Cancers

410 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de neuroblastome qui provoque des métastases au foie, puis des injections d'anticorps et des prélèvements sanguins, pour mettre au point un modèle destiné à tester de futurs traitements de cancers pédiatriques. Le porteur indique que les animaux non traités développent des effets liés à la croissance des tumeurs, et que toutes les souris sont tuées pour prélever le foie. Il présente ce modèle comme "indispensable et non substituable", un test in vitro existant ne reproduisant pas le système immunitaire entier.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mettre au point un modèle animal permettant de tester dans l’avenir des anticorps thérapeutique anti- O-Acétyl GD2. Cette possibilité de combiner les anticorps ou d’utiliser des anticorps bispécifiques (qui seront utilisés suite à cette optimisation de modèle) ouvre la voie à de nouveaux traitements permettant une réponse thérapeutique et des rémissions plus importantes chez les patients. Dans ce modèle, les animaux reçoivent une greffe d’une lignée de neuroblastome murin par voie intraveineuse ce qui conduit à obtenir des métastases hépatiques (tumeur) et sont ensuite traités avec les anticorps thérapeutiques. Ainsi dans ce projet, nous testerons différentes voies et le nombre d’administrations de nos anticorps permettant ainsi de limiter le stress des animaux et par conséquent de diminuer les variations expérimentales induites, tout en conservant l’efficacité du traitement.

Bénéfices attendus

Le bénéfice à court terme de ce projet est d’améliorer le modèle sur lequel nous avons démontré l’efficacité de nos anticorps, de façon à limiter le stress des animaux pour une meilleure reproductibilité des résultats et une meilleure comparaison des traitements pour nos futurs projets. Sur le long terme, nous utiliserons ce modèle (via d’autres demandes d’autorisation de projet) pour tester de nouveaux traitements et démontrer leur efficacité. Ces nouvelles biothérapies (anticorps bispécifiques ou combinaison d’anticorps) sont plus efficaces en termes de réponse thérapeutique et plus respectueuses de la qualité de vie.

Procédures

Pesée des animaux (10 pesées, 1 minute maximum chacune, soit 10 minutes au total). Injection des traitements (7 injections maximum, 3 minutes maximum chacune, soit 21 minutes au total). Prélévement de sang (4 prélèvements maximum, 2 minutes maximum chacune, soit 8 minutes au total).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont : premièrement le stress et la douleur liée à la manipulation (traitements, prélèvements de sang et pesées) et la contention des souris lors de l’administration des traitements (injections intraveineuse et intrapéritonéale). Deuxièmement, l’injection de cellules tumorales conduit à la formation de métastases hépatiques, et des effets indésirables peuvent apparaître chez les animaux en fin d’expérimentation notamment sur les groupes témoins non traités avec des anticorps (au fur et à mesure de la croissance des tumeurs métastatiques). Ces effets indésirables sont pris en compte dans l’annexe 1 attachée à cette demande de projet.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés afin de permettre la réalisation de prélèvements des foies pour évaluer l’efficacité thérapeutique des anticorps.

Remplacement

Il existe à ce jour un test in vitro nommé ADCC (Test de cytotoxicité à méditation cellulaire) qui permet de contrôler que l’anticorps peut reconnaitre et lier la cellule cible à la cellule effectrice. Nous avons réalisé ces tests sur l’anticorps notifié dans cette saisine et les résultats se sont avérés probants. Cependant, ce test est loin de remplacer le système immunitaire dans son ensemble. Les immunothérapies impliquent le système immunitaire de l’hôte. Cette étude donc nécessite impérativement un tissu tumoral en place dans un système physiologique et pharmacodynamique et comprenant un réseau vasculaire capable de se remodeler à partir de toute cellule de l’organisme. Le modèle animal reste indispensable et non substituable pour de telles études et donc un passage obligé avant de pouvoir commencer les études chez les patients.

Réduction

Dans ce projet, nos effectifs sont determinés et nos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Nous assurerons une surveillance quotidienne des animaux par l’expérimentateur (en plus de celle réalisée quotidiennement par le personnel animalier) et nous fixerons des points limites qui conduiront à la mise à mort des animaux dès leur apparition. Nous assurerons aux souris un hébergement de qualité avec 5 souris par cage enrichie (frisotis). Concernant les injections (cellules tumorales ou traitements), une application de crème anesthesiante sera effectuée sur le site d’injection quelques minutes avant injection.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence. Grâce à beaucoup d’études, de nombreux outils cellulaires et moléculaires ont été développés. Chez la souris, la distribution de l’antigène ciblé, l’O-Acétyl GD2 est semblable à celle décrite chez l’Homme : absence d’expression dans les tissus sains et surexpression dans les cancers chez la souris De plus, nous utilisons un modèle de souris sur lequel notre équipe a déjà évalué des traitements à base d’anticorps et pour lequel nous connaissons bien le développement. Les animaux sont âgés de 8 semaines, soit un poids approximatif de 20g au début des expérimentations, ce qui est idéal pour la bonne réalisation des injections intraveineuses (veines caudales bien visibles et suffisamment grosses). De plus, ce choix s’inscrit dans la continuité des études précédentes pour lesquelles des souris de 8 semaines avaient également été utilisées dans des traitements similaires avec d’autres anticorps

6 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées à l'issue et une centaine réutilisées. Immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules ou de fragments de tumeurs humaines ou murines sous la peau ou dans la mamelle, avec suivi de la croissance tumorale et prélèvement terminal des tumeurs et organes. Le porteur situe ce projet en amont d'études d'efficacité de candidats médicaments anticancéreux et fixe un point limite à un volume tumoral de 2 000 mm³. Il affirme que seul "un organisme vivant complet" permet de mesurer les effets d'une molécule et qu'une mauvaise connaissance du modèle serait "incompatible avec la règle des 3R".

Objectifs

Le but de ce projet préliminaire, situé en amont des études d’activité et d’efficacité anti-tumorale de candidats médicaments, est de définir les caractéristiques de croissance, les conditions optimales de greffe (densité cellulaire, souche de souris,…), ainsi que les fenêtres de début des traitements à mettre en œuvre pour chacune des lignées tumorales qui constitueront nos modèles d’études de pharmacologie. Des greffes de tumeurs humaines ou murines, à partir de cellules ou fragments, vont ainsi être effectuées en sous-cutanée, en intra-mammaire ou en intradermique chez des souris. Des souris immunodéprimées seront utilisées pour limiter les problématiques de rejet. Les caractéristiques de croissance tumorale peuvent être évaluées selon deux méthodes : -par mesure au pied à coulisse ,technique non invasive et la plus classiquement utilisée. -par mesure via l’imagerie optique ,technique également non invasive, plus en plus utilisée en recherche car elle permet la détection beaucoup plus précoce de tumeurs en croissance, non visibles à l’œil nu ou non mesurables au pied à coulisse. Cette approche est fondamentale pour évaluer l’efficacité de nos traitements anti-cancéreux dans des modèles bien caractérisés.

Bénéfices attendus

En Europe comme aux Etats-Unis, le cancer est actuellement la seconde cause de mortalité après les maladies cardiovasculaires. En France, le cancer provoque environ 33% des décès chez les hommes et 23% chez les femmes. Il est donc primordial de s’intéresser à cette maladie et de trouver de nouvelles thérapies. Les cellules cancéreuses sont initialement des cellules normales qui ont acquis, au cours du temps, un certain nombre de mutations faisant qu’elles ne répondent plus aux différents mécanismes de régulation et prolifèrent indéfiniment engendrant la formation d’une tumeur maligne et/ou de métastases. Un enjeu majeur pour la recherche consiste à trouver de nouvelles thérapies ciblant spécifiquement les cellules cancéreuses, tout en limitant les effets secondaires sur l’organisme. Ce projet va ainsi consister à déterminer les conditions optimales de greffe de tumeurs et leurs caractéristiques de croissance tumorale afin de disposer de modèles fiables et robustes utilisables pour la sélection de candidats médicaments. Ces modèles de souris greffées par des cellules tumorales doivent au préalable être mis au point et caractérisés pour chaque modèle qui va être étudié (tumeurs d’origine humaine ou de souris). Ces mises au point sont primordiales puisqu’elles permettent d’acquérir une bonne connaissance des modèles et constituent un paramètre essentiel pour une évaluation pharmacologique optimale de nos produits anti-cancéreux. Une mauvaise connaissance du modèle conduirait à des études inexploitables et serait incompatible avec la règle des 3R.

Procédures

- Puçage : un dispositif sous cutané est implanté à chaque animal quelques jours avant l’étude par trocart afin d’être identifié - Greffe de cellules ou de fragments tumoraux : 1 fois dans l’étude (Pour la greffe de cellules tumorales par voie sous-cutanée et intradermique il est possible de le faire anesthésié ou vigile en fonction de l’aisance du technicien, injection en quelques secondes). Les greffes par voie intra-mammaires et de fragments de tumeurs (par trocart) sont toujours réalisées sous anesthésie (temps d’anesthésie gazeuse 5 minutes, geste 1min30) - La mesure du volume tumoral est réalisée soit chez l’animal vigile par mesure au pied à coulisse (avec légère contention de l’animal de quelques minutes 2 fois minimum par semaine voir 3 fois lors du pic de croissance tumorale(environ 30 sec). - Soit chez l’animal anesthésié par mesure par imagerie 2 fois minimum par semaine voir 3 fois lors du Pic de croissance tumorale (anesthésie gazeuse de quelques minutes) - Prélèvement de sang en fin d’étude sur animal anesthésié et sans réveil consécutif par ponction à la veine cave ou par ponction cardiaque (anesthésie + geste 2min environs). - Prélèvement terminal de tumeur : la tumeur sera prélevée sur les animaux préalablement profondément anesthésiés à l’Isoflurane et euthanasiés par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Croissance tumorale sous cutanée limitée à 2000 mm3 (1500 mm3 pour les tumeurs intra-mammaires) Stress léger lié à la manipulation de l’animal vigile pour les gestes de : puçage sous cutanée (1 implant, 15sec), greffe sous-cutanée, (1 injection. Environ 15 sec) ; pesée et mesure de tumeur par pied à coulisse (environ 30 sec, 2 à 3 fois/ semaine le temps de l’étude). Au cours de ce projet, nous serons vigilants sur les effets indésirables rares qui peuvent survenir tout au long des études : Perte de poids >20% du poids maximal pouvant être associée au développement de la tumeur ou ascite.

Devenir

Lorsque le volume tumoral est proche de 2000 mm3, ceci constitue un point limite et l’animal concerné est alors euthanasié. A la fin de chaque étude, tous les animaux sont euthanasiés pour réaliser des prélèvements de sang, de tumeur et/ou d’autres organes. Ces prélèvements seront utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…). Les animaux ne développant pas de tumeur pourront être réutilisés dans un autre protocole, dans la mesure du possible et à la suite d’une validation par SBEA et/ou vétérinaire de leur bon état général.

Remplacement

Pour tester l’activité de nouveaux composés, des tests in-vitro sont systématiquement mis en place sur des cellules en culture, mimant artificiellement la pathologie de l’homme. Grâce à ces tests in-vitro, des molécules actives sont sélectionnées avant d’être testées, en seconde intention, dans des modèles in-vivo de souris porteuses de tumeurs afin de démontrer leur activité et leur efficacité anti-tumorale. C’est en effet dans un organisme vivant complet que l’on peut mesurer les effets pharmacologiques d’une molécule anti-cancéreuse. Pour pouvoir effectuer ces évaluations in-vivo, il est indispensable d’utiliser en premier lieu un modèle tumoral maitrisé et bien caractérisé en recréant la pathologie par implantation de cellules tumorales ou de fragments tumoraux chez la souris. L’animal porteur de tumeur devient ainsi un bon modèle expérimental pour évaluer les composés anti-cancéreux.

Réduction

Deux techniques d’évaluation de la croissance tumorale peuvent être employées : par pied à coulisse ou par imagerie optique (bioluminescence ou fluorescence). Ces 2 techniques, non invasives pour l’animal, présentent chacune leurs avantages et seront choisies en fonction des besoins expérimentaux. Le pied à coulisse permet ainsi une mesure rapide du volume de la tumeur chez l’animal éveillé. La bioluminescence permet une détection plus précoce des tumeurs ainsi qu’une détection de la prolifération métastatique pour certains types de tumeurs mais nécessite une anesthésie de la souris pendant la durée d’acquisition des données. Elles permettent toutes deux d’effectuer des mesures non douloureuses pour l’animal et de suivre l’évolution des tumeurs au cours du temps, ceci concourant à la réduction du nombre de souris nécessaires dans une même étude. D’autre part, un travail a été initié avec l’équipe de biostatistiques pour définir par simulation à partir des données observées dans l’étude de mise au point, des métriques quantitatives pour aider dans le choix des conditions pour évaluer l’efficacité des candidats médicaments. Ces métriques donneront des informations sur le jour de randomisation optimal, , la potentielle fenêtre thérapeutique ainsi que la taille de l’effet traitement qui pourra être évaluée avec 5 à 10 animaux par groupe en fonction de la variabilité de la croissance tumorale observée (utilisation d’un modèle statistique longitudinal basé sur une équation). Mais l’impact sur la réduction du nombre d’animaux est surtout présent pour les études qui seront effectuées grâce aux conditions prédéterminées dans le cadre de ce projet. Car si cette étape est optimisée techniquement et permet avec l’aide des biostats de quantifier la variabilité et le timing idéal pour la randomisation nous pourrons ajuster le nombre d’animaux. Et en connaissant au préalable le temps de la fenêtre thérapeutique nous pourrons garantir d’évaluer l’efficacité des candidats médicaments de la façon la plus relevante possible.

Raffinement

Tout au long de l’étude, les souris sont hébergées en groupes sociaux et un enrichissement de milieu adapté est apporté de manière à favoriser leur instinct de nidification. Cet enrichissement va également permettre de surveiller l’état général des animaux par l’observation de leur comportement vis-à-vis de celui-ci. L’état général des souris est surveillé régulièrement et les volumes tumoraux sont mesurés au minimum 2 /semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais également pour identifier les éventuels signes de souffrance et appliquer les points limites prédéfinis dès que nécessaire. De plus, au-delà de 1500 mm3, (1000 mm3 pour tumeur mammaire) une surveillance accrue et une réduction de l’intervalle de temps entre les mesures est mise en place afin d’anticiper plus efficacement l’atteinte du point limite lié au volume tumoral.

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de souris est largement décrite dans les publications en recherche pré-clinique : ces modèles sont davantage déployés chez la souris que chez le rat. La même souche de souris est utilisée pour l’ensemble des études in-vivo pour une tumeur donnée (DMA/DMT, pharmacocinétique, pharmacodynamie, efficacité). En effet, il peut exister des différences importantes en termes de tolérance et d’exposition plasmatique d’un produit en fonction de la souche murine considérée, pouvant impacter les résultats. Le choix de la souche ainsi que les conditions optimales de greffe seront déterminés dans le cadre de ce projet, en amont des études de pharmacologie. Les souris sont utilisées à l’âge jeune adulte, à partir de 7semaines soit un poids corporel d’environ 18-20g. C’est l’âge classiquement utilisé dans tous les protocoles qui seront réalisés dans la sélection des candidats médicaments.

15 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent par voie intraveineuse un virus génétiquement modifié à visée antitumorale et subissent des prélèvements sanguins pouvant atteindre 20 % de leur volume sanguin, avant d'être tués pour prélever leurs organes. Le porteur indique que chaque animal est hébergé seul à partir de la première injection, alors qu'il s'agit d'une espèce vivant normalement en groupe. Il affirme que les études de toxicité in vivo sont "indispensables" au développement de nouveaux médicaments et justifie le primate par sa proximité avec l'espèce humaine.

Objectifs

Le présent projet vise à étudier la biodistribution ainsi qu’à déterminer le seuil de toxicité d’un virus atténué réassorti (Organisme Génétiquement Modifié) provenant de la combinaison de deux souches de LCMV sauvages (Virus de la chorioméningite lymphocytaire), nommé ABX-001 dans le cadre du traitement de cancers métastasiques. Le projet sera conduit en zone de niveau de sécurité biologique 2 (NSB2) (obtention de l’agrément d’utilisation OGM pour une installation A2). Cette souche réassortie présente un phénotype fortement atténué et utilisé en tant qu’agent viral antitumoral potentiel. En effet, l’infection par une des souches sauvages sur lesquelles est construite la souche ABX-001 entraine des signes d’hépatoxicité et des symptômes de type fièvre hémorragique chez le singe. Un des effets de la création de la souche ABX-001 est une nette diminution de cette morbidité (diminution de la réplication virale, diminution de la réponse cytokinique, moins de pathogénicité au niveau hépatique) et un tropisme spécifiquement tumoral qui la maintient éloignée des tissus sains. Le mécanisme d’action de l’administration de ce type de souche réassortie entraine une activation du système immunitaire concertée et centrée sur la tumeur, impliquant à la fois la réponse innée et adaptative, par une seule injection intraveineuse. Le mode d’action de cette virothérapie immunomodulatrice par le virus atténué réassorti ABX-001 diffère de celui des traitements oncolytiques classiques puisqu’il vise principalement à induire et à remodeler les réponses immunitaires pour cibler spécifiquement les cellules tumorales. Dans ce projet, plusieurs doses croissantes de ABX-001 seront testées, comparé à une formulation contrôle, par administration intraveineuse unique ou répétée.

Bénéfices attendus

Ce projet permet d'évaluer la tolérance du virus atténué réassorti ABX-001 en tant que traitement antitumoral après une exposition répétée ou non, de doses croissantes et d'estimer les marges de sécurité pour lesquelles aucun effet indésirable n'est observé. Ces marges de sécurité permettront par la suite de déterminer une dose initiale "sûre" pour des études précliniques réglementaires, puis pour des essais cliniques chez l'Homme. Cette étude dite de "Dose-Range Finding" permet donc de diminuer le nombre d'animaux utilisés lors de l'étude préclinique réglementaire en calibrant les doses optimales.

Procédures

Le projet consiste en l'administration intraveineuse du virus atténué (répétées ou non) ; ces administrations sont peu invasives (

Impact sur les animaux

Afin d’éviter les contaminations entre les animaux, à partir de la première administration du virus atténué réassorti ABX-001, les animaux seront hébergés seuls en volière séparée avec un lien auditif, visuel et olfactif avec le congénère d’à côté (en cours de protocole). Ces animaux étant habituellement hébergés par groupe sociaux, une attention particulière devra en plus être portée sur le milieu d’hébergement de l’animal en lui apportant de l’enrichissement renouvelé quotidiennement (friandises, jouets, etc.). Les animaux auront été hébergés ensemble lors de la phase d'acclimatation, et ne seront donc pas mis au contact d'autres animaux lors de la phrase infectieuse. Ainsi, uniquement le premier animal sera hébergé seul à partir de l’administration (en NSB2) et pendant 10 jours, le temps de l’arrivée de l’animal suivant dans la volière à côté. Une attention particulière sera d’autant plus portée sur l’environnement cet animal (programme d’enrichissement ultra renforcé : friandises diverses, jouets divers). Les deux derniers animaux (1 animal d’un groupe traité et 1 animal du groupe contrôle) seront mis à mort même temps. Même s'il n'était pas strictement nécessaire au protocole, nous avons insisté pour qu'un animal "contrôle" non-infecté soit ajouté au protocole, afin que le dernier animal infecté ne soit jamais hébergé seul dans la salle d'hébergement en zone NSB2 (ils entreront ensemble et seront mis à mort ensemble). Même si la souche ABX-001 est atténuée, il est connu que les souches de virus sauvage peuvent entrainer des symptômes de type fièvre hémorragique et d’hépatoxicité. Par prudence, des points de vigilance seront donc axés sur le suivi de la température rectale et des paramètres hématologiques et biochimiques (globules rouges, paramètres hépatiques) afin de prédire une potentielle toxicité à la dose administrée. De plus, les points limites généraux seront appliqués.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort pour récolte d'organes.

Remplacement

Les études de toxicité in vivo chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. En effet, celles-ci permettent de déterminer la toxicité de la molécule en fonction de la dose administrée et affine la connaissance des caractéristiques de l’effet principal et des effets indésirables éventuels. Les modèles animaux permettent dans ce cas d'objectiver l'apparition des signes cliniques et donc de mettre en évidence une éventuelle toxicité de la molécule en cours de test.

Réduction

Dans ce projet, les approches de dosage échelonnées ("en escalier": doses croissantes) permettent d'atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés. Une fois la première dose administrée à un seul animal, les observations sont ensuite notées et utilisées pour informer la dose de l’animal suivant, qui peut être supérieure ou inférieure selon la nature des observations relevées. Le nombre d'animaux dosés à chaque niveau doit être petit dans les études initiales (par exemple un voire deux) avec des tailles de groupe augmentées par la suite (poursuite du projet) une fois qu'une dose-réponse est établie (source : "Guidance on dose level selection for reguatory general toxicology studies for pharmaceuticals", NC3Rs). De même, le but même d'une étude de Dose-Range Finding est de réduire la taille de l'étude préclinique réglementaire en éliminant les doses à laquelle la réponse des animaux serait d'office nulle ou toxique.

Raffinement

Les animaux seront suivis individuellement et quotidiennement tout au long de l’étude afin de détecter tout signe clinique de douleur ou de détresse (grille d’observation du bien-être). Comme les animaux seront injectés par groupes de dose, les données obtenues pour les premières doses serviront à affiner la dose suivante et le suivi clinique en fonction des signes cliniques observés. Des périodes de récupération suffisantes seront accordées aux animaux entre les prélèvements ainsi qu’entre les administrations. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress seront déterminées au préalable de la procédure. Les animaux bénéficieront du programme d’enrichissement défini par la structure du bien-être animal de l'installation, notamment la mise disposition de jouets dans les hébergements et la distribution de friandises systématique en fin de journée. Les animaux seront hébergés par groupes sociaux dans des volières conformes aux recommandations pendant la phase d’acclimatation et seront ensuite hébergés seuls à partir de la première administration, avec un lien auditif, visuel et olfactif avec le congénère d’à côté (en cours de protocole). Ces animaux étant habituellement hébergés par groupe sociaux, une attention particulière devra en plus être portée sur le milieu d’hébergement de l’animal en lui apportant de l’enrichissement supplémentaire renouvelé quotidiennement (friandises, jouets, etc.). Aussi, une rotation du matériel d’enrichissement, incluant une désinfection, sera organisée une fois par semaine pour éviter la lassitude et renouveler l’intérêt des animaux. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations.

Choix des espèces

Le primate non humain (macaque cynomolgus) est choisi pour sa proximité phylogénétique avec l'Homme et du fait des similitudes des réponses immunitaires et de sa sensibilité aux infections par LCMV. Spécifiquement, le macaque cynomolgus montre une sensibilité différentielle aux deux souches de LCMV composants ABX-001, ce qui permettra de tester si la stratégie d'atténuation de la souche virale réassortie est efficace. De même, la proximité de la réponse immunitaire du macaque à celle de l'homme permettra de mettre en valeur de potentiels biomarqueurs inflammatoires d'efficacité et de toxicité qui pourront être transposés aux patients de l'étude clinique. Autant que possible, des animaux matures (36-48 mois) seront utilisés pour ce projet.

22 750 souris vont être utilisées, la plupart tuées à l'issue et 525 réutilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules ou de fragments tumoraux en sous-cutané, intradermique ou intra-mammaire, des administrations de candidats médicaments jusqu'à deux fois par jour et des prélèvements de sang, avant d'être tuées pour prélever la tumeur. Le porteur fixe un point limite de volume tumoral de 1 500 à 2 000 mm3 et indique que les souris surnuméraires servent à entraîner le personnel aux gestes techniques. Il affirme que l'étape animale reste "indispensable" pour évaluer une molécule anticancéreuse dans un organisme complet.

Objectifs

Les études de pharmacodynamie ont pour but d’évaluer l’atteinte de la cible d’intérêt par un candidat médicament, au sein d’un organisme vivant et complexe. Une série de tests in vitro (biochimiques et cellulaires) est réalisée en amont afin d’identifier le meilleur candidat. Parallèlement, des tests de pharmacocinétique (PK) in vivo sont réalisés en complément. Ces études faites sur animaux non greffés, (a minima des souris), et à des doses faibles permettent de compléter la première sélection sur la base des caractéristique ADME (Absorption, Distribution, Métabolisme et Elimination). L’objectif est de sélectionner ainsi des candidats susceptibles d’atteindre leur cible d’intérêt avec une puissance cellulaire et une exposition plasmatique suffisantes dans l’organisme. En effet, une molécule très active sur la cible mais insuffisamment concentrée dans le plasma ne présentera par exemple aucune activité fonctionnelle sur la croissance tumorale. Dans ce projet, les tumeurs à étudier sont greffées sur souris et les doses testées sont plus fortes. Cela permettra d’établir une relation entre l’exposition du produit, la quantité de produit dans la tumeur et son niveau d’atteinte de la cible (PK/PD), chose que l’on ne peut pas faire sur souris non greffées. En fonction de la cible étudiée ou du candidat à caractériser, il est possible que ces études soient effectuées soit dans des conditions de système immunitaire fonctionnel sur des souris immunocompétentes (concernant dans ce cas des greffes de lignées tumorales murines), soit sur des souris immunodéprimées, classiquement utilisées en oncologie et présentant un système immunitaire altéré et permettant ainsi de recevoir des greffes de tumeurs d’origine humaine.

Bénéfices attendus

Les cellules cancéreuses sont initialement des cellules normales qui ont acquis, au cours du temps, un certain nombre de mutations faisant qu’elles ne répondent plus aux différents mécanismes de régulation et prolifèrent indéfiniment engendrant la formation d’une tumeur maligne et/ou de métastases. Un enjeu majeur pour la recherche consiste à trouver de nouvelles thérapies ciblant spécifiquement les cellules cancéreuses, tout en limitant les effets secondaires sur l’organisme. Ce projet permettra d’identifier les candidats médicaments qui agissent sur la cible d’intérêt (au niveau de la tumeur) et ainsi la sélection des produits qui feront alors l’objet d’études d’efficacité (effet sur la croissance tumorale) encadré par un autre projet.

Procédures

chez l'animal vigile : •Greffe sous-cutanée, 1 injection (durée environ 15 sec) •Pesée et Mesure de tumeur (environ 30 sec par mesure), 2 à 3 fois/ semaine le temps de l’étude (1 mois max + Mesure pour la randomisation) •Prélèvements de sang si nécessaire dans la limite de 10% du volume total de sang par prélèvement et limité à 15% de volume total de sang sur une période de 28 jours + Tonte de la patte arrière en vue du prélèvement sur animal vigile (en principe une seule fois sauf si un prélèvement a lieu longtemps après la randomisation et que les poils ont repoussé : 10 sec) •Administration de composés candidats médicaments : jusqu’à 2 fois /j suivant la nécessité de l’étude, entre 15 sec et 1 min selon les composés et la voie d’administration. Chez l'animal anesthésié (anesthésie gazeuse) : •Greffe intra mammaire, intradermique ou intratumorale : 1 fois (durée Anesthésie + geste, environ 1min30)

Impact sur les animaux

Le but du projet est d’évaluer l’atteinte de la cible d’intérêt par nos candidats médicament dans des modèles pathologiques. Pour ce faire, les souris reçoivent une greffe de cellules cancéreuses ou de fragments tumoraux en sous-cutanée, en intradermique ou en intra-mammaire pour développer une tumeur dont la taille cible est de 300mm3 environ (si la tumeur pousse de façon hétérogène, les critères d’inclusion peuvent être élargis entre 100-550 mm3) Concernant les traitements pharmacologiques, les doses de produits à administrer à l’animal sont sélectionnées préalablement in vivo grâce à des études de Dose Maximale Administrable (DMA) et Dose Maximale Tolérée (DMT) (faisant l’objet d’un autre projet). Cependant, selon la cible du candidat médicament, même à des doses tolérées dans l’absolu, il peut y avoir une toxicité allant de faible à modérée. En effet, même si les efforts pour identifier des thérapies ciblées sont nombreux, les cellules tumorales sont à l’origine des cellules normales du soi : il est donc très difficile de trouver des traitements qui affectent uniquement les cellules cancéreuses en épargnant complétement les tissus sains. Par ailleurs, ce projet peut nécessiter l’utilisation de souches de souris transgéniques ou mutantes leur conférant un statut immunodéprimé. Ce statut peut être considéré comme un phénotype dommageable mais qui ne s’exprimera pas dans les conditions d’hébergement protégées strictes appliquées au laboratoire

Devenir

Les animaux inclus dans l’étude après traitement et randomisation sur la taille de la tumeur greffée seront euthanasiés en vue de prélever la tumeur/sang pour effectuer des mesures in vitro : Réalisation des tests biochimiques et/ou moléculaires, visant à évaluer l’atteinte de la cible d’intérêt, à partir des lysats tumoraux (Western-blot, ELISA, MSD, immunohistochimie, qPCR, …). Dosage du principe actif dans les échantillons plasmatiques et/ou des lysats tumoraux, permettant la relation PK/PD. En cas d’animaux greffés surnuméraires, une ré-inclusion dans un autre projet pourra être prévue notamment pour des entrainements du personnel aux gestes techniques. A défaut, ils seront euthanasiés.

Remplacement

Aujourd’hui, de plus en plus de tests in silico et in vitro sont mis en place pour caractériser autant que possible les candidats médicaments, de façon à n’investiguer in vivo que les meilleurs candidats issus de ces sélections. Cependant, cette étape chez l’animal reste aujourd’hui encore indispensable : en effet, même avec les limitations inévitablement liées à n’importe quel modèle, c’est dans un organisme vivant complet que l’on peut vraiment étudier les effets pharmacologiques d’une molécule anti-cancéreuse. Son comportement dans un système complexe est plus relevant d’un point de vue physiologique

Réduction

Les conditions et taux de croissance tumorale pour chaque lignée à tester ont été déterminés au préalable dans un projet dédié et permettent de sélectionner les conditions optimales de greffe et le nombre d’animaux nécessaires avant le début de l’expérimentation. De plus, les doses de produits à administrer à l’animal sont sélectionnées préalablement in vivo grâce à des études de Dose Maximale Administrable (DMA) et Dose Maximale Tolérée (DMT) (faisant l’objet d’un autre projet) afin de limiter les risques d’une potentielle toxicité des composés testés. C’est seulement sur la base de ces données préalables que les études de pharmacodynamie sont réalisées : seuls les candidats les plus prometteurs vont être testés, limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Par ailleurs, des prélèvements de sang (entre 40 et 80 µl de sang) à la veine saphène latérale sont mis en œuvre chaque fois que possible pour avoir des informations sur des possibles biomarqueurs ou sur le profil d’exposition du composé (évitant ainsi des études de pharmacocinétique dédiées) et pour exploiter au mieux les données d’activité antitumorale en faisant, notamment, de la relation PK/PD. Si des prélèvements répétés sont prévus, le volume maximal prélevé n’excède pas les 15% de volume de sang total sur 28 jours. Cette technique de prélèvement peu invasive et rapide, permet de prélever plusieurs fois sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux, tout en respectant les limites de volémie physiologiques. Si des volumes sanguins plus importants s’avèrent indispensables, les prélèvements seront réalisés en terminal, à la veine cave ou en intracardiaque, sous anesthésie gazeuse, juste avant le prélèvement de la tumeur. En cas d’animaux greffés surnuméraires après randomisation, une ré-inclusion dans un autre projet sera prévue.

Raffinement

Dans le cas d’un protocole avec traitement chronique, les animaux sont quotidiennement observés et les tumeurs sont mesurées au moins 2 par semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais également pour limiter la souffrance et appliquer les points limites si nécessaire. De plus, au-delà de 1500 mm3 (pour les tumeurs SC et ID) et de 1000mm3 (pour les tumeurs IMam), une surveillance accrue et une réduction de l’intervalle de temps entre les mesures sont mises en place afin d’anticiper plus efficacement l’atteinte du point limite attaché au volume tumoral. Si ce volume est atteint la veille du week-end, des dispositions seront prises en fonction de la croissance du modèle tumoral (déterminée lors des études de TK). Si la tumeur pousse rapidement et a un risque de dépasser les 2000mm3 avant le lundi, l’animal sera euthanasié. Dans le cas contraire, le volume tumoral sera réévalué dès le lundi. La progression du volume tumoral est mesurée via le pied à coulisse et permet un suivi dans le temps sur les mêmes animaux. Les souris immunodéprimées seront hébergées et manipulées dans un secteur à confinement spécifique avec des procédures d’accès, des conditions d’hébergement et de manipulation strictes appliquées par tout le personnel et intervenants, et ce afin de prévenir tout risque d’infection et/ou contamination. Les souris immunocompétentes, quant à elles sont logées et manipulées dans un secteur conventionnel. Toutefois, pour des questions logistiques, elles peuvent être hébergées et manipulées dans le secteur à confinement spécifique dédié à l’expérimentation des souris immunodéprimées. Dans ce cas, elles sont de statut SOPF et sont logées et manipulées dans des salles dédiées et identifiées. Les souris sont hébergées en groupes sociaux. Pour répondre aux impératifs liés à l’expérimentation (nombre d’animaux par groupe/dose/temps…) ce nombre pourra varier, tout en restant dans les standards imposés de respect du nombre d’animaux maximum/superficie disponible Des éléments de nidification (ex : cocoon, sizzle…) sont apportés ainsi que des éléments d’enrichissement lavables (ex : tunnels...) permettent une complexification de l’environnement et l’expression des comportements naturels des souris

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans les publications en recherche préclinique. En effet, ces modèles sont davantage déployés chez la souris que chez le rat. Le choix de la souche est dicté par les études de détermination de la prise tumorale réalisées en amont de toute évaluation de candidat médicament. Cela permet de déterminer tous les paramètres in vivo (taux de prise, temps de doublement, caractère éventuellement cachectique de la tumeur sur la souche, etc…). La souche sélectionnée sera conservée pour toutes les études ultérieures quelle qu’elles soient. En effet, il peut exister des différences significatives en termes de tolérance et d’exposition plasmatique d’un produit fonction de la souche murine considérée, pouvant impacter les résultats. Femelle, sexe utilisé dans toutes nos études de pharmacologie et pour lequel nous avons un grand historique. Exceptionnellement, les mâles peuvent être utilisés dans le cas de produits dont la finalité est le traitement de tumeurs se développent spécifiquement chez la personne masculine.

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales répétées, jusqu'à sept par animal, et du LPS qui provoque un état de type septique avec fièvre, diarrhée et tremblements, ces derniers servant de point limite, ainsi que des prélèvements de sang rétro-orbitaires avant la mise à mort. Le porteur affirme que l'étude de la protéine visée ne s'envisage que dans un "organisme complet" et non sur un modèle cellulaire. Les débouchés annoncés pour l'aplasie fébrile de l'enfant restent formulés comme des perspectives.

Objectifs

Le traitement des cancers de l’enfant utilise la chimiothérapie, qui peut transitoirement entrainer un déficit d’immunité appelé aplasie. Durant cette période, les enfants présentent souvent des épisodes de fièvre, pouvant être sévères et entraîner la mort. Devant ce risque, des mesures importantes sont mises en place avec hospitalisation en urgence et utilisation d’antibiotiques. Les infections en cours d’aplasie fébrile restent une réelle complication avec risque de décès chez ces enfants malades. Onze à 24 % vont présenter une bactériémie (présence d’une bactérie dans la circulation sanguine), facteur de risque de décès en contexte d’aplasie fébrile. En effet, la mortalité au cours des aplasies fébriles chez l’enfant est estimée entre 0,2 et 3 %, pouvant s’élever jusqu’à 10% chez les patients avec une bactériémie. Les infections à Pseudomonas aeruginosa gardent une place majeure tant par leur fréquence que par leur sévérité. A ce jour, il n’existe pas de marqueur biologique pouvant prévenir la gravité d’une aplasie fébrile. Il existe des molécules de danger, libérées dans le corps en période d’infection, et qui sont néfastes pour l’organisme (inflammation majorée, formation de caillots sanguins). Des études publiées montrent que neutraliser ces molécules de danger peut avoir un effet protecteur, améliorant le pronostic au cours d’une infection sévère. Des travaux préliminaires réalisés chez l’adulte présentant une infection sévère et généralisée, suggèrent que la protéine X, naturellement produite par l’organisme, est capable d’inhiber les effets délétères de certaines molécules de danger. Notre projet repose sur l’hypothèse que, chez l’enfant présentant une aplasie fébrile, le taux sanguin de X peut prédire la sévérité de l’infection. Notre étude s’articule en 2 axes : (1) une étude clinique portant sur l’intérêt du dosage de X dans une population pédiatrique suivie en oncologie et (2) une étude chez la souris mesurant la synthèse et l’élimination de X au cours de l’infection et évaluant son potentiel thérapeutique.

Bénéfices attendus

Les débouchés cliniques sont multiples : (i) évaluation de nouveaux marqueurs permettant de prédire la gravité d’un épisode d’aplasie fébrile, (ii) orientation vers le type de pathogène (bactérien, fongique, viral), (iii) proposition d’escalade ou de désescalade de la prise en charge anti-infectieuse, notamment dans le contexte des tumeurs solides pédiatriques et enfin (iiii) un potentiel impact thérapeutique.

Procédures

Dans les quatre procédures de l’étude, les animaux seront traités par des injections intrapéritonéales. Cette voie permet une distribution systémique rapide des produits injectés. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est pas obligatoire. Aucun effet indésirable lié à cet acte n’est attendu. Dans les quatre procédures de l’étude, des prises de sang seront réalisées. Sous anesthésie gazeuse (moins de 5 minutes), la prise de sang rétro orbitaire permet la récolte de 50 à 100µL de sang en moins de 2 minutes, sans traumatisme et sans douleur. Lorsqu’un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. Ainsi, chaque sinus rétro orbitaire ne sera soumis qu’à un seul prélèvement (avec réveil). Procédure 1 : pour chaque animal • 1 injection intra péritonéale • 3 prises de sang maximum dont 1 sans réveil, juste avant euthanasie Procédure 2 : pour chaque animal • 2 injections intra péritonéales. • 3 prises de sang maximum dont 1 sans réveil, juste avant euthanasie • • Procédure 3 : • 3 injections intra péritonéales. • 3 prises de sang maximum dont 1 sans réveil, juste avant euthanasie Procédure 4 : • 7 injections intra péritonéales. • 3 prises de sang maximum dont 1 sans réveil, juste avant euthanasie L’Injection sous cutanée sera éventuellement utilisée dans les procédures 1, 3 et 4 du projet si l’administration de buprénorphine (antalgique) est nécessaire. Elle permet une distribution systémique rapide des produits injectés. C’est la voie recommandée pour ce produit. Elle ne concernera pas forcément tous les animaux des procédures 1, 3 et 4. Il n’est donc pas possible de comptabiliser le nombre de sous-cutanées qu’un un animal pourra recevoir. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire.

Impact sur les animaux

Ce projet étudie le sepsis, c’est-à-dire une inflammation systémique déclenchée par le LPS (lipopolysaccharide = endotoxine), mimant ainsi une infection bactérienne, chez le sujet soumis à une chimiothérapie aplasiante. Une inflammation systémique donne classiquement de la fièvre. Les souris pourront présenter, suivant la dose reçue (i) aucun signe clinique particulier (asymptomatique), (ii) certains signes cliniques et comportementaux traduisant une fatigue et une douleur potentielle. Une fermeture plus prononcée des yeux (fatigue), une diarrhée transitoire, une modification de comportement par l’absence de mobilité pourront être observées. A une dose plus importante de LPS, le poil pourra présenter un aspect piqué et à très forte dose, des tremblements pourront être observés. Ces tremblements constitueront un point limite de l’expérimentation car traduisant une douleur plus importante. 1/ L’Injection intra péritonéale est utilisée dans les quatre procédures du projet. Elle concerne tous les animaux du projet. Elle permet une distribution systémique rapide des produits injectés. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est pas obligatoire. Aucun effet indésirable lié à cet acte n’est attendu. 2/ La prise de sang rétro orbitaire est utilisée dans les quatre procédures du projet. Elle permet, sous anesthésie gazeuse, une récolte de sang rapide, sans traumatisme et sans douleur. Si un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. Ainsi, chaque sinus rétro orbitaire ne sera soumis qu’à un seul prélèvement. 3/ L’Injection sous cutanée sera éventuellement utilisée dans les procédures 1, 3 et 4 du projet si l’injection de buprénorphine (antalgique) est nécessaire. Elle permet une distribution systémique rapide des produits injectés. C’est la voie recommandée pour ce produit. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire.

Devenir

Nous souhaitons doser la molécule X ainsi que diverses molécules pro-inflammatoires dans le sang des animaux mais aussi dans des organes comme la rate, le foie, les poumons et les reins qui sont très touchés par l’orage cytokinique déclenché par le sepsis. Les animaux seront donc euthanasiés à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Le métabolisme de la protéine X est mal connu à ce jour. Sa synthèse est probablement mixte, avec une production (i) par les cellules sanguines), mais également (ii) par d’autres tissus, dont les endothéliums vasculaires (=vaisseaux sanguins). L’étude de cette protéine ne peut donc s’envisager que dans un organisme complet, et pas sur un modèle uniquement cellulaire, compartimenté. Un modèle murin parait être le plus adapté à l’étude de cette protéine.

Réduction

Pour nos expériences, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et avoir le nombre de contrôles internes obligatoires en limitant le nombre d’animaux utilisés. Le nombre minimal d’animaux nécessaires par lot pour détecter 50% de différence inter-lots avec 40% d’écart type intra lot est de 10 (Berndston et al. J ANIM SCI 1991). La cinétique des réponses immunitaires pouvant varier d'une expérience à l'autre, celles-ci seront répétées au minimum deux fois pour renforcer l'approche statistique (Cf. chronogramme associé au dossier).

Raffinement

Le bien-être des animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort afin d’éliminer ou réduire au minimum toute douleur, souffrance, ou angoisse et tout dommage durable susceptible d’être infligé à ceux-ci. Ainsi, selon l’annexe III de la directive 2010/63/CE, les souris seront hébergées en cages collectives (5 animaux par cage), dans des locaux aux paramètres environnementaux contrôlés où leur entretien sera pris en charge par un personnel formé et compétent qui évaluera quotidiennement leur état général selon les critères de Lloyd et al. (Lab animal management and welfare, 1994). Des points limites précoces et adaptés ont également été envisagés avec des procédures d’antalgie (= permettant de gérer la douleur) utilisant le paracétamol et la buprénorphine. Les cages seront enrichies par des tunnels, abris et os en nylon autoclavés, permettant aux animaux d’explorer, de se cacher ou de ronger pour rétablir le répertoire comportemental des souris.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les espèces les plus couramment utilisées dans la recherche préclinique. Ceci est dû à la facilité d'introduire une modification génétique chez ces espèces, à la grande taille des portées, au temps de génération court et à la relative facilité d'hébergement et de soins. De plus, la littérature scientifique décrit de nombreux modèles murins de sepsis. Nous disposons au laboratoire, d’une lignée de souris de fond génétique C57BL/6 chez laquelle le gène de la protéine X, étudiée dans ce projet, est rendu non fonctionnel. Cette technique couramment utilisée en recherche pré-clinique permet de démontrer l’importance d’une protéine dans un modèle donné. Notre étude porte sur l’aplasie fébrile pédiatrique. Nous utiliserons donc des animaux de 4 à 5 semaines, sevrés mais n’ayant pas atteint la maturité sexuelle.

651 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques humaines puis des traitements administrés cinq jours par semaine pendant quatre semaines, avec prélèvements sanguins et imagerie, avant d'être tuées pour prélever rate et os. Le porteur indique que le développement de la leucémie et la toxicité des composés peuvent provoquer perte de poids et apathie. Il affirme que les modèles animaux sont "indispensables" pour évaluer les traitements au stade préclinique, le contexte tumoral ne se reproduisant pas selon lui in vitro.

Objectifs

La leucémie aiguë myéloïde (LAM) est une maladie complexe, avec de nombreux sous-types porteurs de combinaisons d’altérations particulières. Cette maladie est caractérisée par un blocage de développement et l’envahissement de la moelle osseuse par des cellules immatures. De nombreux progrès ont récemment été apportés dans la caractérisation des altérations des LAM. Ces études ont permis une meilleure classification des patients. Cependant, la prise en charge des patients à la récidive de la maladie reste problématique ce qui explique les taux de mortalité. Environ 25-30% des patients atteints de LAM ont une altération du récepteur FLT3 qui est associée à des fréquences de rechutes élevées et à un pronostic défavorable. FLT3 est une cible thérapeutique avérée pour laquelle des traitements efficaces et sélectifs sont disponibles. Cependant, des résistances apparaissent très rapidement après ce type de traitement. A la rechute, le traitement initial devient en général inefficace pour cibler les cellules leucémiques. Les résistances sont les causes majeures de l’échec thérapeutique. Il y a donc un besoin urgent de traitements alternatifs pour prendre en charge les patients. L'objectif de notre projet est donc d'évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans cette maladie. La majorité de nos expériences sont réalisées sur des modèles simplifiés de cellules en culture. Cependant, les modèles animaux sont indispensables pour évaluer les traitements prometteurs pour les études au stade préclinique.

Bénéfices attendus

Notre projet fait appel au repositionnement de médicaments existants pour le traitement des LAM et à des modèles précliniques de LAM. D’autre part, nous interagissons régulièrement avec des cliniciens. En cas de succès, le projet a un fort potentiel de valorisation et de transfert vers la clinique.

Procédures

Une transplantation de cellules cancéreuses (1 minute/souris) sera réalisée une fois au début de l’expérimentation. Les animaux seront soumis à des traitements qui seront administrés au niveau de différents sites d’injection 5 jours consécutifs maximum par semaine pendant 4 semaines. L’intervention durera maximum 1 minute par souris. Des prélèvements sanguins (5 minutes/souris) seront effectués 1 fois toutes les 2 semaines (4 fois maximum) pour suivre l’évolution de la maladie dans le sang. Lorsque les cellules cancéreuses sont bioluminescentes, nous pourrons suivre également l’évolution de la maladie sans geste invasif grâce à une caméra pouvant quantifier la lumière émise par les cellules, localiser le signal donc les cellules cancéreuses au niveau des organes et mesurer son intensité (1 lecture/semaine sous anesthésie volatile). Cette manipulation prendra 10 minutes par souris. Les souris feront l’objet d’un suivi quotidien avec une pesée 5 fois/semaine pour estimer au mieux leur état physiologique global. Ce suivi prendra maximum 1 minute par souris.

Impact sur les animaux

Des effets indésirables dus à la toxicité des composés à la plus forte concentration sont potentiellement à prévoir avec une perte de poids des souris possible. Après greffe des cellules leucémiques, le développement de la pathologie peut entrainer des diminutions de la motricité, un défaut d’entretien du pelage et une perte de poids. Les traitements quotidiens, selon les composés testés, peuvent provoquer une apathie des animaux avec une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux à l'issue de chaque procédure seront euthanasiés. Lors de greffe de cellules cancéreuses, après la mise à mort des souris, la rate et les fémurs/tibias seront prélevés, puis dissociés pour énumérer les cellules cancéreuses afin d'évaluer l'effet des traitements. Un stockage de cellules leucémiques issues de ces organes sera aussi effectué afin de réaliser des expérimentations pour évaluer la fréquence de cellules initiatrices de la leucémie et pour analyser in vitro différents marqueurs exprimés par les cellules en réponse aux traitements.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale se justifie par l’impossibilité réglementaire de conduire ce type de développement chez l’homme en l’absence de données précliniques. La régulation de l’hématopoïèse normale et pathologique implique des mécanismes de communication cellulaire entre de nombreux facteurs microenvironnementaux (extrinsèques) et propres aux cellules hématopoïétiques (intrinsèques): ainsi, la coopération spatiale des cellules, l’importance du stroma et du contexte cytokinien, sont cruciaux dans la réponse thérapeutique et ne peuvent pas être reproduits de façon satisfaisante in vitro.

Réduction

Pour chacune des procédures, nous limiterons au nombre minimum d'animaux permettant de caractériser l'efficacité des molécules testées. Nous ferons en sorte que le groupe contrôle, qui recevra le véhicule de solubilisation du/des composé(s), soit commun à plusieurs combinaisons ce qui nous permettra de réduire le nombre de souris. Afin de réduire le nombre d'animaux génétiquement modifiés issus de nos propres élevages, des animaux des deux sexes seront utilisés. Le sexe sera choisi en fonction du nombre d'animaux nécessaires et disponibles par cohorte.

Raffinement

Hébergement en confinement adapté à la stabulation de lignées murines immunodéprimées (cages individuellement ventilées). La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactés et coton pour nidification), et maintien des animaux en groupes de 3-5 afin d’éviter le stress de l’isolement. De même, les expérimentations seront débutées au plus tôt 7 jours après réception des souris au sein de la zone d’expérimentation pour permettre leur acclimatation. Les greffes de cellules seront réalisées sous anesthésie gazeuse. De plus, dans un souci de raffinement et de réduction, le suivi du développement leucémique se fera par des mesures cinétiques de la charge leucémique circulante après prélèvement sanguin et par imagerie optique par bioluminescence (quand cela est possible) sous anesthésie gazeuse. Durant toute la durée d’un protocole, l’ensemble des animaux est observé quotidiennement et le bien-être est évalué à l'aide d'une grille de scores. La durée des protocoles sera fonction de l’atteinte des points limites ou de l’obtention de résultats validés statistiquement.

Choix des espèces

La xénogreffe désigne la transplantation d'un greffon d’un individu d’une espèce donnée chez un individu hôte d’une espèce différente. Ainsi, un contexte immunitaire permissif est essentiel pour favoriser la prise de greffe de cellules leucémiques humaines et éviter la réaction de l’hôte vis-à-vis du greffon. Dans ce contexte, la lignée de souris NOD.Cg-Prkdc scid/J (NSG) est un des modèles les plus couramment utilisé et très bien documenté dans la littérature dans le cadre d’études précliniques réalisées à partir de xénogreffes de cellules leucémiques humaines. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature pour ce type de modèle d’injection de cellules leucémiques, c’est à dire des souris « jeunes adultes » âgées de 6 à 12 semaines au moment de la greffe.

20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de gravité modérée. Immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules humaines de cancer du foie puis des injections répétées d'un peptide cinq jours par semaine pendant environ un mois, avec surveillance de la croissance tumorale et du poids, pour évaluer l'effet antitumoral du peptide. Le projet fait suite à des résultats in vitro montrant une réduction des cellules cancéreuses. Le porteur affirme ne pas disposer d'alternative et juge nécessaire de tester l'effet dans un "système complet", la souris.

Objectifs

Le cancer du foie est selon l’OMS le septième cancer observé en termes d’incidence avec environ 782 000 nouveaux cas mondiaux par an. Malgré les progrès récents en matière de diagnostic et de traitement, ce cancer du foie est fréquemment diagnostiqué à un stade déjà avancé et avec un mauvais pronostic d’évolution. Les modèles animaux de greffes de tumeurs peuvent permettre de mieux comprendre la réponse aux médicaments chez l'Homme et de découvrir de nouveaux traitements anticancéreux. Les cellules hépatiques utilisées dans cette étude sont issues d'un patient atteint d'un cancer du foie. L’injection de ces cellules chez des souris permet ainsi d’étudier l’effet d’immunothérapies sur des cellules humaines. Le but de ce projet est d’analyser si le peptide thérapeutique a un effet anti tumoral chez des souris avec une greffe de cellules de patients atteints de cancer du foie. Ce projet est encouragé par des résulats in vitro précédents qui ont montré que ce peptide réduisait le nombre de cellules du cancer du foie.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer notre compréhension des effets d’un peptide sur une lignée tumorale. Nous pourrons ainsi comprendre sa capacité d'action et l'impact de son injection sur des lignée tumorales connues. C’est un prérequis avant de tester notre stratégie thérapeutique dans différentes conditions expérimentales. Cette connaissance nous permettra à long terme de mettre en place des peptides thérapeutiques permettant de soigner certaines tumeurs du cancer du foie chez l'Homme.

Procédures

Durant cette étude, nous procéderons sur des souris vigiles à : - des injections par voie sous-cutanée (1X à l'age de 10 semaines) (20 animaux) (durée d'une injection : moins d'une minute) - des injections par voie intrapéritonéale (5X/semaine, sur une durée de 1 mois environ (20 animaux) (durée d'une injection : moins d'une minute)

Impact sur les animaux

Ce projet comprend le developpement de tumeurs, ainsi le bien-être des animaux sera surveillé de manière attentive. Le poids des animaux et la croissance tumorale seront ainsi enregistrés tout au long de l’étude. De plus, les injections des cellules et les injections répétées de peptide peuvent également entraîner des nuisances.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des expériences.

Remplacement

Le peptide utilisé dans cette étude a été testé in vitro sur des cellules de cancer du foie et a entrainé la réduction du nombre de cellules cancéreuses. Ces résultats nous encouragent à tester son effet dans une étude chez l’animal pour valider l’effet antitumoral. Actuellement, nous ne disposons pas d'alternative pour la validation de l'efficacité d'un traitement qui stimule le système immunitaire. Nous devons en effet étudier cet effet dans un système complet et compétent, tel que la souris, le système in vitro ne pouvant apporter un même niveau d’information.

Réduction

Les effectifs de 10 animaux par groupe ont été mis en place suite aux prérequis statistiques, permettant, tout en réduisant le nombre d'animaux utilisés, d'obtenir une réponse statistiquement significative et exploitable. En fonction de la normalité des données (distribution des données en cloche) nous utiliserons les tests statistiques adéquates pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes expérimentaux (traitées avec le peptide vs traitées avec le véhicule).

Raffinement

Afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement, stabulation en groupe) permettant une réduction du stress. Par ailleurs, nous avons mis en place les points limites nécessaires, liés au volume des tumeurs portées par les animaux et à l'évolution probable de l'état de santé. Les animaux seront observés quotidiennement pour s'assurer que leur état de santé n'est pas détérioré et nous suivrons à chaque pesée (deux fois par semaine) l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation et les sites d'injection. Les tumeurs seront aussi palpées (pour détecter leur présence précoce), leurs volumes seront mesurés 2 fois par semaine et nous observerons aussi leur aspect. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer la mise à mort de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. Le cas échéant, des soins locaux par spray de dermidine(R) seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

La souris constitue un bon modèle pour l'étude en oncologie. Il s'agit d’un mammifère au système immunitaire assez proche de l'Homme qui permet d’utiliser les données générées dans une approche translationnelle valide. Les souris Balb/C nude sont particulièrement utilisées comme souris receveuses de greffe. En effet, le profond déficit immunitaire de ces souris permet la prise de greffe de cellules humaines et offre la possibilité d’étudier l’effet d’immunothérapies avec des cellules humaines chez un hôte murin. Cette lignée ne présente pas de phénotype dommageable. De nombreux outils permettent de caractériser les réponses aux traitements antitumoraux chez la souris. Par ailleurs, ce modèle est facile à manipuler et à héberger et nous disposons d'une bonne connaissance des mécanismes d'actions activés lors de la mise en place de tumeurs. Par ailleurs le cout d’hébergement est faible et la reproduction rapide. Les souris seront utilisées à l’âge de 10 semaines, soit à à un stade correspond à des jeunes adultes, permettant une bonne prise de greffe.

338 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de gravité modérée. Chaque souris reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau puis jusqu'à cinq injections de virus oncolytiques, avec des douleurs liées aux injections et à la croissance des tumeurs, la mise à mort intervenant à 20 % de perte de poids. Le projet teste des virus porteurs de protéines chimériques contre le cancer. Le porteur indique disposer de cultures 3D, sphéroïdes et puces microfluidiques, pour une partie de ses expériences, mais juge "l'organisme entier" nécessaire pour évaluer les effets immunitaires.

Objectifs

Les virus oncolytiques sont de nouveaux agents thérapeutiques dont les développements récents participent à l'essor des traitements par immunothérapie. Ces virus présentent 3 modes d’actions principaux, à savoir la capacité à 1) tuer directement les cellules tumorales, 2) induire une réponse immunitaire anti-tumorale et 3) vectoriser des protéines thérapeutiques qui seront uniquement produites dans le microenvironnement tumoral par les cellules cancéreuses infectées. Cette dernière propriété fait actuellement l’objet de nombreuses recherches au niveau international mais des questions importantes demeurent quant aux transgènes thérapeutiques à utiliser et aux conditions dans lesquelles ils doivent être administrés in vivo. Notre projet vise ainsi à étudier, chez la souris immunocompétente, les effets thérapeutiques de virus oncolytiques contenant un nouveau type de transgène codant pour des protéines chimériques qui cibleront plusieurs mécanismes immunitaires au sein du microenvironnement tumoral. Ces protéines chimériques, qui ont été développées dans notre laboratoire, comportent 3 domaines fonctionnels (inhibition des points de contrôle immunitaire, présentation antigénique, co-stimulation) et donnent des résultats très encourageants in vitro. Cependant, l’évaluation de ces différents mécanismes dans une optique de transfert vers la clinique requiert le passage dans des modèles animaux vivants qui reproduisent de façon pertinente la physiologie des tumeurs et les réponses immunitaires systémiques associées.

Bénéfices attendus

Les efforts réalisés pour comprendre la biologie des tumeurs ainsi que l’amélioration continuelle des traitements tels que la chimiothérapie, la radiothérapie, et plus récemment l’immunothérapie ont déjà permis d’augmenter la survie des patients atteints de cancers. Cependant, dans de nombreux cas ces traitements présentent une efficacité limitée. De nouvelles molécules thérapeutiques potentiellement très efficaces nécessitent une vectorisation appropriée pour profiter de leur efficacité tout en limitant les effets secondaires. Il a ainsi été montré qu’une vectorisation appropriée des agents anti-cancéreux permettait de diminuer la morbidité associée au traitement mais aussi d’en améliorer l’efficacité et de limiter l’établissement d’une résistance dans les cellules tumorales. Ce type de stratégie thérapeutique est d’autant plus intéressant dans le cas de cancers très agressifs pour lesquels nous ne disposons pas encore d’options thérapeutiques satisfaisantes. L’utilisation de virus oncolytiques injectés par voie systémique pour vectoriser des molécules au sein même des tumeurs est une approche innovante destinée à répondre à ces problématiques. En créant de nouvelles protéines chimériques très actives et en les combinant au potentiel de vectorisation des virus oncolytiques, nous espérons pouvoir apporter des réponses thérapeutiques à des problèmes actuels en cancérologie.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections sous-cutanées de cellules tumorales puis à des injections intraveineuses, intra-péritonéales et/ou intra-tumorales répétées de traitements. Chaque injection durera une trentaine de secondes, à raison d'un maximum de 5 injections (1 challenge + 4 traitements) par animal.

Impact sur les animaux

Nous avons préalablement pu vérifier que l’injection de virus oncolytiques aux doses prévues n’entraîne pas de morbidité particulière ou de douleur chez les animaux. Concernant la protéine thérapeutique ScFv-OVA-dm41BBL, nous n’avons pour le moment pas de données in vivo. Les données de la littérature sur les différents domaines protéiques qui la composent suggèrent que des effets secondaires auto-immuns pourraient être observés. Une attention particulière sera apportée au suivi de ces effets éventuels (peau, intestin et foie notamment). Chacune des procédures nécessitera la réalisation d'injections intraveineuse, intra-péritonéales et/ou intra-tumorales qui peuvent être à l'origine d'une douleur légère et générer un stress modéré et ponctuel chez les animaux. Dans toutes les procédures, l'établissement et la croissance des tumeurs pourra aussi générer des douleurs qui seront détectées précocement grâce aux points limites préalablement établis pour chaque procédure.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Notre laboratoire a développé au cours des dernières années des systèmes de culture in vitro complexes (sphéroïdes, puces microfluidiques) qui nous permettent de nous affranchir de l'utilisation d'animaux pour une majorité de nos expériences. L'approche sur organisme entier nous permet cependant d’évaluer l’effet thérapeutique des virus et de leurs transgènes mais également les effets toxiques potentiels sur divers tissus tels que le compartiment hématopoïétique par exemple. Une telle complexité n’est malheureusement pas encore reproductible in vitro. Dans la mesure où nous souhaitons étudier le ciblage in vivo des cellules tumorales dans un environnement complexe après administration des virus oncolytiques en intraveineux, comme c’est le cas en clinique, ces expériences nécessitent d’être réalisées sur l’animal. Nous avons déjà validé la spécificité de nos virus sur un large panel de lignées cellulaires, en 2D et en 3D. Cependant, ces expériences ne permettent pas de présumer de la biodistribution réelle et des effets systémiques de nos traitements une fois injectés dans un organisme, en particulier les effets immunitaires.

Réduction

Les différents paramètres mesurés seront comparés par des tests statistiques adaptés aux très petits échantillons (n

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des cages ventilées (5 souris maximum par cage) en milieu enrichi (copeaux de litière, lambeaux de papier) dans des salles à température et hygrométrie contrôlées. Les litières sont changées chaque semaine par le personnel qualifié de l’animalerie. Toutes les procédures prévues dans ce projet sont de classe légère à modérée. L’utilisation d’antalgiques morphiniques n’est pas envisagée car les animaux seront immédiatement euthanasiés en cas d’absence de réponse au traitement ou d’atteinte d’un point limite. Des points limites adaptés à l’espèce utilisée ont été prévus pour chaque procédure. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel zootechnique et les expérimentateurs. En cas d’atteinte d’un des points limites suivants un signalement sera fait au responsable de la SBEA ainsi qu’au responsable de l’étude ou à son suppléant. Les animaux seront alors euthanasiés directement afin de prévenir toute douleur au stade le plus précoce possible et d’éviter la collecte de données altérées en raison d’un stress chez les animaux. •Critères cliniques : - Mauvais état du pelage (diminution du toilettage, poil ébouriffé, perte excessive de poils, plaies) - Faciès contracté et position anormale des vibrisses - Yeux clos et larmoyant - Gonflement abdominal pouvant être causé par l’accumulation de liquide d’ascites en raison des tumeurs - Fèces liquides ou absence de fèces •Critères comportementaux : - Position recourbée (dos voûté, prostration) - Diminution de la mobilité interférant avec l’activité de base de l’animal (alimentation, toilettage) - Réduction de l’activité, isolement - Signes de stress (hyper-sensibilité aux bruits, agressivité, stéréotypie) •Critères zootechniques - Perte de poids de plus de 20 % par rapport au poids initial de l’animal ou comparativement au poids moyen des individus soumis au même protocole expérimental

Choix des espèces

L’objectif principal étant d’évaluer les effets immunitaires de nos nouvelles molécules chimériques et de leur vectorisation par des virus oncolytiques, l’utilisation de souris immunocompétentes et de modèles tumoraux syngéniques est essentielle. L’implantation sous-cutanée des cellules tumorales se justifie par le suivi facilité de la croissance tumorale et la comparaison avec les données de la littérature qui utilisent des approches similaires. Nous utiliserons des animaux âgés de 7 à 10 semaines (jeunes adultes). Le stade de développement est justifié par la nécessité d'avoir des animaux adultes ayant un système immunitaire mature.