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Effet d’un traitement permettant la polarisation de macrophages de phénotype immunosuppresseur en macrophages pro-inflammatoires sur la croissance de glioblastomes dans des modèles murins.
- Recherche appliquée
- Cancers
1 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des cellules de glioblastome sont injectées dans leur cerveau, puis un traitement liposomal est administré par voie intraveineuse, orale, intranasale ou directement dans la cavité de résection après chirurgie. Le porteur indique que la croissance tumorale peut provoquer perte de poids, immobilité, automutilation ou agressivité, entraînant la mise à mort ou l'isolement des animaux dans les 24 heures. Il affirme que le modèle murin est "indispensable" pour suivre une tumeur dans un cerveau vascularisé.
Objectifs
Le glioblastome (GBM) est la tumeur cérébrale la plus agressive chez l’adulte. Le GBM est non seulement composé de cellules tumorales, mais aussi de cellules immunitaires telles que des macrophages, qui par leurs fonctions pro-tumorigènes et immunosuppressives contribuent, après exérèse complète et radio/chimiothérapie (Protocole standard), à la récidive quasi-systématique. Malgré l’arsenal thérapeutique disponible incluant les nouvelles immunothérapies, la survie des patients atteints de GBM n’est pas significativement améliorée à ce jour. De fait les défis à relever pour améliorer cette survie et la qualité de vie des patients restent énormes. L’action des immunothérapies nécessite un statut inflammatoire/immunogène des tumeurs. Pour mieux stimuler le statut inflammatoire des glioblastomes, une stratégie vise à optimiser des agents ciblant les macrophages immunosuppresseurs qui ont une activité pro-tumorale en sécrétion de facteurs proangiogéniques et de cytokines immunosuppressives. Ces agents, à tester en préclinique, ont pour rôle de modifier le phénotype de ces macrophages pour qu’ils deviennent inflammatoires, ce qui pourrait favoriser la réponse immunitaire antitumorale et réduire la croissance des GBM. Dans ce contexte, nous avons pour objectif d’étudier l’effet d’un traitement (formulation originale) qui transforme les macrophages immunosuppresseurs en macrophages inflammatoires, sur la survie de souris porteuses de GBM et sur les mécanismes neurobiologiques associés.
Bénéfices attendus
A court terme, le projet a pour but d’optimiser les voies d’administration d’une formulation liposomale dans la prise en charge du glioblastome notamment l’intérêt d’une administration locale cérébrale versus intranasale, orale ou systémique, translationnelles chez les patients. A long terme, le projet a pour objectif la compréhension du rôle d’une formulation liposomale brevetable capable de diriger les macrophages pour lutter contre les tumeurs cérébrales et de conditionner l’environnement tumoral pour une réponse aux immunothérapies actuellement utilisées dans d’autres tumeurs solides.
Procédures
Des lignées de cellules humaines et de cellules issues de souris injectées dans le cerveau de souris immunodéprimées (Nude) qui peuvent tolérer la présence de cellules humaines mais pourvues de macrophages ou de souris immunocompétentes (C57Bl/6JRj), mâles et femelles afin de ne pas sélectionner un effet lié au genre. Après un délai de 15 jours, plusieurs voies d’administration seront testées : une voie intraveineuse à raison de 2 fois par semaine pendant 2 semaines, par voie orale (gavage) ou par voie intranasale 2 fois par semaine pendant 4 semaines, et enfin directement dans la cavité de résection (1 fois) chez les souris pour lesquelles une résection tumorale chirurgicale sera effectuée. Un groupe d’animaux sera utilisé après la période de traitements pour prélever le sang et les cerveaux afin d’étudier par immunohistochimie transformation des macrophages tumoraux et cérébraux, et le remodelage du tissu cérébral. Dans les groupes pour l’étude de la survie, les cerveaux des animaux seront aussi prélevés pour analyse.
Impact sur les animaux
Pour parer à une potentielle douleur liée à l’acte de chirurgie, les animaux reçoivent un antalgique morphinique. La croissance tumorale, en fonction des lignées cellulaires utilisées, peut s’accompagner entre 15 et 30 jours post-injection d’une inactivité, immobilité, d’une perte de poids importante ou de comportements anormaux (automutilation, agressivité exacerbée). A la survenue de ces critères, les animaux sont mis à mort (inactivité, immobilité ou une perte de poids importante) ou isolés (automutilation, agressivité exacerbée) dans les 24 heures.
Devenir
A l’issu de chacune des 4 procédures correspondant à l’étude des effets de l’injection du traitement X (administré selon une des 4 voies d’administration : intraveineuse, intranasale, per os, intracavité de résection) sur la survie de modèles murins de tumeurs cérébrales, l’ensemble des 420 souris de chaque procédure sera utilisé pour récupérer le sang et les cerveaux. Ces échantillons permettront de réaliser les études biologiques et neurobiologiques prévues.
Remplacement
Le modèle murin est indispensable afin de pouvoir travailler le développement d’une tumeur dans un environnement cérébral vascularisé présentant des infiltrats immunitaires.
Réduction
Le nombre de souris par groupe nécessaire pour réaliser chaque expérience a été estimé en fonction de test de puissance se basant sur des données préliminaires ou des résultats déjà publiés. Il tient compte de la variabilité inter-individuelle et de la mortalité estimée suite aux chirurgies.
Raffinement
Durant l’ensemble des opérations (injections de cellules, voies d’administration intraveineuse, intranasale ou intracavité), les souris seront anesthésiées. Une prise en charge de la douleur éventuelle sera systématiquement menée. Un suivi bi-quotidien (dans les 48h post-chirurgie) puis quotidien sera effectué par du personnel formé et expérimenté et permettra de détecter l’apparition d’un éventuel signe de souffrance. L’ensemble des conditions d’hébergement des animaux (cages, enrichissement et environnement) sera conforme à la règlementation. La mise à mort des souris permettant le prélèvement des échantillons biologiques sera réalisée après anesthésie et en accord avec le cadre règlementaire.
Choix des espèces
Les souris Nude utilisées dans ce protocole présentent une immunodépression qui évite le phénomène de rejet de xénogreffes de cellules humaines et constitue ainsi un modèle permettant d’étudier l’évolution tumorale chez l’Homme. Ces souris, d’après les données de la littérature, auraient conservé environ 20-30% d’astrocytes, de microglie et de macrophages à l’âge adulte. L’activation du système immunitaire étant une composante importante de la croissance tumorale ainsi que de la résection des tissus que nous souhaitons tester ici, il est essentiel de procéder à des expériences sur dans un modèle syngénique, avec des souris immunocompétentes (C57Bl/6J), xénogreffées avec des lignées murines de GBM. Les souris utilisées seront des jeunes adultes âgées de 8 à 10 semaines au moment de l’injection/xénogreffe des cellules de GBM.
Rôle du métabolisme tumoral sur la réponse aux thérapies adoptives de transfert de cellules (CAR-T)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de niveau modéré. Toutes reçoivent une greffe de cellules de lymphome puis des cellules CAR-T par voie intraveineuse, avec plusieurs prélèvements sanguins, et 320 d'entre elles sont irradiées, pour étudier comment le métabolisme de la tumeur influence la réponse à cette immunothérapie. Le porteur indique que la croissance tumorale ne provoque des signes de souffrance qu'à un stade avancé, où l'animal est alors mis à mort. Il présente comme bénéfice attendu de mieux sélectionner les patients éligibles, et affirme qu'aucune alternative in vitro ne reproduit ce dialogue immunitaire.
Objectifs
Le lymphome diffus à grandes cellules B (LDGC-B) est un cancer du sang très agressif et très fréquent dans les pays industrialisés. Cette maladie est très diverse et hétérogène, ce qui explique qu'environ 40 % des patients ne répondent pas au traitement de référence. S'ils sont éligibles, les patients qui échappent au traitement peuvent bénéficier d'une thérapie innovante appelée "thérapie par transfert de cellules adoptives" (ou cellules CAR-T). Pour cela, un type spécifique de cellules du système immunitaire du patient (lymphocytes) est prélevé puis génétiquement modifié en laboratoire pour leur permettre de reconnaître les cellules tumorales du patient. Une fois ces cellules immunitaires réintroduites chez le même patient, elles peuvent alors reconnaître et éliminer les cellules cancéreuses. Bien que très efficace dans le traitement du LDGC-B, environ 50 % des patients ne répondent pas à ce traitement ou rechutent rapidement (dans l'année qui suit). Il est donc important de comprendre comment améliorer la réponse à ce traitement. Les LDGC-B ont différentes façons de produire leur énergie cellulaire, un support essentiel à leur division constante et rapide. En effet, ces cellules tumorales utilisent soit la voie des sucres (glycolyse), soit l'usine de fabrication d'énergie de la cellule (la mitochondrie). Ainsi, l'objectif de ce projet est de déterminer si la façon dont la cellule tumorale produit son énergie va limiter ou favoriser la réponse des cellules CAR-T.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à terme de mieux sélectionner les patients qui pourraient bénéficier de cette thérapie innovante.
Procédures
Toutes les souris (640) seront injectées par voie intra-veineuse dans la veine caudale 2 fois au cours de l’expérience pour 1/ recevoir les cellules de lymphome (allogreffe) puis 2/ 7 jours plus tard les cellules T (contrôle ou CAR-T). Chaque injection prendra environ 5 min par souris et sera réalisé sur souris vigile. Un prélèvement de sang (100 µl) sera effectué sur souris vigile 2-3 jours avant l’injection des cellules CAR-T puis une fois par semaine dans la veine caudale de la souris ou en sub-mandibulaire à l’aide d’une aiguille 25G (le volume maximal qui sera prélevé à chaque fois est de 100 µl). Ainsi chaque souris aura entre 4 et 6 prélèvements sanguin sur l’ensemble de la durée de l’expérience. Les souris de la procédure 2 (320) seront irradiées à une dose sublétale (4 Gy). Pour cela elles seront placées 5 par cages (cage spéciale pour l’irradiateur) et seront irradiées pendant 206 secondes (3 min et 26 secondes) pour atteindre 4 Gy (notre irradiateur dispense 1,16 gray par 60 secondes). Cette irradiation ne sera réalisée qu’une fois par souris.
Impact sur les animaux
Avant l’arrivée aux points limites décrits dans chaque procédure, les souris pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous seront très attentifs. Ces effets indésirables pourront être causés soit par la croissance de la tumeur, soit par l’injection des cellules immunitaire (CAR-T), soit par l'irradiation modérée. Nous avons une grande expertise de ce modèle. Nous savons que la croissance tumorale n’entrainerait des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance (poils hérissés, dos voûté, perte de poids, mobilité réduite, absence de toilettage, une prostration et/ou une agitation) qu’à un stade avancé de la maladie. Cependant en cas de persistance des signes décrits ci-dessus, l’animal sera mis à mort. Les sites d’injections seront surveillés attentivement.
Devenir
mise à mort et mesure du poids des organes, analyses métabolomiques, cytométrie de flux, analyses moléculaires et immuno-histochimiques
Remplacement
Notre projet évalue l’importance de la source de production de l’énergie par la cellule tumorale sur la réponse au traitement par les CAR-T. Le métabolisme tumoral au sein de son environnement est profondément différent de celui observé in vitro et il n’existe pas à ce jour d’autre alternative à l’utilisation des souris pour l’étude in vivo des mécanismes métaboliques impliqués dans l’échappement des cellules tumorales aux thérapies proposées.
Réduction
Bien qu’il n’existe à ce jour pas de méthode de remplacement pour réaliser ces études, notre expérience des modèles utilisés nous permet de définir le nombre minimum de souris à utiliser afin d’être statistiquement significatif.
Raffinement
Une grande importance sera accordée au bien-être des souris. En terme de raffinement, les souris sont hébergées par groupe de 5 avec un milieu enrichi. Leur suivi permet de détecter tout signe de souffrance, de détresse et ainsi la prise immédiate des mesures adéquates grâce à l’application de points limites adaptés. La notion d’enrichissement du milieu des rongeurs utilisés est familière aux demandeurs. Tous les participants à ce projet sont dûment qualifiés et ont validé les compétences requises pour les manipulations proposées.
Choix des espèces
La souris est une espèce animale relativement proche phylogénétiquement de l’homme, et est le modèle de choix utilisé par la communauté scientifique pour étudier les acteurs moléculaires et cellulaires impliqués dans le cancer. De plus, la souris présente plusieurs avantages comme un cycle de vie relativement court, une natalité importante et un modèle facile à élever. Finalement, en absence de système pouvant reproduire in vitro la réaction immunitaire et le dialogue entre les différents médiateurs cellulaires, il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour mener à bien ce projet. Les souris auront entre 5 et 20 semaines car c’est durant cette période qu’il y a la meilleure prise de tumeur.
Etude de l’implication de la protéine ML-IAP dans la réponse des cellules souches tumorales au traitement au GDC-0152, dans le glioblastome
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
306 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 160 dans des procédures de niveau sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules de glioblastome sous la peau ou dans le cerveau, puis des injections et une perfusion cardiaque, pour tester une molécule censée agir sur une protéine des cellules souches tumorales. Le porteur indique que la croissance de la tumeur cérébrale peut provoquer perte de poids, prostration, ataxie et difficultés respiratoires en fin de protocole. Sur le remplacement, il se borne à affirmer qu'aucune autre méthode ne pourrait se substituer à l'expérimentation animale dans ce domaine.
Objectifs
L’objectif du projet est de confirmer le rôle crucial de la protéine inibitrice de l'apoptose" Melanoma IAP ihnibitor" (ML-IAP) dans l’efficacité du la molécule candidat médicament "GDC-0152" in vivo dans la progression tumorale dans un modèle de cellules souches de glioblastoma.
Bénéfices attendus
Le glioblastome est une tumeur cérébrale dont le pronostic est sombre. Il n’existe aucun traitement curatif et la survie médiane des patients est d’un an avec un traitement combinant chirurgie, chimiothérapie et radiothérapie. Déterminer le rôle de la protéine inibitrice de l'apoptose "Melanoma Ihnibitor of Apoptosis Protein" (ML-IAP) dans la réponse à la chimiothérapie par les molécules mimetiques de la protéine "Second mitochondria-derived activator of caspase" (SMAC) s’inscrit dans la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Greffe sous-cutanée (128 animaux, une seule intervention de 1 minute environ); 2) Greffe intra-cérébrale (160 animaux, une seule intervention de 30 minutes environ); 3) Injection pour les traitements ou pour l'anesthésie (306 animaux, quelques minutes d'intervention ); 4) Injections sous-cutanées d'analgésiques lors des greffes intra-cérébrales (160 animaux, quelques secondes d'intervention); perfusions intracardiaques (160 animaux, 10 minutes d'intervention).
Impact sur les animaux
Les greffe cellulaires sous-cutanée et intracérébrale seront exécutée sous anesthésie donc la chirurgie ne devrait pas induire la souffrance de l’animale. L’injection sous-cutanée induit une douleur dont la durée est limitée à l’intervention. Les injections en intra-péritonéale retro-orbitale sont très rapides et sous anesthésie. La perte de poids est le paramètre principal qui reflète la progression tumorale et peut être associée à une diminution de l’activité motrice. Les déficits moteurs, caractérisés par une forte diminution ou manque de déplacement ainsi qu’une prostration, ataxie et difficultés à respirer peuvent être rencontrés pendant les derniers jours d’observation à cause du développement tumoral.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l'experimentation ou dès lors de l’apparition des points limites.
Remplacement
Il n’existe à l’heure actuelle, aucune autre méthode qui pourrait se substituer à l’expérimentation animale dans ce domaine
Réduction
Afin de minimiser le nombre d'animaux utilisés, un maximum d'expériences sera réalisé in vitro. Le nombre d’animaux utilisés dans les expériences a été estimé en fonction de protocoles précédemment décrits. Conformément aux exigences de réduction du nombre d’animaux, le nombre d'animaux prévus dans chaque groupe sera aussi basé sur un calcul d'effectif permettant de prédire que nous avons 80% de chance d’obtenir un résultat statistiquement significatif. A noter que l’utilisation de cellules souches tumorales modifiées génétiquement pour exprimer la protéine fluorescente IRFP, s’inscrit dans une démarche de réduction et raffinement
Raffinement
Les animaux seront surveillés quotidiennement et les cages changées et nettoyées toutes les semaines. Les souris seront hébergées en portoir ventilé à raison de 5 animaux par cage avec un enrichissement (« nestlets », nid végétal, igloos en polycarbonate). Après 7 jours d'acclimatation, les animaux seront anesthésiés avant la chirurgie et en postopératoire une analgésie est prévue. L'évaluation de la douleur sera effectuée en fonction de la perte de poids des animaux, du changement dans leur comportement, ou de l'apparition de signes cliniques de souffrance. En cas de souffrance de l’animal une analgésie sera envisagée. Une mise en place des points limites a été effectué pour éviter toute souffrance de l’animal.
Choix des espèces
Le modèle souris représente un des modèles le plus utilisés dans la recherche en oncologie pour l’étude des tumeurs cérébrales. Les modèles de greffes cancéreuses sous-cutanées et intracerébrales sont communément pratiqués chez cette espèce et bien maîtrisés. De plus, la prise tumorale est rapide (entre 15 jours et 2 mois). Selon les protocoles décrits pour ce modèle physiopathologique, les souris seront utilisées à l'âge de 6 semaine.
Injection intraveineuse d’un candidat médicament anticancéreux – chimiquement modifié pour une administration systémique – dans un modèle souris de cancer de vessie
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
63 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous anesthésie, puis douze perfusions intraveineuses d'une heure par un cathéter alors qu'elles sont éveillées, avant un prélèvement de sang cardiaque terminal, pour tester un candidat médicament anticancéreux dans un modèle de cancer de la vessie. Le porteur annonce un effet "vaccinal" contre les récidives, à partir de résultats antérieurs, et vise des données précliniques pour un futur essai chez l'humain. Il indique que le cathéter peut s'obstruer et que la pousse tumorale peut gêner la locomotion.
Objectifs
Le TLR3 est un récepteur impliqué dans l’immunité et est exprimé par les cellules normales mais aussi dans de très nombreuses cellules tumorales. L’activation de ce dernier par certaines molécules entraîne une mort spécifique des cellules cancéreuses (mais pas des cellules normales), ainsi qu’une activation de l’immunité ayant un effet antitumoral. La conjugaison de ces deux mécanismes induit une vaccination à long terme contre la tumeur empêchant ainsi les récidives cancéreuses. Des études précédentes ont démontré l’ensemble des effets cités ci-dessus (guérisons complète de 45% des souris traitées et vaccination à vie des souris guéries contre les récidives dans 66% des cas). Ces résultats ont été obtenus lors d’injections intratumorales d’une toute nouvelle famille de molécules activant le TLR3 (spécifique, utilisable en clinique et bien tolérée). Dans la présente étude, le candidat médicament adapté à une injection dans le système veineux (ici perfusion intraveineuse sur souris vigiles sans contention) va être comparé en doses croissantes sur 63 souris dotées d’un cathéter pour déterminer : (1) l’efficacité antitumorale, (2) la tolérance et (3) les mécanismes d’action (dont l’action sur le système immunitaire). Pour ce faire, le modèle de cancer de la vessie sera utilisé pour que l’activité de ce candidat médicament puisse être directement comparable aux études précédentes et à venir.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à démontrer l’efficacité du candidat médicament par voie d’administration en perfusion intraveineuse et à trouver sa dose efficace pour une action anti-tumorale. L’hypothèse est également que ce candidat médicament permettra d’éviter les récidives avec un effet vaccinal. Il est testé ici sur un modèle de tumeur de la vessie mais il pourrait avoir des actions sur une multitude de cancer.
Procédures
- Anesthésie pour identification, tonte, injection de cellules tumorales dans le flanc …. (5 min) - Douze traitements (injection intraveineuse lente par le cathéter) d’une heure sur souris non anesthésiées. - Une anesthésie pour prélèvement de sang intracardiaque suivi d’une mise à mort (10-15 min).
Impact sur les animaux
Les animaux sont reçus déjà dotées d’un cathéter dans la veine jugulaire avec un injecteur double qui est susceptible de s’obstruer. Les animaux subiront un stress lors des contentions, mesures, entretien des cathéter, anesthésies et greffe tumorale. L’anesthésie terminale en vue du prélèvement sanguin intracardiaque peut entraîner l’arrêt du cœur. La pousse tumorale peut engendrer une gêne dans la locomotion.
Devenir
A la fin de l'unique procédure, tous les animaux seront mis à mort avant prélèvements en point final sans réveil (analyses pharmacocinétiques, biodistribution et biomarqueurs).
Remplacement
Pour cette étude, des souris ayant un système immunitaire complet et dotées d’un cathéter sur la veine jugulaire permettant les injections et les prélèvements seront directement reçues du fournisseur. Ces expériences sur petits animaux ne peuvent pas être REMPLACEES. Seul un modèle in-vivo, possédant un système immunitaire complet, permet l'étude de l'effet vaccinal thérapeutique et anti-récidives contre les tumeurs. Il en va de même pour les facteurs physiologiques pouvant influer sur l’effet de la molécule testée (biodisponibilité, métabolisation, distribution cellulaire, réponse immunitaire...). Aucune donnée bibliographique n’étant disponible sur ces molécules, seules les expérimentations permettront de disposer de ces données et d'étudier l'efficacité du candidat médicament aux différentes étapes de la progression tumorale. Ces expériences s'inscrivent dans le cadre du développement d'une application thérapeutique et fournira des données précliniques précieuses pour la conception d'un essai clinique chez l’Homme.
Réduction
Une précédente preuve de concept a permis de déterminer que le nombre de souris prévu pour cette expérience était adapté. Ainsi, la REDUCTION du nombre d'animaux sans mettre en péril une interprétation statistique des résultats sera respectée, tout en utilisant les méthodes statistiques adaptées. Des études statistiques seront effectuées sur les mesures de croissances tumorales et sur le nombre de tumeurs n’atteignant pas une taille critique.
Raffinement
Le RAFFINEMENT sera respecté par la mise en place d’une définition précise des points limites précoces et prédictifs, sur la base d'une grille de score validée sur ce modèle et sur ce type de traitement. Une surveillance adaptée des animaux 3 fois par semaine permettra d'éviter toute souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 et isolés pendant le temps du traitement dans des cages transparentes et pourront ainsi se voir à travers les parois. Ils auront accès à l’eau et à la nourriture ainsi qu’à de l’enrichissement. Un prélèvement de sang aura lieu à la fin de 2 des 12 traitements sans que l’animal s’en rende compte par le cathéter. Les autres prélèvements seront des prélèvements terminaux pratiqués sous anesthésie et antalgie. Ce modèle se rapproche donc physiologiquement d’une infusion clinique sur l’Homme. Ce dispositif permet aussi de ne pas piquer plusieurs fois dans la même veine, ce qui peut l’abîmer.
Choix des espèces
La souris est un modèle mammifère bien caractérisé pour les études pharmacologiques et immunologiques : (1) En plus d’être un modèle pertinent, la souris est un modèle de petite taille, facile à manipuler et génétiquement bien caractérisé, avec des grilles de comparaison entre la souris et l'homme très bien définis pour les perfusions intraveineuses. (2) La réponse immunitaire chez cette espèce est également très bien définie. Or, seul le modèle animal possédant un système immunitaire complet permet l'étude de l'effet vaccinal contre le cancer. Les expériences s’effectueront sur des souris de 9 à 11 semaines après 7 jours d'acclimatation dans l’EU. A ce stade de développement, la croissance tumorale est plus reproductible et bien tolérée, de plus, le système immunitaire est suffisamment mature pour induire une réponse vaccinale. Les souris utilisées seront toutes des femelles afin de limiter le risque d’agressivité inter-individu par rapport aux mâles. De plus, les études précédentes ont également été effectuées sur des souris femelles, ce qui permettra de comparer les résultats de cette étude.
Mesure de l’efficacité chez la souris des anticorps humanisés anti-VEGFC dans le contexte des cancers du sein et du rein
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Dépourvues de système immunitaire, elles reçoivent une greffe de cellules tumorales humaines sous la peau puis des injections deux fois par semaine, pour tester des anticorps anti-VEGFC contre les cancers du sein et du rein métastatiques. Le porteur indique que la croissance tumorale peut provoquer poils hérissés, dos voûté, perte de poids, mobilité réduite et nécrose de la peau, et que les souris sont tuées par dislocation cervicale quand la tumeur atteint un centimètre cube. Il présente le projet comme une étape vers un essai clinique et la création d'une société, et affirme qu'il n'existe aucune méthode alternative.
Objectifs
Les cellules cancéreuses disséminent dans l’organisme (métastase) en grande partie via un réseau de vaisseaux lymphatiques intra-tumoral. La création de ces vaisseaux dépend de facteurs de croissance des cellules endothéliales les constituant. Le VEGFC (Facteur de Croisance des cellules Vasculaires Endothéliales) est l’un des facteurs de croissance majeurs impliqués dans ce phénomène. Nous avons obtenu des anticorps anti-VEGFC chez la souris qui freinent la croissance de tumeurs du rein expérimentales. Forts de cette preuve de concept, nous proposons de développer des formes humanisées de ces anticorps murins. Les anticorps humanisés actuellement utilisés en clinique représentent le « Gold standard » en thérapie anticancéreuse. Dans le cadre du projet de prématuration, les anticorps anti-VEGFC générés par génie génétique subiront des tests ex vivo et in vivo pour valider leur efficacité. Adossés à une propriété intellectuelle par dépôt de brevet, ces outils thérapeutiques seront proposés pour un essai clinique de phase précoce chez l’homme.
Bénéfices attendus
Le projet aboutira à une preuve de concept de validation d’anticorps thérapeutiques humanisés pour le traitement des pathologies avec lymphangiogenèse exacerbée. Cette étape est nécessaire pour l’introduction des anticorps en clinique et aboutir à un nouveau traitement des cancers métastatiques. La mission fondamentale de ce projet est d’améliorer la survie des patients et de répondre à leurs besoins non satisfaits. Sur le plan économique, le projet mènera vers la création d’une nouvelle société française développant des technologies innovantes. A plus long terme, le projet amènera à l’initiation d’essais de phase II/III avec un partenaire industriel pour approbation de l’utilisation d’anticorps anti-VEGFC pour le traitement de cancers métastatiques. Le but ultime est d’améliorer l’efficacité des traitements des cancers métastatiques et d’obtenir des rémissions plus longues/guérisons. Il est envisagé d’étendre l’utilisation de ces anticorps aux pathologies avec lymphangiogenèse délétère.
Procédures
1/ 200 souris seront Injectées par les véhicules ou différentes cellules tumorales en sous-cutanée au début des procédures (environ 10 sec). 2/ Ensuite, une fois que les tumeurs seront préformées, une injection en IP (environ 10 sec) deux fois par semaine sera réalisée sur la totalité des souris. Dans les groupes injectées par les cellules tumorales, nous attendrons que la taille de la tumeur atteigne 1cm3. L’atteinte de ce point limite (quel que soit le groupe expérimental concerné) dictera la fin de l’expérimentation. 3/ Une fois ce point limite atteint, la mise à mort par dislocation cervicale des 200 souris sera réalisée. Pas d'intervention prévue sur animaux vigiles. » La durée totale de l’expérimentation est évaluée à 4 semaines.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. Ces effets indésirables pourront être causés soit par la croissance de la tumeur, soit par l’injection des véhicules ou cellules tumorales. La croissance de la tumeur pourra entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance (poils hérissés, dos voûté, perte de poids, mobilité réduite, prostration), ainsi que des altérations visibles de la peau (nécrose, rougeur, infection). L’injection des véhicules ou cellules tumorales pourraient également entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations local au site d’injection (rougeur, infection, nécrose).
Devenir
Les animaux seront mis à morts pour effectuer des prélèvements lorsque la tumeur atteint 1 cm3 . Les souris ayant été injectées avec des cellules tumorales, elles ne pourront pas etre réutilisées, remplacées ou adoptées.
Remplacement
Il n‘existe pas de méthodes alternatives ni substitutives l‘utilisation de souris pour nos objectifs.
Réduction
Avant de passer au modele in vivo, toutes nos expériences ont été préalablement validées in vitro et in vivo. Nous avons également effectué une large recherche bibliographique. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous nous baserons sur les données de la littérature et sur nos résultats antérieurs pour les doses administrées de composés pharmacologiques. Le nombre minimum de souris est établi à 10 par groupe pour etre statistiquement significatif (en nous basant sur le fait que les traitements expérimentaux induiront une diminution de la prise/croissance tumorale d'environ 25%).
Raffinement
Les animaux agés de 6 à 8 semaines seront mis dans des cages enrichies (maison et morceaux de papiers) sur portoirs (5 animaux/cage), nourriture et boisson ad libitum. De plus, les expériences seront menées de sorte qu'aucune souris ne reste isolée. Les expérimentateurs procéderont à une évaluation quotidienne de l'état général des souris pour déterminer la présence de signes de stress ou de souffrance (attitude soumise, dos vouté, respiration difficile, extrémités pales, démarche anormale, diarrhée). Des points limites précis sont définis dans chaque procédure.
Choix des espèces
NMRI-_Foxn1nu /Foxn1nu (nude), qui constituent le meilleur modele d'étude de xénogrefffe des cellules cancéreuses. Injection de cellules humaines sans rejet. Nous utiliserons ici des animaux agés de 6 à 8 semaines. Une fois les groupes expérimentaux réalisés, les animaux seront acclimatés durant une semaine avant de réaliser les injections sous-cutanées des cellules tumorales, ce qui implique de débuter les expériences sur des animaux agés de 7 à 9 semaines (utilisation de souris jeunes mais ayant déjà atteints leur maturité sexuelle et ayant une courbe de poids stable).
Irradiation de modèles murins
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 500
2 500 rongeurs, 2 000 souris et 500 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sur une plateforme d'irradiation ouverte à d'autres équipes. Chaque animal reçoit une ou plusieurs séances d'irradiation sous anesthésie, puis retourne dans son animalerie d'origine, son sort final dépendant du projet qui l'utilise. Le porteur indique que l'irradiation d'une tumeur peut entraîner des nécroses et que l'irradiation du corps entier peut provoquer des douleurs à long terme. Il affirme que le recours à l'animal reste "essentiel" malgré des cultures cellulaires en 2D ou 3D, et justifie le nombre d'animaux par le seul "minimum nécessaire pour assurer une étude statistique".
Objectifs
La radiothérapie est un traitement localisé qui consiste à utiliser des radiations pour détruire les cellules cancéreuses. Les dommages induits par les rayonnements vont bloquer la prolifération cellulaire, tout en préservant le plus possible les zones périphériques saines. A l’heure actuelle, elle est utilisée seule ou en combinaison avec la chirurgie et/ou la chimiothérapie et concerne aujourd’hui 60% des traitements contre le cancer. Ainsi, la radiothérapie représente une technique nécessaire aux équipes de recherche travaillant dans le domaine de la cancérologie pour la compréhension des mécanismes biologiques en jeux et l’amélioration des traitements. Ce projet a pour objectif de permettre l’accès à un équipement de radiothérapie dédié au rongeurs à la communauté scientifique.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans la recherche thérapeutique utilisant l’irradiation pour mieux comprendre les mécanismes en jeux et/ou pour le développement de nouveaux traitements. Ce projet s’inscrit de ce fait dans une volonté de faire progresser les connaissances sur le développement tumoral ainsi que d’améliorer le traitement des patients en augmentant ainsi aussi bien la qualité de vie que leur survie.
Procédures
L’ensemble des animaux sera soumis à une ou plusieurs séances d’irradiation sous anesthésie générale. La durée de l’irradiation avec mise en place, irradiation et retour dans la cage prendra au maximum 30 minutes. L’anesthésie générale durera au maximum 20 minutes et l’irradiation au maximum 15 minutes. Chaque session aura une durée courte et pourra être réitérée au maximum deux fois par jour sur une durée de 1 jour à plusieurs semaines.
Impact sur les animaux
L’irradiation n’induit pas d’effets indésirables directs. Néanmoins, l’irradiation de tumeurs peut induire des nécroses suite à l’évolution de la croissance tumorale post-traitement et l’irradiation totale d’un animal peut aussi induire des douleurs à long terme.
Devenir
Après irradiation chaque animal retournera dans son animalerie d'appartenance. L'issue finale des animaux dépendra de chaque projet et sera détaillée dans chacune des procédures expérimentales présentées dans les demandes de projet.
Remplacement
Nous tacherons dans la mesure du possible d’utiliser des cultures cellulaires en 2D ou 3D (sphéroïdes et organoïdes). Néanmoins, il est nécessaire de valider les résultats obtenus in vivo afin de prendre en compte toute la complexité du vivant et avant de pouvoir faire l’objet d’essai clinique sur l’homme. Ainsi, le recours à l’animal s’avère essentiel pour avancer dans la validation de nouveaux traitements.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est établi afin de correspondre au minimum nécessaire pour assurer une étude statistique.
Raffinement
L’irradiation n’induit pas de souffrance ni de douleur à l’animal pendant et directement après. Les séances d’irradiation seront réalisées sous anesthésie générale de l’animal avec maintien de leur température corporelle. La durée de l’irradiation prendra de 5 à 30 minutes maximum. De l’onguent ophtalmique sera déposé sur les yeux pour éviter leur dessèchement. En cas d’irradiation ciblée, l’animal sera protégé par un bouclier adapté en fonction de la zone à irradier. La structure en charge du bien-être animal accompagnera chaque projet séparément dans sa mise en œuvre avec les conseils du vétérinaire désigné qui prendra les dispositions nécessaires au maintien du bien-être des animaux. Si un animal (rat ou souris) venait à montrer des signes de problèmes respiratoires, il pourrait être euthanasié sur site. Cette procédure ne sera réalisée qu’après accord du porteur du projet.
Choix des espèces
La souris représente l’espèce la plus utilisée en expérimentation en oncologie. La raison la plus importante du choix de la souris est sa similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. Sa petite taille, sa prolificité, les facilités zootechniques, les risques sanitaires moindres et une littérature abondante sont autant d’arguments complémentaires en faveur du choix de cette espèce. Le rat est une alternative à l’utilisation de la souris de par sa taille permettant d’atteindre une maturité de tumeur plus importante nécessaire dans certaines études. Nous utiliserons des rongeurs à différents stades de développement pour couvrir le plus largement les situations rencontrées dans les services cliniques.
Evaluation de l’efficacité et de l’innocuité de nouvelles technologies de robotique chirurgicale pour la thermoablation percutanée mini-invasive de tumeurs sur modèle porcin
- Recherche appliquée
- Cancers
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
36 porcs vont être utilisés, opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil. Chaque animal reçoit sept insertions d'aiguille, quatre dans les poumons et trois dans le foie, suivies de séances de destruction de tissu par la chaleur, pour valider des dispositifs robotisés de thermoablation destinés à l'humain. Le porteur indique que la procédure, sans réveil, dure jusqu'à cinq heures et que les nuisances attendues concernent surtout le stress des phases d'isolement et de préparation. Il affirme que ces dispositifs, déjà testés en laboratoire, doivent être validés sur un animal vivant pour tenir compte des mouvements respiratoires et de la proximité des organes.
Objectifs
D’après l’Organisation Mondiale de la Santé, le cancer est une cause majeure de décès dans le monde, à l’origine de 10 millions de décès en 2020. Le choix du traitement du cancer dépend de l'organe cible et du stade d’avancée de la maladie. Par exemple, la transplantation hépatique, la résection chirurgicale ou la destruction percutanée sont les traitements proposés pour un cancer diagnostiqué à un stade peu avancé. La chimioembolisation, la chimiothérapie, les thérapies ciblées, les traitements palliatifs sont proposés dans le cas de cancers plus avancés. La destruction percutanée est envisagée chez les patients ayant des masses tumorales bien définies. Ce traitement peu invasif est une alternative à la chirurgie consistant à introduire une sonde sous repérage scanner afin d’atteindre la tumeur et la détruire par la chaleur (micro-ondes ou radiofréquences). Ce traitement est rapide avec peu de complications reportées. L’insertion de la sonde peut être réalisée manuellement ou à l’aide d’une plateforme robotique. Les objectifs de ce projet sont double: valider de nouvelles technologies de thermoablation, et tester de nouvelles technologies robotisées permettant la réalisation de biopsies et la destruction percutanée mini-invasive de tumeurs. Ces plateformes robotisées proposent une atteinte très précise et sécurisée des tumeurs. Elle sera une alternative pour les patients n’ayant pas recours à la transplantation ou aux traitements par chimiothérapie ou radiologie. Des tests in-vitro ont été réalisés afin de s’assurer du bon fonctionnement du robot et/ou du générateur de thermoablation. Néanmoins, il est nécessaire d’évaluer l’efficacité de ces appareils en réalisant des tests sur animaux pour prendre en compte les éléments qui ne peuvent pas être démontrés par des tests in-vitro (mouvements naturels engendrés par la respiration, proximité d’autres organes et des vaisseaux sanguins).
Bénéfices attendus
A l’issu de cette étude, les meilleures combinaisons de conditions seront sélectionnées pour une efficacité optimale des générateurs de thermoablation (puissance et durée d'action). Cette étude permettra également de valider, pour les stations robotisées de positionnement d'aiguilles, le protocole standard et de s’assurer d’avoir une méthode reproductible permettant plusieurs atteintes des cibles, ainsi qu’une évaluation de la sécurité du dispositif.
Procédures
Chaque animal sera impliqué dans une procédure sans réveil après 7 jours d'acclimatation. Les animaux concernés seront isolés la veille de l'intervention en petit groupe de 2 à 3 et mis à jeun ensemble. Le jour de l'intervention, l'anesthésie est précédée d'un isolement de l'animal dans un box vide afin de réaliser la prémédication par piqûre intramusculaire du mélange (Kétamine, calmivet, robinul). cette étape ne dure que 5 minutes car l'animal est piqué au niveau de la cuisse par une aiguille de 19G reliée à une grande tubulure permettant une injection lente du produit sans contention. Sous anesthésie générale (avec intubation, anesthésie volatile et administration de morphiniques), les animaux auront 7 insertions d'aiguille de thermoablation sous repérage scanner (4 dans les poumons et 3 dans le foie). Des évaluations de zones de thermoablation permettront de valider des générateurs de thermoablation et de standardiser des protocoles en fonction des dispositifs. Des imageries scanners seront réalisées tout au long de la procédure dans un but de repérage anatomique, de vérification de la localisation des aiguilles et de l'efficacité du générateur après thermoablation (zone d'ablation visible au scanner). Les protocoles utilisés (temps et puissance) pour chaque procédure seront déterminés en fonction des caractéristiques du matériel utilisé (fournis par le fabricant), ceux-ci seront compris entre 50 et 150 Watt pour une durée de 2 à 15 minutes pour chaque ablation. La procédure aura une durée de 5h maximum en prenant en compte les possibles contre-temps techniques (30minutes de préparation de l'animal, imageries basales, installation du robot et du générateur, mise en place des aiguilles (n=7), temps de thermoablations, imageries scanner de vérification à chaque positionnement d'aiguille et à chaque ablation).
Impact sur les animaux
La procédure expérimentale étant sans-réveil, les nuisances ou effets indésirables attendus concernent principalement les périodes d'acclimatation et de préparation. Celles-ci peuvent, en effet, être source de stress, notamment la veille de l'intervention pendant la phase d'isolement en petit groupe (n=2 ou 3) pour la mise à jeun. Le jour de l'intervention, l'anesthésie est précédée d'un isolement de l'animal dans un box vide afin de réaliser la prémédication par piqure intramusculaire du mélange (Kétamine, calmivet, robinul), cette étape ne dure que 5 minutes (piqure avec une grande tubulure permettant l'injection lente du produit sans contention) mais peut également être source de stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de cette procédure expérimentale afin d'effectuer des analyses histologiques et immunohistichimiques sur les organes cibles.
Remplacement
Il s’agit d’une étude ayant pour objectif d'évaluer l’efficacité et l’innocuité de nouvelles technologies de thermoablation et de plateformes robotiques chirurgicales pour la pose d'aiguille de thermoablation percutanée. L'ensemble de ces appareils ont été testés in vitro, cependant, il est nécessaire d’évaluer l’efficacité de ces appareils en réalisant des tests sur organismes vivants pour prendre en compte les éléments qui ne peuvent pas être démontrés par des tests in-vitro (mouvements naturels engendrés par la respiration, proximité d’autres organes et des vaisseaux sanguins). Le projet a pour objectif de valider les aspects d’efficacité et de sécurité dans un modèle in-vivo, ne pouvant être validés lors des tests in-vitro. Le modèle porcin, de par sa taille, présente l'avantgae d'avoir des tailles d'organes comparables à l'Homme, ce qui permet de tester directement les appareils dédiés à l'Homme après validation.
Réduction
Pour chaque session (nouvel appareil à tester), 6 animaux seront nécessaires. Cette étude permet de combiner des essais de plateformes robotisées à l'évaluation de générateurs de thermoablation, permettant ainsi de réduire le nombre d'animaux. En effet, un nombre de 6 animaux permet d'obtenir un total de 42 insertions d'aiguille robotisées et zones de thermoablations (4 dans les poumons et 3 dans le foie, ce qui fait 7 insertions par animal; pour 6 animaux: 6 x 7= 42 insertions et thermoablation). Le nombre d’animaux a été réduit en veillant toutefois de travailler sur un nombre suffisant pour obtenir une différence significative entre les différents groupes pour les comparaisons ( variation de la puissance et du temps de thermoablation en fonction des générateurs à tester, selon les recommandations du fabriquant). La plupart des analyses de positionnement robotisée dépendront de données qualitatives, par expérience, un nombre de 6 cochons par session permettra d'obtenir des résultats interprétables, en tenant compte de la variabilité interindividuelle.
Raffinement
Toutes les procédures expérimentales ainsi que l’environnement d’hébergement ont été optimisées. Les gestes interventionnels seront toujours réalisés sous anesthésie générale avec utilisation de morphiniques, par du personnel formé, permettant un temps interventionnel réduit au maximun, afin de prévenir la souffrance et l’angoisse de l’animal dans les phases de préparation (prémédication, pose de cathéter). Le bien-être de l'animal sera contrôlé en veillant aux conditions d'hébergement et au comportement des animaux durant l'acclimatation, d'une durée d'une semaine avant d'entrer dans le protocole. Lors de celle-ci, des observations quotidiennes seront réalisées par une personne compétente basées sur l'apparence physique externe, le comportement (sociabilité, appétit) et les réponses comportementales aux stimuli externes (bruits...).
Choix des espèces
Le porc est devenu l'animal de taille humaine de référence parce qu'il est très proche de l'homme d'un point de vue physiologique et anatomique (taille, structure et morphométrie des organes, stabilité génétique). De nombreuses constantes biologiques sont très similaires à l'Humain. Une fratrie habituelle de 10 à 12 animaux fournit un groupe de stabulation et d'expérimentation homogène. Les dispositifs médicaux de la clinique humaine peuvent directement être utilisés chez le Porc. Ainsi, l'utilisation d'équipements d'imagerie médicale destinés à l'Homme permet d'avoir une qualité d'imagerie équivalente à celle obtenue chez l’humain. Pour des raisons de nursing et de manutention l’animal sera un porc de 40 +/- 5 kg ce qui correspond à un porc de 4 à 6 mois.
Ciblage de fibroblastes activés (CAF) dans le cadre du cancer du sein chez la souris par l’intermédiaire d’inhibiteurs des NADPH oxydases
- Recherche appliquée
- Cancers
390 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ces souris transgéniques développent spontanément des tumeurs mammaires multiples et métastatiques, et reçoivent chaque jour par gavage un inhibiteur pendant neuf semaines, pour tester une molécule censée rendre les tumeurs sensibles à l'immunothérapie. Le porteur indique qu'aucune analgésie ni anesthésie n'est prévue, jugeant que ces gestes auraient un impact "égal ou supérieur" à celui des procédures, et que les animaux seront tués au CO2 puis par dislocation cervicale. Il affirme que ces interactions entre tumeur et système immunitaire ne peuvent pas encore être reproduites hors de l'animal.
Objectifs
Aujourd'hui des progrès considérables ont été faits dans les traitements apportés aux cancers. La médecine proposée est de plus en plus personnalisée et l'analyse des mutations des cellules tumorales permet d'ajuster et de proposer les traitements les plus adaptés. L'arrivée des immunothérapies a aussi permis de faire en sorte que le corps et le système immunitaire du patient puisse combattre lui même les cellules tumorales. Cependant un grand nombre de patients ne répondent pas à ces nouvelles thérapies car dans ce cas précis il a été observé qu'une capsule fibreuse entourait les tumeurs et rendait invisible ces cellules au système immunitaire du patient. Ce stroma fibreux a été montré composé de CAF (fibroblastes) dont leur recrutement et leur activation étaient liés aux NADPH oxidase, enzymes responsables de la production de radicaux libres. Notre société développant des inhibiteurs des NADPH oxidase nous pensons donc que l'inhibition principalement de NOX1 et NOX4 pourrait amener une avancée significative dans la prise en charge de ces patients qui ne répondent pas aux immunothérapies. Les travaux préliminaires des professeurs Gareth Thomas (UK) et Natalie Sampson (Autriche) ont montré en effet que la combinaison d'une immunothérapie avec l'inhibition de NOX1 et NOX4 conduisait à une réduction totale des tumeurs fortement constituées de CAF. Nous souhaitons donc tester nos nouvelles générations d'inhibiteurs de NOX1/4 dans ce modèle de cancérologie.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus dans ce modèle pourraient fournir une alternative de traitement chez les patients souffrant de cancers qui ne répondent aujourd'hui pas bien aux immunothérapies. L'inhibition de NOX1 et NOX4 permettra ainsi de réduire cette capsule fibreuse entourant la plupart des tumeurs réfractaires aux immunothérapies et permettra ainsi aux immunothérapies de permettre au propre système immunitaire du patient de reconnaitre les cellules tumorales comme un hôte étranger et de les combattre. Nous pouvons ainsi espérer non seulement combattre la croissance des tumeurs sur le court terme mais également prévenir la survenue de métastases sur d'autres organes et ainsi améliorer la survie des patients en ayant de meilleures prise en charge et réponse aux traitements.
Procédures
Les animaux seront traités au quotidien par gavage soit avec nos composés inhibiteurs de NOX1 et NOX4 soit avec le véhicule qui servira à leur préparation. Le type de sonde ainsi que le volume administré (10mL/kg maximum) seront adaptés au poids des animaux utilisés. Cette procédure a une durée de 10 à 15 secondes. Tout au long des 9 semaines maximum de traitement, une évaluation clinique quodienne sera effectuée sur chaque animal lors de ce gavage. Une pesée bi hebdomadaire (5 à 10 secondes) et la mesure de la taille des tumeurs à l'aide d'un pied à coulisse (20 à 30 secondes) seront réalisées ces mêmes jours. Ces actes seront réalisés sur tous les animaux et sur animaux vigiles. L'étude ne comprend pas de prélèvement sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Nous pouvons distinguer les effets indésirables liés au phénotype des souris de ceux liés aux procédures techniques qui seront réalisées au long des 9 semaines maximum de traitement. Les souris vont développer de manière spontanée des tumeurs mammaires localisées dans la graisse ce qui peut générer un inconfort ainsi qu'une perte de mobilité. Cependant un suivi strict 2 fois par semaine de la taille de ces tumeurs permettra de fixer la limite de taille à ne pas excéder pour que cela puisse effecter la qualité de vie ainsi que les interactions sociales des souris. Une fois la limite de taille définie dans les procédures expérimentales, la décision sera prise d'euthanasier les souris. Les animaux seront observés de manière quotidienne au moment des traitements et si des signes de douleur ou de prostration sont observés nous pourrons faire appel aux conseils de notre vétérinaire référent et prendre la décision de l'euthanasie de l'animal. Enfin, il n'a pas été décrit de perte de poids significative dans ce modèle pour autant que le point limite de la taille de tumeur soit respecté mais nous pèserons également les animaux 2 fois par semaine. Cet indicateur permettra d'évaluer que les animaux présentent bien une mobilité correcte pour se nourrir et avoir des interactions sociales. Les animaux seront également traités au quotidien par gavage oral ce qui peut créer un inconfort et un stress limité dans le temps. La formation du personnel, la taille adaptée de la sonde de gavage ainsi que l'adaptation du volume adminsitré permettront de réduire au strict minimum le stress généré par cette technique de traitement.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, l'ensemble des animaux seront mis à mort par absorption progressive de CO2 après anesthésie gazeuse. La mort sera vérifiée par le test des reflexes au niveau d'une patte postérieure et assurée par dislocation cervicale. Cette mise à mort est nécessaire pour le prélèvement des tumeurs et des poumons.
Remplacement
Les progrès de la technologie permettent en permanence le remplacement des animaux par d'autres modèles dans la science expérimentale. Ces évolutions sont évidemment souhaitables et, chaque fois que possible, nous réalisons des essais in vitro appropriés pour identifier les composés actifs présentant le plus grand potentiel avant d’être testés in vivo. Cependant, nous étudions les effets des molécules qui interagissent avec le stroma tumoral et l'effet que cela a sur différents axes du système immunitaire murin, en vue du traitement des maladies humaines. Ces interactions se produisent entre différents tissus et organes et sont également susceptibles d'être influencées par la présence de tumeurs en croissance et elles ne peuvent ainsi pas encore être reproduites in vitro ce qui nécessite toujours le développement chez l'animal.
Réduction
Des inhibiteurs des Nox ont déjà été testés dans ce modèle. Nous utilisons les données de croissance tumorale déjà obtenues pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des différences significatives dans la croissance tumorale entre les groupes témoins et traités. Nous testerons au préalable chaque composé dans des essais in vitro (tests cellulaires, ADME...). Nous obtiendrons également au préalable les données ADME des différents composés ainsi que leur profil de pharmacocinétique. Nous ne sélectionnerons ainsi uniquement que les composés les plus puissants dans nos essais de pharmacologie, ainsi que les composés présentant toutes les caractéristiques d'un potentiel futur médicament. Nous n'utiliserons pas non plus d'animaux sham (souris ne développant pas de tumeurs) car l'ensemble des données analysées le seront au niveau de la taille des tumeurs ainsi que de l'infiltration des cellules immunitaires dans les tumeurs. Afin de montrer l'effet d'une dose par rapport au groupe contrôle ou au groupe de référence, les données seront analysées par des tests statistiques. Pour normaliser les données des groupes à variances significativement différentes, une correction sera appliquée en fonction des tests statistiques utilisés.
Raffinement
Les souris seront hébergées en cage ventillée, par groupe social stable, avec l’enrichissement leur permettant d’explorer leur comportement naturel (enfouir, ronger, se cacher). L’hébergement correspond aux recommandations internationales et les constantes sont surveillées quotidiennement. Les composés seront administrés par voie orale aux souris. Les souris tolèrent bien cette technique. Le volume classique de 10mL/kg maximum (5mL/kg si possible) est bien toléré. Comme les tumeurs se formeront sur le tampon graisseux mammaire, la taille de celles-ci pourra être facilement mesurée sans aucun stress causé aux animaux. Des points limites sont définis en fonction du volume des tumeurs et l'apparition éventuelle de nécrose. Si la tumeur a une influence sur l'état général de l'animal (pelage sale, perte de poids, prostation, isolement...), les animaux seront soignés selon leurs besoins, sur les conseils du vétérinaire référent. Ce dernier décidera de leur sortie, ou non, de l'étude. Les procédures d'analgésie ou d'anesthésie ayant un impact égal ou supérieur aux gestes techniques de ces procédures expérimentales, il n'est pas prévu au protocole d'utiliser de telles substances.
Choix des espèces
Pour modéliser une tumeur riche en tissu stromal, nous avons choisi d'étudier les souris transgéniques FVB / N-Tg (MMTV-PyVT) 634Mul / J ou MMTV-PyMT. Ces souris expriment l'antigène T moyen du Polyomavirus sous le promoteur/activateur du virus de la tumeur mammaire de la souris (MMTV). Les femelles MMTV-PyMT développent spontanément des tumeurs mammaires palpables multifocales, hautement fibrotiques et qui métastasent dans le poumon, caractéristiques proches d'un cancer du sein humain. Nous utiliserons des animaux adultes de 6 à 14 semaines environ. Des femelles seront surveillées à partir de 6 semaines d’âge, les tumeurs mammaires commençant à se développer à cet âge (dès l'apparition des tumeurs). Les traitements commenceront entre 6 et 8 semaines d'âge, dès l'apparition des tumeurs, et ce pour 9 semaines maximum.
Etude de l’effet de variants d’une cytokine sur la modulation de la réponse immunitaire anti-tumorale dans des modèles murins
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
8 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections de cellules humaines et de cellules tumorales, des traitements répétés et des prélèvements de sang au sinus de l'œil jusqu'à sept fois par expérience, pour tester des variants d'une cytokine en immunothérapie anticancéreuse. Le porteur indique que la greffe de cellules humaines peut déclencher une réaction du greffon contre l'hôte avec perte de poids et de poils, et que les prélèvements répétés peuvent entraîner une inflammation, une cécité ou un choc par manque de sang. Il affirme que le passage par la souris reste "réglementairement obligatoire" malgré les modèles de tumeurs en trois dimensions déjà utilisés.
Objectifs
L’absence de réponse de certains patients aux chimiothérapies conventionnelles et l’étude approfondie des cellules immunitaires infiltrant la tumeur a conduit au développement de nouvelles molécules thérapeutiques destinées à mobiliser le système immunitaire du patient afin qu’il reconnaisse les cellules cancéreuses et les détruises. Cette stratégie est appelée immunothérapie. Ces stratégies thérapeutiques ont permis aux patients traités d’avoir une augmentation drastique de leur survie faisant des immunothérapies des traitements révolutionnaires. Notre molécule d’intérêt est une cytokine qui agit sur différentes populations de cellules du système immunitaire, en particulier sur les cellules effectrices, qui attaquent les cellules cancéreuses ou qui activent d’autres cellules pour aider à les éliminer ; et les régulatrices, qui contrôlent la réponse immune. Cette cytokine d’intêret est déjà utilisée en oncologie à forte dose depuis plusieurs années pour sa capacité à activer les cellules effectrices. Cependant, la toxicité reste importante et la faible efficacité est due à l'activation non désirée des cellules régulatrices qui diminuent la réponse immune effectrice. Toutefois, à faible dose la cytokine agit préférentiellement sur les cellules régulatrices et peut être utilisée comme médicament immuno-inhibiteur (actuellement testée en clinique pour le diabète de type 1, le lupus érythémateux disséminé et la réaction du greffon contre l’hôte). Cependant, le principal défi dans ce domaine est la dissociation des effets opposés de la cytokine : activation des cellules effectrices et activation des cellules régulatrices. Pour cela, en nous appuyant sur nos résultats antérieurs, l'équipe a modifié génétiquement la cytokine (variants de la cytokine) en la combinant à d’autres acteurs de la réponse immunitaire, afin d’étudier l’effet anti-tumoralde ces variants générés, dans différents modèles de souris. Pour cela, nous allons utiliser des modèles de cancers humains et murins puisque nous avons développé un ensemble de cytokines humaines et murines modifiées. Enfin, nous souhaitons également agir sur d’autres points de contrôles de la réponse immunitaire afin d’optimiser nos cytokines modifiées.
Bénéfices attendus
Plusieurs bénéfices peuvent découler de notre projet. En effet, si l’injection des immunocytokines et/ou en combinaison avec des anticorps anti-checkpoint immunitaire dans les modèles tumoraux de souris humanisées conduisent à une régression tumorale dans les souris, nous pourrons passer aux étapes de développement clinique pour les patients atteints de cancer. De plus, l’analyse de la réponse immunitaire au sein du micro-environnement tumoral avec les différents traitements nous permettra de faire progresser les connaissances scientifiques dans le domaine de l’immuno-oncologie.
Procédures
-Injection des cellules humaines par voie voie rétro-orbitale : sur animal endormi sous anesthésie gazeuse; 1936 souris, une fois par expérience. La durée du geste est de 30 secondes par souris. -Prélèvements sanguins : sur animal endormi sous anesthésie gazeuse, 5976 souris, 2 à 7 fois par expérience (à raison de 2 à 4 points de sang) sur une durée de 11j à 2 mois. La durée du geste est de 15 secondes par souris. -Injection des cellules tumorales : sur animal vigile, sans anesthésie. 7392 souris, une fois par expérience. La durée du geste est de 30 secondes par souris. -Injection de traitements par voie intrapéritonéale : sur animal vigile, sans anesthésie. 8040 souris, 1 à 2x/semaine et entre 6 ou 9 injections au maximum. La durée du geste est de 20 secondes par souris. -Mesure de la taille tumorale avec pied à coulisse : sur animal vigile, sans anesthésie. 7392 souris, 2x/semaine sur une durée d’environ 2 mois maximum . La durée du geste est de 15 secondes par souris. -Poids des animaux : sur animaux vigiles, sans anesthésie. 7392 souris. 2x/semaine sur une durée d’environ 2 mois maximum. La durée du geste est de 30 secondes par souris.
Impact sur les animaux
Certains effets indésirables peuvent apparaître sur les animaux. En effet, la reconstitution du système immunitaire de la souris avec des cellules humaines peut conduire au développement d’une GvHD (maladie du greffon contre l’autre) par la présence d’une perte de poids 2-3 semaines après l’injection des cellules pour les modèles PBMCs, ainsi que des signes cliniques tels que mobilité réduite, perte de poils, posture voûtée, … La durée des symptômes varie entre chaque animal. En ce qui concerne l'injection de cellules tumorales par voie sous-cutanée cela conduit au développement d’une tumeur. Les prélèvements sanguins répétés au niveau du sinus rétro-orbital peuvent éventuellement entrainer une inflammation, une cécité ou un choc hypovolémique.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort. Des tissus seront prélevés post-mortem pour analyses.
Remplacement
Afin de remplacer et de limiter l’utilisation des souris pour évaluer l’effet de nos composés, nous avons mis en place plusieurs méthodes alternatives. En effet, nous sommes actuellement en train d’évaluer l’effet des immunocytokines grâce à plusieurs technologies in vitro : sur des tumeurs 3D et sur des organoïdes de tumeurs. A cette fin, nous avons établi des collaborations avec des équipes de recherche et des entreprises spécialisées dans les modèles de tumeurs in vitro. Cependant, bien que ces méthodes alternatives nous apportent des informations quant à l’effet de nos composés sur les cellules tumorales, nous devrons quand même tester les immunocytokines les plus prometteuses dans des modèles murins afin d’être dans un système plus physiologique, ce qui est réglementairement obligatoire avant d’envisager d’aller en clinique. En ce qui concerne l’évaluation des agonistes de la cytokine, il n’existe de nos jours aucune méthode alternative permettant d’évaluer l’effet des agonistes sur le développement d’une maladie auto-immune. En effet, ces dernières ont souvent des manifestations cliniques affectant un grand nombre d’organes, ce qui nécessite d’avoir un organisme vivant pour analyser leur effet. Nous sommes donc dans l’obligation de tester la cross-réactivité et la capacité à expandre les cellules T régulatrices de nos molécules avant de les tester dans des modèles murins d’auto-immunité.
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux dans notre projet, nous avons mis en place plusieurs mesures : 1) Nous avons analysé in vitro la capacité des différentes immunocytokines à se fixer au récepteur de haute affinité des cellules T régulatrices humaines et murines et leur capacité à antagoniser la fixation de la cytokine non modifiée. Nous avons également mesuré la capacité des immunocytokines à induire une réponse dans les cellules T régulatrices (induction de la voie de signalisation). Seules les immunocytokines remplissant les deux conditions seront pré-sélectionnées pour cette procédure (fixation sur le récepteur de haute affinité et blocage de la voie de signalisation des cellules T régulatrices). En parralèle, des expériences ex vivo sur des modèles 3D de tumeurs ou organoïdes, nous permettra de mieux comprendre l’effet thérapeutique de notre molécule et ainsi de n’utiliser que celles validées in vitro et ex vivo dans les souris. 2) Selon les procédures, le nombre de souris par groupe est de 6 à 12 afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante pour mettre en évidence l’efficacité thérapeutique. Le nombre de souris sélectionnées pour chaque expérience tient compte de la nécessité 1/ d'utiliser le minimum de souris et 2/ de pouvoir limiter l’impact de la variabilité entre les donneurs (souris immunodéficientes greffées avec des cellules immunitaires humaines). La comparaison de la survie après greffe de tumeurs sera évaluée à l'aide du LogRank test et les analyses des populations de cellules immunes ou la comparaison des tailles de tumeurs à des points précis de la cinétique seront évalués à l'aide des tests non paramétriques Anova et Kruskal Wallis par GraphPad Prism. 3) Dans la procédure 1, 3 et 5, nous avons également décidé d’analyser plusieurs immunocytokines/cytokines agonistes par expérience afin de limiter le nombre de souris recevant des traitements contrôles. 4) Enfin, nous utiliserons des souris femelles pour réduire l’aggressivité et les conflits entre les individus, qui sont généralement le cas chez les souirs mâles, entrainant moins de lésions chez les individus.
Raffinement
Les souris sont surveillées régulièrement et elles sont mises à mort lorsque les points limites énoncés dans la grille de score de chaque procédure sont atteints. De plus, tous les animaux doivent faire l’objet d’une période d’acclimatation d’au moins 72h afin de réduire le stress lié au transport des animaux. De plus, nous utiliserons des souris femelles pour réduire l’aggressivité et les conflits entre les individus, qui sont généralement le cas chez les souirs mâles, entrainant moins de lésions chez les individus. Concernant l’enrichissement, les souris bénificieront dans leurs cages des élements suivants, selon leur disponibilité à l’animalerie : bâtonnets de coton et/ou maison en carton et/ou bâtonnetes de bois. Enfin, les prélèvement de sang se réaliserons sous une rapide anesthésie gazeuse et la cage sera sous un tapis chauffant après leur réveil.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les expériences menées en thérapeutique du cancer et elle a depuis longtemps servi à l'étude de thérapies anti-tumorales, notamment car la physiologie de la souris est proche de celle de l'Homme. La connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques permettant d'identifier des cibles précises pour la thérapie. En effet, il existe un grand nombre de modèles de tumeurs transplantées ainsi que des modèles de tumeurs spontanées qui sont disponibles. Les souris NSG seront utilisées à l’âge de 5-7 semaines afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux. De plus, cet âge est adapté pour générer des modèles de tumeurs spontanées et/ou induites par le transfert de lignées de cellules tumorales (Procédure 1, 3, 5). Les souris huCD34-NOG-EXL et huCD34-SGM3 seront utilisées à l’âge adulte, entre 18 à 24 semaines, délai dû à la reconstitution en cellules immunitaires à partir de cellules CD34+. Cette méthode de reconstitution est plus lente ce qui entraîne cette différence d’âge avec le modèle NSG (Procédure 1, 3, 5). Les souris C57BL/6 et Balbc seront également utilisées à l’âge de 5-7 semaines (Procédure 2, 4, 5).
Étude de l’impact du traitement des leucémies aigues myéloïdes sur l’expression du génome silencieux
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
210 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation corporelle totale, une injection de cellules leucémiques ou de moelle humaine, des prélèvements sanguins hebdomadaires et des cures de traitement injectées dans l'abdomen sur animal vigile, puis sont tuées pour analyser leur moelle osseuse. Le porteur indique que les souris porteuses de leucémie peuvent présenter des signes de souffrance selon la progression de la maladie. Il affirme que le modèle murin reste "indispensable", le contrôle d'une moelle saine traitée étant selon lui impossible à obtenir autrement.
Objectifs
Le génome silencieux (qui ne permet pas la production de protéines) représente plus de 50% du génome. Il est composé de fragments d’ADN capables de se déplacer dans le génome. Chez l’homme comme dans d’autres espèces animales, il est démontré que ces séquences peuvent interférer avec le génome codant pour des protéines avec un retentissement fonctionnel. Dans le cancer, les insertions de ces séquences dans des gènes suppresseurs de tumeurs peuvent être responsables de la cancérogénèse mais elles peuvent également interagir avec des séquences codantes de l’ADN pour produire de nouveaux antigènes (néoantigènes) spécifiques de la tumeur. Lorsqu’une séquence d’ADN ne doit pas être exprimée, la cellule le signale en marquant cette séquence avec une étiquette appelée méthylation. Ce phénomène de marquage est très présent sur le génome silencieux dans des maladies comme les leucémies aigues myéloïdes (LAM) limitant sa capacité d’interaction avec le reste du génome. A l’heure actuelle une partie des traitements utilisés dans ces maladies est connu pour avoir la capacité de retirer ce marquage. Notre hypothèse principale soutenue par des travaux préliminaires est que ces traitements pourraient favoriser l’interaction du génome silencieux avec le reste de l’ADN induisant des erreurs qui seraient faciles à repérer par le système immunitaire afin d’éliminer la maladie. L’objectif de ce projet est d’étudier de manière systématique l’expression du génome silencieux dans les leucémies aigues myéloïdes (LAM) soumis à un traitement. Il permettra tout d’abord une meilleure compréhension des mécanismes d’actions de ces traitements mais les erreurs favorisées par le traitement peuvent également constituer une source de cibles pour des thérapies spécifiques et contribuer à améliorer le pronostique effroyable de ces hémopathies.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples. Sur le plan scientifique, il permettra la description fine des mécanismes d’action des traitements qui retirent les marquages sur l’expression du génome silencieux dans les LAM et permettra une comparaison à des moelles saines traitées, impossibles à obtenir en dehors du cadre murin. Il permettra également d’établir un modèle de souris atteintes de LAM d’origine humaine afin de pouvoir tester d’éventuels traitements spécifiques des cibles identifiées dans le cadre d’un autre projet. Sur le plan médical, il peut permettre la découverte de cibles thérapeutiques permettant l’amélioration du pronostic de ces hémopathies.
Procédures
Les souris seront soumises à une irradiation corporelle totale (1 fois) suivie d’une injection de cellules tumorales ou de moelle saine. Des prélèvements sanguins hebdomadaires seront réalisés sur une partie des animaux. Des traitements seront administrés aux autres animaux. Ces traitements seront injectés directement dans l’abdomen à raison d’une fois par jour pendant 5 jours consécutifs. Deux cures seront réalisées avec 2 jours de repos entre chaque cure. Tous ces gestes seront réalisés sur animaux vigiles. Les gestes seront inférieurs à 2 minutes pour les injections/prélèvements. L’irradiation des animaux n’excédera pas 5 minutes au total
Impact sur les animaux
La réalisation des injections et prélèvements peut être source de douleur pour les animaux au moment de la piqûre. Les souris étant irradiées, le risque de toxicité en particulier digestive est présent avec une durée de quelques jours. Cependant, la dose d’irradiation étant faible, ce risque est très modéré. Les souris étant injectées avec des leucémies aigues myéloides, elles peuvent présenter des signes de souffrance dans le cas d’une progression de la leucémie.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin des expériences pour analyse post mortem de la composition de leur moelle osseuse
Remplacement
L’analyse transcriptomique sera au préalable réalisée sur les mêmes lignées de LAM traitées in vitro. Cependant, le contrôle nécessaire qui est celui d’une moelle saine traitée par les mêmes agents est impossible à obtenir en dehors de la souris, ce traitement n’étant administré qu’à des patients malades. Par ailleurs, ni les modélisations mathématiques, ni les systèmes in vitro ne permettent de reproduire l’environnement auquel est soumis la cellule tumorale. L’utilisation du modèle Souris reste donc indispensable pour le projet.
Réduction
Le nombre d’expériences et donc d’animaux utilisés seront réduits au minimum pour permettre la reproductibilité des phénomènes observés en assurant la puissance statistique nécessaire en tenant compte de la variabilité expérimentale du modèle employé. L’analyse statistique entre les différentes conditions s’appuiera sur l’étude de l’expression différentielle des gènes en utilisant des modèles de régression linéaires. Les organes hématopoïétiques (moelle osseuse et rate) seront analysés chez toutes les souris après mise à mort.
Raffinement
Les animaux seront suivis tous les 2/3jours afin d’assurer leur bien-être et pour monitorer les éventuels signes de douleur, de souffrance ou de stress. Des points-limites ont été établis et une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux.
Choix des espèces
Dans le cadre de notre projet, la souris est le modèle de choix pour ces expériences qui étudient la cancérogénèse et la recherche en thérapeutique du cancer. C’est la seule espèce présentant une souche exprimant les facteurs de croissances hématopoïétiques humains permettant une bonne prise de cellules myéloïdes à partir de moelle osseuse humaine saine dans un environnement médullaire proche de celui de l’être humain. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (6 à 12 semaines après la naissance). Nous n’attendons pas d’effet lié à l’âge des souris sur la croissance tumorale.
Analyse de l’hétérogénéité et du rôle des cellules myéloïdes dans des modèles murins de lymphomes Diffus à Larges Cellules B (DLBCL)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements sanguins sur animal vigile, une irradiation destinée à les rendre aplasiques, des greffes de cellules souches, des injections intraveineuses, sous-cutanées et intrapéritonéales, et une induction de lymphome par des globules rouges de mouton et du tamoxifène, les animaux étant tués dès une perte de poids de 20 % ou un gonflement abdominal. Le projet cherche à comprendre le rôle des cellules myéloïdes dans un cancer du sang humain et à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Le porteur affirme que la souris est un modèle "irremplaçable" et qu'"aucun autre système" ne peut s'y substituer.
Objectifs
Le lymphome diffus à grandes cellules B (DLBCL) est un groupe de cancers du sang qui se disséminent dans les organes lymphoïdes. Il est très agressif et la survie du patient atteint de DLBCL se compte en nombre de mois en absence de traitement. Malgré des traitements standards efficaces, environ 30 à 40 % des patients atteints de DLBCL meurent de leur maladie. Ce manque d'efficacité thérapeutique contre le DLBCL a été attribué entre autres par la présence de cellules immunitaires d’origine myéloïde. Ces cellules myéloïdes pourraient participer à la survie et au maintien des cellules tumorales chez des patients atteints de DLBCL, et pourraient aider les cellules tumorales à échapper à la reconnaissance immunitaire, donc pourraient contrecarrer les bénéfices des thérapies administrées aux patients. Jusqu’à présent, toutes les études visant à comprendre le rôle des cellules myéloïdes dans le DLBCL portaient sur des échantillons prélevés sur des patients atteints de DLBCL. Cependant, les accès aux biopsies sont limités : les biopsies ne sont pas fréquentes, et pour celles qui nous parviennent, elles ne contiennent que peu très peu de cellules myéloïdes et tumorales, et ne nous permettent pas de poursuivre des analyses expérimentales poussées. Ainsi, ce projet vise à développer des modèles de DLBCL chez la souris afin de déterminer comment, au cours de la progression tumorale, les cellules myéloïdes alimentent l’expansion des cellules tumorales. Les objectifs de ce projet sont : 1) Analyser les populations de cellules myéloïdes infiltrant les organes atteints par les cellules tumorales ; 2) Déterminer le rôle des populations myéloïdes dans le maintien de la survie des cellules tumorales ; 3) Identifier des cibles thérapeutiques exprimées par les cellules myéloïdes, et les valider expérimentalement. Ce projet en expérimentation animale est critique pour avancer sur notre compréhension du lymphome agressif DLBCL chez l’homme, contre lequel les traitements actuels ne sont pas efficaces à 100%.
Bénéfices attendus
Ce projet en expérimentation animale est essentiel pour plusieurs raisons : - il permet de mieux comprendre comment les cellules myéloïdes favorisent la persistance des cellules tumorales, et la résistance des patients atteints de DLBCL aux thérapies anti tumorales utilisées actuellement en clinique. - il participe à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques présentes sur ces cellules myéloïdes, qui pourraient être spécifiquement ciblées et/ou neutralisées en clinique pour améliorer les traitements actuellement appliqués, et qui restent sans effet chez des patients DLBCL. - il permet de valider l’efficacité thérapeutique de nouveaux traitements de DLBCL sur des modèles précliniques murins.
Procédures
En ce qui concerne les interventions, aucune intervention chirurgicale n’est prévue dans ce projet. Des prélèvements sanguins via la veine sous maxillaire sont effectués sur animaux vigiles (540 animaux). 560 animaux seront irradiés. Quant aux gestes techniques, le projet comprend des injections intraveineuses et sous-cutanées sur animaux anesthésiés par voie gazeuse (isoflurane et oxygène) (972 animaux), des injections par voie intrapéritonéale (772) sur animaux vigils selon la réglementation en vigueur.
Impact sur les animaux
Dans ce projet d’expérimentation animale, nous réalisons plusieurs gestes techniques nous amenant à : 1) administrer de cellules de lymphome d’origine murine; 2) irradier des animaux pour les rendre aplasiques et pouvoir reconstituer leur système immunitaire avec des cellules souches hématopoïétiques modifiés; 3) effectuer des administrations par voie intraveineuse de cellules immunitaires purifiées; 4) administrer un inhibiteur du développement des cellules myéloïdes par la voie intra-péritonéale, ou administrer des inhibiteurs de la vascularisation des tumeurs par la voie sous-cutanée; 5) induire des lymphomes B par administration de globules rouges de mouton et de tamoxifène. Toutes ces procédures nécessitent de la contention à l’origine d’un stress passager de l’animal (5 minutes). Les procédures impliquant l’administration d’un traitement par voie intrapéritonéale sur animaux vigils entrainent une douleur locale de 2 secondes causée par la piqure de la seringue. Toute autre administration (voie intraveineuse ou sous-cutanée, prélèvements sanguins) se réalise sur animaux anesthésiés et ne provoque pas d’inconfort le temps de la manipulation. Les injections intraveineuses et les prélèvements sanguins par voie rétro-orbitales entrainent un inconfort passager (5 minutes) de l’oeil qui est soignée par l’application d’un gel oculaire dès la fin de la procédure. L’irradiation n’entraine aucun effet indésirable dès lors que les animaux reçoivent une greffe de cellules souches hématopoïétiques suivie d’un traitement antibiotique continu de 4 semaines. L’immunisation par des globules rouges de mouton et le transfert adoptif n’entraine aucun effet indésirable sur le long terme. L’administration de tamoxifène peut entrainer une perte de poids de 10% le temps du traitement (ici, 9 jours). La croissance tumorale du lymphome peut entrainer une perte de poids dans 10% des cas ou un gonflement abdominal. La mise à mort des animaux concernés sera appliquée dès lors que la perte de poids atteindra 20% du poids total, ou qu’un gonflement abdominal est observé.
Devenir
Les animaux (mus musculus) sont euthanasiés pour effectuer des prélèvements de plusieurs organes, et effectuer des analyses biologiques en laboratoire.
Remplacement
Il nous est à ce jour impossible de recréer grâce à des modèles informatiques ou des modèles de culture cellulaire tous les facteurs physiologiques et environnementaux permettant à une tumeur de se développer, d’être irriguée par le sang, drainée par la lymphe, de modifier son environnement, et d’interagir avec les cellules du système immunitaire. Ainsi aucun autre système ou modèle actuellement disponible ne peut se substituer au modèle murin, modèle animal irremplaçable pour notre projet.
Réduction
Des résultats fiables sont obtenus avec 5 animaux par groupe expérimental, et pour des expériences répétées deux fois. Tous les animaux ont un fond génétique uniforme pour limiter les variations entre les individus et assurer la reproductibilité des résultats. Nous appliquons des analyses statistiques spécifiques à chaque expérience pour déterminer si les différences que nous observons entre nos groupes d’animaux sont exactes et suffisamment fiables pour conclure sur les effets observés, établir de nouvelles hypothèses et avancer dans notre recherche de potentielles molécules candidates pouvant être ciblées dans les lymphomes de type DLBCL.
Raffinement
Les animaux sont gardés en groupes sociaux, avec nids et dômes protecteurs, et suivis quotidiennement. Les analgésiques administrés régulièrement en systémique modifiant les réponses immunitaires étudiées, leur utilisation n’est pas recommandée. La totalité des animaux utilisés dans ce projet et porteurs de cellules tumorales sont mis à mort avant l’apparition de signe de stress ou de souffrance. Cependant, un animal présentant des signes de trouble du comportement et/ou de douleur fera l’objet d’une surveillance accrue, disposera de nourriture humidifiée au fond de la cage pour faciliter la prise alimentaire, et sera mis à mort dès lors qu’il présente simultanément une perte de poids, des troubles du comportement, une déshydratation, et une baisse d’activité. Dans les expériences nécessitant des injections sous-cutanée, intraveineuse et des prélèvements sanguins, les souris sont anesthésiées par voie gazeuse (un mélange oxygène/isoflurane), ou chimiquement.
Choix des espèces
La physiopathologie de la souris est proche de celle de l’homme : une étude de la souris nous permet de mieux comprendre le fonctionnement du système immunitaire chez l’homme. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle d’étude le plus simple et le mieux approprié pour 1) Analyser l’impact des mutations génétiques à l’origine des pathologies des lymphomes agressifs de type DLBCL chez les patients, et 2) Visualiser et analyser des cellules myéloïdes qui participent à l’émergence et à la persistance des cellules tumorales dans les tissus tels que la rate, la moelle osseuse et les ganglions grâce à des techniques d’imagerie de pointe (cytométrie, microscopie). Dans ce projet, les animaux utilisés ont atteint l'âge adulte (> 8 semaines d’âge).
Programme d’immunisation de rats en vue de la production d’anticorps polyclonaux
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit huit injections d'antigène, dont certaines avec l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux servant au contrôle de protéines-médicaments. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, chaque antigène empêchant selon lui leur réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable", aucune méthode in vitro n'étant selon lui aussi efficace.
Objectifs
Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.
Bénéfices attendus
Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.
Procédures
Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).
Impact sur les animaux
Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.
Devenir
Tous les animaux sont concernés. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.
Remplacement
La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.
Réduction
Réduction : Le nombre d’animaux (10 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant, notamment dans le contrôle et la qualification de protéines médicaments. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.
Raffinement
Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.
Choix des espèces
Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.