Cancers

260 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit huit injections d'antigène, souvent couplées à l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, un antigène différent empêchant selon lui toute réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable" et qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (20 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant dans l’obtention des protéines médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.

Choix des espèces

Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.

104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est greffée par injection de cellules cancéreuses, 80 d’entre elles recevant en plus un médicament, la tumeur pouvant atteindre deux centimètres cubes et gêner leurs déplacements avant leur mise à mort pour prélèvement, afin de valider le rôle d’un ARN non codant dans le carcinome rénal. Le porteur indique que des métastases pulmonaires peuvent se former et provoquer une perte de poids et d’appétit. Il affirme que les cultures in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes de la formation tumorale et compte ouvrir une collaboration avec l’industrie pharmaceutique.

Objectifs

Le carcinome rénal à cellules claires (CRCC) est un cancer agressif et malgré le développement de thérapies ciblées et d'immunothérapies, les patients diagnostiqués au stade métastatique ont toujours un mauvais pronostic. Il est donc urgent de trouver de nouvelles cibles pour les tests de diagnostic précoce et pour les traitements de la maladie métastatique. Ce projet vise à démontrer que l'expression d'un ARN long non codant in vivo altère la formation de carcinome des cellules rénales et la progression de métastases, en association avec les traitements déjà existants. Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l'industrie pharmaceutique pour développer des inhibiteurs spécifiques pouvant être testés dans des essais précliniques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la validation d'une cible pour le traitement du carcinome rénal à cellules claires. Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l'industrie pharmaceutique pour développer des inhibiteurs spécifiques pouvant faire l'objet d'essais précliniques, dans l'objectif final d'identifier de nouveaux traitements pour le carcinome rénal à cellules claires chez l'homme.

Procédures

Toutes les souris seront injectées avec des cellules tumorales (104). L'injection se fait sous anesthésie gazeuse et dure une dizaine de secondes. Les souris de l'étude expérimentale (80) subiront en plus l'administration de médicament 3 fois à 3 jours d'intervalle. Ce traitement supplémentaire est réalisé sur animaux vigiles et dure une dizaine de secondes.

Impact sur les animaux

L'injection de cellules tumorales va provoquer la croissance d'une tumeur primaire à l'endroit de l'injection et potentiellement la formation de métastases distantes, notamment dans les poumons. La tumeur primaire pourra générer un inconfort physique lors des déplacements des souris. Cette tumeur primaire devrait apparataitre à partir de 5 jours suivant injection et croitre assez rapidement. La temps d'atteinte du point limite du volume de 2cm3 est estimé à moins de 3 semaines. Les métastases ne seront pas visibiles mais pourront entraîner une perte de poids, d'appétit et d'autres effets biologiques liés à la perturbation des organes vitaux touchés. Lors des expériences précédentes d'injection de cellules tumorales dans le laboratoire, les souris ont du être sacrifiées du fait de la taille de la tumeur primaire et non d'effets dus aux métastases.

Devenir

Il est prévu de mettre à mort tous les animaux pendant ou à la fin du projet : l'injection de cellules tumorales devant conduire à la formation de tumeurs voire de métastases chez les souris, les animaux seront mis à mort pendant le projet si la taille de(s) tumeur(s) atteint les points limites, en cas de signes de souffrance ou à la fin du projet. Les tumeurs et métastases seront prélevées à des fins d'histologie pour étudier les marqueurs de cancer et la composition des tumeurs ainsi que pour d'autres analyses : séquençage d'ARNs, quantification protéique afin d'évaluer le résultat des différents traitements.

Remplacement

Les procédures expérimentales proposées visent à étudier l’importance d'un ARN non codant dans des conditions de croissance tumorale in vivo. Nous estimons que ces approches sont très importantes et ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation des souris. Les expériences in vitro nous ont permis de valider nos techniques d’expérimentation et d’apporter de premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes de substitution in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et donc ne pourront pas apporter le niveau d'information requis.

Réduction

L'étude se fera en deux étapes : * la première procédure constitut l'étude-pilote de la tumorigénicité des modèles cellulaires utilisés (12 souris par lignée cellulaire, donc 24 souris). * Si l'étude pilote est concluante (les lignées injectées vont entraîner une croissance tumorale), elle sera suivie de la seconde procédure : l'étude expériementale visant à étudier l'effet du médicament sur la croissance tumorale : 80 souris injectées avec les lignées modifiées pour la surexpression de l'ARN non codant et traitées ensuite soit avec le véhicule, soit avec le médicament. Ce nombre représente le nombre minimal de souris pour obtenir un résultat significatif d’un point de vue statistique en tenant compte de l’éventualité de mort précoce. Le nombre total de souris expérimentales sera de 104. Cet effectif correspond au nombre d’animaux nécessaires afin que les résultats obtenus soient exploitables et reproductibles (statistiquement valides).

Raffinement

Des souris femelles seront utilisées : moins agressives entre congénères que les mâles, elles pourront être hébergées en cohorte afin de conserver l’interaction sociale, ce qui confortera le résultat des expériences. Les expérimentateurs établiront le contact avec les cohortes au moins 8 jours avant le début de l’expérimentation pour habituation à la manipulation et réduction de l’angoisse des animaux. Les cages seront agrémentées de coton type « nestlet ». Nous mesurerons la taille de la tumeur au moins deux fois par semaine (lundi et vendredi plus éventuellement le mercredi) à l'aide d'un pied à coulisse tout au long de la croissance tumorale jusqu’à l'atteinte de la taille limite de la tumeur de 2 cm3 par souris. La vitesse de croissance des tumeurs n’est pas connue, nous adapterons donc la période de mesure pour chacune des lignées cellulaires utilisées. Nous surveillerons également quotidiennement l'état des souris après injection des lignées tumorales afin de détecter tout effet dommageable. En cas de souffrance évidente, les souris seront sacrifiées.

Choix des espèces

In vitro, nous avons validé nos techniques expérimentales et obtenu des premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et ne peuvent donc fournir le niveau d'information requis. L'utilisation du modèle de xénogreffe chez la souris ne peut être remplacée par d'autres méthodes expérimentales, il est fiable et facile à manipuler et déjà largement utilisé. De plus, les données que nous produirons à partir de nos tumeurs (cinétique tumorale, séquençage d'ARN, quantifications de protéines) seront comparées à celles collectées par notre laboratoire et nos collaborateurs dans des modèles similaires pour d'autres études. Pour cette expérience d’injection de lignées cellulaires murines sur des souris immunocompétentes, nous ferons correspondre la souche d'origine des lignées cellulaires avec celle des souris réceptrices. Nous utiliserons des souris jeunes adultes de 6 semaines. Le médicament à tester étant un inhibiteur des points de contrôle immunitaires, il convient que sa cible, la population de lymphocytes T, soit à son meilleur stade de développement. A 6 semaines, les souris présentent un système immunitaire développé et fonctionnel, que ne présentent pas des souris plus jeunes. Après cet âge, certaines sous-populations de cellules immunitaires ainsi que la fonction immunitaire globale commence à décliner : la diminution des lymphocytes T naïfs, l'augmentation des lymphocytes T à mémoire dont la fonctionnalité est réduite et la diminution de la diversité de la reconnaissance des antigènes par les lymphocytes T entraînent l'immunosénescence.

2880 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur est greffée sous leur peau, puis elles reçoivent des injections d'un anticorps avant un prélèvement sanguin terminal, pour valider chez la souris un anticorps humain déjà testé sous forme murine contre le cancer du poumon. Le porteur indique que la nécrose de la tumeur peut ouvrir une plaie qui s'agrandit par frottement ou cannibalisme, et compte cette nécrose parmi ses mesures d'efficacité. Il présente ce passage chez l'animal comme une étape "nécessaire et obligatoire" imposée par la réglementation avant un essai clinique.

Objectifs

Notre projet de recherche est focalisé depuis de nombreuses années sur le rôle d’une hormone la neurotensine et son récepteur, le couple NTS-NTSR1 dans le cancer. Ainsi nous avons démontré que la neurotensine était un facteur lié à l’agressivité des tumeurs, en ayant une action sur la croissance tumorale et le développement des métastases. Le récepteur de cette hormone est surexprimé dans presque tous les cancers solides (tumeurs qui font des amas). Nous avons montré que l’expression élevée de NTSR1 est un marqueur de mauvais pronostique pour les cancers du poumon, du sein, et pour de nombreux autres cancers. La présence de cette hormone au sein des tumeurs est associée à la résistance aux traitements anticancéreux. Nous développons des stratégies thérapeutiques qui vont inhiber cette hormone dans le but de diminuer l’agressivité des tumeurs et de restaurer la réponse aux traitements. Plus précisément, nous avons développé des anticorps neutralisants dirigés contre les formes précurseurs de cette hormone qui peuvent être utilisés en thérapie humaine. Le projet décrit ici a pour but de démontrer l’efficacité thérapeutique de ces anticorps sur des modèles de tumeurs expérimentales en particulier sur la croissance tumorale, évasion métastatique, et surtout la réponse aux traitements standards proposés aux patients avec un cancer du poumon en récidive. L’ensemble des résultats obtenus seront inclus dans la demande d’autorisation pour pratiquer une phase 1 chez l’homme.

Bénéfices attendus

Nous avons établi la preuve de concept de l’efficacité d’un anticorps dirigé contre les formes longues de la neurotensine sur la croissance tumorale, invasion métastatique et la réponse aux chimiothérapies à base de sels de platine avec un anticorps murin. Ces résultats ont été publiés. L’étape suivante de développement du projet est de valider l’utilisation d’un anticorps humain en utilisant des procédures similaires dans le but de l’inclure dans les traitements actuels proposés aux patients. La réglementation exige que les médicaments destinés à la thérapie humaine soient testés dans plusieurs modèles animaux. Les tests de l’efficacité thérapeutique de ces anticorps dans un modèle murin sont une étape préalable, nécessaire et obligatoire avant de poursuivre vers les études réglementaires de toxicologie et un essai clinique.

Procédures

Les animaux commerciaux seront acclimatés durant une semaine puis ils seront soumis à une injection sous-cutanée de cellule tumorale sur animal vigile (15 seconde/animal). Après quelques jours (environ 7 jours), les animaux seront traités avec les molécules thérapeutiques par injection intraveineuse sur animal vigile (15 seconde/animal) à raison de 3 à 6 injections maximum par animal. Enfin, les animaux subiront un prélèvement sanguin terminal unique sous anesthésie profonde (5 minutes) puis seront immédiatement euthanasié sans réveil de l’animal.

Impact sur les animaux

L’implantation des cellules tumorales sur le flan de l’animal provoque le développement d’une tumeur solide. Les tumeurs se développent sous la peau. Les tumeurs sont à priori pas innervées innervées et elles n’entrainent donc pas de douleur en tant que telles. En revanche la taille de la tumeur peut provoquer des difficultés de déplacement des souris surtout si après l’implantation en sous cutanée la tumeur se développe dans le creux de la patte postérieure. Ce phénomène arrive parfois, il n’est pas contrôlable. L’efficacité de la thérapie que nous développons se traduit par une réduction de la taille tumorale, ralentissement de la pousse, mais aussi par une nécrose plus ou moins importante qui démarre au centre de la tumeur. Ce phénomène de nécrose peut atteindre la surface de la tumeur et provoquer une plaie. Cette plaie peut s’agrandir soit par frottement soit par cannibalisme. Dès l’apparition d’un point de nécrose nous appliquons des soins adaptés. Cependant, plus le traitement est efficace plus la nécrose va se développer à l’intérieure de la tumeur qui est un phénomène inévitable, et un paramètre que nous comptabilisons pour évaluer l’efficacité de la thérapie.

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet (n=2880) seront euthanasiés à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses ultérieures (les tumeurs, les ganglions, la rate et le sang) afin d’analyser le mode d’action de nos anticorps.

Remplacement

Le criblage in vitro va nous permettre de remplacer l’utilisation d’animaux en utilisant les techniques de culture cellulaire. L’objectif étant de sélectionner les meilleurs anticorps candidats. Ces clones sélectionnés seront utilisés pour la partie in vivo qui fait l’objet de la présente demande. Néanmoins, Un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement tumoral et les effets thérapeutiques de nos molécules qui sont au cœur de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Un nombre de 10 souris par groupe est prévu afin de pouvoir réaliser des statistiques. Un total de 2880 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (points limites adaptés) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Dans ce projet, l’administration des traitements devrait apporter un bénéfice pour les animaux avec un ralentissement de la progression tumorale. De plus, l’ensemble des gestes techniques qui sont réalisés sur animal vigile sont pratiqués par des personnes formées et expérimentées avec du matériel adapté permettant de réduire significativement les nuisances liées aux actes techniques.

Choix des espèces

Justification de l’espèce/modèle : Le choix de l’espèce est justifié à travers différents aspect : - La physiologie de la souris qui est un mammifère comme l’Homme ; - La possibilité de recréer un modèle de cancer pulmonaire métastatique ; - Une espèce couramment utilisée et reconnue en oncologie ; - Un modèle ayant permis de déterminer l’importance du protocole d’administration, l’influence du volume tumoral et la toxicité des traitements ; - La réglementation demande à ce que tout développement de médicaments soit testé chez deux modèles animaux différents avant toute administration chez l’humain. La souris Nude est le standard pour les études précliniques relatives à l'évaluation in vivo des effets anti-tumoraux sur des cellules humaines. Nous utiliserons la souche NMRI Nude-Foxnu afin de ne pas avoir d’interaction du système immunitaire sur les effets observés de nos anticorps. Justification du stade : Les souris seront achetées à 5 semaines d'âges et entreront en protocole après 1 semaine d’acclimatation, le poids des animaux se stabilisent entre 28 et 35 jours d’âge. Ce stade de développement est couramment utilisé et validé par la communauté scientifique. Justification du sexe : Toutes nos études avec l’anticorps murin ont été réalisées sur des mâles. Nous travaillerons donc exclusivement sur les mâles afin de pouvoir comparer nos résultats aux études antérieures. Ce choix a été fait en amont pour limiter les problèmes hormonaux, puisqu’il est connu que certains cancers sont hormono-dépendants.

225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur de vessie est greffée dans leur flanc, puis elles reçoivent deux injections par semaine pendant six semaines et deux prélèvements de sang dans l'œil, avant une exsanguination terminale sous anesthésie, pour comparer deux candidats médicaments en doses croissantes. Le porteur indique que la pousse tumorale peut gêner les déplacements et qu'aucun anti-inflammatoire ne peut être administré car l'inflammation participe au mécanisme testé. Il affirme que ces expériences sur petit animal ne peuvent être remplacées par des cultures in vitro.

Objectifs

La cible du candidat médicament est un récepteur l’immunité et est exprimé par les cellules normales mais aussi dans de très nombreuses cellules tumorales. L’activation de ce récepteur par certaines molécules entraîne une mort spécifique des cellules cancéreuses (mais pas des cellules normales), ainsi qu’une activation de l’immunité ayant un effet antitumoral. La conjugaison de ces deux mécanismes induit une vaccination à long terme contre la tumeur empêchant ainsi les récidives cancéreuses. Des études précédentes (utilisant le même modèle de cancer de la vessie que celui de ce protocole) ont démontré l’ensemble des effets cités ci-dessus (guérisons complète de 45% des souris traitées et vaccination à vie des souris guéries contre les récidives dans 66% des cas). Ces résultats ont été obtenus lors d’injections intratumorales de d’une toute nouvelle famille de molécules activant ce récepteur (spécifique, utilisable en clinique et bien tolérée). Dans la présente étude, deux candidats médicaments (CM1 et CM2) adaptées à une injection dans le système veineux (ici une injection intrapéritonéale) vont être comparées en doses croissantes pour leur : (1) efficacité antitumorale, (2) tolérance et (3) mécanismes d’action (dont leur action sur le système immunitaire). Pour ce faire, le modèle de cancer de la vessie sera utilisé pour que l’activité de ces candidats médicaments puisse être directement comparables aux études précédentes et à venir. Sept doses croissantes de chacun des deux candidats médicament seront testées sur des groupes de 12 souris rentrant en protocole. Ajouté au groupe contrôle, cela donne 15 groupes de 12 souris en traitement. Pour ce faire, 225 souris seront injectées avec des cellules cancéreuses de vessie. Sachant que 80% des souris injectées développent des tumeurs pouvant entrer protocole, cela donne 180 souris qui intègreront les 15 groupes de traitement. Les molécules seules (sans autre molécules ajoutées), seront administré deux fois par semaine pendant 6 semaines.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’effectuer un choix/classement entre deux molécules lors d’une injection par voie sanguine. Elle permettra d’affiner les doses à utiliser dans les futures études ainsi qu’en clinique. Il s’agit d’une étude de recherche à la fois fondamentale et translationnelle en vue de définir les fondements d’une étude clinique chez l’homme en injection par voie sanguine.

Procédures

Cette étude nécessite : - Une injection de cellules tumorales dans le flanc de la souris (sous anesthésie) - Des traitements injectés par voie sanguine (piqure d’aiguille sur souris vigiles). - Deux prises de sang intermédiaires de petits volumes (100µl - 3 à 4 minutes anesthésie incluse), espacés de deux semaines (sous anesthésie) - Une exsanguination terminale pouvant induire un arrêt cardiaque (sous anesthésie générale - environ 4 min anesthésie incluse), immédiatement suivie d’une mise à mort par dislocation cervicale (toujours sous anesthésie générale).

Impact sur les animaux

225 souris C3H/HeN (de phénotype non dommageable), sont acclimatées pendant une semaine à daté de leur réception. Les animaux subiront un stress lors des contentions, préparations, greffes, traitements, suivis et prélèvements ainsi que lors de leurs anesthésies : 1/ Anesthésie par voie gazeuse (isoflurane) pour permettre : (i) leur numérotation par poinçonnage auriculaire, (ii) la tonte pour préparer (iii) la greffe tumorale. 2/ Stress à la contention et à la piqure lors des traitements par injections sanguine sur souris vigiles (2 fois par semaine). 3/ Stress à la contention lors des pesées et mesures de la croissance tumorale par pied-à-coulisse sur souris vigiles. 4/ Les deux prélèvements de sang intermédiaire rétro-orbitaux de 100µl de sang après le premier et le 5eme traitement peuvent générer de la douleur au niveau de l’œil prélevé c’est pourquoi chaque œil sera prélevé une fois. Les volumes et fréquences de ces prélèvements sont adéquats pour ne pas engendrer de stress volémique chez ces souris. 5/ La pousse tumorale peut engendrer une gêne dans la locomotion (pris en compte dans la grille de score => Mise à Mort). 6/ Exsanguination intracardiaque terminale sous anesthésie générale (kétamine/Xylazine), immédiatement suivie d’une mise à mort par dislocation cervicale.

Devenir

A la fin de l'unique procédure, tous les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale sous anesthésie (pour permettre des analyses d’efficacité et de mécanismes d’action post-mortem).

Remplacement

De nombreuses expériences in vitro ont déjà permis de mettre en évidence l’activité et les mécanismes d’action de ces deux candidats médicaments. A présent, seules des études sur le petit animal permettront d’étudier les interrelations complexes des facteurs physiologiques susceptibles d’influencer l’effet de la molécule testée, et surtout le système immunitaire complet qui permettra d’étudier l'effet vaccinal contre le cancer de ces deux candidats médicaments. Ces expériences sur petits animaux ne peuvent donc pas être Remplacées. Ces expériences s'inscrivent dans le cadre du développement d'une application thérapeutique et fournira des données précliniques précieuses pour la conception d'un essai clinique.

Réduction

Les expériences menées lors de précédentes études démontrent que le nombre de souris par groupe (12 souris par groupe), prévu pour cette expérience est adapté sans mettre en péril une interprétation statistique des résultats, tout en utilisant les méthodes statistiques adaptées aux petits nombres.

Raffinement

Le « Raffinement » sera respecté par la mise en place d’une définition précise de points limites précoces et prédictifs, sur la base d'une grille de score validée sur ce modèle et sur ce type de traitement. Une surveillance adaptée des animaux 3 fois par semaine permettra d'éviter toute souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 puis avec nourriture et de l’eau ad-libitum avec des bâtonnets à ronger et du coton comme enrichissement en excès. Les prélèvements seront réduits au maximum en quantité et en durée grâce à nos méthodes d’analyses. Les deux prélèvements intermédiaires rétro-orbitaux de 100µl de sang s’effectueront sous anesthésie, respectivement après le premier et le cinquième traitement (J0 et J14). Une goutte de tétracaïne sera déposée sur l’œil 1 min avant le prélèvement afin de réduire la douleur au réveil. Les prélèvements terminaux pratiqués sous anesthésie et antalgie, suivis d'une mise à mort sans réveil. Le maximum d’analyses sur les différents prélèvements intermédiaires et finaux seront effectuées afin de tirer le plus d’informations possibles. Des traitements antiseptiques et cicatrisants sont prévus en cas de plaies. cf. grille de score. Note : Les anti-inflammatoires ne peuvent être utilisés, le processus inflammatoire étant important pour notre mécanisme d'action.

Choix des espèces

Des souris possédant un système immunitaire complet seront utilisée. La souris est un modèle mammifère bien caractérisé pour les études pharmacologiques et immunologiques : (1) En plus d’être un modèle pertinent, la souris est un modèle de petite taille, facile à manipuler et génétiquement bien caractérisé, avec des grilles de comparaison entre la souris et l'homme très bien définis pour les injections sanguines. (2) La réponse immunitaire chez cette espèce est également très bien définie. Or, seul le modèle animal possédant un système immunitaire complet permet l'étude de l'effet vaccinal contre le cancer. Les expériences s’effectueront sur des souris de 9 à 11 semaines après 7 jours d'acclimatation dans l’établissement utilisateur. A ce stade de développement, la croissance tumorale est plus reproductible et bien tolérée, de plus, le système immunitaire est suffisamment mature pour induire une réponse vaccinale. Les souris utilisées seront toutes des femelles afin de limiter le risque d’agressivité inter-individu par rapport aux mâles. De plus, les études précédentes ayant été faites sur des souris femelles, cela nous permettra de comparer les résultats de cette étude.

800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du foie, par injection simple ou par chirurgie dans le foie, la rate ou la veine porte, puis des traitements testés et un suivi par imagerie sous anesthésie. Le porteur indique que le développement de la tumeur peut entraîner des effets délétères encadrés par des points limites, les animaux étant tués pour prélever organes et fluides. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico n'évalue un médicament sur le cancer du foie et que l'animal reste un "passage obligatoire" avant l'humain.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux médicaments dans des modèles murins pertinents de cancer du foie. Ces modèles devant être représentatifs des tumeurs humaines et permettre d’évaluer au mieux l’effet bénéfique de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que les stratégies thérapeutiques testées sont actives dans un modèle expérimental et également d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques. Ainsi, à long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter les cancers hépatiques, une pathologie humaine touchant plus de 10 000 personnes par an en France.

Procédures

Les animaux recevront 1 greffe de cellules tumorales soit par voie peu invasive (sc, ip, iv - durée max 1 min) soit par chirurgie (injection dans le foie, la veine prote ou encore la rate - durée de la chirurgie estimé à 5-10 min). Dès lors, des essais de traitements seront menés Le schéma thérapeutique sera adapté en fonction de la nature du traitement testé. En cas de prélèvement de sang ceux-ci seront réalisés sous anesthésie et limités à 1 par semaine et à un volume

Impact sur les animaux

Le développement de la tumeur chez la souris pourra à terme être associé à des effets délétères. Dans ce contexte, la mise en place de points limites adaptés permettra de détecter ces signes au plus tôt et donc de garantir le bien-être animal. De même, l’utilisation de traitement novateur pour lesquels par définition nous ne connaissons pas tous les effets, pourront également induire des effets délétères. Encore une fois, la mise en place de points limites adaptés permettra de détecter les signes de mal être au plus tôt et donc de pouvoir agir rapidement et ainsi de garantir le bien-être animal. Les procédures chirurgicales d’implantation intrahépatique, intrasplénique et veine porte repose sur la mise en place de protocoles chirurgicaux incluant une analgésie maitrisée ainsi que d’un suivi post-opératoire adapté. L’impact négatif pour l’animal est réduit au maximum. Après récupération, les animaux sont maintenus en groupe sociaux pour améliorer leur bien-être et la qualité des données recueillies. L'ensemble des mesures décrites ci-dessus permet donc de réduire les contraintes potentielles pour l’animal à leur minimum.

Devenir

Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal Euthanasie des animaux suite aux effets indésirables provoqués le développement de la tumeur ou encore par le produit / modèle chez les animaux

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le cancer du foie. De plus, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’une nouvelle thérapeutique. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 6 à 10 / par groupe en fonction de l’effet thérapeutique attendu.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le suivi des signes cliniques et la détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse,

Choix des espèces

La souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées notamment pour évaluer l’efficacité de traitements anti-tumoraux, de par leurs facilités d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement .

25 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est greffée pour reproduire des métastases péritonéales, puis ils subissent trois anesthésies avec chirurgies par cœlioscopie et administration de chimiothérapie en aérosol pressurisé. Le porteur indique qu'une anorexie, une perte de poids et une accumulation de liquide dans l'abdomen sont attendues, les animaux étant tués en fin de protocole pour prélèvements. Il présente ce projet comme "indispensable" avant tout essai chez l'humain, la souris étant jugée trop petite pour la technique.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’implication de la réponse aux traitements par nanomédicaments de platine/Doxorubicine administrés via PIPAC (Chimiothérapie intrapéritonéale pressurisée par aérosol) dans un modèle animal immunocompétent. Cette approche validera l’utilisation de l’approche immunothérapeutique pour traiter les métastases péritonéales d'origine gastrique. L’évolution de la tumeur primaire et des métastases péritonéales (PM) sera étudiée dans un modèle animal lapin. Des modèles existants de lapins présentant des métastases après injection de tumeur VX2 (carcinome à cellules squameuses de lapin transplantables) vont être traités par chimiothérapie pressurisée par voie coelioscopique (groupe test) versus contrôle (injection de sérum physiologique).

Bénéfices attendus

Ce projet est indispensable avant de réaliser les tests d'efficacité de traitements chimiothérapeutiques sur des individus qui ne sont pas pris en charge par la thérapie curative de nos jours. Au-delà de la valorisation scientifique, les applications en santé humaine seront facilement transposables en raison de l'absence d'études dans ce domaine.

Procédures

Tous les animaux (25) sont soumis à 3 anesthésies générales d'une durée totale maximum d'1h30. Ils reçoivent les mêmes gestes chirurgicaux (incision, insertion de trocart, biopsie et aérosolisation) durant les anesthésies par laparotomie légère et coelioscopie pour chaque PIPAC. La seule différence est le type d'agent thérapeutique administré. Un scanner est réalisé en plus (10 min maximum) lors de la 1ère anesthésie avant la chirurgie. Une dernière anesthésie générale permet de réaliser un 2ème scanner (10 min) avant mise à mort.

Impact sur les animaux

Une anorexie et une perte de poids peuvent apparaître, ainsi qu’une altération de l’apparence physique et du comportement en conséquence. Une augmentation du diamètre abdominal est à prévoir en raison de l'accumulation du liquide d'ascite dans la cavité péritonéale, en particulier les dernières semaines post greffe, d'où la décision de limiter la durée de la manipulation jusqu’aux semaines 5 à 7. Le fonctionnement du transit intestinal peut aussi être perturbé (selles liquides).

Devenir

À l'issue de la procédure, les 25 animaux sont euthanasiés dans le but d'effectuer des prélèvements et des analyses tissulaires et moléculaires.

Remplacement

Des études in vitro ont déjà été effectuées sur ce sujet mais ont montré leurs limites. Les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser la complexité de la réponse histologique d’un organisme entier face à l’administration de thérapeutiques, et encore moins en prenant en compte l'environnement tumoral (une métastase en 3 dimensions ne répondra pas aux traitements chimiothérapeutiques de la même façon qu'une culture en 2 dimensions) et la coopération avec le système immunitaire. Ils sont aussi insuffisants pour envisager des essais cliniques chez l’Homme. Les modèles de lapins de carcinose péritonéale sont bien décrits et permettent de mimer le phénomène observé chez l’Homme.

Réduction

Le modèle de carcinose péritonéale et hépatique est maitrisé par l’équipe et les porteurs de ce projet, ce qui permet de limiter des étapes de mises au point, déjà réalisées par le passé dans des laboratoires de renom. De plus, des expériences in vitro ont déjà permis de définir les valeurs de la gamme de concentration des cellules de cancer colorectal murin selon leur cinétique de croissance. Celles in vivo sont organisées dans un ordre précis, avec des témoins choisis de sorte à limiter la répétition d’expériences. Le lapin est l’espèce modèle la plus adaptée pour ces études précliniques.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans des conditions d’hébergement (température et hygrométrie de l’environnement, présence systématique d’enrichissement, change régulier de la litière (qui n'est pas en contact avec les animaux mais dans un plateau sous la grille de la cage), nourriture et eau ad libitum, surveillance quotidienne de l’état général des animaux) qui respectent leur bien-être. Une attention particulière sera apportée à l'hydratation des animaux pour surveiller d'éventuels troubles du transit. De plus, l’ensemble des procédures sera réalisé de manière à limiter le stress et la souffrance des animaux (anesthésie, tapis ou lampe chauffante pendant la chirurgie, analgésique post opératoire).

Choix des espèces

Pour l’étude des métastases péritonéales, la souris est l’animal le plus couramment utilisé. Néanmoins, la coelioscopie et la surpression due à la PIPAC/ePIPAC n’est pas compatible avec la taille de la souris à ce jour. Le modèle de lapin est ainsi le plus approprié pour étudier les métastases péritonéales gastriques. Le lapin est un animal avec une durée de vie plus longue que la souris, ce qui permet de réaliser des plans expérimentaux répétés sur de plus longues périodes. Il a une anatomie abdominale et une physiopathologie péritonéale proche de celle de l’homme, ce qui en fait un modèle stratégique en cancérologie digestive. Les lapins seront des jeunes individus (2.5-3.5 kg) pour ne pas interférer avec les processus de vieillissement (si animaux plus âgés) ou des processus de croissance juvénile (si animaux plus jeunes).