, nous utiliserons du sang de certains animaux de la première procédure. Nous utilisons males et femelles afin de réduire le nombre d’individus en considérant qu’il ne devrait pas y avoir un biais de sexe quant à la formation tumorale

Raffinement

Nous suivrons quotidiennement les animaux sous traitement avec l’antibiotique ainsi que leurs contrôles. Nous serons particulièrement attentifs à tous les signes de détresse susceptibles de survenir afin de réduire/éliminer la souffrance des animaux, les signes cliniques externes (prostration, poils hérissés, jaunissement, corps dur à la palpation, perte de poids). Les animaux seront mis à mort quand cela sera nécessaire en fonction de leur état et en suivant des grilles d’observation de souffrance et les points limites spécifiques et précoces définis (évaluation du Body Condition Score (BCS) problèmes posturaux prolongés, corps dur à la palpation abdominale pouvant être associé à une tumoration/hepatomégalie). En cas de souffrance et avant la mise à mort au plus tard au bout de 24h après confirmation des signes cliniques externes, nous aurons recours au besoin de la nourriture humidifiée / gel hydrique, la réhydratation sous-cutanée ou le chauffage des animaux si hypothermie associée.

Choix des espèces

La souris est un mammifère de petite taille à reproduction rapide qui montre 90% d’homologie avec le génome humain, d’où l’intérêt majeur en recherche fondamentale et création de modèles pour des maladies humaines. Les souris utilisées seront des souris adultes de 2-6 mois car l’étude d’apparition de tumeurs porte sur les adultes et est longue.

64 souris privées de système immunitaire reçoivent chacune une greffe de cellules de glioblastome humain directement dans le cerveau, au cours d'une chirurgie de trente minutes. S'ajoutent trois injections de chimiothérapie sur trois jours consécutifs, trois séances d'irradiation de 4 Gy, des IRM de suivi et, pour 48 d'entre elles, jusqu'à vingt-cinq injections de la molécule testée sur cinq semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur attend une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les souris dont la tumeur se développe, ainsi qu'une dégradation de l'état général après l'irradiation du cerveau, avec sécrétions au museau et pelades sur la tête. Ces mêmes signes constituent les points limites du protocole, leur apparition déclenchant la mise à mort de l'animal, et le porteur annonce avoir adapté le suivi pour éviter d'y arriver.

Objectifs

L'étude a les objectifs suivants : • Déterminer l'efficacité in vivo de la molécule vasodilatatrice en présence de radiochimiothérapie en tant que composé candidat dans deux modèles de xénogreffes murines de glioblastome humain, déterminée par la survie des animaux et la charge tumorale. • Déterminer l'effet de la molécule vasodilatatrice sur l'hypoxie tumorale telle que déterminée par immunomarquage, afin de déterminer si elle peut augmenter la sensibilité tumorale aux rayonnements ionisants.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est une amélioration des stratégies thérapeutiques actuelles sur le glioblastome (RT+CT)

Procédures

Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - Chirurgie (implantation cérébrale de cellules tumorales sous anesthésie générale) : 30 minutes maximum par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal, 64 animaux sont concernés. - Injection intrapéritonéale de la chimiothérapie(animal vigile) : 3 fois sur 3 jours consécutifs ; 5 minutes maximum par animal, 64 animaux sont concernés. - Injection intrapéritonéale de la molécule (animal vigile) : 5 fois consécutifs par semaine pendant 5 semaines post radiothérapie au maximum ; 5 minutes maximum par animal, 48 animaux sont concernés. - Irradiation (sous anesthésie générale) : 3 séances de 4 Gy sur 3 jours consécutifs : 10 minutes maximum par animal, 64 animaux sont concernés. - Injection sous-cutanée de buprénorphine (animal vigile) : 1 fois avant la mise à mort pour tous les animaux ; 2 minutes maximum par animal, tous les animaux sont concernés. - Imagerie IRM pour suivi de croissance tumorale

Impact sur les animaux

Suivant l’expérience du laboratoire concernant les procédures expérimentales, nous nous attendons à avoir une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux qui auront un développement de tumeur. Toutefois, ces critères représentent les points limites de l’étude et ainsi, si l’un ou plusieurs de ces éléments apparaissaient, alors les animaux seraient mis à mort. Nous nous attendons également à une fatigue et une dégradation de l’état général (porphyrine autour des yeux et de la bouche, sécrétions au niveau du museau, pelades sur la tête) induit par l'irradiation cérébrale jusqu’à une semaine après l’irradiation. Nous avons adapté en conséquence le suivi des animaux, le raffinement des conditions expérimentales et le scoring afin d’anticiper et d’éviter l’exclusion des animaux par atteinte de points limites.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort dans le but de récupérer différents organes pour analyses post-mortem.

Remplacement

Les tumeurs sont connues pour être multi-compartimentales, c'est-à-dire qu’au-delà du simple compartiment de la cellule tumorale existent la vascularisation, l’hypoxie et l’inflammation qui influent fortement sur la croissance tumorale. L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et de réponses aux différents traitements. Dans ce projet, nous nous intéressons aux phénomènes de vasodilatation, impossibles à appréhender in vitro.

Réduction

L’utilisation des méthodes d’imagerie non invasive se conforme à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux car elles permettent de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur chez le même animal sans nécessité d’euthanasier plusieurs animaux à chacun des temps. Chaque animal est, dans ce cas, son propre contrôle et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. . Afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques, nous estimons qu’au minimum, 12 animaux par groupe au départ sont nécessaires afin de réaliser des tests statistiques puissants , et ainsi comparer les effets des différents traitements et ce, en fonction du temps. Ces 12 animaux sont calculés sur la base d’un test de puissance connaissant la variabilité intrinsèque des modèles tumoraux (environ 25%) basés sur nos travaux antérieurs et en espérant une valeur statistique de 5% pour une puissance de 80%. De plus, 4 animaux par groupe sont nécessaires pour évaluer le niveau d’hypoxie cérébral juste après la RT par une étude immuno-histochimique.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux (4 souris par cage) dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation et bénéficieront également d’enrichissement (roue d’activité, stimulation sensorielle par différents objets). Les animaux seront surveillés de leur arrivée à la fin du protocole par un personnel compétent afin de déterminer leur état (poids, apparence physique) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée quotidiennement pendant les phases critiques (implantation, irradiation) et 3 fois par semaine par la suite. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés et par le choix de points limites cohérents. Il est à noter que les animaux étant immunodéprimés, ils sont placés dans des cages ventilées individuellement par des portoirs spécifiques (portoirs Innovive), ces deniers étant eux-mêmes dans une zone spécifique et dédiée à la manipulation des animaux immunodéprimés pour la recherche en cancérologie.

Choix des espèces

La souris immunodéprimée est une espèce de choix pour évaluer l’évolution du volume tumoral dans le temps dès lors que les cellules tumorales utilisées sont d’origine humaine. Notre expertise des différents modèles de tumeurs cérébrales, nous a permis d’établir que suivant le type cellulaire, nous obtenons des tumeurs plus ou moins hypoxiques et plus ou moins vascularisés. Ces deux composantes, influençant la croissance tumorale et l’efficacité des traitements actuels, il est nécessaire de travailler avec ces différents modèles in vivo, afin de se rapprocher de la situation clinique. 3.4.11. Indiquez à quels stades de développement les animaux seront utilisés et le justifier : L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes, âgés de 8 à 12 semaines en début de protocole. Cela permettra le développement de tumeurs plus reproductibles. De plus, à ce stade, le cerveau est mature et il est possible de suivre l’évolution des animaux sur des temps longs. Cet âge leur confère également une résistance aux protocoles expérimentaux utilisés.

960 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant une greffe de cellules tumorales puis jusqu'à seize injections de traitement en deux mois. Elles sont anesthésiées pour être placées dans le dispositif qui irradie la tumeur, et toutes sont tuées pour que tumeurs et tissus soient analysés. L'objectif immédiat est de trouver la dose d'un antiviral, le brincidofovir, qui ralentit la tumeur sans l'éliminer, une dose pleinement efficace empêchant de mesurer l'effet de l'association avec la radiothérapie. Le porteur annonce un "changement radical" dans l'administration des radiosensibilisants. La baisse d'appétit, la réduction d'activité et les modifications du comportement social, elles, sont attendues dès la croissance des tumeurs.

Objectifs

Nous prévoyons d'étudier un agent antiviral, pour lequel des études précliniques ont montré qu'il possède des propriétés anti-tumorales et radio-sensibilisantes. L'immunothérapie est devenue un pilier du traitement du cancer, mais son utilisation en association avec la radiothérapie reste limitée. Le projet actuel vise à explorer la synergie potentielle entre ce médicament anti-viral et l'immuno-radiothérapie. Cela pourrait ouvrir la voie à de nouvelles combinaisons thérapeutiques et conduire à un changement radical dans l’administration concomitante de radio-sensibilisants, qui sont restés depuis des décennies bloqués sur des agents relativement anciens et parfois toxiques tels que les dérivés du platine, générant un gain thérapeutique relativement faible (gains de survie souvent de l’ordre de 5 à 10 % par rapport à la radiothérapie seule). Les objectifs de ce projet consistent à : 1-determiner dans un premier temps la dose de médicament permettant d’obtenir un ralentissement de la croissance tumorale sans toutefois induire une élimination totale de la tumeur. Il est à noter qu’il n’y a aucun intérêt à combiner une dose élevée et très efficace de médicament (permettant une élimination totale de la tumeur) avec la radiothérapie, car ceci empêcherait de voir l’effet de la combinaison. De plus, utiliser une très forte dose de médicament pourrait induire des effets secondaires, 2-ensuite, combiner le médicament avec la radiothérapie et l’immunothérapie afin d’évaluer l’effet anti-tumoral de la combinaison, 3-Enfin, comprendre les mécanismes biologiques impliqués en collectant les tumeurs pour réaliser des analyses de cytométrie de flux.

Bénéfices attendus

A travers ce projet, nous visons à minimiser les limitations des thérapies utlisées seules, à améliorer les résultats thérapeutiques et à augmenter la réponse globale des tumeurs en modulant les réactions immunitaires dans le microenvironnement tumoral. Cette stratégie de traitement à multiples facettes non seulement promet d'améliorer les résultats thérapeutiques actuels mais pourrait également nous conduire à développer de nouvelles stratégies de traitement antitumoral plus efficaces. Avec une conception expérimentale et une analyse des données approfondies, ce projet espère fournir une base solide et de nouvelles perspectives pour optimiser les traitements cliniques futurs tout en réduisant les effets secondaires des thérapies en question.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections de cellules tumorales (n=1, 25 secondes) et à des injections de traitements (au maximum 16 injections sur deux mois, durée 25 secondes), sous anesthésie locale. Les animaux vont recevoir une anesthésie générale afin de les placer dans les dispositifs qui permettent la réalisation des irradiations localisées au niveau des tumeurs (n=1, durée 12 minutes en tout).

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent subir un stress léger en raison de leur manipulation par l'expérimentateur, lors des procédures expérimentales (telles que les injections, etc.). Les animaux peuvent également ressentir douleur et inconfort légers à modérés lors des injections sous-cutanées pour l'implantation des tumeurs, les traitements de radiothérapie ou les traitements pharmacologiques. En raison de la croissance des tumeurs ou des effets secondaires des traitements, les animaux peuvent présenter des changements de comportement modérés, tels qu'une diminution de l'appétit, une réduction de l'activité ou des modifications du comportement social.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour études sur les tumeurs et tissus post-mortem.

Remplacement

Ce projet a pour but d’évaluer l'effet thérapeutique d'un agent antiviral, le brincidofovir, combinés à la radiothérapie et à des immuno-modulateurs sur la réponse tumorale. Ceci exige donc un système immunitaire dynamique complet (composé de toutes les cellules immunitaires) en interaction direct avec le stroma tumoral. L’étude du recrutement et de la réponse des cellules immunitaires dans la tumeur ainsi que leur interaction complexe nécessite le recours à un modèle animal vivant entier et ne peut pas être réalisé in vitro ni in silico.

Réduction

Afin de pouvoir observer des différences qui soient statistiquement interprétables entre les différents groupes de traitements, nous avons besoin d’utiliser des tests statistiques solides et adéquats. Ces tests exigent l’utilisation d’un nombre minimum d’animaux par groupe. Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux à utiliser nous permettant d’atteindre les objectifs du projet, nous avons réalisé une analyse statistique a priori, afin de calculer le nombre d’animaux nécessaires pour détecter des différences significatives pour chaque procédure expérimentale. De plus, notre expertise dans le domaine de la radiobiologie ainsi que les données de la littérature nous permettent de réduire les conditions expérimentales et donc réduire le nombre d’animaux. Le critère de jugement principal pour le calcul de puissance est la taille tumorale . Ce critère est aussi utilisé pour la randomisation des animaux. La randomisation est réalisée de façon à avoir la même moyenne taille tumorale dans chaque groupe de traitement. Ce plan d'étude et cette méthodologie stricts vont nous permettre d'avoir des résultats fiables et valides sur le nombre minimum d'animaux nécessaires.

Raffinement

Toutes les manipulations expérimentales seront menées en veillant à adhérer aux normes les plus élevées pour minimiser la douleur et le stress chez les animaux. Une anesthésie adéquate sera utilisée pendant les expériences. Les conditions d'hébergement des animaux seront optimisées, en fournissant l'environnement et la nourriture nécessaire. Leur environnement sera enrichi avec du coton ou des maisons en carton afin de diminuer leur angoisse. Le comportement et l'état de santé des animaux seront surveillés quotidiennement, pour identifier et traiter toute anomalie. Les souris seront élevées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. Une pesée sera effectuée régulièrement. Les points limite précoces définis seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie et des réponses immunitaires pendant le développement tumoral. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues et de nombreuses études ont déjà validé des découvertes faites chez la souris en les appliquant pendant des essais cliniques, ce qui facilite le transfert des résultats obtenus chez la souris en clinique. Les souris seront utilisées à un âge de 8 ou 9 semaines, âge auquel les souris sont suffisamment matures.

Une injection de cellules tumorales sous la peau ou dans le sang, puis des injections dans l'abdomen ou des gavages trois à cinq fois par semaine, et une à deux séances d'imagerie sous anesthésie chaque semaine : 5 505 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que les tumeurs du flanc gênent les déplacements aux stades avancés et que les métastases pulmonaires peuvent provoquer une détresse respiratoire. Le protocole court sur huit semaines, jusqu'à quatre-vingt-dix jours de traitement pour certaines expériences, afin de chercher de nouvelles cibles contre la résistance thérapeutique du mélanome. Aucun seuil n'est donné pour les critères d'arrêt annoncés comme précis et précoces, et l'effectif de 5 505 souris est rapporté à un logiciel d'analyse de puissance qui n'est pas nommé.

Objectifs

Le mélanome cutané est le type de cancer de la peau le plus grave avec un fort taux de mortalité associé aux stades avancés de la maladie. Même si le développement récent des thérapies ciblées et de l’immunothérapie a permis d’améliorer considérablement la prise en charge des patients atteints de mélanome avancé, certains patients ne répondent pas à ces traitements et de nombreux rechutent en raison du developpement de résistances à ces traitements. L’un des enjeux majeurs de la cancérologie cutanée pour les années à venir est donc d’identifier de nouvelles cibles/stratégies permettant de prévenir ou de contourner les situations d’échappement thérapeutique. Notre projet propose d’explorer l’implication possible de certains de nouvelles protéines dans la réponse thérapeutique du mélanome avancé afin de révéler des cibles/stratégies nouvelles pour éliminer les cellules résistantes à ces traitements.

Bénéfices attendus

Notre projet propose d’explorer l’implication possible de nouvelles protéines dans la réponse thérapeutique du mélanome avancé afin de révéler des cibles/stratégies nouvelles pour éliminer les cellules résistantes à ces traitements. Nos travaux devraient permettre de mieux comprendre les processus responsables du développement métastatique et de l'échappement au traitement des mélanomes et pourraient à terme permettre d'identifier de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les interventions réalisées sur les animaux seront les suivantes : injection sous-cutanée ou intraveineuse unique de cellules tumorales (durée: moins de 1 minute/souris), injections intrapéritonéales et/ou des gavages oraux à raison de 3 à 5 fois par semaine (durée: moins de 1 minute/souris). Séances d'imagerie (bioluminescence) sous anesthésie : 1 à 2 fois par semaine (durée : moins de 30 minutes).

Impact sur les animaux

1/Contention et douleur induites lors de l'injection i.v ou s.c de cellules tumorales. Durée de la procédure : 1 minute/souris; 2/ Inconfort/ difficultés de déplacement dues à la présence de tumeurs sur le flanc aux stades les plus avancées de la croissance tumorale; 3/ Possible détresse respiratoire due à la présence de métastases pulmonaires aux stades les plus avancées de la dissémination métastatique; 4/ Possible inflammation lors des injections intrapéritonéales répétées; 5/ Introduction accidentelle de liquide dans la trachée ou les poumons lors des gavages oraux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour prélever les tumeurs et les analyser par biochimie, biologie cellulaire, analyse transcriptomique et histopathologique.

Remplacement

Pour satisfaire au remplacement, les études in vitro ont été réalisées sur des lignées cellulaires de mélanome et des cellules primaires de mélanome fraichement isolées de patients au lieu de cellules isolées à partir des animaux. Cependant, pour mieux comprendre les conséquences du ciblage des canaux calciques de type L dans la progression, la dissémination métastatique et la résistance thérapeutique du mélanome, il est indispensable de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas d’appréhender l’impact des antagonistes calciques sur le fonctionnement des différents types cellulaires qui composent le microenvironnement tumoral et leurs interactions avec les cellules tumorales.

Réduction

Pour satisfaire à la réduction, les souris « sauvages » seront commandées chez un fournisseur agréé afin de ne pas générer d’animaux surnuméraires. . L'utilisation d'un logiciel d'analyse de puissance et de tests statistiques appropriés nous a permis de réduire au minimum la taille des groupes permettant de démontrer une différence statistique.

Raffinement

Un effort de raffinement sera réalisé en utilisant préférentiellement des femelles de façon à limiter les risques de blessures consécutives aux agressions entre congénères. Pour réduire l'angoisse des animaux, nous hébergerons 6 souris/cage dans des conditions enrichies d’élevage (igloo en polycarbonate et une tigette en papier irradié pour permettre la nidification). Dans les différentes procédures, le suivi pondéral régulier des souris sera un bon indicateur de leur état général. Dans le cas d’injections intrapéritonéales répétées, nous effectuerons une rotation des sites d’injection et surveillerons quotidiennement l’aspect des sites d’injection. Le suivi sanitaire quotidien et nos visites régulières (au moins 3 fois par semaine en fonction des procédures) permettront de déceler précocement tout signe de douleur, de souffrance ou d’angoisse et d'appliquer les points limites que nous avons définis. Des critères d’arrêt précis et précoces ont été définis pour chaque procédure. Enfin, lorsque ce sera possible, nous aurons recours à l'utilisation de techniques d'imagerie non invasive pour suivre l'évolution de la tumeur, afin de prendre en compte et soulager au plus tôt toute douleur manifestée par les animaux. Lors des acquisitions d'images, les souris seront anesthésiées et placées sur un plateau chauffant de façon à éviter l'hypothermie

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris car la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les animaux seront utilisés à l'âge de 8 semaines pour une période de 8 semaines, certaines expériences pouvant aller à 90 jours de traitement. Enfin, les données in vivo de la littérature sont obtenues essentiellement sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour faire des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée.

Un prélèvement sanguin de grand volume par piqûre dans le cœur, sous anesthésie sans réveil et pouvant provoquer un arrêt cardiaque, attend chaque souris en fin d'expérience. 1 440 souris CD-1 vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et environ 288 d'entre elles, écartées du protocole faute d'un poids suffisant ou à cause d'un problème à l'injection, sont d'abord utilisées pour l'entraînement à des gestes techniques avant d'être tuées. Les autres reçoivent une injection dans la veine de la queue puis quatre prélèvements de sang par éraflure de cette même veine, sur vingt-huit jours, pour mesurer la tolérance de candidats médicaments anticancéreux. Le porteur affirme qu'un "organisme entier" et vivant est "nécessaire" et qu'"aucune alternative" ne peut se substituer à la souris.

Objectifs

Ce projet vise à déterminer la tolérance lors de l’administration des candidats de thérapie ciblée anticancéreuse. Les données de tolérance sont nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats anticancéreux dans la circulation sanguine en dose unique. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats de tolérance (projet actuel), seront objectivables entre l’humain et le modèle souris et serviront, à terme, à définir les modalités d'administration du médicament (dose et fréquences), lors des premiers essais cliniques. Ils permettront également d’objectiver des évènements indésirables. La première dose de cette étude sera déterminée en se basant sur une dose de référence connue, efficace et bien tolérée.

Bénéfices attendus

Les données de tolérance seront nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats anticancéreux dans la circulation sanguine. Ces études permettront de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité et ainsi, à terme, de déterminer les doses et les fréquences des premières études cliniques chez l’Homme.

Procédures

# Une contention et des prélèvement(s) sur animal vigile seront prévues sur chaque animal : -lors de l’injection par voie intraveineuse dans le veine de la queue des candidats anticancéreux J(0) (5minutes) -lors de chacun des prélèvements sanguins (en éraflant la veine de la queue pour ne prélever qu'une goutte de sang) à chaque temps (J(-3), J(0), J(3) et J(9) post-traitement - 5 minutes). Une anesthésie générale sans réveil sera effectuée sur chaque animal en fin d’expérimentation et/ou atteignant les critères éthiques pour effectuer un prélevement sanguin final de grand volume, suivie d’une mise à mort (10 minutes).

Impact sur les animaux

Projet en sévérité modérée: # Les animaux subirons un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : (1) changes, (2) pesées, (3) contentions et (4) anesthésies. # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors : (1) de l’injection par voie intraveineuse des candidats anticancéreux (au temps J(0)), et (2) de chacun des prélèvements sanguins (en éraflant la veine de la queue pour ne prélever qu'une goutte de sang) à chaque temps (J(-3), J(0), J(3) et J(9) post-traitement). Ces prélèvements faibles sont généralement très bien tolérés par l'animal. # S’agissant d’une expérience de tolérance, les composés de la classe thérapeutique utilisée peuvent induire des évènements indésirables à haute dose (parmi les plus attendus : perte d’appétit, fatigue, diarrhées, perte de poils…). Il est à noter que ces effets sont généralement transitoires (environ une semaine pour les doses les plus fortes et culminant autour du 3ème jour post-traitement). Il est à noter que ces études ne sont pas conditionnées à une atteinte de la dose maximale tolérée chez l'animal et que la dose maximale de cette étude est plafonnée à une dose considérée comme bien tolérée en clinique pour cette classe de médicaments. # Un prélevement sanguin final de grand volume, pouvant induire un arrêt cardiaque, sera pratiquée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil sur l’ensemble des animaux arrivant en fin d’expérience (à 28 jours post-traitement) ou en cas d'atteinte des critères éthiques.

Devenir

# Tous les animaux ayant atteint les critères éthiques ainsi que les animaux arrivant en fin d’expérience à 28 jours post-traitement auront un prélèvement sanguin de grand volume (par piqure dans le coeur) effectuée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil. # Les animaux non entrées en protocole (problème à l'injection, poids inférieur à 24g... env 20%), seront réutilisées pour pouvoir pratiquer des entrainement aux geste techniques, puis mises à mort selon les critères de la formation sous controle de la SBEA et/ou controle vétérinaire.

Remplacement

S’agissant d’analyses de tolérance, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. De plus, les candidats médicaments de thérapie ciblée anticancéreuse étudiés dans ce projet ayant une efficacité comparable entre humains/souris aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris.

Réduction

Le procédé de micro-échantillonnage lors des prélèvements sanguins permet d’obtenir l’ensemble des valeurs pour un même animal en ne lui prenant que de très faibles quantités de sang. Le nombre d’animaux utilisés est ainsi considérablement réduit par rapport à un prélèvement sanguin classique et les variations inter-individus seront également mieux maîtrisées. En cas d’obtention de la dose maximum tolérée, les animaux prévus pour les doses suivantes seront annulés. Les animaux étant livrés chaque semaine pour les différents tests de dose, cela permettra de diminuer le nombre d’animaux entrés en protocole. Pas d’utilisation de groupe contrôle nécessaire par rapport aux échantillonnages de par l’utilisation d’un prélèvement sur les souris en expérience à J(-3) avant traitement par les candidats anticancéreux (permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux).

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (coton pour nidification, tunnels, bâtons à ronger, ou équivalents). Avant la mise en place du protocole, les souris seront acclimatées pendant une période d’une semaine afin de limiter leur stress. Chaque essai de dose sera séparé du précédent d’une semaine, ce qui permettra d’ajuster au mieux les doses (ainsi que la souffrance résultant d’utilisation de doses trop élevées). Une surveillance comportementale et physiologique poussée des animaux ainsi que la définition d’une grille de score adaptée et suffisamment prédictive permettra d’anticiper et d’éviter au mieux toute souffrance animale. Les animaux seront observés sur critères physiques et comportementaux deux fois par jour pendant les trois premiers jours de traitement, puis une fois par jour jusqu’à la fin de l’expérience à J(28), et seront pesés une fois par jour pendant la première semaine, puis trois fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience à J(28). Un système de surveillance est mis en place au sein de l'établissement utilisateur pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue le week-end et les jours fériés. Les animaux inclus dans la grille de score n'atteignant pas les critères éthiques de mise à mort recevront des soins adaptés (alimentation et abreuvement facilités, réchauffement...). Une pommade antalgique/anesthésique pourra également être utilisée en cas d’inflammation au site d’injection. Le prélèvement sanguin final de grand volume sera effectuée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil et la mise à mort de l'animal sera assurée par surdose d'anesthesiques. Les prélèvements d’organes seront réalisés après la mort de l'animal.

Choix des espèces

S’agissant d’analyses de tolérance, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. De plus, les candidats médicaments de thérapie ciblée anticancéreuse étudiés dans ce projet ayant une efficacité comparable entre humains/souris, aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris. La souris est une espèce animale à la fois petite et bien caractérisée pour ces études. En plus, les données d’efficacité anticancéreuses et de pharmacocinétique (le devenir du médicament dans le sang au cours du temps) seront générées sur cette même espèce animale afin de déterminer au mieux les doses et les fréquences d'administration de ces candidats médicaments de thérapie ciblée anticancéreuse chez l'Homme. Les animaux seront livrés à 7 semaines de développement et inclus en expérience à 8 semaines . A cet âge-là, les animaux sont adultes avec un système immunitaire et des organes matures permettant une tolérance pertinente par rapport au type de thérapies utilisées dans ce projet.