Maladies infectieuses

Maintenir en vie un parasite pour pouvoir le cultiver au laboratoire : 150 souris reçoivent une injection intrapéritonéale d'Echinococcus multilocularis, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le geste dure cinq à dix secondes et constitue l'unique intervention, la masse parasitaire se développant ensuite dans leur abdomen pendant deux à trois mois. Le porteur indique que l'échinococcose alvéolaire ne donne de symptômes qu'à un stade très avancé et prévoit une seule visite par semaine, avec une grille de score et une surveillance resserrée au-delà d'un certain seuil. Toutes sont tuées par dislocation cervicale pour récupérer le matériel parasitaire, qui sert à réinfecter un nouveau lot de souris et à relancer les cultures in vitro.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de maintenir en vie le parasite Echinococcus multilocularis chez des animaux, afin de pouvoir le multiplier en culture in vitro et tester de nouveaux traitements sur ces cultures.

Bénéfices attendus

Nous attendons de ce projet de pouvoir tester des nouveaux traitements contre ce parasite sur des cultures in vitro. Ceci permettra d’éliminer les traitements candidats se montrant inefficaces, et de sélectionner ceux se montrant efficaces pour une étude plus approfondie. Le projet permet également de maintenir en vie le parasite, sans quoi il serait perdu.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule injection de 100 μL de parasite dans le péritoine (durée 5-10 sec).

Impact sur les animaux

L’échinococcose alvéolaire ne génère des symptômes qu’à un stade très avancé de la maladie. Les nuisances générées dépendent de la taille du parasite et de sa localisation. Dans ce projet, le parasite est dans le péritoine, ce qui limite l’impact sur les autres organes. Toutefois, nous réaliserons une visite hebdomadaire avec des observations selon une feuille de score adaptée. Cette feuille permet un suivi individuel des souris une fois par semaine puis avec une fréquence plus importante dès lors qu’un certain score est atteint En cas d’atteinte d’un point limite, l’animal sera mis à mort et la charge parasitaire sera prélevée comme prévu

Devenir

Les animaux sont tous mis à mort par dislocation cervicale 2 à 3 mois (en fonction de l’évolution de la masse parasitaire et des points limites atteints) après l’infection péritonéale afin de récupérer le matériel parasitaire pour ré-infecter un nouveau lot de souris et démarrer des cultures in vitro.

Remplacement

Un système de culture in vitro du parasite a été développé et permet sa culture à grande échelle. Cependant, cette méthode de culture ne peut pas se maintenir dans un temps infini, justifiant que le matériel parasitaire doit être acquis régulièrement auprès d’animaux infectés, telles que les souris, afin de permettre une amplification du parasite in vitro. Les petits rongeurs sont des hôtes naturels du parasite E. multilocularis. L'utilisation de souris, et leur infection péritonéale est une méthode standard pour le maintien du parasite E. multilocularis et la génération ultérieure de cultures in vitro. Le matériel parasitaire ainsi produit nous permettra de tester et de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cette pathologie souvent mortelle.

Réduction

Le choix des conditions expérimentales est fixé en lien avec les questions scientifiques du projet et les principes de réduction. Les procédures expérimentales sont rigoureusement planifiées afin de n’utiliser que le nombre d’animaux strictement nécessaire mais suffisant pour réaliser nos cultures in vitro pour tester de nouvelles thérapeutiques. Pour atteindre les objectifs scientifiques du projet, un nombre de 150 souris sera utilisé.

Raffinement

Un suivi régulier de l’état des animaux sera mis en oeuvre, a minima de façon hebdomadaire lors des pesées ou plus régulièrement si nécessaire selon une grille de score adaptée. Nous réaliserons une visite hebdomadaire avec des observations selon une feuille de score. La feuille sera remplie individuellement pour chaque souris au moins chaque semaine une fois que la croissance parasitaire ou une anomalie dans le comportement ou le bien-être de l'animal est observée. En cas d’atteinte sévère l'animal sera euthanasié. A partir d’un certain score sur la grille, la fréquence de contrôle des animaux sera augmentée.

Choix des espèces

es petits rongeurs sont des hôtes naturels du parasite Echinococcus multilocularis. L’utilisation de souris et leur infection péritonéale est une méthode standard pour le maintien du parasite E. multilocularis et la génération ultérieure de cultures in vitro. Adulte, âgées de 6 à 8 semaines, d’environ 20g

Une partie des souris est injectée à quinze jours de vie, âge auquel le porteur indique que le foie prolifère encore et permet d'induire l'atteinte hépatique. 840 souris mâles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, avec des atteintes du foie légères à modérées déjà observées lors de travaux antérieurs. Le génome du virus de l'hépatite B leur est transféré par injection sous anesthésie, un autre groupe recevant un réactif qui déclenche un cancer du foie, avec un à deux prélèvements sanguins sur des expériences durant de sept semaines à six mois. Toutes sont tuées pour prélever des organes et conduire histologie, virologie et immunologie post-mortem.

Objectifs

Le virus de l’hépatite B (VHB) est le facteur de risque majeur du carcinome hépatocellulaire (CHC). Le CHC est la seconde cause de mortalité par cancer dans le monde. Des travaux de recherche ont montré une corrélation entre certaines formes virales du VHB et la sévérité de l’atteinte hépatique jusqu’au cancer du foie. Ce projet a pour objectif de déterminer le rôle de l'interaction protéine-protéine d'une des protéines de VHB produites par ces formes virales avec une protéine cellulaire dans le mécanisme d'action de la pathogenèse hépatique générée par l'infection par le VHB.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est d'avoir une meilleure compréhension des mécanismes associés à la modulation de la pathogenèse hépatique liée à l’infection par le virus de l'hépatite B (VHB), qui pourrait conduire au développement de nouvelles approches thérapeutiques améliorant la prise en charge du carcinome hépatocellulaire de patients. Le virus de l’hépatite B (VHB) est un facteur de risque majeur du carcinome hépatocellulaire (CHC), augmentant d’un facteur x100 ce risque (800 000 décès par an par cirrhose ou CHC associés au VHB). De plus, le CHC est la seconde cause de mortalité par cancer dans le monde. Notre principale hypothèse est que l'interaction d'une des protéines du VHB avec une protéine cellulaire module l'atteinte hépatique. Grâce aux modèles murins, il est possible d'invalider l'expression de cette protéine cellulaire dans le foie, et ainsi réduire l'atteinte hépatique induite par l'infection par le VHB. À terme, ces travaux de recherche pourraient permettre d'interférer sur ces interactions protéiques et, en conséquence, de bloquer la progression de la maladie vers le CHC.

Procédures

Le transfert du génome du virus de l'hépatite B (VHB) sera réalisé sous anesthésie et analgésie sur l'ensemble des souris incluses de 7 à 10 semaines de vie (souris adulte) par injection. Un second groupe de souris vigiles subira une injection unique d'un réactif générant un cancer du foie. Deux groupes supplémentaires de souris recevront une petite injection de substances destinées à activer temporairement leurs défenses naturelles. Ces injections seront effectuées avec précaution, sous anesthésie ou sur animaux vigiles selon les cas, et avec des médicaments contre la douleur si nécessaire, quelques heures avant la fin de l’expérience. La durée de chaque injection est estimée à environ 3 secondes chez les animaux vigiles, et à 5 secondes chez les animaux anesthésiés, incluant la manipulation. Au cours de cette étude, nous serons amenés à prélever du sang. Le nombre de prélèvements varie de 1 à 2 selon la durée de l’expérimentation (de 7 semaines à 6 mois), et la durée totale de chaque acte de prélèvement est comprise entre 30 et 60 secondes. Tous les prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale, laquelle apporte également une analgésie efficace, garantissant l’absence de douleur pendant l’acte. À la fin de ce projet, tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Des études antérieures utilisant les mêmes protocoles ont montré des atteintes hépatiques légères à modérées chez les animaux traités. Les manipulations, en particulier les injections et les prélèvements sanguins, peuvent entraîner un stress modéré. Les injections peuvent provoquer une douleur légère, un petit saignement ou un hématome localisé, généralement transitoires. Les prélèvements sanguins peuvent également induire une douleur légère ainsi qu’un stress transitoire. L’anesthésie peut induire un stress thermique lié à la perte de chaleur corporelle. L’administration de certaines substances peut entraîner une inflammation hépatique, voire, dans certains cas, une tumorigenèse. Des troubles digestifs transitoires peuvent également survenir, sans conséquences durables.

Devenir

L'euthanasie est effectuée, apres anesthesie, afin de prélever differents organes. Ces animaux vont permettre de réaliser de nombreuses analyses post-mortem (histologie, quantification de paramètres cliniques, virologiques et immunologiques...) pour répondre à la question scientifique. Cet acte nécessaire sera réalisé par du personnel compétent et selon les bonnes pratiques d'euthanasie des animaux.

Remplacement

Nous avons précedemment effectué des cultures cellulaires à l'aide de modèles bidimensionnels (2D) et tridimensionnels (3D) pour diverses lignées cellulaires invalidées ou non pour un gène cellulaire afin d'examiner si l'effet de l'expression d'une des protéines du VHB in vitro est modulée. Cette protéine du VHB a des effets intra- et extracellulaires. C'est pourquoi un modèle de co-culture en compartiments séparés a été créé pour examiner les rapports entre les cellules hépatiques, qui expriment cette protéine du VHB, et differentes sous-populations immunitaires présentes dans le foie. Toutefois, il n'existe pas encore de modèle in vitro qui condenserait toutes les cellules présentes autour des hépatocytes dans le foie. Le modèle in vivo est donc indispensable pour déterminer le mécanisme d'action des effets intra- et extracellulaires d'une des protéines du VHB sur la pathogenèse hépatique.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé a été évalué par approche statistique afin que les résultats obtenus puissent être signigicatifs. Certains groupes contrôles seront utilisés pour plusieurs procédures, afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. À la fin des procédures, les souris seront euthanasiées par une méthode réglementaire, et un grand nombre de tissus seront prélevés afin qu'un grand nombre d'analyses puissent être effectuées. Le nombre total de souris mâles à utiliser sera de 840.

Raffinement

Les souris sont hébergées dans une animalerie dont la température et l'hygrométrie sont contrôlées (vérifiée quotidiennement par les techniciens animaliers), avec un cycle de lumière du jour de 12 heures. L'eau et la nourriture sont fournies à tout moment. En outre, les cages seront enrichies de bandes de nidification en kraft et d'un bâton à ronger en bois. Les animaux ne sont manipulés que par du personnel qualifié et sensible au bien-être des animaux. Les procédures nécessitant le sommeil des animaux sont affinées par un protocole d'anesthésie et d'analgésie approprié, la gestion du risque d'hypothermie par l'utilisation d'une lampe chauffante ou d'un tapis chauffant, et l'ajout d'un gel protecteur pour les yeux afin d'éviter la sécheresse oculaire. Des limites sont fixées et respectées pour éviter la souffrance des animaux. Si les signes de douleur persistent ou si les points limites sont atteints, les animaux seront euthanasiés afin d'éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Le modèle de souris utilisé dans cette étude est couramment employé en recherche car il permet d’obtenir des résultats fiables. Son système de défense naturelle fonctionne de manière similaire à celui de l’être humain, ce qui facilite l’étude de certaines maladies du foie. Les animaux seront utilisés à deux stades de développement, soit à 15 jours de vie (stade de développement murin pendant lequel le foie est encore en prolifération et permet l'induction de la pathogenèse hépatique), soit de 7 semaines (souris sevrées et adultes) car il est nécessaire que le foie soit mature.

324 hamsters, lapins, furets et porcelets vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacun recevant une à quatre immunisations, une prise de sang par semaine et une anesthésie par semaine. Les porcelets, vaccinés à six semaines, sont mis à jeun avant chaque anesthésie. Tous sont tués sous anesthésie générale en fin d'étude pour prélever la rate, les nœuds lymphatiques et une grande quantité de sang. Les bénéfices avancés, des vaccins antigrippaux plus stables pour l'humain et un meilleur contrôle de la grippe porcine en élevage, restent au conditionnel, et le porteur rappelle que les autorités exigent de toute façon ces études d'immunogénicité.

Objectifs

D’après l’organisation mondiale de la santé animale, la grippe porcine est une infection virale hautement contagieuse et très fréquentes dans les élevages. Elle se propage rapidement avec un taux de contamination de 100%. Elle est généralement bénigne associant de l’hyperthermie, de l’apathie, une perte de poids et des signes respiratoires peu intenses. Cependant, la maladie peut être exacerbée (en fonction la souche ou d’une possible co-infection) ou persister au sein d’un élevage, entraînant des problèmes sanitaires et des pertes économiques importantes. Lorsque la grippe porcine est établie dans un élevage, il peut être difficile de l’éliminer complètement, et une dépopulation des troupeaux peut être nécessaire. D’autre part selon l’Organisation Mondiale de la Santé, la grippe représente une menace sérieuse pour la santé publique, surtout dans les pays à faible revenu. Les infections respiratoires aiguës, dont la grippe, sont parmi les principales causes de mortalité, particulièrement chez les enfants de moins de 5 ans et les personnes âgées ou ayant des maladies chroniques. La vaccination est essentielle pour protéger les populations vulnérables contre ces maladies. Plusieurs vaccins saisonniers sont disponibles, mais leur efficacité peut varier d'une année à l'autre en raison des mutations virales. Dans les deux cas, chaque année, les virus de la grippe subissent des changements, ce qui nécessite souvent l'ajustement des formulations vaccinales. L'objectif de la recherche est de développer des vaccins plus stables qui pourraient offrir une protection durable, réduisant ainsi la nécessité de modifier fréquemment les vaccins. La recherche se concentre également sur le développement de vaccins contre d'autres agents pathogènes respiratoires. Ce processus nécessite la sélection d'antigènes capables de déclencher une réponse immunitaire efficace, souvent renforcée par des adjuvants. Notre projet a donc pour objectif d'utiliser des animaux pour évaluer la capacité de candidats vaccins à stimuler le système immunitaire contre la grippe, afin 1) d'améliorer la protection des populations à risque 2) enrayer sa diffusion et sa persistance dans les élevages de porcs.

Bénéfices attendus

Le projet vise à évaluer l'immunogénicité et la tolérance de candidats vaccins, ainsi il permet de sélectionner des molécules qui seront ensuite étudiées plus en détail en vue de leur mise sur le marché. En développant des vaccins plus stables et durables, nous espérons : 1) Si le vaccin est a visée humaine, réduire la morbidité et la mortalité liées aux infections respiratoires. 2) Si le vaccin est destiné à l’élevage porcin, un meilleur contrôle de la grippe porcine par la capacité du vaccin enrayer l’introduction, la diffusion et la persistance des virus influenza porcins dans les élevages. Ce qui constitue un challenge majeur tant d’un point de vue de la santé animale que de la santé publique (transmission à l'homme). De plus, les résultats contribueront à la recherche sur d'autres maladies respiratoires, enrichissant notre compréhension des réponses immunitaires et renforçant l'importance de la vaccination dans la prévention des maladies infectieuses. D’autre part, il est encore possible d’améliorer le confort, la tolérance et l’efficacité des vaccins déjà existants.

Procédures

Les animaux seront soumis à un ensemble d'administration et de prélèvements :(1) Administration du vaccin par voie intramusculaire ou intradermique (2) Prélèvements sanguins en cours et fin d'étude sous anesthésie (3) Prélèvements d'organes après l'euthanasie en fin d'étude. Le nombre d’immunisation (administration du vaccin) et les volumes d’administration respecteront les recommandations éthiques : ils dépendront de l’espèce animale, de la voie d’administration et du poids de l’animal. Cependant, il sera compris entre 1 à 4 immunisations selon le plan d’administration avec 1 semaine à 1 mois entre deux immunisations. Le volume et la fréquence des prélèvements sanguins respecteront les recommandations éthiques : ils dépendront de l’espèce animale et du poids de l’animal. Les prises de sang seront réalisées une fois par semaine. La durée pour les administrations et les prélèvements seront de quelques secondes. En fonction de l'espèce et de la voie de prélèvement, les animaux seront préalablement anesthésiés (anesthésie gazeuse réversible en quelques minutes ou anesthésie chimiques d'environ 20min). Les injections d'anesthésique chimique se feront dans le muscle et seront très brèves. Les anesthésies gazeuses constistent en l'inhalation d'un gaz qui endormira l'animal. Il est prévu de réaliser une anesthésie par semaine.

Impact sur les animaux

La principale nuisance attendue chez les animaux est liée aux injections de vaccin ainsi qu’aux prélèvements sanguins, ce qui est susceptible d’apporter un inconfort et/ou de générer du stress chez l’animal. Le nombre d’immunisations et les volumes administrés respecteront les recommandations éthiques : ils dépendront de l’espèce animale, de la voie d’administration et du poids de l’animal. Les prélèvements sanguins et les volumes de prélèvement respecteront également les recommandations éthiques : ils varieront en fonction de l’espèce animale et de son poids. Un temps de repos nécessaire sera observé entre deux prélèvements, en fonction du volume prélevé. De plus, comme tout produit de santé, un vaccin peut entraîner des effets indésirables. Ces derniers surviennent généralement dans les deux semaines suivant la vaccination, ou plus rarement deux mois après. Dans l’immense majorité des cas, ces effets sont légers à modérés. Il s’agit principalement de réactions inflammatoires naturelles dues à la mobilisation du système immunitaire après l’injection du vaccin. Cette inflammation peut provoquer des symptômes tels que fièvre, douleur et rougeur au site d’injection. Plus rarement, des réactions allergiques à l’un des composants du vaccin peuvent survenir. Les contentions et injections pour les anesthésies provoqueront un stress et une douleur transitoire chez les animaux. Ces nuisances ne dureront pas plus de quelques minutes pour les animaux. Les mises à jeûn avant les anesthésies provoqueront également un stress chez les animaux (seulement pour les porcs).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés sous anesthésie générale. Pour les besoins des études, certains organes sont prélevés après l'euthanasié (exemple : rate, noeuds lymphatiques), ainsi qu’une grande quantité de sang.

Remplacement

Après des phases préliminaires in silico (par ordinateur) et in vitro (tests cellulaires), il est essentiel d’obtenir des données dans des conditions réelles d’utilisation, étant donné que le vaccin à développer a une visée clinique (humaine ou vétérinaire). L’utilisation d’un organisme complet et vivant devient donc indispensable, notamment pour le suivi post-immunisation. Par ailleurs, le fonctionnement du système immunitaire est très complexe et implique des mécanismes qu’il est impossible de reproduire autrement. De plus, des études d’immunogénicité sont exigées par les autorités dans le cadre du développement des vaccins.

Réduction

Le nombre d’animaux doit permettre d’identifier une différence significative entre les produits testés, sur la base de la comparaison quantitative et qualitative des immunisations obtenues (taux d’anticorps, affinité, spécificité, etc.). Les premières études sont réalisées avec des nombres reduits d'animaux, par exemple 3 lapins par groupe. En fonction des résultats obtenus, ce nombre peut être affiné s’il est possible de mettre en évidence des différences significatives avec moins d’animaux. Les effectifs et les tests statistiques seront définis en fonction du nombre de série d’observation, la dépendance ou indépendance de ces séries d’observation, la nature des variables (quantitative ou qualitative), et la nature du test (test paramétrique ou non paramétrique).

Raffinement

Après réception, les animaux auront une période d’acclimatation d’une durée propre à chaque espèce animale. Les animaux feront l'objet d'un conditionnement positif, basé sur des intéractions amicales avec les personnels en charge des soins, ceci afin de permettre des manipulations sans stress et avec un minimum de contraintes. Les animaux seront hébergés en groupe sociaux et recevront un enrichissement du milieu adapté à leur espèce, régulièrement renouvelé (rotation des jouets par exemple). Des évaluations cliniques sont mises en place (observation quotidienne de l’état général, du comportement, etc.). Les actes douloureux ou provoquant un stress élevé, seront réalisés sous anesthésie, avec analgésie adaptée. Tout au long des études les animaux sont manipulés/observés par un personnel formé et habilité à travailler chez les espèces en question. Les voies et volumes de prélèvement et d’administration suivront les recommandations des publications. De plus, des points limites suffisamment prédictifs sont mis en place pour suivre l'état de l'animal.

Choix des espèces

Le but de cette manipulation, qui précède une étude de toxicité, est de s'assurer que l’espèce est adaptée aux vaccins que nous allons tester. Si le vaccin est destiné à la clinique humaine, il est important de choisir un modèle qui réagit correctement au vaccin, et pour cela, nous utiliserons le hamster, le lapin et le furet qui sont les espèces les plus appropriées. Nous utiliserons le porc lorsqu’il s’agira de l’espèce cible du vaccin. Les animaux seront de jeunes adultes (car croissance terminée, paramètres physiologiques stables, réponse immunologique optimale) mais pourront également être des animaux jeunes, dont le système immunitaire ne serait pas mature. Pour le porc les animaux seront utilisés seront des porcelets agés de 6 semaines au moment de la vaccination afin de réfléter les programmes de vacination dans les élevages.