Cancers

Une partie des souris utilisées est immunodéprimée, donc sans défense face à une infection banale. 2 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des candidats médicaments par voie orale, intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée, une à deux fois par jour, ou par une pompe implantée chirurgicalement sous la peau, l'intervention durant quinze minutes pour une pompe osmotique et une heure pour une pompe électronique, avec jusqu'à six prélèvements de sang en vingt-quatre heures sur animal vigile. Elles sont tuées en fin d'étude ou dès l'atteinte des points limites, pour un dernier prélèvement de sang sous anesthésie puis des prélèvements d'organes destinés à chercher des biomarqueurs, dans un programme de sélection de molécules en oncologie et en immuno-inflammation.

Objectifs

L’objectif de la pharmacocinétique (PK) est d’évaluer que la molécule soit correctement absorbée, distribuée, métabolisée et éliminée (ADME) par l’organisme afin de fournir les informations nécessaires à la sélection des médicaments. Cela permettra également d’adapter la posologie du médicament pour obtenir une efficacité optimale du principe actif avec un minimum de risques d’effets secondaires. L’objectif de ce projet est de déterminer les paramètres pharmacocinétiques d’un produit et/ou ses effets sur les paramètres hématologiques en fonction du temps, dans le but de déterminer le devenir du produit au sein d’un organisme, d’évaluer l’intérêt d’une voie d’administration, de vérifier que la relation entre la dose administrée et sa concentration plasmatique est linéaire et, pour les produits susceptibles d’agir de cette manière, d’évaluer leur profil d’activité via leur effet sur les paramètres hématologiques et biologiques. Bien que des tests in vitro visant à remplacer l’usage de l’animal sont mis en place, le recours aux modèles vivo pour discriminer in fine de façon certaine les candidats restent indispensables. Ces études pharmacocinétiques sont effectuées principalement 1) de façon préliminaire à une étude d’efficacité chez la souris (candidats choisis sur des tests in vitro de fonctionnalité) pour assurer le niveau plasmatique du candidat voulu aux doses envisagées. Le choix de la souris se fera sur la base du modèle utilisé lors des études d’efficacité pour transposer au mieux les données ; 2) afin de dérisquer la pharmacocinétique des candidats médicaments plus avancés dans leur processus de R&D, avant les études réglementaires obligatoirement réalisées chez une « grande espèce » non rongeurs. Dans les 2 cas, cette stratégie permet de réduire le nombre d’animaux dans les études ultérieures. En complément, il peut être nécessaire d’évaluer l’impact du candidat sur des cellules sanguines et les biomarqueurs associés pouvant servir de marqueurs d’activité pharmacologique. L’ensemble de ces études reste limité aux candidats très avancés dans la phase de recherche afin de réduire le nombre d’animaux utilisés Les études réalisées dans le cadre de ce projet prévoient des prélèvements sanguins en cinétique chez des souris après leur avoir administré un candidat traitement.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont d’une part de mieux comprendre l’exposition plasmatique des différents composés et d’autre part d’établir des relations pharmacocinétique / pharmacodynamie (PK/PD) dans un but de sélectionner le meilleur candidat médicament. Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche en oncologie, immuno- oncologie et immuno-inflammation.

Procédures

Administration (voie intra-péritonéale, intra-veineuse, sous cutanée ou per-os) de candidats médicaments (entité biologique ou chimique) (contention d’une durée maximale de 15s quotidienne ou biquotidienne sur animal vigile Ou Implantation chirurgicale sous anesthésie et analgésie de la pompe (durée de l’intervention de 15 minutes pour la pompe osmotique, 1 heure pour la pompe électronique) En cours d'étude, des prélèvements sanguins (moins de 30 secondes) avec un maximum de 6 prélèvements de sang sur 24 h peuvent être réalisés sur animal vigile

Impact sur les animaux

Les nuisances estimées sont les suivantes : - Administration de composés candidats médicaments selon les voies classiques intra-péritonéale, intra-veineuse, sous-cutanée ou per os pouvant induire ponctuellement stress et douleur légère (max 10s) - Implantation chirurgicale sous anesthésie d’une pompe osmotique (15 min) ou électronique (1 heure) pouvant générer une douleur modérée potentielle - Prélèvements de sang (moins de 30s par prélèvements) pouvant ponctuellement induire stress et douleurs légères

Devenir

En fin d’étude ou dès l’atteinte des points limites et de dégradation de l’état général, les souris seront euthanasiées et des prélèvements biologiques (et éventuellement la pompe) seront réalisés. Le process sera le suivant : prélèvement sanguin unique à la fin de l’étude, sous anesthésie générale puis prélèvements biologiques supplémentaires, pour rechercher d’éventuels biomarqueurs, après euthanasie toujours sous anesthésie.

Remplacement

Ces dernières années, les pharmacocinéticiens ont mis en place de nombreux tests in vitro visant à remplacer l’usage de l’animal. La majorité des études de pharmacocinétique est menée sur des récepteurs, enzymes, fractions cellulaires isolées, cellules isolées ou organes isolés. Cependant, même si les caractéristiques pharmacocinétiques d’une molécule dans l’organisme peuvent être estimées par des tests in vitro, elles ne peuvent pas être complètement et infailliblement prédites. Il est donc nécessaire d’avoir ensuite recours à l’animal pour discriminer de façon certaine les candidats les plus avancés et ainsi pré-sélectionnés. En effet, ce n’est que dans un modèle intégré que l’on pourra mettre en évidence le devenir d’un produit dans l’organisme. Celui-ci va subir un certain nombre de processus physiologiques avant d’atteindre son site d’action et d’être éliminé. C’est un préalable scientifique et éthique à toute administration chez l’homme et qui permet également de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour les études d'efficacité ultérieures.

Réduction

Des prélèvements de sang répétés à la veine saphène latérale ou à la veine caudale peuvent être mis en œuvre afin d’obtenir des informations sur des possibles biomarqueurs ou sur le profil d’exposition du composé (évitant dans ce cas les études de pharmacocinétique dédiées). La méthode de prélèvement sanguin par prélèvement répété est privilégiée chaque fois que possible (puisqu’elle est extrêmement rapide, et réalisable plusieurs fois sur un même individu dans la limite des recommandations de la Structure du Bien Être Animal). Les études in silico et in vitro réalisées en amont permettent de réduire le nombre de molécules d’intérêts et donc de réduire le nombre d’animaux utilisés. Afin d’obtenir des données robustes, les pharmacocinéticiens recommandent un effectif de 8 souris par lot avec pour chacune des souris plusieurs points de cinétique en accord avec les recommandations de la SBEA. Le nombre de groupes au sein d’une étude (6 maximum) permettra de tester plusieurs candidats médicaments, ou pour un même candidat médicament plusieurs voies d’administrations ou plusieurs doses pour un même candidat.

Raffinement

Les doses de produits à administrer à l’animal sont sélectionnées préalablement in vivo grâce à des études de Dose Maximale Administrable (DMA) et Dose Maximale Tolérée (DMT) (faisant l’objet d’un autre projet) afin de limiter les risques d’une potentielle toxicité des composés testés. Des prélèvements de sang répétés à la veine saphène latérale ou à la veine caudale peuvent être mis en œuvre afin d’obtenir des informations sur des possibles biomarqueurs ou sur le profil d’exposition du composé (évitant dans ce cas les études de pharmacocinétique dédiées). Cette technique de prélèvement, peu invasive et rapide, permet de prélever plusieurs fois sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux, tout en respectant les limites de volume de sang total physiologiques. Si des prélèvements répétés sont prévus, le volume maximal prélevé respectera les recommandations en termes de bien-être animal et respect de sa physiologie. L’utilisation de pompes pour administrer le produit testé permet de ne pas intervenir sur l’animal plusieurs fois par jour ou par semaine, contrairement aux administrations répétées, en limitant ainsi le stress. Les souris sont hébergées en groupes sociaux. Un enrichissement de milieu par des éléments de nidification adaptés vont également permettre de surveiller leur état général par l’observation de leur comportement vis-à-vis de ces éléments. Par ailleurs, pour l’implantation chirurgicale des pompes des améliorations techniques ont été identifiées pour assurer une bonne cicatrisation et récupération post-opératoire.

Choix des espèces

L’utilisation des souris est largement décrite dans les publications en recherche pré-clinique, ce modèle étant davantage déployé que le modèle rat. Plus précisément les études décrites ci-dessus se situant en amont des études d’efficacité réalisées sur différents modèles de souris, il est important de réaliser ces études sur la souche de souris qui sera utilisée dans ces études, mais également sur des modèles de souris qui permettent de prédire la PK chez l’homme. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 7 semaines, soit un poids corporel d’environ 18-20g. C’est l’âge classiquement utilisé pour tous les protocoles qui seront réalisés à la suite de cette étude dans la sélection des candidats médicaments.

3 552 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un carcinogène par injection puis trois cycles d'une molécule dans l'eau de boisson pour déclencher des tumeurs de l'intestin et du colon, six injections d'anticorps, un gavage de glucose suivi de cinq prises de sang en deux heures, et pour une partie d'entre elles seize semaines de régime gras. Le porteur écrit que la compréhension de ces mécanismes "pourrait conduire" à de nouvelles approches thérapeutiques, alors que les tumeurs poussent sans pouvoir être mesurées du vivant de l'animal. Une perte de plus de 20 % du poids initial déclenche la mise à mort, et le volume des tumeurs n'est mesuré qu'après.

Objectifs

La lutte contre les cancers gastro-intestinaux est un enjeu majeur de santé publique. Malgré certaines améliorations en matière de dépistage et thérapie, l'incidence, la prévalence et la mortalité des cancers du colon restent élevées dans les pays développés. En particulier, le pronostic des patients atteints de cancer colorectal (CCR) métastatique reste mauvais, avec un taux de survie de 10 pourcents à 5 ans, en raison de l'inefficacité des traitements actuels. Il est donc urgent de développer des traitements plus efficaces pour les patients atteints de cette maladie. Dans le CCR, un rôle clé des réponses immunitaires a été démontré dans la croissance de la tumeur et ce rôle est notamment influencée par les macrophages, des cellules immunitaires innées. Ce projet propose de s’appuyer sur l’étude de tumeurs colorectales murines afin (1) de caractériser les différentes populations de macrophages présentes dans la tumeur et en périphérie, (2) de déterminer le rôle fonctionnel de ces macrophages dans la réponse anti-tumorale et (3) d’étudier l’impact de différents traitements et conditions sur cette réponse. Notamment, nous nous intéresserons à l’influence de l’obésité (induite à l’aide de régimes alimentaires spéciaux) et l’influence d'un traitement sur la réponse innée dans le CCR. L’obésité est connue comme étant un facteur de risque de développement du CCR et reprogramme les macrophages intestinaux vers un phénotype pro-tumoral. Nous chercherons donc à caractériser l’impact de l’obésité sur l’efficacité d'un traitement via l’action des macrophages. Ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur l’implication des cellules myéloïdes dans les cancers primaires de l’intestin pour ainsi contribuer à long terme à améliorer la prise en charge et/ou le diagnostic des patients en clinique.

Bénéfices attendus

En 2023, en France métropolitaine, l'incidence du cancer colorectal était de plus de 47 000 nouveaux cas par an. Même si la mortalité (taux standardisé) par cancer colorectal est en baisse depuis les années 1990, celui-ci demeure la deuxième cause de décès par cancer tous sexes confondus. Nous proposons ici de caractériser au niveau moléculaire et cellulaire le mécanisme de surveillance immunitaire des cellules myéloïdes dans un modèle tumoral de cancer colorectal ainsi que de déterminer l’influence de l'obésité et d'un traitement sur cette réponse immunitaire innée. Ainsi, nous obtiendrons une compréhension intégrée du système immunitaire intestinal et colonique dans des conditions normales et pathologiques. La compréhension des mécanismes qui régulent les premières phases de l'immunité innée lors de la progression tumorale pourrait conduire à de nouvelles approches thérapeutiques pour prévenir ou améliorer l'espérance de vie des patients.

Procédures

Les souris seront soumises à : 1. un régime alimentaire riche en gras (animal vigil, tous les jours pendant 16 semaines), 2. un traitement pour induire des tumeurs intestinales et colorectales consistant en une injection intra-péritonéale (une fois par animal vigil, durée de quelques secondes) suivi de 3 cycles d’une semaine d’administration de traitement dans l’eau de boisson (chaque cycle est suivi d'au moins une semaine de repos sans traitement), 3. des traitements par injection d’anticorps en intra-péritonéal (6 fois par animal vigil, durée de quelques secondes), 4. un gavage oral de glucose (une fois par animal vigil, durée de quelques secondes) accompagné de prélèvements sanguins sur animal vigil (5 petits prélèvements successifs sur une période de 2 heures, durée de quelques secondes par prélèvement) afin d’évaluer la capacité à réguler la glycémie après 4 semaines de régime gras, 5. des injections intrapéritonéales de molécule permettant l’induction des modèles génétiquement modifiés (animal vigil, durée de quelques secondes par injection, 2-3 injections par semaine pendant un maximum de 16 semaines), 6. un gavage oral d'un agent permettant l’induction des modèles génétiquement modifiés (5 fois par animal vigil, durée de quelques secondes), 7. une euthanasie par une méthode réglementaire (durée de quelques secondes). Tous les prélèvements tissulaires se feront suite à l’euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

Notre projet propose d’étudier les cellules myéloïdes infiltrant la tumeur et nécessite donc d’induire le développement de tumeurs chez les souris via des modèles induits chimiquement (par deux molécules de traitement) ou via l’utilisation du modèle murin génétique. La première molécule est un carcinogène connu et son administration promeut le développement de tumeurs. L’administration de la seconde molécule peut lui entraîner une perte de poids. La localisation des tumeurs pourrait impacter la mobilité des animaux, leur alimentation, leur pelage et leur comportement. Dans le phénotype du modèle murin génétique, les effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont majoritairement liés à l'apparition spontanée de tumeurs intestinales. Les animaux vont alors subir le développement d'une ou plusieurs tumeurs pouvant amener à la dégradation de la condition physique, du stress, des douleurs. Les injections de molécules par voie intra-péritonéale pourront induire une douleur de courte durée aux animaux. Les gavages pourront induire une irritation de courte durée de l'œsophage. Les manipulations des animaux pourront également induire un stress de courte durée. Par ailleurs, dans le cadre de ce projet, certaines souris seront soumises à un régime enrichi en graisses. Ce régime entraîne une prise de poids qui sera étroitement surveillée tout au long de l’étude pouvant altérer la mobilité. Pour les explorations métaboliques, certaines procédures telles que la mise à jeun des animaux pendant quelques heures, le gavage de glucose et les prélèvements sanguins peuvent entraîner des périodes de stress et d’inconfort temporaires pour les animaux.

Devenir

Afin de répondre aux questions et enjeux scientifiques soulevés au cours de notre projet expérimental, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et impliquent donc l'euthanasie de l'ensemble des animaux.

Remplacement

Actuellement, il n’existe pas de substitut non animal capable de reproduire avec précision les mécanismes complexes impliqués dans la genèse du cancer colorectal (CCR) et les réponses immunitaires associées. Parmi les différentes espèces, la souris s’avère être la plus appropriée pour étudier cette pathologie. De plus, l’utilisation du modèle murin est nécessaire pour explorer la pathologie au sein d’un organisme complet, ce qui ne peut être fidèlement reproduit en se basant uniquement sur des cultures de cellules isolées.

Réduction

En prenant en considération les publications antérieures, notre expérience dans le domaine et en utilisant une méthodologie de calcul de la taille des échantillons basée sur un test de puissance, notre estimation est de 12 souris par groupe. Le nombre de souris nécessaires à l’expérimentation a été déterminé en tenant compte d’une réduction maximale du nombre d’individus tout en garantissant une significativité statistique des résultats. Lorsque cela sera possible et afin de limiter le nombre total de souris utilisées, nous essaierons de mettre en commun des souris contrôles pour l’étude de différents modèles murins. Le nombre total d’animaux prévu est de 3552 souris.

Raffinement

Le bien-être animal sera une priorité constante tout au long du projet afin de minimiser la douleur et le stress. Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées et de taille réglementaire contenant des éléments d’enrichissement (lanières de papier kraft et bâton en bois). La température et l’hygrométrie seront contrôlées et monitorées, le cycle jour-nuit sera réglé de manière automatique. Le change de la litière et de la nourriture se fera une fois par semaine minimum. Une période d’acclimatation d’une semaine précédera les expérimentations. L’accès à l’eau et à la nourriture sera mis à disposition ad libitum. Une vérification visuelle quotidienne de l’état général des souris est effectuée par le personnel animalier. Tout signe d’inconfort, de détresse ou de comportement anormal (agressivité subite, inactivité, vocalisation, mutilation, isolement, diminution de l’appétit) ainsi que toute modification physique (pelage ébouriffé, dos courbé, perte excessive de poils) sera étroitement surveillée et entraînera un isolement si nécessaire. Les critères absolus d’inconfort (état de choc, léthargie, inconscience, immobilité, forte hypothermie, difficultés respiratoires), qui ne sont pas censés être déclenchés par la procédure utilisée, mèneront à l’euthanasie immédiate de l’animal conformément aux directives éthiques. Une grille de suivi sera mise en place avec une pesée hebdomadaire des animaux et deux pesées lors de chaque de cycle de traitement. Une perte de poids de plus de 20 pourcents du poids initial à l’initiation du traitement des animaux sera considérée comme point limite. Dans le cadre de la tumorigenèse intestinale, la tumeur ne pourra pas être mesurée au cours de l’expérimentation mais le volume tumoral sera mesuré après l'euthanasie afin de contrôler la pousse tumorale.

Choix des espèces

L'objectif de ce projet est d'explorer le rôle des macrophages dans la pathogénèse et l’évolution du cancer colorectal (CCR) ainsi que d’identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents. La souris a été sélectionnée comme modèle expérimental en raison de sa capacité à reproduire de manière précise les mécanismes impliqués dans le développement du CCR. Plus particulièrement, elle est capable d’intégrer les réponses immunitaires observées chez les êtres humains. En outre, la souris est un modèle bien établi pour l’étude du CCR et permet également d’utiliser un certain nombre de lignées transgéniques générées au préalable. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 à 12 semaines à leur entrée dans les procédures. Nos études requièrent que les animaux aient un métabolisme et un système immunitaire matures.

Pour tester chez la souris une association de deux médicaments et d'une radiothérapie contre le cancer de la prostate peu métastatique, 700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements terminaux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune peut subir une chirurgie de vingt minutes pour l'injection de cellules tumorales dans la prostate, quatre séances de radiothérapie, une injection dans l'abdomen toutes les deux semaines, quatre administrations orales par semaine et un prélèvement de sang hebdomadaire pendant huit semaines. Les effets annoncés vont de la douleur au site d'injection à l'infection, en passant par la gêne provoquée par la tumeur et la perte de poids. Une grille de score fixe le moment où l'état est jugé trop dégradé, et les souris sont alors mises à mort, décision que le porteur place après l'adaptation de l'hébergement et les soins.

Objectifs

Le cancer de la prostate est le cancer le plus commun chez l’homme. C’est le cancer dont l’incidence augmente le plus, ce qui se traduit par le fait qu’environ un homme sur huit sera atteint d’un cancer de la prostate au cours de sa vie avec une forme métastatique de la maladie. En dehors de la radiothérapie qui peut être efficace dans le traitement des formes localisées et des métastases osseuses, différents traitements médicamenteux ont également été approuvés en première ligne. Si l’autorisation de ces nouvelles thérapies représente une avancée majeure dans le traitement de ces cancers, le problème de leur utilisation en combinaison avec la radiothérapie, reste entier. En laboratoire, notre équipe a étudié et comparé l’efficacité d’une association de 2 médicaments avec la radiothérapie sur des cellules cancéreuses. Nous avons réalisé différents tests qui nous ont permis d’identifier une combinaison de médicaments et un schéma de traitements efficaces. Nous souhaitons maintenant déterminer si l’association identifiée lors de ces études en laboratoire, pourrait être utilisable et efficace dans un modèle animal de cancer de prostate présentant un faible nombre de métastases.

Bénéfices attendus

Ce projet à caractère translationnel adresse la question de l’optimisation des combinaisons de 2 médicaments et la radiothérapie dans le traitement des cancers de prostate à peu de métastases et résistants à la castration. Malgré les essais cliniques en cours il n’existe en effet aucune méthode préclinique rationnelle et standardisée permettant de déterminer à priori les combinaisons qui seront les plus efficaces et les ratios de doses les plus pertinents à utiliser. Les résultats attendus de notre approche préclinique permettront de valider la combinaison de cette triple association la plus efficace. Cela permettra d’envisager la mise en place d’essais prospectifs et de nouvelles stratégies de prise en charge des cancers de prostate avec peu de métastases avec une possible adaptation des standards de traitement actuels.

Procédures

Les gestes réalisés sont : 1 injection intra-péritonéale toutes les 2 semaines pendant 8 semaines (2 minutes par souris) 1 radiothérapie 1 toutes les 2 semaines pendant 8 semaines (6 minutes par souris) 4 administrations per os par semaine pendant 8 semaines (2 minutes par souris) 1 injection sous-cutanée unique (2 minutes par souris) 1 prélèvement sanguin par semaine pendant 8 semaine Chirurgie pour 1 injection unique intra-prostatique (20 minutes par souris)

Impact sur les animaux

Effets indésirables direct : - Douleur associée à une injection de cellules en sous-cutanée ou intra-prostatique - Douleur suite au prélèvement sanguin sur la veine caudale - Infection au site d’injection - Complication suite à la chirurgie pour l’injection intra-prostatique Effets indésirables indirects conséquence des produits injectés : - Croissance tumorale et gêne engendrée par la tumeur - Perte de poids. Les nuisances qui pourront être engendrées par la croissance tumorale chez ces animaux seront parfaitement surveillées et maîtrisées afin de limiter toute souffrance.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements terminaux.

Remplacement

Ils n’existent pas de modèles in vitro et in silico reproduisant la complexité du milieu tumoral et permettant de déterminer l'efficacité thérapeutique de cette tri-thérapie.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum basé sur les données de la littérature pour des expériences similaires. Nous réaliserons une étude préliminaire de toxicité afin de réduire le nombre d’animaux. Concernant l’approche statistique, chaque lot d’animaux comprendra 10 animaux afin de réaliser les tests statistiques pertinents sur un effectif suffisant.

Raffinement

Les souris feront l'objet d'une surveillance quotidienne y compris les week-ends et jours fériés. Le suivi de la croissance tumorale ainsi que du poids des animaux. Dans le cas où un animal présente un signe de souffrance, différentes décisions peuvent être prises comme l’adaptation des conditions d’hébergement, l’application de soins ou l’euthanasie. Les animaux seront euthanasiés si leur état général est fortement altéré ou si les points limites sont atteints. Une grille de scoring ayant été établi, tous les soins nécessaires pour apaiser le stress ou la douleur seront mis en place, jusqu’à l’euthanasie si besoin.

Choix des espèces

L’espèce choisie pour cette étude est la souris car elle est l’espèce qui est le mieux défini génétiquement et pour laquelle les données scientifiques de référence sont nombreuses. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines, âge de maturité sexuelle.

Produire des anticorps polyclonaux à la commande, pour le compte d'équipes publiques ou privées : telle est la finalité de ce protocole, où 150 poules vont être utilisées, deux par commande, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque poule reçoit cinq injections intramusculaires d'un antigène mélangé à l'adjuvant complet de Freund, qui peut provoquer des ulcérations au point d'injection, de la fièvre et une baisse de mobilité. Le porteur présente la récupération des anticorps dans le jaune d'œuf comme un raffinement, puisqu'elle évite les prélèvements de sang, et invoque la recommandation du Centre européen pour la validation des méthodes alternatives. Les poules sont malgré tout toutes tuées au 63e jour, un animal immunisé contre un antigène ne pouvant pas, selon lui, servir à une autre commande.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tels que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherches publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de poule. La poule est une hôte d’intérêt, pour le développement d’anticorps dirigés contre des protéines hautement conservées chez les mammifères. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole durera 63 jours.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux sont des auxiliaires et des réactifs employés dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie. Ils permettront notamment d’approfondir les connaissances nécessaires pour l’avancement de la recherche et le développement de test de diagnostic voir de nouvelles pistes d’applications thérapeutiques.

Procédures

5 injections en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (10 minutes)

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les animaux sont surveillés après injection afin de vérifier qu’aucune douleur n’est apparue.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J63.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des anticorps polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budgets et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 poules par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique, a été adapté au plus juste par rapport au besoin pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont injectés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. La recherche sur la douleur aviaire est limitée, mais une grande partie des connaissances provient de la science du bien-être avec un intérêt pour les pratiques agricoles de routine. Dans ce cadre, une attention particulière sera portée à 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du plumage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). La récupération des anticorps à partir des œufs de poule constitue un raffinement, car les prélèvements sanguins ne sont pas nécessaires. Lors de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les poules disposeront d’un environnement enrichi (miroir, perchoir, bloc à picorer, thon, courgette, vers de farine,…)

Choix des espèces

La poule est utile pour la production d’anticorps contre des protéines de mammifères, car elle est éloignée phylogénétiquement de la classe des Mammalia. L’utilisation de poules pondeuses est en totale conformité avec le principe des 3R et cette méthode est fortement recommandée depuis un certain temps par le Centre Européen pour la Validation des Méthodes Alternatives. Il s'agit d'un raffinement du protocole de production d'anticorps, car ces derniers peuvent être extraits du jaune d’œuf sans avoir à prélever du sang sur l’animal. Un autre avantage est que les poules pondeuses sont capables de produire des anticorps en plus grande quantité, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir les anticorps. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les poules entreront en protocole dès l’âge de 5 mois. Auparavant elles auront subi une période de quarantaine de 14 jours, et si les animaux ne présentent aucun signe clinique, elles seront aptes à rentrer en protocole.

12812 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant subir huit prélèvements sanguins à la queue, des gavages quotidiens pendant 30 semaines et des injections intrapéritonéales deux fois par semaine sur la même durée. S'y ajoutent une chirurgie de pose d'implant d'œstrogène, une injection sous-cutanée de cellules tumorales humaines dans les deux flancs, une ligature vasculaire, une biopsie de la queue au sixième jour de vie et des transports entre cinq établissements. Le porteur signale un risque de perforation de l'œsophage et de passage de la solution dans les poumons lors des gavages, des douleurs dès que la tumeur atteint un certain volume, des démangeaisons et des difficultés à s'alimenter et à s'abreuver. Les souris des procédures expérimentales sont tuées pour exploration anatomique, celles de l'élevage restant en vie pour l'accouplement sauf les mâles immunodéficients, et le bénéfice annoncé tient en une phrase, une meilleure compréhension des syndromes d'hypercroissance et l'identification potentielle de nouveaux traitements.

Objectifs

Les syndromes d’hypercroissance sont causés par des mutations génétiques affectant uniquement certains tissus. Notre objectif est de développer des modèles précliniques porteurs de mutations de ces genes dans différents tissus afin de comprendre la physiopathologie des anomalies et d’identifier de nouveaux traitements permettant de prévenir l’apparition des symptômes ou de freiner la pathologie. Le projet se déroule sur 5 sites différents.

Bénéfices attendus

Ce projet nous conduira à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant aux syndromes hypertrophiques et à l'identification potentielle de nouveaux traitements

Procédures

Les interventions subies par les animaux seront : 1) Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour l’insertion des implants d’œstrogène (EU1 et EU2) 2) Une injection en sous cutané de cellules tumorales humaines sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2). 3) Des prélèvements sanguins (n= 8 par souris) à la queue sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2) 4) Des inductions par gavages au tamoxifène (moins d’une minute) sur 5 jours pour induire les phénotypes d’hypercroissance (EU1 et EU2) 5) Des observations des tumeurs et des imageries in vivo sous anesthésie gazeuse durant maximum 30 min (EU3, EU4, EU5) 6) Des traitements en injections bihebdomadaires intra péritonéal (moins d’une minute) de traitements (30 semaines) (EU1 et EU2) 7) Des gavages quotidiens de traitements (moins d’une minute) pour une durée maximale de 30 semaines (EU1 et EU2) 8)Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour ligature vasculaire (EU1 et EU2) 9) Biopsie de la queue à jour 6 de vie pour génotypage (3 secondes) (EU1 et EU2)

Impact sur les animaux

Les souris recevront par voie sous cutanée (flancs gauche et droit) deux injections mais toutes n’auront pas de développement de tumeurs. S’il y a prise de greffe, et formation de tumeurs sous cutanées, les effets de la tumeur peuvent être indésirables et générer certaines contraintes : douleurs à partir d’un certain volume, difficultés à s’alimenter et à s’abreuver, tension au niveau de la peau, démangeaisons et irritations. L’insertion de l’implant et la mise en place d’un point de suture peut également provoquer une gêne avec des démangeaisons et une légère tension au niveau de la plaie suite à la cicatrisation. Une hypothermie, une déshydratation et un asséchement des yeux peut également survenir suite à l’anesthésie. Les séances d’imageries et les prélèvements sanguins répétés sont un stress. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections péritonéales répétées peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection. Les ligatures vasculaires peuvent engendrer des infections localisées, des saignements et des douleurs. Le transport d'un centre à un autre pour les imageries in vivo peut induire un stress pour les animaux. Au cours des biopsies à jour 6 pour génotypage, une douleur localisée de très courte durée peut survenir.

Devenir

Les animaux de la procédure d’élevage seront maintenus en vie pour accouplement et maintien des lignées sauf pour les males immunodéficients. Les animaux des procédures d’expérimentation seront mis à mort pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Il n'existe pas de modèle in vitro qui permette d'étudier les caractéristiques des syndromes de surcroissance. Au cours de ces syndromes, les cellules nécessitent un environnement complexe avec de multiples interactions et facteurs de croissances qu’il est actuellement impossible de récréer in vitro. La souris est le seul mammifère pour lequel la protéine impliquée ici a été mutée.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d'animaux nécessaire pour avoir la puissance statistique. Celle-ci été défini en utilisant un logiciel de statistique. Le nombre de souris par groupe a ensuite été calculé afin de pouvoir mettre en évidence un effet statistique significatif. Tout au long du projet pour minimiser le nombre d'animaux utilisés et conformément aux objectifs scientifiques, nous réutiliserons les différents tissus.

Raffinement

Nous éviterons toute souffrance inutile des animaux en les surveillant régulièrement. Le gavage sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie adaptées, avec une surveillance accrue post-opératoire. L’ensemble des prélèvements et des imageries sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Enfin, des points- limites précis ont été établis (poids, comportement, aspect du poil), entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.Le transport entre sites est assuré par un prestataire agréé. Les animaux ont accès à l’eau et l’alimentation pendant toute la durée du trajet. Les cages sont ventilées et enrichies avec du coton.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. Par ailleurs, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). Souris âgées de 6 semaines pour l'induction au tamoxifène car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée. Ces souris seront ensuite suivies à l'âge adulte.

1720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune recevant une greffe de cellules tumorales sous la peau ou dans la babine, une irradiation sous anesthésie, puis six injections d'anticorps en deux semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les tumeurs implantées dans la babine gênent l'alimentation, celles greffées sous la peau provoquent une gêne liée à la croissance tumorale et une perte de poids. Une partie du protocole consiste à prélever le sang de souris jeunes sous anesthésie et sans réveil pour le transfuser à des souris de 15 à 18 mois, afin de voir si cela modifie leur réponse au traitement combiné. L'amélioration attendue du taux de guérison chez les patients âgés reste annoncée au futur, quand les greffes, l'irradiation et la mise à mort sont, elles, déjà programmées.

Objectifs

Le nombre de personnes âgées diagnostiquées avec un cancer ne cesse d'augmenter chaque année avec l'augmentation de l'espérance de vie. L’efficacité de certaines immunothérapies cempêchant l'inactivation du système immunitaire par la tumeur, combinée avec la radiothérapie est très prometteuse chez le patient âgé comme chez le patient jeune. Toutefois, il a été observé une baisse de certains types de cellules immunitaires chez le patient âgé comparé au patient jeune, ce qui peut impacter la réponse au traitement. Le patient âgé répond donc moins bien aux traitements comparé au patient jeune. Beaucoup d'articles ont été publiés, décrivant les nouvelles stratégies d'immunothérapies pour combattre le cancer mais peu traitent des effets du vieillissement, de l’immunité tumorale et de la radiothérapie. Ce projet a pour but d'évaluer l'impact du vieillissement sur la réponse à l'immunothérapie combinée à la radiothérapie dans le cancer du côlon et de la sphère oto-rhino-laryngologique.

Bénéfices attendus

L'étude de l'impact du vieillissement sur la réponse à la radiothérapie combinée à l'immunothérapie, nous apportera des informations primordiales pour améliorer/rétablir l’immunité anti tumorale chez le sujet âgé. Cette approche permettra ainsi d’améliorer le traitement chez le patient âgé et augmenter le taux de guérison. La mise en évidence de différence de populations immunitaires entre le sujet âgé et le sujet jeune se font par des analyses de la tumeur et du sang circulant via des tests biologiques poussés.

Procédures

Pour chaque intervention, il y aura une injection des cellules tumorales en sous cutané ou en orthotopique sous anesthésie locale (durée 10 secondes). De plus, concernant les traitements des souris, elles seront irradiées sous anesthésie (durée: 10 minutes) puis traitées 3 fois par semaine avec un anticorps en intrapéritonéale durant deux semaines (durée de l'injection 10 secondes). Cette injection se fera sous anesthésie locale afin d’éviter une souffrance chez l’animal. Lors de la procédure concernant l’étude du microenvironnement, nous prélèverons la tumeur après euthanasie de la souris. Concernant la dernière procédure, qui va étudier l’impact d’une transfusion de sang de souris jeunes chez des souris âgées sur le traitement combiné radiothérapie/immunothérapie, ceci se fera par une seule transfusion sanguine avant le traitement de la radiothérapie et de l’immunothérapie. Nous allons prélever du sang aux souris jeunes sous anesthésie générale et sans réveil (durée maximale 10 minutes), puis injecterons ce sang dans les souris âgées sous anesthésie locale (durée 2 minutes maximum)

Impact sur les animaux

Les nuisances qui pourront survenir lors de greffes sous-cutanées sont une gène légère du fait de la croissance tumorale ainsi qu’une perte de poids légère qui peut éventuellement être causée par les traitements Les nuisances qui pourront survenir lors des greffes dans la babine seront une gène modérée à s'alimenter et éventuellement une perte de poids légère due à la localisation de la tumeur.

Devenir

Les snaimaux seront euthanasiés pour études et examen sur tissus et sang post-mortem.

Remplacement

Le recours à des modèles animaux est indispensable pour étudier les effets des combinaisons thérapeutiques dans un contexte qui inclut le micro environnement tumoral et qui permet donc l’interaction des cellules tumorales avec le stroma (dont les cellules immunitaires sous dépendance de médiateurs type cytokines ou cellules provenant du reste de l'organisme). Cela est indispensable dans le contexte de la radiothérapie (par exemple: les effets que les cellules irradiées pourraient exercer sur des cellules non irradiées à proximité ou à distance par exemple). Il n’existe pas de modèles in vitro permettant une telle étude, ni de méthodes in silico. Le projet nécessite donc d’être mené sur un organisme vivant disposant d’un système immunitaire complet, en interaction avec tout le reste de l'organisme.

Réduction

Nous avons choisi d'utiliser le modèle du cancer du colon et le modèle orthotopique de cancer otorhinolaryngologique pour lesquels il y a beaucoup de données dans la littérature ainsi que dans notre laboratoire concernant la réponse à la radiothérapie et l'immunothérapie. Ceci nous permettra de réduire les conditions expérimentales (dose d'irradiation et d'immunomodulateurs) et donc le nombre d'animaux nécessaires pour tester nos hypothèses. De plus nous nous sommes basés sur des analyses statistiques précises pour déterminer le nombre nécessaire d'animaux par procédure et pour le projet.

Raffinement

Le développement de la tumeur sera suivi 3 fois par semaine par la mesure du volume tumoral grâce à un pied à coulisse et par imagerie du petit animal. Les souris seront pesées 3 fois par semaine. Un examen clinique quotidien sera effectué. Des points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les souris seront élevées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. Leur environnement sera enrichi avec du coton ou des nids en carton ainsi que du papier afin de diminuer leur angoisse. Des compléments alimentaires riches en énergie et facilement accessibles, ainsi que des médicaments analgésiques seront utilisés en cas de besoin.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie. Elles ont été choisies pour leur capacité à développer rapidement et efficacement des tumeurs et pour l’homogénéité et donc la fiabilité des résultats que l’on peut générer avec ce modèle (souris congéniques, avec recul important sur les données antérieures). Les souris seront âgées de 7 ou 8 semaines, un âge où la souris est suffisamment mature, représenteront les souris jeunes, et il s’agit de l’âge plus largement utilisé dans les études en cancérologie. Les souris âgées seront âgées entre 15 et 18 mois. Cela nous assure que le système immunitaire entre les souris jeunes et les souris âgées est bien différent, ce qui est primordial pour ce projet.